Embed Size (px)
Citation preview
www.neur-one.fr
[email protected] 1 20/06/2015
DES NEUROSCIENCES…7/7
L'HISTOIRE DU SYSTEME NERVEUX: DE LA PREHISTOIRE A NOS JOURS
Les phénomènes de bioélectricité étaient connus dès la plus haute Antiquité par les décharges produites par l'organe électriq ue de
certains poissons. Bien que les mécanismes à leur origine fussent inconnus, ces décharges électriques de plusieurs dizaines de volts ont été
décrites et utilisées comme thérapie dans la lutte contre la migraine ou la goutte (par Scribonius Largus, sous le règne de l 'empereur
Claude, 41-54 ap. JC). L'électrothérapie était née...
Au cours du XVIIIe siècle on tenta de découvrir l'origine de ces décharges électrique en disséquant l'organe électrique de to rpille.
En 1776, John Walsh parvint à rendre visible la décharge électrique de l 'organe électrique au moyen d'un flash lumineux. On peut dire qu'il
s'agit de la "naissance" de l'électrophysiologie...
A la fin du XVIIIe siècle Alessandro Volta et Luigi Galvani démontrent, avec des points de vue différents, que les phénomènes électriques ne sont pas restreints à l'organe électrique, mais de manières plus générales à l'activité des nerfs et des muscles. En 1791,
Galvani montra que les muscles de grenouille se contractent quand ils sont mis en contact avec un arc de métal. Il interpréte ra ce
phénomène, en analogie à l'organe électrique qui est un muscle modifié, comme la décharge dans le métal de l'énergie électriq ue contenue
dans le muscle. Volta, quant à lui, pensait que l'utilisation de deux métaux produisait une différence de potentiel, et que l'électricité était transférée aux cellules musculaires. Cette interprétation le conduit à construire la pile électrique par l'empilement de disq ue. A noter que
l'aspect de cette première pile ressemble beaucoup à la morphologie des colonnes de l'organe électrique...
Dans les années 1840, le physicien italien Carlo Matteucci avait montré que sur la surface d'un muscle coupé de travers un courant
existe entre la face coupée (l'intérieur de la cellule) et la surface non endommagée (milieu extracellulaire). Au milieu du XIXe siècle, Emil du Bois-Reymond mesura pour la première fois un courant d'action sur des muscles et des nerfs stimulés. En améliorant ses instruments de mesure,
il observa en effet une diminution temporaire du courant précédemment découvert (alors appelé "courant de blessure", c'est-à-dire le potentiel de
repos). Il nomma cette diminution "négative" de courant "négative Schwankung". Cependant l'origine de ce "courant de blessure" et de cette
"fluctuation négative" restait indéterminée. Ludimar Hermann, un élève de du Bois-Reymond développa en 1898 la théorie du "noyau conducteur" (Kernleitertheorie) selon laquelle les muscles et les fibres nerveuses seraient composés d'un noyau conducteur et d'une interface
isolante (comme une "enveloppe"). Une excitation produirait un courant d'action qui polariserait l'enveloppe isolante, et, par induction, activerait
les fibres voisines. L'oriqine locale de l'excitation serait une réaction chimique de type explosive dans le noyau: une altération brutale du
métabolisme (Alterationstheorie). Mais Julius Bernstein, un autre élève de du Bois-Reymond, montra en 1902 grâce à des mesure de dépendance à la température du potentiel de repos, que les phénomènes bioélectriques ne sont pas directement d'origine chimique. Ses expériences
indiquaient au contraire qu'il y avait dans les fibres un électrolyte préexistant responsable du potentiel de repos et de la "fluctuation négative". Il
profita pour aboutir à cette conclusion de deux avancées récentes:
Walther Nernst avait décrit le potentiel de diffusion entre deux solutions de concentration différente (1888/1889). Bernstein appliqua l'équation de Nernst au potentiel de repos qu'il mesurait.
Wilhelm Ostwald obtint presque simultanément (1890) un potentiel électrique de part et d'autre d'une membrane
artificielle semi-perméable aux ions.
Bernstein pensa que l'enveloppe isolante décrite par Hermann est en fait une membrane semi-perméable. Il supposa alors que le courant observé entre la surface tranchée des muscles et la surface intacte est due à la différence de concentration ionique des électrolytes
préexistants. L'intérieur des fibres est riche en phosphate de potassium (K2HP04), et la membrane perméable seulement au potassium. Il
reprit sa "théorie membranaire" en 1912 dans sa monographie "Elektrobiologie". Il fonda ainsi un nouveau paradigme pour la
compréhension de la bioélectricité qui resta inchangé pendant environ 40 ans, jusqu'à ce que l'amélioration des instruments d e mesure permette de mieux préciser les différents mécanismes de la bioélectricité. La neurophysiologie, et plus spécialement ce qui deviendra la
neurophysiologie cellulaire, étaient en train de naître...
LE 20EME SIECLE : ENTRE 1900 ET 1960 - L'EFFERVESCENCE - LA DECOUVERTE DES NEUROTRANSMETTEURS
Le prix Nobel a été mis en place en 1901 : Un est dédié aux recherches en physiologie et médecine. En 1906, il récompense 2 chercheurs de talents dans les avancées de la compréhension de la cellule nerveuse. Remontons en
amont de ces 2 récompensés : Au XIXème siècle existent 2 théories concurrentes : Une théorie qui considère que
le système nerveux est un immense réseau (les réticularistes); l’autre qui considère que les cellules sont individualisées (les histologistes).
La première théorie est appuyée par l’italien Camillo GOLGI (1843-1926). Grâce à une technique de son
invention, il colore avec du nitrate d’argent des coupes post mortem de neurones. Golgi mettra en évidence, au sein
de la cellule, une petite structure l’appareil réticulaire interne qui s’appellera plus tard appareil de golgi. La seconde théorie va être confirmée par l’espagnol Santiago Ramon y CAJAL (1852-1934). Il améliore la
technique de Golgi, et présente ses travaux en 1889 à un congrès de Berlin : De plus, c'est un excellent dessinateur;
Grâce à sa technique, il met en exergue une légère séparation entre les neurones, la synapse postulée plus tôt par
Sherrington.
www.neur-one.fr
[email protected] 2 20/06/2015
La même année de ce prix Nobel, 1906, le psychiatre allemand Alois Alzheimer présente son premier cas d’une
analyse post mortem d’une femme démente (ces travaux seront publiés en 1907). En 1909, l'histologiste autrichien Korbinian Brodmann publie son travail sur l'analyse histologique de l’encéphale
d’un macaque (un singe). Ce travail met en évidence une différence dans l’organisation des cellules, des dendrites
dans la profondeur du cortex. Il en définit 6 couches de ce cortex (qui signifie couche, une couche épaisse de 2 à 4
millimètres) ; Les zones délimitées sont ainsi appelées Aires de Brodmann, elles sont au nombre de 52 initialement (48 maintenant).
Dès les années 1906, l’anglais Henry Dale met en évidence une modification de réponses sur les nerfs
sympathiques à travers un extrait de l'ergot de seigle. En 1910, il récidive en étudiant les effets de l'histamine
(effets sur le cœur) En 1926, le physiologiste allemand Otto Loewi va mettre en évidence, à la suite d’un rêve, le premier
neurotransmetteur sur une grenouille: Il isole deux cœurs de grenouille et enregistre la fréquence des battements de
celles-ci. Il recueille la substance du cœur de chacune des grenouilles. Il baigne le cœur d’une grenouille avec la
substance de l'autre, et découvre que le cœur ralentit, mettant en évidence une substance chimique qu’il appelle à l'époque substance vagale qui sera ensuite rebaptisée l'Acétylcholine
En 1932, les américains Joseph Erlanger et Herbert Gasser vont mettre en évidence que la vitesse de conduction
des courants électriques est différente selon les fibres.
1937: James Papez va proposer la construction du système limbique en étendant les idées de Paul Broca. En 1952, deux médecins français, Jean Delay et Pierre Deniker vont administrer un puissant médicament
anesthésique mis en évidence par leur confrère Henri Laborit (et créé par des chimistes de Rhône-Poulenc), qui
sera ensuite dénommé neuroleptique Le Largactil (nom chimique : chlorpromazine ).
1952: Alan Hodgkin et Andrew Huxley de l'Université de Cambridge vont mettre en place en s’appuyant sur une nouvelle méthode, la méthode du voltage imposé (voltage clamp) développée par Kenneth Cole en 1940, tout un
ensemble de compréhension sur le potentiel d’action (canaux ioniques) et les courants ioniques du Sodium (Na+)
et Potassium (K+). (A ce jour, en combinant avec la génétique, plus de 100 gènes de canaux ioniques sont connus).
En 1953 (la même année que la découverte de la double hélice de l’ADN), Nathaniel Kleitman et Eugene Aserinsky publient un travail dans Science mettant en évidence durant le sommeil des mouvements rapides
oculaires (rapid-eye movement, REM) et que ces mouvements sont liés à la phase du rêve (par électrophysiologie).
LA NEUROPHYSIOLOGIE
http://www.bordeaux-neurocampus.fr/fr/divers/com-archives/jm-israel-electrophy-pour-les-nuls.html
La neurophysiologie est l'étude du fonctionnement du système nerveux. L'information en provenance des récepteurs
périphériques qui nous renseignent sur l'environnement est analysée par le cerveau pour donner naissance aux perceptions, certaines d'entre
elles pouvant être stockées en mémoire. Compte tenu de ces informations, le cerveau est en mesure de commander la contraction coordonnée de muscles (effecteurs), la sécrétion de glandes et d'une manière beaucoup plus générale de contrôler nos comportements.
Exemple de l’arc réflexe et de l’activité électrique des cellules excitables impliquées.
Or, la transmission des signaux nerveux le long d'un réseau -d'un récepteur à un effecteur- est à la base de l'activité fonctionnelle
du système nerveux. Elle repose sur les propriétés d'excitabilité, de conduction et de transmission du signal généré par chaq ue cellule nerveuse ou neurone, unité structurale et fonctionnelle du système nerveux. La neurophysiologie cellulaire est donc l'étude du
fonctionnement du neurone. Comme l'activité du neurone s'exprime par des signaux électriques (ioniques), la méthode d'investi gation
repose sur l'utilisation des techniques électrophysiologiques. Par extension, la neurophysiologie cellulaire est aussi l'étude de toutes les
cellules dites "excitables" (cardiaques, musculaires, glandulaires...).
www.neur-one.fr
[email protected] 3 20/06/2015
L'outil électrophysiologique appliqué à la neurophysiologie
A - Microélectrophysiologie intracellulaire, PA et courants ioniques; B - Représentation schématique d'un neurone et de ses nombreuses afférences synaptiques, patch clamp, courants ioniques et courants unitaires
GRANDES ETAPES DE L'HISTOIRE DE LA NEUROPHYSIOLOGIE
Moitié du XIXeme siècle: naissance de l'électrophysiologie
1848, DU BOIS REYMOND, première mesure, à l'aide d'un galvanomètre à cadre mobile, d'un "courant de repos"
(0.03V !) entre la surface Intacte d'un nerf et sa section; il constate une diminution de ce courant lors de l'excitation
du nerf: "la variation négative du courant de repos est le courant d'action ou l'influx nerveux"
1850, HELMHOTZ, étudie la conducton de l'influx nerveux 1871, BERNSTEIN, le premier à déterminer la forme de l'onde électrique qui se propage le long du nerf: pour lui:
le "potentiel d'action" annule transitoirement le "potentiel de repos"
Début du XXeme siècle, mesures « électrophysiologiques »
Avec le développement de l'utilisation de l'électricité et de l'électronique (éprouvée par les militaires pendant chaque guerre mondiale),
naissance des techniques de mesures électrophysiologiques (sur tronc nerveux, faisceau d'axones, puis axone Isolé)
1922-1937, ERLANGER et GASSER utilisent l'oscillographe cathodique et l'amplificateur à triodes pour l'étude
des caractéristiques du PA et de sa vitesse de conduction le long d'un tronc nerveux 1941, TASAKI et TAKEUCHI, puis, 1949, HUXLEY et STAMPFLI mettent en évidence la conduction saltatoire
dans des axones myélinisés
1945, HODGKIN et HUXLEY utilisent l'oscilloscope, un amplificateur à impédance d'entrée élevée (DC
amplifier) et à bas gain (bas bruit de fond) relié à une électrode métallique insérée dans l'axone géant de calmar pour la première fois effectuer la mesure directe du PR et PA: le potentiel de pointe n'annule pas le potentiel de
repos mais l'inverse transitoirement: c'est l'overshoot
1949, avec la mise sur le marché de l'amplificateur opérationnel, naissance de la méthode de voltage Imposé:
HODGKIN, HUXLEY et KATZ: Théorie Ionique de l'excitation construite à partir des résultats en voltage imposé obtenus sur l'axone géant de calmar empalé par une électrode métallique...
HODGKIN et STAMFLI: voltage imposé sur le nœud de Ranvier par la méthode du sucrose-gap.
1949, naissance de la microélectrophysiologie cellulaire
1949, LING et GERARD, mise au point de la micropipette de verre remplie d'électrolyte pouvant être insérée sans lésion dans une cellule (de grande taille)
1950-1980: grand essor de la microélectrophysiologie intra cellulaire à associer aux perfectionnements des appareils électroniques
(amplificateurs de voltage et stimulateur à injection de courant à transistors, amplificateur opérationnel et développement de la méthode de
voltage imposé): NASTUK et HODGKIN, Fibre musculaire de grenouille
KATZ, MILEDI, DEL CASTILLO, KUFFLER, TAKEUCHI, jonction neuromusculaire
BROCK, ALBE-FESSARD, BUSER, ECCLES, motoneurones, neurones du cerveau ADRIAN, CHANDLER,
fibre musculaires, voltage imposé par micro électrodes HAGIWARA, neurones et fibres musculaires d'invertébrés (courants calciques)
NOBLE, TRAUTWEIN, fibres musculaires cardiaques
1981, naissance de l'électrophysiologie moléculaire avec la méthode du patch clamp
1976, HAMILL, NEHER, MARTY, SACKMANN et SIGWORTH 1981, NEHER, SACKMANN plusieurs configurations possibles de patch clamp:
whole cell clamp, voltage imposé par une seule pipette extracellulaire sur petite cellule;
www.neur-one.fr
[email protected] 4 20/06/2015
cell attached ou membrane excisée pour l'étude de courants unitaires.
Pour résumer, on peut diviser en 3 périodes l'histoire de la neurophysiologie liée à celle de l'étude des signaux nerveux : 1) de la fin du 19ème siècle à 1950, après la bioélectricité, c'est la période de l'electrophysiologie et la
neurophysiologie que l'on peut qualifier de macroscopique dans la mesure où elle ne s'intéresse à recueillir par des
électrodes externes, pour l'interpréter, que l'activité électrique globale de différentes structures nerveuses,
(cérébrales: électroencéphalogramme/EEG, électrocorticogramme/ECG; de nerfs périphériques; on parle parfois d'électroneurogramme). Les enseignements de cette électrophysiologie mettent en évidence le fait que les neurones
sont capables de produire de l'énergie électrique (c'est à dire qu'ils sont le siège d'une électrogénèse importante) à
l'origine de leurs propriétés d'excitabilité;
2) de 1950 à 1980, c'est la période de la microelectrophysiologie cellulaire. Le développement de l'utilisation de la microélectrode intracellulaire (Ling et Guerard, 1949) implantée dans un neurone (ou dans un autre type de
cellule) et connectée à des amplificateurs de tension (puis de courant) de plus en plus perfectionnés permet le
recueil de signaux électriques émis par ce neurone. Ces signaux sont décrits comme des potentiels d'action (PA),
des potentiels post-synaptiques excitateurs (PPSE) ou inhibiteurs (PPSI) ou des potentiels de récepteur (PR). Dès le début des années 50, on invoque des changements de perméabilité de la membrane plasmique pour expliquer
l'électrogénèse transmembranaire à l'origine de ces signaux électriques neuronaux: c'est l'enregistrement des
courants transmembranaires (d'une cellule"entière"), par la technique du voltage imposé ou voltage clamp. Ainsi
s'élabora "la théorie ionique de l'excitation" (Hodgkin et Huxley, 1952); 3) de 1980 à nos jours, c'est la période d'investigation de l'électrogénèse membranaire par la technique
electrophysiologique de patch clamp. Elle permet d'évoquer l'implication de protéines enchâssées dans l'épaisseur
de la membrane cytoplasmique et formant des canaux ioniques pouvant être tour à tour ouverts ou fermés selon les
conditions physico-chimiques de part et d'autre de la membrane cytoplasmique. Grâce aux travaux de Neher et Sackmann (1981), l'étude des canaux ioniques par la technique de patch clamp s'est considérablement développée
pour permettre l'enregistrement de l'activité électrique d'un petit nombre de canaux d'une cellule "entière" même de
petite taille, voire d'un seul canal (activité électrique unitaire) d'un fragment de membrane (patch).
En 1939: K. C. Cole et H. J. Curtis effectuent des travaux de recherche en électrophysiologie sur l'axone de calamar. Dans les
années 1950: Alan L. Hodgkin et Andrew Huxley utilisent une technique électrophysiologique qu'ils ont mise au point, la techn ique de
potentiel imposé (voltage clamp en anglais), sur l'axone géant de calmar, et postulent la théorie ionique de l'excitation: l'existence de deux
conductances ioniques membranaires indépendantes et activées par le potentiel de membrane, une conductance sélective des ions sodium, et l'autre des ions potassium. Ils peuvent ainsi modéliser ces deux conductances (que l'on a par la suite identifiées à des canaux ioniques) et
prédirent toutes les propriétés des potentiels d'action enregistrés. Ces résultats se sont révélés applicables à l'ensemble d es neurones, et ont
valu à ces deux chercheurs le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1963, partagé avec John Carew Eccles. Durant toute cette période,
la neurophysiologie cellulaire a considérablement progressé, grâce aussi au développement des techniques de la microélectrophysiologie intracellulaire: la première microélectrode de verre susceptible d'être insérée dans une cellule (neurone) pour en étudier son activité
électrique a été présentée par Ling et Gérard en 1949.
La plupart de nos connaissances sur les propriétés électrophysiologiques des canaux ioniques proviennent d'expériences réalis ées
en voltage imposé. Cette technique a été introduite pour la première fois par Cole et ses collègues et reprise ensuite par Hodgkin et Huxley, en 1952. Depuis plusieurs variantes ont été utilisées.
En 1950, on avait en effet de bonnes raisons de penser que les potentiels d'action naissaient d'une augmentation transitoire de la
perméabilité sodique suivie d'une augmentation, elle aussi transitoire, de la perméabilité potassique.
Ces changements semblaient dus à la dépolarisation de la membrane. En effet, La façon la plus simple pour faire naître un potentiel d'action était de dépolariser la membrane d'une cellule excitable; le stimulus parfaitement quantifiable susceptible de dépolariser la membrane a
été le courant électrique. En faisant passer des impulsions rectangulaires de courant, de durée et d'intensité variable, au travers de la membrane,
on était capable d'évoquer:
Des réponses électriques passives (potentiels électrotoniques) de la membrane, pour des courants entrants de quelque intensité que ce soit et pour des courants sortants infraliminaires;
Des PA (réponses actives membranaires) pour des courants sortants liminaires et supraliminaires.
La technique électrophysiologique de courant imposé (current clamp) était née. Dès 1949, l'invention de la
microélectrode de verre fut à l'origine de l'essor de la microélectrophysiologie intracellulaire.
Toutefois, en l'absence d'une méthode permettant de maintenir constant le potentiel de membrane, on ne pouvait déterminer l'e ffet
exact de la dépolarisation sur les perméabilités ioniques. En d'autres termes, l'hypothèse cruciale était que la perméabilité au Na + était
régulée par le potentiel de membrane. Si la façon théoriquement la plus simple de tester cette hypothèse était de dépolariser la membrane
cellulaire à différents niveaux et de mesurer la perméabilité au Na+ correspondante, le problème était cependant que dès même une faible dépolarisation de la membrane cellulaire, la perméabilité au sodium changeait et un PA était irrémédiablement déclenché ("loi du tout-ou-
rien"). Pour des raisons pratiques, on ne disposait pas assez de temps pour mesurer le changement de perméabilité. C'était un obstacle
majeur pour poursuivre plus avant l'analyse des mécanismes ioniques qui gouvernent le développement du potentiel d'acti on. C'est là qu'Alan Hodgkin et Andrew Huxley développèrent la technique du voltage imposé fondé sur des travaux plus anciens accomplis pa r
Kenneth Cole et George Marmont.
Principe de la technique de voltage imposé
Il consiste à maintenir le potentiel de membrane à une valeur constante, choisie par l'expérimentateur. Le voltage ne peut plus alors changer librement avec le temps et suivant la région de la membrane, comme lors d'un enregistrement de potentiel. Avec cette technique, on
mesure des courants souvent appelés macroscopiques ou globaux qui représentent la somme des courants unitaires traversant plusieurs centaines
de canaux. A la base de cette technique, il y a la découverte d'un composant électronique, l'amplificateur opérationnel ou "feed-back amplifier",
dès le début des années 40, et son application à l'électrophysiologie, à la fin des années 40... Pour éviter que des courants locaux ne se produisent et faussent les valeurs du courant mesuré, il est important que la valeur du
potentiel de membrane soit uniforme et contrôlée sur toute la surface membranaire. Cette uniformité spatiale du potentiel dans le cas de l'axone
www.neur-one.fr
[email protected] 5 20/06/2015
géant de calmar est assurée par une électrode axiale très conductrice insérée à l'intérieur de l'axone (figure). Dans le cas des cellules nerveuses, si
leur diamètre le permet, 2 microélectrodes sont insérées dans le corps cellulaire (figure). Des variantes de ces techniques ont été mises au point pour dériver les courants d'un nœud de Ranvier (sucrose-gap, figure) ou dans des portions de membrane de fibres musculaires (voltage clamp par
3 microélectrodes intracellulaires).
A) Allure générale d'un PA recueilli par enregistrement intracellulaire (figure de gauche)
Une électrode intracellulaire est placée dans l'axone géant de calmar. La valeur du potentiel de repos est -50 mV. L'axone est stimulé au temps t = 0 (artefact de stimulation) avec une seconde électrode placée loin de la première. L'amplitude du PA est 85 mV. La phase de repolarisation se prolonge par une hyperpolarisation durant environ 3 ms. B) Changements d'amplitude du PA en fonction de la concentration extracellulaire de Na+ appauvrie à 70%, 50% puis 33% de sa valeur normale. C) Représentation graphique de l'amplitude du pic du PA en fonction de la concentration extracellulaire de Na+. La ligne droite est représentative de l'équation de Nernst pour une valeur intracellulaire de Na de 17 mV.
Potentiels électrotoniques et potentiels d'action (PA) enregistrés dans les conditions de courant imposé par microélectrodes intracellulaires (schéma de droite)
Dispositif expérimental utilisé pour réaliser des expériences de voltage imposé dans l'axone géant de calmar.
Deux électrodes axiales sont insérées dans le corps de l'axone; (pour la légende, voir texte).
Dispositif expérimental utilisé pour les expériences de voltage imposé dans un neurone ou une cellule sphérique de grand diamètre.
Deux microélectrodes intracellulaires sont insérées dans le soma; (pour la légende, voir texte). Le dispositif expérimental adopté pour les fibres musculaires (courtes, de préférence) est dérivé de celui-ci et comprend 3 microélectrodes insérées le plus proche possible l'une de l’autre, la microélectrode de mesure du courant étant à égale distance des 2 microélectrodes de "voltage".
www.neur-one.fr
[email protected] 6 20/06/2015
Dispositif expérimental utilisé pour réaliser des expériences de voltage imposé dans l'axone myélinisé.
Le nœud de Ranvier est disposé entre les 2 ponts de sucrose et l'extrémité gauche de la fibre est immergée dans une solution physiologique intracellulaire (KCI140 mM ); (pour la légende, voir texte).
Beaucoup de cellules n'ont pas une taille suffisante pour que deux microélectrodes soient introduites à l'intérieur du corps
cellulaire. On peut réaliser des expériences de voltage imposé avec une seule microélectrode. Le voltage imposé à une seule microélectrode implique un système électronique qui oscille rapidement d'un mode d'enregistrement en voltage à un mode d'enregistrement en courant (3-
20 kHz), et un amplificateur de courant qui contrôle le taux de courant délivré. Les résultats obtenus sont moins précis que ceux obtenus
avec 2 électrodes.
Principe de la technique de patch clamp dans la configuration cellule entière et dans les conditions de voltage imposé
La technique de patch clamp dans la configuration cellule entière (figure) est souvent considérée comme une variante de la
technique de voltage imposé à une électrode. Mais il existe une différence majeure entre les deux techniques: le volta ge n'est jamais
mesuré en mode voltage imposé dans le cas du patch clamp, mais calculé.
Dispositif expérimental utilisé pour réaliser des expériences de voltage imposé en patch clamp.
Configuration cellule entière (whole cell clamp); (pour la légende, voir texte). Dans tous les cas, le montage expérimental de base consiste à disposer (réellement ou virtuellement) 2 électrodes intracellulaires. L'une mesure le potentiel de membrane (Em). L'autre permet d'imposer un potentiel (Vréf) dont la valeur est choisie par l'expérimentateur. Un amplificateur (amplificateur opérationnel ou feed-back amplifier, FBA) détecte la moindre différence entre le voltage recueilli (Em) et le voltage de référence (Vréf) et convertit instantanément cette différence en un courant dont l'intensité lui est directement proportionnelle. Ce courant est réinjecté au travers de la membrane par l'électrode de référence, ce qui permet le maintien de son potentiel à la valeur choisie. Enregistré sur son trajet, ce courant est l'image du courant total qui traverse la membrane et né de la différence à chaque instant entre Em - Vréf.
L'expérience de voltage imposée standard (figures suivantes) consiste à porter le potentiel de membrane d'une valeur de
maintien proche du potentiel de repos de la cellule (-60 mV par exemple) à une valeur moins négative (-50 mV par exemple), pendant quelques millisecondes ou plus. Si le potentiel de la membrane (Vm) de la cellule est égal au potentiel de commande Vréf (hol ding
potential), il ne passe alors aucun courant par l'amplificateur opérationnel, indiquant que le courant de membrane Im est nul. Lorsque le
potentiel imposé est soudainement porté à une valeur moins négative que celle du holding potential, dans un premier temps, l' amplificateur
délivre des charges positives qui vont momentanément charger la capacité de membrane et porté ainsi Em = Vréf = -50 mV. Ces charges positives, portées essentiellement par les ions K+, vont ensuite traverser la membrane par les canaux ouverts au potentiel de repos et un
courant sortant stable va s'établir tout le temps que Em sera égal à Vréf. Par convention, les courants sortants de charges positi ves sont
positifs et dirigés vers le haut par rapport au niveau de contrôle, et les courants entrants de charges positives sont négatifs et dirigés vers le
bas. Ce courant stable est souvent appelé courant de fuite (If). Le courant mesuré Im est donc égal à la somme de 2 courants, le courant capacitif le et le courant de fuite If:
Lorsque la capacité de membrane Cm est chargée à sa nouvelle valeur de potentiel, Ic est nul et le courant mesuré Im est égal au
courant If traversant les canaux ioniques ouverts à cette nouvelle valeur de potentiel.
Si le potentiel de référence est porté à une nouvelle valeur plus importante (0 mV), les canaux sensibles au potentiel vont s'ouvrir.
Supposons que l'axone ou la cellule baigne dans un milieu ionique et pharmacologique tel que seuls les canaux Na + puissent
s'ouvrir. Lors d'un tel saut de potentiel, les ions Na+ vont traverser la membrane et entrer dans la cellule. Ainsi lorsque le courant entrant
est porté par les ions Na+, des charges positives sont immédiatement enlevées de la cellule par le système de contrôle de façon à garder le
potentiel de membrane constant. Si l'amplificateur opérationnel est correct, cet ajustement se fait en quelques microsecondes et se maintient tout le temps que les ions Na+ entrent dans la cellule. Le courant mesuré Im représente alors la somme de 2 courants (lorsque Ic
est nul), le courant de fuite If et le courant Na+, INa, entrant.
Les courants non spécifiques étant identifiés ils peuvent être corrigés; la détermination des courants ioniques spécifiques d evient
alors accessible: l'outil pharmacologique permet l'identification des courants spécifiques, sodiques, potassiques, calciques etc...(figure). A partir de chacune des familles de tracés de courants spécifiques, l'intensité maximum du courant pour chacun des niveaux de dépolarisation
est mesurée et reportée pour établir la courbe I-V (figure).
www.neur-one.fr
[email protected] 7 20/06/2015
Placé dans la configuration "CELLULE ENTIERE" du "PATCH CLAM P" et en VOLTAGE IMPOSE, un neurone dépolarisé par des sauts de potentiel successifs évoque des courants ioniques transmembranaires visualisés par l'intermédiaire de l'amplificateur de "Patch" comme des variations du courant recueilli par la pipette. En règle générale ce courant dit "macroscopique" se compose d'un courant initial, précoce et entrant suivi courant qui se stabilise tardivement et qui est sortant. L'utilisation de drogues bloquant sélectivement le courant "sodium" voltage-sensible, comme la térodotoxine (TTX), ou le courant "potassium voltage- sensible", comme le tétra-éthylammonium (TEA) ou la 4- aminopyridine (4-AP), permet d'identifier le courant entrant précoce comme un courant sodique voltage sensible et le courant sortant tardif comme un courant potassium voltage-sensible.
Protocole expérimental d'une expérience de voltage imposé réalisée sur l'axone géant de calmar.
1- Lorsque le potentiel de référence (Vréf) fixé par l'expérimentateur est égal au potentiel de repos de la cellule (Vm), aucun courant ne traverse la membrane; 2- Lorsque Vréf est fixé à une valeur légèrement plus positive que Vm, un courant sortant (Im) s’établit. Ce courant est égal à la somme de deux courants, le courant capacitif Ic et le courant dit de fuite If. 3- Si Vréf est fixé à une valeur suffisamment positive, les canaux Na+ sensibles au voltage sont susceptibles de s’ouvrir. On enregistre alors un courant entrant qui se superpose à If et Ic.
www.neur-one.fr
[email protected] 8 20/06/2015
Courants macroscopiques (voltage imposé) en correspondance des niveaux de potentiel de membrane (courant imposé) lors d'un PA du
nœud de Ranvier d'axone myélinisé de grenouille (Bergman, Thèse de Doctorat d'Etat, Université d'Orsay, 1971).
Identification des courants sodiques et potassiques du nœud de Ranvier (séparation pharmacologique des courants ioniques
spécifiques). Un nœud de Ranvier placé dans les conditions de voltage imposé (potentiel de maintien -95 mV) est hyperpolarisé durant 40 ms jusqu'à -120 mV puis dépolarisé à différents niveaux de potentiels entre -60 et +60 mV, en 15 sauts (Les courants de fuite et de capacité ont été soustraits par l'ordinateur. A) Courants macroscopiques évoqués dans une solution de Ringer ordinaire. B) Courants évoqués dans le même nœud de Ranvier qu'en A) mais après addition de 300 nM TTX (d'après Hille, 1966). C) Mesures de contrôle dans un autre nœud de Ranvier. D) Courants évoqués dans le même nœud de Ranvier qu'en C) mais après addition de 6 mM TEA (d'après Hille, 1967). A partir de la courbe I-V pour chacun des courants spécifiques, il devient possible de déterminer l'évolution des conductances membranaires en fonction du potentiel, et du temps; pour le sodium et le potassium, on a:
Courants macroscopiques (A), courants spécifiques (B) et courbes I-V (C).
www.neur-one.fr
[email protected] 9 20/06/2015
De 1976 à 1981 (et au-delà): Erwin Neher et Bert Sakmann (en collaboration avec Hamill, Marty et Sigworth) mettent au point la
technique de patch-clamp, pour laquelle ils reçoivent le prix Nobel de chimie en 1992.
Cette technique repose sur l'utilisation de microélectrode de verre de forme et de caractéristiques électriques particulières (que
l'on appelle plutôt "micropipette") et qui ne sont plus insérées dans la cellule, mais dont la pointe est appliquée "hermétiq uement" sur la
face externe de la membrane plasmique. Avec Neher et Sackmann, les bases de la neurobiologie moléculaire sont jetées...
La technique de patch clamp a connu des variantes; elle reste actuellement une technique d'investigation de la conductance de chaque "protéine-canal membranaire" largement utilisée.
http://www.leica-microsystems.com/science-lab/the-patch-clamp-technique/
General principle
The patch-clamp technique allows the investigation of a small set or even single ion channels. It is thus of special interest in the research of excitable cells such as neurons, cardiomyocytes and muscle fibers.
A single ion channel conducts around 10 million ions per second. Yet the current is only a few picoamperes. Recording currents
in this order of magnitude is quite challenging not only for the researcher, but also for the equipment. In principle, thin g lass or quartz
pipettes with a blunt end are sealed onto the membrane.
Suction is applied to aid the development of a high-resistance seal in the gigaohm range. This tight seal isolates the membrane
patch electrically, which means that all ions fluxing the membrane patch flow into the pipette and are recorded by a chlorided silver
electrode connected to a highly sensitive electronic amplifier. A bath electrode is used to set the zero level.
To prevent alterations in the membrane potential, a compensating current that resembles the current that is flowing through the
membrane is generated by the amplifier as a negative feedback mechanism (Figure 1).
Fig. 1: General principle of patch-clamp recordings.
A glass pipette containing electrolyte solution is tightly sealed onto the cell membrane and thus isolates a membrane patch electrically. Currents fluxing through the channels in this patch hence flow into the pipette and can be recorded by an electrode that is connected to a highly sensitive differential amplifier. In the voltage-clamp configuration, a current is injected into the cell via a negative feedback loop to compensate changes in membrane potential. Recording this current allows conclusions about the membrane conductance.
The membrane potential of the cell is measured and compared to the command potential. If there are differences between the
command potential and the measurement, a current will be injected. This compensation current will be recorded and allows conc lusions about the membrane conductance. The membrane potential can be manipulated independently of ionic currents and this allows
investigation of the current-voltage relationships of membrane channels.
Configurations
Depending on the research interest, different configurations can be used. In the cell-attached mode the membrane patch is left
intact (Figure 3). A modification of the cell-attached mode is the loose-patch. In this case, the pipette is not tightly sealed to the membrane
but is only loosely attached to it. This mode is often used to record action potentials in neuronal cells. The advantage is that the composition of the cytoplasm is not influenced. On the other hand, however, the intracellular environment cannot be controlle d.
Applying pore-forming agents (usually antibiotics) via the patch pipette results in a perforated patch which guarantees ionic
continuity but assures that intracellular proteins are not washed out by the pipette solution. The most commonly used patch -clamp mode is
the whole-cell mode (Figure 3). To achieve this mode, the membrane patch is disrupted by briefly applying strong suction. The interior of
www.neur-one.fr
[email protected] 10 20/06/2015
the pipette becomes continuous with the cytoplasm. This method is used to record the electrical potentials and currents from the entire cell.
In whole-cell measurements the researcher can choose between two configurations: the voltage-clamp mode in which the voltage is kept constant and current is recorded, or the current-clamp mode in which the current is kept constant and changes in the membrane potential
can be observed.
Moreover, it is also possible to record currents only from a small patch instead of the whole cell. This raises the chances o f
recording single channels. The patch can be orientated in two different directions inside the patch pipette. To achieve the i nside-out configuration the patch pipette is attached to the cell membrane and is then retracted to break off a patch of membrane (Figu re 3). In this
case the cytosolic surface of the membrane is exposed. This is often used to investigate single channel activ ity with the advantage that the
medium that is exposed to the intracellular surface can be modified.
If the aim is to study the influence of extracellular cues such as neurotransmitters, the outside-out configuration (Figure 3) should be chosen. In this case the pipette is retracted during the w/?o/e-ce//configuration, causing a rupture and rearrangement of the membrane.
In this configuration the extracellular surface is exposed and thus extracellular cues can easily be applied.
Fig. 3: The four recording methods for patch-clamp:
Cell-attached: When the pipette is in closest proximity to the cell membrane, mild suction is applied to gain a tight seal between the pipette and the membrane. Whole-cell: By applying another brief but strong suction, the cell membrane is ruptured and the pipette gains access to the cytoplasm. Inside-out: In the cell-attached mode, the pipette is retracted and the patch is separated from the rest of the membrane and exposed to air. The cytosolic surface of the membrane is exposed. Outside-out In the whole-cell mode, the pipette is retracted resulting in two small pieces of membrane that reconnect and form a small vesicular structure with the cytosolic side facing the pipette solution. Source: Patch me if you can - What is the patch-Clamp Technique?, puzzledponderer.wordpress.com
Requirements
Patch-clamp experiments can either be performed on cultured cells, acutely dissociated cells or on acute vibratome slices, which
allows investigation of the cell's electrophysiological properties in their natural environment. The ion channel of interest can also be
isolated and expressed heterogeneously in a common cell line (e.g. HEK293, CHO, LNCaP).
Depending on the sample, either an inverted (cultured cells) or an upright fixed stage microscope (for slices) with a stable
platform is needed. If cells in acute slices are investigated, an infrared DIC is recommendable to visualize the membrane. The microscope
should be placed on an anti-vibration table because any movement could be fatal to the seal between the pipette and the membrane.
A micromanipulator is needed to move the pipette precisely. Very fine pipettes are formed by heating and pulling small glass or quartz capillary tubes. The diameter of the pipette tip is around 1 pm which encloses a membrane patch that contains only a few or even
just one ion channel. The tip of the pipette is heat-polished in a microforge to gain a high- resistance seal onto the membrane. The pipette
is filled with a solution that resembles either the extracellular solution or the cytoplasm, depending on the recording mode. The pipette is
mounted on a micromanipulator to permit precise movements towards the cell membrane.
For conductance of the current a chlorided silver wire is used. The bath electrode, which is also a chlorided silver wire, sets zero
current value. A differential amplifier with a low-noise transistor is connected to a computer for data acquisition and digitization. Specific
software can be purchased to control the amplifier and analyze the data. An oscilloscope can alternatively be used to monitor the currents.
If desired, a perfusion system can be added to the setup. Substances can either be applied via a perfusion pencil or by using a POC (perfusion open and closed) chamber.
www.neur-one.fr
[email protected] 11 20/06/2015
Applications
Patch-clamp experiments are used to approach a huge variety of physiological questions, not only in neuroscience.
During the last two decades patch-clamp recordings have also become more important for the investigation of ion channels in
non-excitable cells. It is also a very important method in medical research, since many diseases are related to a malfunction of definite ion
channels. In pharmacological research, automated patch-clamping is used to screen potent substances for ion channel modifications.
Patch-clamp recordings can also be combined with live-cell imaging approaches such as Ca2~ imaging. In this case a Ca2~-sensitive fluorescent dye is applied to the cell via the patch pipette. The membrane current and changes in fluorescence are recorded
simultaneously. Similar experiments can be performed with pH- or Cl -sensitive dyes.
VOIR http://www.neur-one.fr/patch.pdf
