Linea Celular TE671

VIII Congreso Virtual Hispanoamericanode Anatomía Patológica — Octubre de 2006

http://conganat.cs.urjc.esPatología Molecular

Jana BalbuenaMónica EnguitaAiala LorentePaula LázcozJavier Sáez Castresana

Unidad de Biología de TumoresCerebrales, Universidad deNavarra, Pamplona

Correspondencia:Javier Sáez CastresanaUnidad de Biología de TumoresCerebrales, Universidad de NavarraC/ Irunlarrea 1,31008 Pamplona, España

Telf: +34 948 425 600Fax: +34 948 425 652E-mail: [email protected]

Estudio del grado de diferenciación celular en líneascelulares de Gliobastoma y Meduloblastoma

INTRODUCCIÓN: Las "células madre tumorales", identificadas en distin-tos tipos tumorales, aunque constituyen sólo una pequeña proporción de lascélulas tumorales totales, parecen ser las únicas causantes del mantenimien-to del tumor y de la recidiva de la enfermedad tras distintos tratamientos.Poseen capacidad de autorrenovación y de diferenciación a distintos tiposcelulares y pueden ser detectadas mediante el uso de marcadores de inma-durez celular. Entre ellos el CD133 ha demostrado recientemente ser unbuen candidato. OBJETIVO: Estudiar el grado de diferenciación en dis-tintas líneas celulares tumorales de glioblastoma y meduloblastoma, para,posteriormente aislar las posibles células inmaduras existentes y tipificarlasgenéticamente. MATERIAL Y MÉTODOS: El estudio se realizó en9 líneascelulares de glioblastoma (A172, GOS3, T98G, LN405, SW1088, SW1783,CCF-STTG1, MOG-C-CCM y U-87MG) y 6 de meduloblastoma (PFSK-1,Daoy, TE671, TE671sub2, SK-PN-DW, D283Med). Se estudió la expresiónde CD133 y de otros genes relacionados con el grado de diferenciación ce-lular: Musashi 1, NCAM-1, FAS, Nestina y GFAP, mediante RT-PCR semi-cuantitativa. RESULTADOS: De las líneas celulares de glioblastoma sóloSW1088 fue positiva para CD133, sin embargo, fue la única queno mostróexpresión de FAS. Además, todas mostraron expresión de nestina y Musahi1. Asimismo, se observó expresión de NCAM-1 en GOS3 y T98G, y ex-presión de GFAP en GOS3, MOG-C-CCM, CCF-STTG1 y LN405. Todaslas líneas celulares de meduloblastoma fueron positivas para la expresiónde CD133, nestina, Musashi 1, NCAM-1 y FAS, y negativas para la expre-sión de GFAP. CONCLUSIONES:1. Glioblastoma: los datos sugieren queen una misma línea celular convergen células tumorales en distinto gradode diferenciación. 2. Meduloblastoma: los resultados parecen indicar un al-to grado de inmadurez en todas las líneas celulares, probablemente porqueel meduloblastoma es un tumor embrionario compuesto en su mayoría porcélulas indiferenciadas.

Palabras clave:meduloblastoma; globlastoma; stem cell tumoral.

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INTRODUCCIÓN

El glioblastoma multiforme es un tumor primario del sis-tema nervioso central (SNC) y se corresponde con ungrado IV del WHO (World Health Organization). Tieneuna frecuencia relativa del 25 % de los tumores prima-rios y cerca del 50 % de los gliomas. Tiene una mayorfrecuencia en el adulto mayor (en la sexta década de lavida) pero pueden aparecer en todas las edades. Apare-ce localizado predominantemente en hemisferios cere-brales, especialmente en lóbulos frontales, pero con fre-cuencia con el compromiso de más de un lóbulo (5).

El meduloblastoma es un tumor neuroectodermico pri-mitivo (PNET), extremadamente maligno e invasivo. Secorresponde con un grado histológico IV y es el tu-mor cerebral infantil maligno más común. Representa un20 % de todos los tumores cerebrales infantiles (4).

Recientemente, varios estudios han demostrado que tu-mores como el glioblastoma multiforme y el medu-loblastoma están asociados a células madre tumorales(1,2). Esto significa que en estos tumores coexisten 2subpoblaciones celulares: células tumorales propiamen-te dichas y células madre tumorales, denominadas en di-versos artículos como “side population” (6). Estas últi-mas serían las responsables de la formación del tumor,de la malignidad del mismo, así como de su manteni-miento (3).

Además, son capaces de reproducir las característicasdel tumor original al ser transplantadas (7). Esto podríaexplicar por qué los tratamientos antitumoralaes no sondel todo eficaces, ya que no están diseñados para atacarespecíficamente a esta población de células.

A día de hoy se desconocen cuáles son las diferenciasexistentes entre ambos tipos de células (tumorales y ma-dre tumorales), ya que tanto la activación de determina-dos oncogenes como la supresión de determinados genessupresores de tumores son similares en ambas, por lo quese cree que las diferencias puedan ser epigenéticas (8).

El estudio de estas células madre o células inmaduras(no diferenciadas) obtenidas a partir de distintos tejidos,tumores o líneas celulares tumorales facilitará una me-jor comprensión del mecanismo de progresión tumoraly podría ayudar a diseñar nuevas estrategias terapéuticascontra ciertos tipos de cáncer (9).

MATERIAL Y MÉTODOS

Material: Las líneas celulares de meduloblastoma a es-tudiar son : PFSK-1, Daoy, TE671 y TE671 Sub.2, queson células adherentes y SK-PN-DW y D283Med queson células que crecen en suspensión. Crecen en me-dio RPMI + glutamax con 10 % SFB (suero fetal bo-vino), 4 % Aminoácidos no esenciales, 1 % Penicili-na/streptomicina y un 0,1 % de anfotericina.

Las líneas celulares de glioblastoma multiforme a es-tudiar son: A-172, GOS 3, T98G, LN405, SW1088,SW1783, CCF-STTG1, MOG-G-CCM, U-87 MG y U-118. Todas ellas son células adherentes y crecen en unmedio de cultivo RPMI + glutamax con 10 % SFB (sue-ro fetal bovino), 1 % Penicilina/streptomicina y un 0,1 %de anfotericina.

Métodos: Para identificar las células madre tumorales yestudiar los distintos grados de diferenciación celular endichas líneas se decidió analizar la expresión de distintosgenes mediante RT-PCR, asociados a inmadurez celularcomo Nestina, Musashi-1, NCAM-1, Fas y CD133 (es-te último relacionado directamente con células madre).También GFAP que marcaría una diferenciación glial.

Extracción de RNA

Se realizó una extracción de RNA de los pellets de laslíneas con el QuickPrep Total RNA Extraction Kit (27-9271-01, Amersham Biosciences).

Retrotranscripción

El RNA se retrotranscribió a cDNA mediante el kit Su-perScript II Reverse Transcriptase (Cat. 18064-022).

Cuantificación de cDNA

Midiendo la absorbancia a 260 nm en un espectrofotó-metro.

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RT-PCR

Las condiciones de la RT-PCR se pusieron a punto paracada gen.

Los cebadores específicos se diseñaron con el programaBeacon Designer 5.0.

Gel de agarosa

Se prepararon al 1 % para meduloblastoma y al 2 % paraglioblastoma ya que los tamaños de banda a amplificarestán entre 100 y 200 pb. Por cada 100 ml de gel se aña-den 10µ l de bromuro de etidio y se cargan 10µ l demuestra y 5µ l de buffer de carga. El marcador de pesomolecular utilizado es el de 1kb.

RESULTADOS

En meduloblastoma, los resultados muestran una clarainmadurez celular para todas las líneas estudiadas ya quetodas han sido positivas para los marcadores CD133,Nestina, Musashi-1, FAS y NCAM-1 y negativas paraGFAP (es el único gen marcador de madurez). Pese ademostrar un alto grado de inmadurez y ser positivas pa-ra la expresión de CD133, no podemos asegurar que setrate de células madre ya que los resultados pueden serdebidos únicamente a que el meduloblastoma es un tu-mor embrionario y por tanto, estará compuesto por célu-las inmaduras (no tienen porque ser células madre).

En glioblastoma, con los resultados obtenidos no se pue-de concluir que realmente tengamos una población decélulas madre tumorales, pero sí se ve que tenemos dis-tintas poblaciones dentro de una misma línea con distin-to grado de diferenciación celular. En cuanto a las ban-das obtenidas en los geles, que muestran el grado de ex-presión de los genes podemos decir que para la nestina,N-CAM 1 y FAS, para todos los casos en que fue po-sitivo, todas tenían prácticamente los mismos niveles deexpresión, salvo para FAS en T98G, que los niveles eranmás bajos. Para musashi, las bandas aparecen muy sua-ves, en algunos casos casi inapreciables y para GFAPhay un elevado nivel de expresión en la línea GOS3 y enel resto casi inapreciables.

CONCLUSIONES

1. Glioblastoma: los datos sugieren que en una misma lí-nea celular convergen células tumorales en distinto gra-do de diferenciación.

2. Meduloblastoma: los resultados parecen indicar un al-to grado de inmadurez en todas las líneas celulares, pro-bablemente porque el meduloblastoma es un tumor em-brionario compuesto en su mayoría por células indife-renciadas.

REFERENCIAS

1. Aboody, K.S., Brown, A., Rainov, N.G., Bower, K.A., Liu,S., Yang, W., Small, J.E., Herrlinger, U., Ourednik, V., Black,P.M., Breakefield, X.O. & Snyder, E.Y. (2000). Neural stemcells display extensive tropism for pathology in adult brain:evidence from intracranial gliomas. Proc Natl Acad Sci U SA, 97, 12846-51.

2. Bazan, E., Alonso, F.J., Redondo, C., Lopez-Toledano, M.A.,Alfaro, J.M., Reimers, D., Herranz, A.S., Paino, C.L., Serra-no, A.B., Cobacho, N., Caso, E. & Lobo, M.V. (2004). In vi-tro and in vivo characterization of neural stem cells. HistolHistopathol, 19, 1261-75

3. Brown, A.B., Yang, W., Schmidt, N.O., Carroll, R., Leis-hear, K.K., Rainov, N.G., Black, P.M., Breakefield, X.O. &Aboody, K.S. (2003). Intravascular delivery of neural stemcell lines to target intracranial and extracranial tumors of neu-ral and non-neural origin. Hum Gene Ther, 14, 1777-85

4. Figols-Ladron de Guevara J, Lafuente-Sanchez JV. The me-dulloblastoma. Rev Neurol. 2006 Aug 16-31;43(4):213-7

5. Hou LC, Veeravagu A, Hsu AR, Tse VC. Recurrent glioblas-toma multiforme: a review of natural history and managementoptions. Neurosurg Focus. 2006 Apr 15;20(4):E5. Review.

6. Singh, S.K., Clarke, I.D., Terasaki, M., Bonn, V.E., Hawkins,C., Squire, J. & Dirks, P.B. (2003). Identification of a cancerstem cell in human brain tumors. Cancer Res, 63, 5821-8.

7. Singh, S.K., Clarke, I.D., Hide, T. & Dirks, P.B. (2004). Can-cer stem cells in nervous system tumors. Oncogene, 23, 7267-73.

8. Toru Kondo, Takao Setoguchi and Tetsuya Taga. Persistenceof a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6glioma cell line. PNAS, January 20,2004, vol. 101, no. 3, 781-786.

9. Yip, S., Aboody, K.S., Burns, M., Imitola, J., Boockvar, J.A.,Allport, J., Park, K.I., Teng, Y.D., Lachyankar, M., McIntosh,T., O’Rourke, D.M., Khoury, S., Weissleder, R., Black, P.M.,Weiss, W. & Snyder, E.Y. (2003). Neural stem cell biologymay be well suited for improving brain tumor therapies. Can-cer J, 9, 189-204.

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ICONOGRAFÍA

Figura 1.- RT-PCR para CD133 de líneas celulares de glioblastoma: Gel de agarosa de las líneas para el marcadorCD133. 1: control positivo (cDNA Weri), 2: sangre, 3:agua, 4: A-172, 5: GOS-3, 6: T98G, 7: LN405, 8: SW1088, 9:SW1783, 10: CCF, 11: MOG y 12: U-87.

Figura 2.- RT-PCR para CD133 de líneas celulares de meduloblastoma.Gel de agarosa de las líneas para el marcadorCD133. 1: control positivo (cDNA Weri), 2: agua, 3:sangre, 4: PFSK-1, 5: Daoy, 6: TE671, 7: TE671 Sub.2, 8:SK-PN-DW, 9: D283Med.

Figura 3.- RT-PCR para nestina de líneas celulares de meduloblastoma. Gel de agarosa de las líneas para el marcadorNestina. 1:control positivo (cDNA Weri), 2: agua, 3:sangre, 4: PFSK-1, 5: Daoy, 6: TE671, 7: TE671 Sub.2, 8:SK-PN-DW, 9: D283Med.

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Tabla 1.- Resultados del estudio del grado de expresión mediante RT-PCR para los distintos marcadores dediferenciación celular en líneas celulares de glioblastoma multiforme.

Tabla 2.- Resultados del estudio del grado de expresión mediante RT-PCR para los distintos marcadores dediferenciación celular en líneas celulares de meduloblastoma.

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Documents

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