Z e i t s c h r i f t fiir

Untersuchung der Nahrungs- und GenuGnlittel, sowie der Gebrauchsgegenst~nde.

Heft 7. 1. Apr i l 1911. 21. Band.

Liegt den Erseheinungen der sog. Peroxydase ein Ferment zugrunde?

Von

Dr. Hesse und W. D. Kooper.

(Eingegangen am 8. ffanuar 1911.)

Die vor einiger Zeit ersehienene Ver5ffentlichung yon R o t h e n f u B e r 1) gab uns Veranlassung, nochmals Versuche mit dem yon ibm empfohlenen Reagens anzu- stellen, jetzt aber statt der yon uns verwendeten freien Base das Chlorhydrat des p-Phenylendiamins zu nehme~. - - Wie aus unseren frfiheren Versuchen 2) ersichtlich, erhidten wir mit der freien Base sehr gute Ergebnisse, mu~ten aber beziiglich der lVIalt- barkeit, besonders bei nich* vorschriftsmiil~iger Aufbewahrung, zu grol3er Vorsicht mahnen. In der obengena ~ YerSffentlichung spricht R o t h e n f u ~ e r die ~ber- zeugung aus, dab wir bei Anwendung des Chlorhydrats, statt der freien Base, was die ttaltbarkeit betreffe, entschieden zu noch besseren Ergebnissen gelangen wfirden.

Wir haben deshalb die Yersuche wiederholt ,rod die Naehpriifung lieferte bei Anwendung des SalzCs Ergebnisse, die sich ]m wesentlichen mit den mittels der freien Base erzielten deckten. Was Empfindliehkeit und Zuverliissigkeit anbetrifft, konnten wir konstatieren, da~ das yon R o t h e n f u l 3 e r empfohlene Reagens auch in dieser Zusammensetzung die yon ibm behaupteten Vorzfige vor den iibrigen, alt- br~uchlichen Reagenzien im volIen Mai~e besitzt. Aueh die Ha]tbarkeit des Reagens in der ]etzigen Zusammensetzung ist bedeutend grSl3er, denn dne in brauner Flasche aufbewahrte Probe zeigt jetzt, 6 Monate nach ihrer tterstellung, noch volle Wirk- samkeit, obwohl die anfangs farblose Fliissigkeit allerdings jetzt eine leiehte Violett- fiirbung angenommen hat.

Auf unsere VerSffentlichung fiber diesen Gegenstand teilte uns Herr Dr. G rim m e r- Greifswald eine Beobachtung mit, die wir dann spiiter bestiitigen konnten, n~mlich dab Serumproben von gekochter Milch mitunter sehwache Violettf~irbung zeigten, die nach Zusatz yon Soda- oder :NatriumhydroxydlSsung sti~rker wurde. Diese be- achtungswerte Tatsache wurde ]etzt von uns waiter verfdgt, und zwar wuMea dem- entsprechend Versuehe mit dem R o t h e n f u ~ e r'schen Reagens in der vorgeschriebenen Zusammensetzung unter Mitwirkung verschiedener Fliissigkeiten in neutralem, alka- lischem und sauerem Zustande ausgeffihrt. - - In zweiter Linie suchten wit die Frage zu beantworten: ,,Ist die mittels des R o t h e n f u ~ e r ' s e h e n Reagens z. B. in friseher

[_Fortsetzung S. 387.]

~) Milchwirtsch. Zen~ralbL 1910, 6, 468. 2) Milchwirtsch. Zentralbl. 1910, 6, 412.

~. 11. 25

[Zei tsehr . fi Untorsu¢hung 386 H e s s e und W. D. K o o p e r , Peroxydase. [d. Nahr.-u~enufimitteh

Tabelle I.

Art der Milch etc.

F~irbung mit [ i ~ I d - [Durch Zusatz yon ~fio N . - N a -

- - I - - I - - ~ ^ . ~ ~ , , ~ ~ [ tronlauge oder Sodal~sung zu: f u f i e r ' [ I l e n d i a - [

schemRea- Guajakol- rain chlor- gens.(2g] 15sung IhydratlS-

Guajakol, lg] (2 g in t sung p-Phenylen. 135 ccm ill ginl5ce~t liaminehlor-] 950~o-lgem ]Wasser und B C hydrat, 15 Alkohol) ,185 cem 95%.

~cmWasser i igem Alko- 185 ecru Alk.) i hol)

Stark kein e sanere

rohe :Milch ~ r b u n g

W a s s e r desg].

:~olken aus s aue re r desgl.

3~ilch

B u t t e r - desgl. m i l c h

~ a g e r - violett m i 1 c h (so fort)

Molken aus keine

Butter: F~rbung milch

Molken violett (dutch Lab- gerinnung) (sofort)

B r u c h desgl.

:~olken aus s t a r k

s aue re r schwach- But te rmi leh violett (versetzt mit Reinkul tur)

A

s t ~ r - I k e r e s ehvei~n-d et Rosa-

fitrbung Fiirbung die F~rbung

Durch Zusatz yon 1/~o N.- Schwefels/~ure oder anderer

SKure zu:

Violet t - I f~rbung i (naeh i desg 1"

ain iger Z e i t )

A B C

rSflich ] graublau (nach

e in iger Zeil) (sofort)

keine keine Farbung F~rbung

desgl, desgl.

desgl.

desgl.

i

desgl, desgL desgl, keine Farbung desgl, desgl.

sehwache Viole?~t-

desgl, desgl, f~rbung , desgl, desgl, desgl, desgl, desgl. (nach I

e in iger Zeit),

rSflich indigo- gleiche :sehw~ehere ROSa- !1 blau Farbung ~ l~'~rbung ! f~irbung (sofor~) I (sofort) : (sofort) i

nach ] keine I keine ziniger Zeit] keine keine

schwache F~rbung F~rbung x iole~t- Ft~rbung Fiirbung I fKrbung I

- il- indigo------ sti~ r- [~ Fiirbung Rot- rStlich , blau k e r e bleibt (sofort) i(sofort) Farbung dieselbe farbun~,

keine n e u e desgl.

Farbung

st~rkere keine Violett- ! F~irbung farbung i

starkere Violett- , desgl. fi~rbung :

desgl.

keine Farbung

I desgl. I I

~ufierst ] I ] desgL schwachel desgl. / Violett- ! desgl, desgl.

fiirbung i

stfirkere [ ] schwach- desgl. Violett- i desgl, desgl. ] gelblich-

I g r i i n e farbung I Farban~

3~olken I aus stark /~ufierst sauerer ] schwach-

3Iagermi leh (versetzt mit ] violett Relnkul tur) I

G e - keine k o c h ~ e M i l c h Farbung

_ ~ In e in igea

se l t enen aufierst FRllen mi~ schwach-

gekoehter violett Milch

keine Fiir- bung (in stiirkerer i

Konzentra-, tion, grlin/

Grtin- keine nel.le

ffirbnng F~rbung

keine keine FKrbung FKrbung

F/irbung grtinliche bleibt F~irbung dieselbe

grfinli('he Farbung desgl.

schwach- griinliche i keine F~irbung r Farbung

i

keine neue

FKrbung

keine F~rbung

grtinlich- gelbe

F/irbung

gelbe F~irbung

keine F~rbung

desgl, desgl, desgl.

desgl, desgl.

desgl, desgl.

schwache ] Viole t t - : desgl. f~irbung

rStlich kein kein F r i s c he mchtend indigo- G r fi n- Farben- Farben- r o h e violett (nacheini- blau

(sofort) M i l c h (sofor~) ger Zeit) l farbung umschlag umschlag

[schwache i ] keine ] keine ] V i o l e t t - i keine keine keine keine keine Farbung II Farbung if a rbung . I Farbung Fiirbung Farbung Farbung Farbung

desgl, desgl, desgl, desgl, desgt.

21. Band. ] Hes se und W. D. Kooper , Peroxydase. 387 1. April 1911.]

[Fortsetzung vor~ S. 385.] Milch auftretende Violettf~rbung eine sich aus Blau und Rot aufbauende Komplementar- f~rbung (denn das p-Phenylendiamin fill- sich oxydiert sich in Gegenwart yon ~Vasserstoff- superoxyd in frischer Milch zu einem blauen Farbsto~f, das Gua]acol unter denselben Be- dingungen zu einem roten) oder ist in der R o t h e n f u t ] e r ' s c h e n LSsung ein neuer KSrper vorhanden, der dutch Oxydation einen violetten Farbsto~f liefert?" Um diese zweite Frage zu beantworten, ~fihrten wit neben der ersten Versuchsreihe Versuehe aus mit LSsungen, welche die Bestandteile des R o t h e n f u l ] e r ' s c h e n Reagens ffir sich enthielten.

Die Ergebnisse beider Versuchsreihen sind in der Tabelle auf S. 386 niedergelegt.

In allen Fallen, wo mit der GuajacollSsung in der angewendeten Verdfinnung eine Rotf•rbung, mit p-Phenylendiaminchlorhydrat eine Blauf~rbung auftrat, zeigte n die mit dem R o t h e n ful~ e r'sehen Reagens versetzten l~roben Violettf~rbung. W~ihrend abet diese V~.elettf~irbung dutch Alkalizusatz eine st~rkere, dunklere wurde, ver- sehwand die rote F~rbung in den mit GuajacollSsung versetzten Proben und die in- digoblaue F~irbung der p-PhenylendiaminchlorhydratlSsung schlug in Rosa bis Rot urn. Durh 1[1o N.-Schwea%ls~ure wurde die violette Farbung eine grfine, w~hrend bei B and C kein FarbenumseMag stattfand. I-Iieraus geht also klar hervor, dal~ im R o t h e n - fut~er 'schen Reagens eln neuer Stoff vorhanden ~sein mut~, der mit ~ischer Milch in Gegenwart yon Wasserstoffsuperoxyd Violettfarbung hervorruft and diese nicht durch die zwei Farbungen, Rot und Blau, entstanden sein kann, die sich mit den Bestandteilen des R o t h e n f u I ~ e r ' s c h e n Reagens ffir sich erzielen lassen.

Ffigt man zu destilliertem Wasser etwas von dem Reagens und v o n d e r WasserstoffsuperoxydlSsung, dann tritt keine F~rbung auf. Dies ist aber sofort der Fall, wenn man I]1o ]~.-Natronlauge odor eine andere Base zusetzt. Die ent- standene Violettf~rbung verschwindet wieder auf Zusatz von S~iure odor die LSsung wird, wenn man eine gr51~ere Menge des Reagens anwendet, grfin. Dageg'en tritt in mit etwas yon der Guaiacol- oder p-PhenylendiaminlSsung versetztem Wasser, anch nach Zusatz yon Alkali oder Siiure keine F~trbung auf.

Das R o t h e n f u l ~ e r ' s e h e Reagens besitzt sauren Charakter. Ffigt man zu 5 ccm des Reagens dnige Tropfen einer l°/o-igen Wasserstoffsuperoxyd-LSsung und 2,50 ccm 1]to N.-Natronlauge, dann sind nur 0,12 cem I]~o ~.-Schwefels~ure nStig, um die Violettf~irbuug zum Verschwinden zu bringen. Es txltt eine br~iunlich-grfine F~trbung auf, die dureh Alkali fiber Rot wleder leicht in Violett umsehI~gt. Setzt man nur eino Spur (0,01 cem) 1/lo 2ff.-Schwefels~ure zuviel zu, dann krystallisiert sofort ein SaIz aus. Wir haben es in der mit Wasserstoffsuperoxyd versetzten R o t h e n f u ~ e r ' s e h e n LSsung also mit einem KSrper zu tun, dessen nicht-dissoziierte Molekfile eine grtin- liche Farbe besitzen. Naeh Zusatz yon ~atronlauge bildet sich aber das dissoziierte Salz des in der L5sung befindlichen, durch Oxydation entstandenen K6rpers, wodurch die violette Farbung der negatlven Ionen sichtbar wird. Setzen wir nun wieder eine S~ure zu, dann wird die Dissoziation aufgehoben, die violetten Anlonen verschwinden und die grfinliehe Farbe des fraglichen Stoffes in elektrisch-neutralem Zustande er- scheint wieder.

Die indirekte Oxydase oder Peroxydase soll es sein, welche dutch Sauerstoff- tibertragung in frischer Milch mit den verschiedenen Reagenzien die verschiedenen F~rbungen hervorruft. Direkte Beweise fSr die Existenz dieses Fermentes haben wir nicht; nur die Tatsaehe, dag gewisse Desinfektionsmittel die Eigenschaft friseher Milch

[Zeits~hr. £ Untersuchung 388 Hesse und W. D. Kooper, Peroxydase. [a.Nahr.-u. Genu~mi~teL

bestimmte KSrper in Gegenwart yon Wasserstoffsuperoxyd zu Farbstoffen zu oxy- dieren, vernichten kSnnen, welter, daft durch eine Erhitzung der Milch diese Wirkung aufgehoben wird, und auch noch einige andere Umstande schienen ffir sein Dasein zu sprechen. - - In einer ~rfiheren VerSffentlichung 1) wurden auf Grund einiger Unter- suchungen beztiglich dieser sogenannten Peroxyda~se folgende Ergebnisse erhalten:

1. Die Peroxydase (oder indirekte Oxydase) geht sowohl beim Entrahmen mittels Zentrifugen, sis durch Abrahmen mit der Hand aussehliel~lich in die Mager- milch fiber.

2. Beira ~Iterwerden der Milch ist keine st~irkere Wirksamkeit zu beobachten. 3. Von einem zwischen 40--50 liegenden S~uregrade (nach ThSrner ) an

nimm~ die Intensit~it der Blaufiirbung mittels ParaphenylendiaminlSsung fortwahrend ab, um schliel~lich ganz zu verschwinden.

4. Sie wird dutch SublimaflSsung in einer ffir Fermentorganismen tStlichen Verdfinnung nicht vernichtet, scheinbar sogar nicht geschw~cht.

5. Sie vermehrt sich n i c h t in gekochter Milch nach dem Impfen derselben mit roher Kuhmilch.

6. Sie rfihrt deshalb nieht yon Mikroorganismen, sondem wahrscheinlich vom Muttertier her, o b w o h l a u e h e i n f a c h e c h e m i s e h e V o r g ~ n g e zur E r k l ~ - r u n g tier O x y d a t i o n s v o r g ~ n g e a u s r e i e h e n .

Vor nicht allzu langer Zeit gIaubten F. B o r d a s und F. T o u p l a i n 2) bewiesen zu haben, daf~ zur Erkl~rung der migtels Pal'aphenylendiamins auftretenden F~irbung nicht notwendig die Existenz von bestimmten Fermenten angenommen zu werden brauchte. lqach B o r d a s und T o u p l a i n ist es die Caseinverbindung in roher Milch, welche die Zersetzung des Wasserstoffsuperoxyds und die Bl~uung durch Oxydation des Para- phenylendiamins zustande bringt.

Die yon den beiden Autoren verSffentlichten Versuchsresultate wurden yon J. M e y e r ~) einer Nachprfifung unterzogen, und es bestanden die Ergebnisse seiner Untersuchung darin, ,,daf~ die Versuchsresultate yon F. B o r d a s und F. T o u p l a i n unter den dargelegten Versuchsbedingungen zum grSf~ten Teile nicht best~tlgt werden konnten und daf] bisher keine Veranlassung vorliege, yon der Annahme abzugehen, dal3 in tier Milch Fermente vorhanden sind, welche Wasserstoffsuperoxyd zersetzen und seine Oxydationswirkung au~ andere Verbindungen beschleunigen kSnnen."

Die jetzt von uns ausgeffihrten Untersuchungen lieferten Ergebnisse, die zum wenigsten die Fermentnatur der mittels des Rothenfuf~er ' schen Reagens auf- tretenden :Erseheinungen sehr fraglich machen und daffir zu sprechen scheinen, daf~ die Wirkungen der sog. Peroxydase eher ihre Ursache in einfachen chemischen Vor- g£ngen haben.

Wir sahen, dal~ das Ro thenfu l~er ' sche Reagens einen Indikator mit aus- gepr~igt sauren Eigenschaften darstellt. Es wird also schon mit schw~icheren Basen Salze bilden, welche nur durch verhMtnism/~.l~ig starke S~iuren zerlegt werden kSnnen.

Bekanntlieh reagiert die Milch amphoter oder amphichromatisch, l~ach S o x hl e t wird die amphotere Reaktion der Milch dadurch bedingt, dal~ sich in ihr neu- trales und saures Alkaliphosphat und Alkalicarbonat findet. W~hrend n~mlich die

~) Diese Zeitschrift 1910, 20, 574. -~) 0ompL rend. 1909, 149, 1057. 3) Molkerei.Ztg. Berlin 1910, 20, 218.

~1. Ban~. ] Hesse und W. D. Kooper , Peroxydase. 389 1. April 1911.J

sauren Verbindungen KH2P Q und NaH~POt sauer reagieren, zeigen die Verbindungen K~HPO 4 und NaeHPO 4 alkalische Reaktion. Diese alkalisch reagierenden Salze werden also auch mit dem R o t h e n f u l ~ e r ' s c h e n Reagens, das, wie gesagt, einen Indikator der ersten Gruppe darstell~, die basische Farbung des Reagens hervorrufen.

Die Acidit~t yon 2 ccm des Reagens betr~igt oder entspricht 0,5 ccm I/lo ~.- hTatrontauge, d. h. es sind 0,5 ccm I[io N.-Natronlauge erforderlich, damit die grfinliche F~rbung eine violette wird. m Bringt man nun zu 10 ccm fl'ischer Milch 2 ccm des Reagens, dann bringen erst 1,02 ccm :N.-Schwefels~ure die intensive Violet~f~irbung zum Verschwinden. Da die 2 ccm Reagens 0,5 1/lo N.-Natronlauge und diesen 0,05 N.- Schwefelsaure entsprechen, besal~en die angewendeten 10 ccm frischer Milch also eine Basizit~t yon 1,02 -~ 0,05 ~ 1 , 0 7 ccm ~.-SchwefelsEure oder 100 ccm Milch mit einem durchschnittlichen S~iuregrad yon 18,0 (nach T h S r n e r ) erforderten 10,7 ccm 1/lo N.-Schwefels~ure, welche Zah l man als A l k a l i t ~ t s g r a d beze i chnen kSnnte ,

- - Die st~irkste Stiitze ffir die Annahme, dab die indirekte Oxydase oder Peroxydase. welche in frischer Milch mit l='araphenylendiaminlSsung, mit dem R o t h e n f u l ~ e r ' - schen Reagens etc. F~irbungen durch Sauerstofffibertragung hervorruft, ein ]~ermeng ist, besteht in der Tatsache, da~ dutch Kochen der Milch diese Eigenschaft verloren geht. L~i~t man nunzu 10 ccm gekochter Milch 2 ccm R o t h e n f u I ~ e r ' s c h e s Reagens fliel~en, dann entsteht momentan e]ne ~iu~erst schwache violette F~rbung, we]the aber zu gleicher Zeit wieder verschwindet. SobMd man aber einige ccm 1/lo N.-Natronlauge zusetzt, erscheint dieser Farbenton wieder, am allm~ihlich starker zu werden, ie nach der Menge der zugesetzten Natronlauge. Titrlert man nun mk N.-Schwefels~ure, um diese F~rbung zum Verschwinden zu bringen, dann braucht man nicht 1,07 ccm, wie in frischer Milch, sondern nur 0,63 ccm N.-Schwefels~ure, natiirlieh nach Abzug der zugesetzten Menge t/io N.-~atronlauge. Durch das Kochen ist also der AlkalitStsgrad yon 10,7 auf 6,35 gesunken und diese noch vorhandene Alkalitat scheint nicht stark genug zu seln, nm die F~irbung zustande zu bringen.

Bei der Titration mit :N.-Schwefels~ure in frischer Milch verlief der Farbenum- schlag anders als in gekochter Milch. W~hrend in frischer Milch die violette F~rbung ziemlich plStzlich eine dunkelgrfine wurde, welehe dutch mehr S~ure ins Gelbliche umschlug, wurde die F~bung bei gekochter Milch atlm~ihlich eine graue, um schliel~- lich ganz zu verschwinden. Es sei welter bemerkt, dal~ auch iu friseher Milch die Ffirbung nur nach Zusatz von WasserstoffsuperoxydlSsung auftrat, w~hrend die vlolette Farbe in dem Reagens selber schon durch ~Ao ~.-Natronlauge ohne Wasserstoffsuper- oxydlSsung zum Vorschein kam.

Wir sehen, dat~ durch ~Ao ~.-Natronlauge-Zusatz zu gekochter Milch auch hier F~rbung zu erzielen war. Bringt man aber Milch und ~atronlauge in demselben Verh~Itnis v or dem Kochen zusammen, dann tritt nach dem Kochen mit dem R o t h e n f u l ~ e r ' s c h e n Reagens k e i n e F~rbung mehr auf. Das ~atriumhydroxyd mul~ also beim Erhitzen e~ne Verbindung eingegangen haben. Die Mischung besa~ dennoch alkalische Reaktion, da mit Phenolphthalein eine Rotf~trbung e]ntrat. Ffigte man zu der Mischung etwas ~atronlauge, dann erschien die gewfinschte Violettf~rbung. Jetzt verschwand sic erst durch etwa 0,92 ccm :N.-Schwefels~ure. Zieht man hiervon das nachtr~glich zugesetzte 1 ccm ~/~o N.-Natronlauge ab, dann linden wit ffir die Mileh-Natronlauge-Mischung einen Alkalit~tsgrad von 8,9. Bringt man auch die vor- her zugesetzten 4 ccm ~/~o ]~.-Natronlauge in Abzug, dann ergibt sich im Durchschnitt nur ~,6. Dutch das Kochcn mi~ Natronlauge ist also die alkalische Reaktion der

~Zeits~hr. f. Un~ersuchung :390 Hesse und W. D. Kooper , Peroxydase. [d. Nahr.-u. Genu~mittel

Milch stark heruntergedrfickt und ist diese ]etzt nut in einer Form vorhanden, die nicht mehr imstande ist, die R o t h e n f u • e r ' s c h e LSsung oder den fi:agllchen KSrper in dieser LSsung zu dissoziieren.

Bereitet man sich eine LSstmg, die in 100 ccm 3 g des sauer reagierendcn Salzes KH2PO 4 and ebenso 3 g der neutralen Verb]ndung IqaeHPO 4 enthiilt, dann slnd mit Phenolphthalein als Indikator 19,0 ccm 1/io Iq.-Natronlauge nSt]g, um 10 ccm dieser gegen Phenolphthalein sauer reagierenden LSsung zu neutralisieren. Der S/iure- grad ist also 19,0. - - Mit dem R o t h e n f u l ] e r ' s c h e n Reagens dagegen entsteht eine intensive Violettf~irbung und erst 0,79 ccm N.-Schwefels/iure bewirken einen Farben- umschlag. Der Alkalit~tsgrad der LSsung ist also 8,40.

Brachte man nun zu 10 ecm gekochter Milch 10 ccm der obigen LSsung, dann trat anfangs mit dem R o t h e n f u t ~ e r ' s c h e n Reagens gar keine F/irbung auf und erst naeh l~ngerer Zeit zeigte sich ein immer dunkler werdender violetter Schimmer. Dieser verschwand nach Titration mit 1,44 ccm N.-Schwefelsiiure, wonach also die 10 ccm der mit der LSsung versetzten gekoehten Milch 1 , 4 4 - - ( 0 , 8 3 - 0,05) 0,66 ccm l~.-Schwefels~iure zu binden vermochten. W/ihrend der Sgturegrad dieser Mischung 106,5 nach T h S r n e r betrug, war der Alkaliti~tsgrad 1,43. Der S/~uregrad der urspriinglichen, gekochten Milch betrug also (106,5--95.5) X 2 ~ 22.0 und der Alkalitiitsgrad 10 [1,43 - - (0,84 - - 0,05)] ~ 6,4.

Da man annimmt, dab die Peroxydase die ~Vasserstoffsuperoxyd-LSsung nach tier Gleichung H20 e - - H20 ~ O spaltet, im Gegensatz zu tier Katalase, die die LSsung nach der Gleichung 2 HeO z == 2 H e O - ~ O2 spalten soll, wiire es inkonsequent, wenn man das Iqachdunkeln der mit dem R o t h e n f u lii e r'schen Reagens versetzten gekochten Milch dem atmosphiirisehen Saucrstoff zuschreiben wollte. Mit gleichem Rechte kSnnte man dann behaupten, dab es in ungekoehter Milch die Katalase ist, die die Sauer- stoff-l~bertragung zustande bringt.

Aus diesen Versuchen haben wir also gesehen, dal~ dutch das Koehen der Alkali~tsgrad abzunehmen scheint, ferner, dal] dtu'ch Zusatz yon einer geniigend grol]en Menge Natronlauge die gekochte Milch aufs Neue die Eigenschaft zuriick erlangt, mit dem R o t h e n f u l ~ e r ' s c h e n Reagens eine Violettf/irbung zustande zu bringen. Allerdings ist es nicht klar, warum ohne Wasserstoffsuperoxyd-Zusatz bei Milch keine Fi~rbung auftritt, wKhrend in w/isseriger oder alkoholischer LSsung schon eine geringe Menge I~atronlauge genfigt, um Violettfi~rbung zu erzielen. Auch in ge- kochter Milch, wo also uicht yon einer Spaltung durch Fermente die Redo sein kann, entsteht nur bei Anwesenheit yon ~rasserstoffsuperoxyd und nach Zusatz von ~/lo ~N.- Natronlauge Fiirbung. Spielt das ~Vasserstoffsuperoxyd vielleicht eine positiv wirkende katalytische Rolle, wiihrend in der Milch selber andere katalytisch wirkende Stoffe vorhanden sind, die einen negativ-katalytischen, also hemmenden Einflu~ auf den Verlauf tier Dissoziierung auszufiben vermSgen?

Ffigt man zu frischer Milch eine nicht zu grol]e Menge Quecksilberchlorid, aber immerhin genug, um alle Lebewesen abzutSten, dann verliert solehe Milch nieht die Eigen- schaf~, mit dem Rothenful~er ' schen Reagens und Wasserstoffsuperoxyd eine Vio- lettfiirbung hervorzurufen. Eine zu groBe Menge Quecksilberchlorid aber vernichtet diese Eigenschaft. Man w~ire also an erster SteIle gendgt, zu glauben, dab es Fermente sind, d i e die Wirkungen hervorrufen, da bekanntlich auch diese dureh nicht zu groBe, fiir Mikroorganismen immerhin tSdliche Mengen Quecksilberehlorid, nicht verniehtet, bei gr6Beren Mengen aber auch ihre Wirkungen aufgehoben werden. Wir brachten

21. Band. ] Hesse und W. D. Kooper , Peroxydase. 391 L .~pri119mJ

deshalb zu 100 ccm Milch 2 g Quecksilberchlorid. Diese Menge, die sich nicht ganz gelSs~ butte, geniigte, um dee Eigenschaft der Milch, mit dem R o t h e n f u l ~ e r ' s c h e n Reagens Violettfiirbung hervorzurufen, aufzuheben. Der Siiuregrad der Milch aber war durch den Quecksilberchlorid-Zusatz von 19,0 auf 86,0 gestiegen und aus diesem Grunde schon war es nieht zu verwundern, daI~ keine Fi~rbung auftrat, da, wie friihere Untersuchungen gezeigt haben, schon yon einem zwisehen 40- -50 schwankenden S~ure- grad an, die Intensitiit der Fi~rbung anf/~ngt, eine geringere zu werden. Nach einiger Zeit aber zeigte sich auch in dieser Milch Fi~rbung, welche auf Zusatz yon 0,60 ccm ~.-Schwcfelsfiure in Griin umschlug. DEe Alkalit~it der 10 ccm Milch entsprach also 0,61 ,4-0,05 ~ 0,66 ccm ~.-Schwefelsaure oder der Alkalitiitsgrad war 6,6, also an- n~ihernd so hoch als der yon gekochter Milch. Das Kochen sowohl als der Quecksilber- chlorid-Zusatz scheint also dieselbe Wirkung verursacht, niimlich einen Tell der Alkalit~it und zwar d e n s e 1 b e n Tell neutralisiert oder vernichtet zu haben. Da das Quecksilber- chlorid mit Eiweil~stoffen Verbindungen eingeht/wKre es nieht ausgeschlossen, dal~ auch (lurch Einwirkung des Quecksilberchlorids auf die neutrale Kalkcaseinverbindung die mSgliche alkalische Reaktion dieses Stoffes aufgehoben und dadurch die Farbstoffbildung unmSglich gemacht wurde. Von welchen Salzen, organischen oder anorganischen, die iibrigbleibende Alkalitat herriihrt, 1Kfgt sich nicht ohne weiteres sagen. Ebenso wie bei der freiwilligen Gerinnung oder durch Sauren dem KKsestoff der Kalk entzogen wird, konnte dureh Kochen oder durch Quecksilberchlorid-Zusatz ein ahnlicher Vorgang start- linden, nur mit dem Unterschiede, dal~ dan freie Casein nicht wie bei der freiwilligen Ge- rinnung als geschlossene Masse oder wie beim Zusatz von S~iuren als flockiges Gerinnsel abgeschieden wird, sondern durch die eine oder andere Ursache in kolloidalem Zustande oder scheinbarer LSsung bleibt. Da das reine Casein sich wee eine S~ure verh~ilt, kSnnte es leicht die alkalische Reaktion der Milch herabsetzen. Die Tatsache, dug leicht sauere Milch eher beim Kochen gerinnt als frische, scheint fiir diese Annahme zu spreehen, welter die Versuche, welche wir mit Molken aunfiihrten.

Zu 10 ccm frischen Molken mit einem durchschnittliehen Si~uregrad yon 13,1 (naeh T h S r n e r ) wurden 2 cem den R o t h e n f u g e r ' s c h e u l~eagens und 10 Tropfen der Wasserstoffsuperoxyd-LSsung gesetzt. Die sofort entstehende intensive Violettfiir- bung verschwand auf Zusatz yon 0,44 cem :N.-Schwefels~iure. Der Alkalit~itsgrad der dutch Labgerinnung gewonnenen Molken betrug also 4,9. Die frischen Molken be- sal~ also einen niedrigeren Alkalit~tsgrad als frische Vollmilch. Man soltte demnach meinen, dal~ der Bruch gleichfalls Fiirbung hervorrufen miii~te und dies war nun ge- rude in sehr geringem Mal~e der Fall. Setzte man n~mlieh zu 5 g gewaschenem Bruch 20 ccm Wasser, 2 ecm des Rothenful i ler ' schen Reagens und 10 Tropfen Wasserstoff- superoxydl5sung, dann entstand erst nach einiger Zeit eine i~ui~erst schwache Violettffir- bung, die haupts~.chlich an den in der Flfissigkeit schwebenden Bruchteilchen haftete. Schon durch 0~03 cem I/1o N.-Schwefels~ure schlug die violette Farbe in Blau um und dieser btaue Farbenton blieb sogar nach sehr groSem S~iurezusatz bestehen. Der Alkalitiitsgrad ffir 100 g Brueh wiirde demnach sein 20 X (0,03 -~- 0,05) ~ 1,60. G e k o c h t e Mot~ken (10 ccm) gaben mit dem R o t h e n f u l ~ e r ' s c h e n Reagens (2 ccm) und 10 Tropfen WasserstoffsuperoxydlSsung sofort eine Violettf/irbung, allerdings eine schwache, die aber immer intensiver wurde und auf Zusatz von 0,21 ccm ~q.-Schwefel- si~ure in Grfin umschlug. Der Alkaliti£tsgrad der gekoehten Molken betrug also 10 (0,21. -~- 0,05) = 2,6. ttierbei machten wir die Beobachtung, da~ das Steigen des S/~uregrades verbunden ist mit einem Sinken des Alkalit~tsgrades, denn dleselben

[Fortsetzu~g S. 393.]

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21. Band. ] 1. April 1911./ K. Beck und P. Lehmann , St~rkesirup-Bestimmung. 393

[Fortsetzung yon S. 391.] Molken, die bei einem S£uregrade yon durchschnittlich 13,1 einen Alkalit£tsgrad yon 4,9 aufwiesen, zeigten bei einem S£uregrade von 20,0 nur einen Alkalit~itsgrad yon 4,5.

Der besseren ~bersieht halber sind die einzelnen Versuchsergebnisse in einer Tabelle (S. 392) zusammengestellt.

Die Versuche haben es wahrscheinlich gemacht, d a ~ w i r e s b e i d e r P e r o - x y d a s e n i c h t m i t e i n e m F e r m e n t zu t u n h a b e n , s o n d e r n dal~ es l e d i g l i c h d ie a l k a l i s c h r e a g i e r e n d e n S t o f f e in d e r M i l c h s i n d , d ie m i t d e m R o t h e n f u _ ~ e r ' s c h e n Reagens d i e b e k a n n t e F a r b e n e r s c h e i n u n g he rvo r r u f en. Sobald diese alkalische Reaktion durch besondere Einfliisse, wie Kochen, Si~urezusatz, freiwillige S£uerung, Quecksilberchlorid-Zusatz in geniigender Menge, aufgehoben wird, geht auch das VermSgen der ~ischen Milch, mit dem Reagens die F~rbung zustande za bringen, verloren; es li~t~t sich aber wieder her- stellen dutch Beseitigung der hemmenden Einflfisse, d. h. dutch Neutralisation der fiberschfissigen freien Siiure. Ob es die Caseinkalkverbindung oder die neutrMen Phosphate oder andere Stof~fe oder vielleicht mehrere zusammen sind, welche die alkalische Reaktion hervorrufen, l~il~t sich ohne weiteres nicht sagen. Der Umstand aber, dal~ nach dem Kochen und nach dem Quecksilberehlorid-Zusatz sowie nach Zusatz der amphoteren L5sung zu gekochter Milch ein Alkatit~tsrest bleibt, der stets anniihernd derselbe ist, macht es wahrscheinlieh, da~ jedenfalls mehrere Stoffe an der alkalischen Reaktion beteiligt sind.

Zum Schlusse sei noch bemerkt, da~ sich bier vielleicht ein Weg finden liege, um zu einem quantitativen Nachweis yon gekochter Milch in ungekochter zu gelangen. Dann w~ire es welter nicht ausgeschlossen, da~ man auf die Alkalit£tsbestimmung eine Methode griinden kSnnte znm Nachweise, wie hoch eine Milch erhitzt war. Vet- suche in dieser Richtung sind im Gange und werden auch solehe aul~er mit dem R o t h e n f u 1~ e r'schen mit anderen Reagenzien augestellt werden.

Au~erdem l£~t die Tatsache, den A l k a l i t a t s g r a d t ier M i l c h b e s t i m m e n zu k S n n e n , die MSglichkeit zu, gr56eren Einblick in die Zusammensetzung der mineralischen Bestandteile der Milch zu gewinnen und den Einflut~ verschiedener Fiitterung bezw. des Bodens auf die Mineralbestandteile festzustellen. Bislang konnte das noeh nieht erreicht werden, da man nut imstande war, eine etwaige Vermehrung oder Verminderung der Aschenbestandteile der Milch nachzuweisen, aber nicht die Form mit Sicherheit festzustellen, in welcher die einzelnen Mineralbestandteile in der Milch vorhanden sind.

Quantitative Bestimmungen yon St~irkesirup in Obsterzeugnissen.

Yon

K, Beck und P. Lehmann.

M i i t e i l u n g aus der Kgl. U n t e r s u c h u n g s a n s t a l t E r l angen .

[Eingegangen am 24. Januar 1910.]

l~ber die Untersuchung der Obsterzeugnisse (Marmeladen, Gelees, Fruchtsi~ffe und anderer Obstkonserven) sind in der Literatur eine grS~ere Anzahl yon Arbeiten erschienen, welche sich in erster Linie mit der quantitativen Bestimmung des zuge-