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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
LESÃO NERVOSA PERIFÉRICA E ENVELHECIMENTO: EFEITOS DO TREINAMENTO EM ESTEIRA
Dissertação de Mestrado
Núbia Broetto Cunha
Porto Alegre
2010
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
LESÃO NERVOSA PERIFÉRICA E ENVELHECIMENTO: EFEITOS DO TREINAMENTO EM ESTEIRA
Núbia Broetto Cunha
Orientadora Profª. Drª. Matilde Achaval Elena
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Neurociências, da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.
Porto Alegre
2010
II
RESUMO
O treinamento em esteira tem sido utilizado como recurso terapêutico após a aplicação
de modelos de lesão nervosa periférica, sendo considerada uma intervenção eficaz para
a aceleração do processo de regeneração nervosa (ILHA et al., 2008; SABATIER et al.,
2008). Em contrapartida o processo de envelhecimento pode ser um fator capaz de
retardar a regeneração do nervo periférico após lesão (BOWE et al., 1987; POLA et al.,
2004). Nesse contexto, o presente estudo verificou os possíveis efeitos do treinamento
em esteira sobre a regeneração nervosa periférica após esmagamento do nervo ciático de
ratos jovens (3 meses de idade) e maduros (13 meses de idade), utilizando análises
funcional, eletrofisiológica e morfométrica. Os resultados demonstram que o
treinamento em esteira melhorou a função sensoriomotora e aumentou a amplitude do
potencial de ação do músculo gastrocnêmio nos animais jovens. A análise morfológica
mostrou um aumento da densidade de fibras mielínicas no grupo jovem submetido à
lesão, caracterizando uma reposta de poli-inervação, que foi reduzido após a aplicação
do treinamento em esteira. Essa redução pode sugerir uma melhora na funcionalidade
das unidades motoras após o exercício. No grupo maduro, o treinamento em esteira
promoveu melhora somente na função sensoriomotora, sendo que não houve diferenças
significativas nos parâmetros eletrofisiológicos e morfométricos. Futuros estudos são
necessários para investigar se um maior período de treinamento nos ratos maduros é
capaz de promover melhora nos parâmetros eletrofisiológicos e morfológicos, além da
investigação da influência da associação do treinamento em esteira em ratos maduros
com outros recursos terapêuticos como é encontrado na reabilitação de pacientes com
neuropatia periférica na prática clínica.
III
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS.....................................................................................IV
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................VI
LISTA DE TABELAS.................................................................................................VII
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................1
1.1 Lesão e regeneração nervosa periférica.................................................................2
1.2 Modelo animal.......................................................................................................8
1.3 Envelhecimento.....................................................................................................9
1.4 Exercício físico e neuropatias periféricas............................................................11
2 JUSTIFICATIVA...................................................................................................14
3 OBJETIVOS...........................................................................................................15
3.1 Objetivo geral......................................................................................................15
3.2 Objetivos específicos...........................................................................................15
4 MÉTODOS E RESULTADOS..............................................................................16
4.1 Artigo – Núbia Broetto Cunha, Jocemar Ilha, Lígia A. Centenaro, Gisele A.
Lovatel, Luciane F. Balbinot, Matilde Achaval. Effects of treadmill training on the
aging process after traumatic peripheral nerve lesion in rats………………………...16
5 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS....................................................................41
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................43
IV
LISTA DE ABREVIATURAS
BDNF........Fator neurotrófico derivado do encéfalo
GAP...........Proteína associada ao crescimento
LNP...........Lesão nervosa periférica
N-CAM.....Molécula neural de adesão celular
NGF...........Fator de crescimento neural
NPs............Nervos periféricos
SNC...........Sistema nervoso central
SNP...........Sistema nervoso periférico
TrKA.........Receptor tirosino-quinase A
TrKB.........Receptor tirosino-quinase B
TrKC.........Receptor tirosino-quinase C
ARTIGO
BDNF.....Brain-derived neurotrophic factor
ConM......Control mature
V
ConY.......Control Young
HLRWT...Horizontal ladder rung walking test
InM.........Injured mature
InY..........Injured Young
MET…...Maximal exercise test
NBT……Narrow beam test
PNL……Peripheral nerve lesion
TrM…...Trained mature
TrY……Trained young
VI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Processo de degeneração e regeneração no SNP...............................................4
Figura 2. Processo de degeneração walleriana no SNP.....................................................6
Figura 3. Representação esquemática da idade dos animais associada às modificações
ocasionadas no processo de envelhecimento...................................................................11
ARTIGO
Figure 1. Distribution of the needle electrodes during the electrophysiological
test………………………………………………………………………………………38
Figure 2. Comparison of the sensorimotor analysis determined by horizontal ladder rung
walking test and narrow beam test on the young and mature rats……………………...38
Figure 3. Analysis of treadmill training on the muscular evoked potential on the young
and mature rats………………………………………………………………………….39
VII
Figure 4. Digitalized images of transverse-semithin sections (1 µm) obtained from
regenerating sciatic nerves after 5 weeks of treadmill training………………………...39
Figure 5. Effects of treadmill training on the morphometrical parameters of regenerating
right sciatic nerve fibers………………………………………………..………………40
Figure 6. Effects of treadmill training on the morphometrical parameters of regenerating
right sciatic nerve……………………………………………………………………….40
VIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Tabela esquemática dos tipos e características da
neuroplasticidade...............................................................................................................8
1
1 INTRODUÇÃO
Os nervos periféricos são alvos frequentes de lesões traumáticas, tais como,
esmagamento, compressão, estiramento, avulsão e secção parcial ou total, que resultam
na interrupção da transmissão correta de impulsos nervosos e diminuição ou perda da
sensibilidade e motricidade no território inervado. Em pacientes, a recuperação
morfológica e funcional após uma lesão nervosa raramente é completa, apesar da
aplicação de técnicas modernas e sofisticadas de reconstrução. Esse fato deve-se a
inúmeros fatores que influenciam na regeneração da fibra nervosa, incluindo a natureza
e o nível da lesão, o tempo de desnervação, o tipo e diâmetro das fibras nervosas
afetadas, a idade do indivíduo e outras variáveis individuais (MONTE RASO et al.,
2005).
A plasticidade neuromuscular é a base do controle neural do movimento, pois
dentro da variação normal da função, o controle de movimento depende da resposta
contínua do sistema nervoso às informações que recebe a respeito do estado do
organismo e do meio ambiente. Entretanto, muitas vezes essa plasticidade é ampliada de
modo que a função neuromuscular possa adaptar-se a circunstâncias externas distintas,
como um treinamento muscular intensivo ou frente a uma lesão de nervo periférico
(LOWRIE, 2000).
Durante o processo de reinervação existe uma retração seletiva de ramos axonais
colaterais mal direcionados durante semanas subseqüentes a reinervação muscular
(LOWRIE, 2000). Logo, a ausência de atividade contrátil em fibras musculares
desnervadas pode estimular a persistência deste brotamento axonal colateral mal
direcionado. Assim, a atividade física pode, ao menos em parte, influenciar na retração
2
seletiva dos ramos axonais colaterais de maneira a regular a plasticidade neuromuscular
durante o período de reinervação (SON & THOMPSON, 1995).
1.1 Lesão e Regeneração Nervosa Periférica
Diversos tipos de lesões podem acometer o nervo periférico. Seddon (1943) as
classificou conforme o grau de lesão dos componentes neurais em: neuropraxia,
axonotmese e neurotmese.
Neuropraxia – é a forma mais branda de uma lesão nervosa, na qual existe um
bloqueio localizado na condução dos estímulos nervosos, que, no entanto, está
preservada nos segmentos proximal e distal a lesão. Nessa lesão, o axônio não perde sua
continuidade, portanto ocorre uma recuperação rápida e completa em poucas semanas.
Axonotmese – é uma lesão mais grave, na qual os danos são suficientes para
promover uma ruptura da continuidade axonal, provocando uma degeneração
walleriana. O prognóstico de recuperação funcional é bom, desde que seja mantida a
continuidade do tecido conjuntivo de suporte e a integridade das células de Schawnn e
da membrana basal.
Neurotmese – é o tipo mais grave de lesão nervosa periférica. Nela há uma
completa ruptura do nervo periférico e o prognóstico de recuperação não é favorável, a
menos que a continuidade do nervo seja restabelecida.
As desordens mais comuns dos nervos periféricos (NPs) são aquelas que
afetam primariamente o axônio, chamadas axonopatias. Estas são frequentemente
causadas por traumas agudos, sendo assim o esmagamento pode ser ocasionado por
3
compressão, contusões traumáticas, ou secção por artefatos penetrantes
(FREDERICKS, 1996).
Frequentemente os sinais e sintomas observados nos pacientes acometidos por
uma neuropatia periférica incluem dor lombar, dor ao longo do nervo ciático, distúrbios
sensoriais e fraqueza dos músculos do membro inferior inervados por ele
(KOBAYASHI; YOSHIZAWA; YAMADA, 2004).
Ao ocorrer uma lesão nervosa periférica (LNP), inicia-se uma série de reações
nos neurônios sensoriais e motores, principalmente no soma celular, no local da lesão e
distal a ela (Figura 1). O processo que ocorre no soma neuronal é chamado cromatólise
e tem inicio dentro das primeiras horas após a lesão. Sucede-se pela vacuolização do
citoplasma, aumento do volume nuclear, formação de múltiplos nucléolos e um
deslocamento do núcleo para uma posição excêntrica ou periférica, acompanhada pelo
edema do soma neuronal (REIER, 1995; KARTJE & SCHWAB, 2006). A característica
mais marcante da cromatólise é a dissolução dos grânulos de Nissl, além disso, há o
rompimento do aparelho de Golgi e do retículo endoplasmático rugoso, com um
concomitante aumento na densidade de poliribossomos livres no citoplasma (REIER,
1995).
O axônio desconectado do soma neuronal tem seu segmento distal
gradualmente degenerado, caracterizando a degeneração walleriana. Esta degeneração
serve para criar um microambiente favorável ao novo crescimento axonal
(RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ; NAVARRO, 2004) e é uma etapa essencial na
regeneração de axônios lesionados (ZHANG et al., 2000). O processo de regeneração é
facilitado por um ambiente favorável na periferia (STOLL & MULLER, 1999), porém
alguns fatores podem impedir o retorno normal da função, como a distância entre os
4
cotos do nervo (GORDON; SULAIMAN; BOYD, 2003), distúrbios metabólicos
(KENNEDY & ZOCHODNE, 2005), o tipo de lesão e a idade (RUITER et al., 2008).
Figura 1. Processo de degeneração e de regeneração no SNP. Após uma lesão axonal por
esmagamento, as células de Schwann sofrem divisão mitótica e preenchem o espaço
entre os cotos proximais e distais do nervo (1). Estas células fagocitam a mielina.
Gotículas de mielina são excretadas por estas células de Schwann e, em seguida,
fagocitadas pelos macrófagos (2). Ocorre cromatólise (3) e é observada a degeneração
dos segmentos distal e proximal do axônio. O coto proximal do axônio gera múltiplos
brotamentos que avançam por entre as células de Schwann, e estes brotamentos
persistem e crescem distalmente para reinervar o músculo (4). Uma vez o axônio
regenerado atinge o órgão-alvo, as células de Schawnn começam a produzir mielina (5)
(modificado de KIERSZENBAUM, 2008).
5
Logo após a desconexão dos segmentos proximal e distal, os mesmos se retraem,
o axoplasma extravasa e as membranas lesadas colapsam. A porção distal do axônio
degenera, a bainha de mielina se rompe e os fragmentos de mielina são fagocitados
pelas células de Schwann e por macrófagos hematógenos que se infiltram na local da
lesão e no segmento distal do axônio lesionado. As células de Schwann, desprovidas do
contato com os axônios, se desdiferenciam, proliferam e alinham-se na forma de um
cordão de células, chamado de coluna de células de Schwann ou bandas de Büngner
(Figura 2), dentro da lamina basal das fibras degeneradas (IDE, 1996; DAHLIN &
BRANDT, 2004). Essas são essenciais para a regeneração nervosa, uma vez que
provém um ambiente permissivo para o crescimento do axônio, sendo também fonte de
fatores neurotróficos (SON; TRACHTENBERG; THOMPSON, 1996; RADTKE et al.,
2005; KARTJE & SCHWAB, 2006).
Além disso, múltiplos brotos axonais surgem usualmente dos nodos de Ranvier
localizados nas proximidades do segmento proximal à lesão dentro de
aproximadamente 1 hora após a injúria nervosa (KARTJE & SCHWAB, 2006). Estes se
estendem através do espaço entre a lâmina basal e a membrana das células de Schwann
ou a bainha de mielina no segmento proximal, atravessam a estreita fenda de tecido
conjuntivo entre os cotos proximal e distal, e finalmente entram no segmento distal
(IDE, 1996).
Os axônios em regeneração no segmento distal crescem pela fixação da
membrana de seus cones de crescimento à superfície interna da lâmina basal e/ou sobre
a membrana plasmática das células de Schwann, mas não pelos fragmentos de mielina.
Isto indica que substâncias favoráveis à regeneração axonal podem ser expressas tanto
na superfície interna da lâmina basal quanto na membrana plasmática das células de
6
Schwann e, em contraste, a mielina é considerada como um repelente à fixação dos
axônios em regeneração no segmento distal à lesão (IDE, 1996; DAHLIN & BRANDT,
2004).
Figura 2. Processo de degeneração walleriana no SNP. Após uma lesão axonal, o corpo
neuronal inicia um processo chamado cromatólise, caracterizado pelo aumento de
volume (edema) e posição excêntrica do núcleo. Tão logo a lesão ocorra, o axônio e a
mielina localizados distalmente ao corpo neuronal degeneram. Células de Schwann
permissivas ao crescimento secretam fatores que estimulam os axônios a sobreviver e
regenerar (modificado de KARTJE & SCHWAB, 2006).
Os cones de crescimento axonal podem seletivamente exibir diferentes
moléculas de adesão em suas membranas. A fixação axônio–célula de Schwann é
mediado por várias moléculas, incluindo a molécula neural de adesão celular (N-CAM),
L1, N-caderina e E-caderina, enquanto o contato axônio–lâmina basal é em sua maior
parte mediado pela ligação laminina–integrina. Estas moléculas têm sua expressão
aumentada na superfície das células de Schwann que se posicionam formando as bandas
7
de Büngner, e na membrana plasmática dos axônios em regeneração (IDE, 1996;
DAHLIN & BRANDT, 2004).
Neurônios axotomizados devem passar de um modo de transmissão para um
modo de crescimento, e expressar proteínas associadas ao crescimento, como GAP-43,
tubulina e actina, bem como uma nova matriz de neuropeptídios e citocinas. Auxiliando
desta maneira a promover a regeneração axonal (FU & GORDON,1995).
Além da capacidade de fornecer um meio mecânico para o crescimento dos
axônios em regeneração, as células de Schwann são responsáveis pela produção de
fatores de crescimento que promovem a sobrevivência e estimulam o crescimento
axonal, tais como o fator de crescimento neural (NGF) e o fator neurotrófico derivado
do encéfalo (BDNF), exercendo assim uma função trófica na ausência da inervação dos
órgãos alvo. Os cones de crescimento, por sua vez, expressam proteínas de membrana
que são receptores para estes fatores tróficos, tais como receptor de baixa afinidade p75
e receptores tirosino-quinase A, B e C (TrKA, TrKB e TrKC, respectivamente),
possibilitando assim a ação trófica destes fatores (IDE, 1996; DAHLIN & BRANDT,
2004).
O grau de capacidade de adaptação do sistema nervoso ou neuroplasticidade
varia de acordo com a idade (Tabela 1). Durante o desenvolvimento ontogenético, o
sistema nervoso é mais plástico, sendo suscetíveis as informações do genoma e as
influências do ambiente externo. Depois que o organismo ultrapassa essa fase e atinge a
maturidade, sua capacidade plástica diminui, ou pelo menos se modifica. Além disso,
em alguns casos é possível identificar mudanças morfológicas resultantes das alterações
ambientais, chamadas de plasticidade morfológica, na qual há novos neurônios gerados
em uma dada região, ou neurônios desaparecem por morte celular programada; são
também novos circuitos neurais que se formam pela alteração do trajeto de fibras
8
nervosas, uma nova configuração da árvore dendrítica do neurônio, ou modificações no
número e na forma das sinapses e dos espinhos dendríticos. No entanto, em alguns
casos só é possível identificar correlatos funcionais, chamada de plasticidade funcional,
geralmente ligada à atividade sináptica de um determinado circuito ou um determinado
grupo de neurônios (LENT, 2010).
Tabela 1. Tipos e características da neuroplasticidade (LENT, 2010).
1.2 Modelo animal
Para mimetizar os efeitos observados após a LNP, bem como os fatores e
estratégias terapêuticas que influenciam na recuperação da mesma, vários modelos
animais têm sido utilizados. O ciático é o nervo mais utilizado nos estudos de
regeneração do nervo periférico, pois possui um tronco nervoso com um adequado
comprimento e espaço para intervenção cirúrgica (VALERO-CABRÉ & NAVARRO,
2002; 2004). De Medinacelli, Freed e Wyatt (1982) estabeleceram que a lesão por
9
esmagamento é uma modalidade para o estudo de regeneração dos NPs, pois é do tipo
axonotmese, na qual os danos são suficientes para seccionar o axônio, levando a
degeneração walleriana, porém sua recuperação funcional é boa, graças a preservação
dos tecidos de sustentação.
1.3 Envelhecimento
O envelhecimento é considerado um fenômeno natural associado com alterações
estrutural e funcional das células e tecidos. Normalmente ele leva a uma série de
mudanças no sistema nervoso central (SNC) e no sistema nervoso periférico (SNP),
incluindo perda de neurônios e oligodendrócitos e diminuição das conexões sinápticas.
Nos nervos periféricos ocorre uma diminuição no número de fibras mielínicas, prejuízo
da interação célula de Schwann versus axônio, divisão da bainha da mielina, mielina
redundante e interrupção do nodo de Ranvier (SHOKOUHI et al., 2008). A
glicoproteína P0 e a expressão do gene para a protéina básica de mielina também foram
encontradas diminuídas no nervo ciático de ratos velhos (MELCANGI et al., 1998).
Além dos déficits observados pelas alterações estrutural e funcional das células e
tecidos com o envelhecimento, os mesmos podem ser acentuados pela LNP.
Vários estudos clínicos têm sugerido que a idade mais jovem está associada a
um prognóstico mais favorável após a LNP (HESS et al., 2006) desta maneira,
pesquisas experimentais buscam elucidar os atrasos da regeneração associados ao
envelhecimento, os quais indicam que a degeneração walleriana seja mais lenta
(KEREZOUDI & THOMAS, 1999). Choi e colaboradores (1995) demonstraram que na
4ª semana pós LNP, os animais com 10 meses de idade apresentaram atraso no reparo
10
nervoso quando comparados com animais de 2 meses de idade, este atraso contribuiu
principalmente para estudar a degeneração walleriana em ratos velhos.
A capacidade das células de Schwann em produzir mielina pode ser também
importante para a regeneração, sendo mais lenta em animais velhos. A produção de
nova mielina pelas células de Schwann durante a regeneração é regulada pelos axônios
(KEREZOUDI & THOMAS, 1999).
As mudanças no transporte axonal têm sido implicadas na redução da
capacidade regenerativa e do rápido crescimento do cone axonal de animais velhos.
Existem evidências suficientes que apoiam a noção que as principais formas de
transporte axonal anterógrado exibem retardo em nervos de ratos velhos. Além disso,
detecta-se um déficit na quantidade de material transportado, ou ainda, na
responsividade trófica de neurônios motores lesionados. Essas anormalidades podem
estar associadas com a capacidade alterada de regenerar axônios lesionados em animais
idosos (ALBERGHINA et al., 1983; PIEHL et al., 1998).
Os macrófagos também estão implicados neste processo mais lento de
regeneração durante o envelhecimento. Foi encontrado baixo número de fibras
mielínicas regeneradas em ratos submetidos à supressão experimental de macrófagos,
sugerindo que a insuficiência de macrófagos peri-endoneurais observados em nervos
envelhecidos pode reduzir a capacidade regeneradora dos mesmos (KEREZOUDI &
THOMAS, 1999).
Quanto aos estudos eletrofisiológicos do nervo, estes mostram que a velocidade
de condução de fibras nervosas permanece inalterada (SATO; SATO; SUZUKI, 1985),
11
enquanto a latência do potencial evocado somatossensorial aumenta gradualmente com
o avanço da idade (ZEKPA & DINSE, 1995).
Estudos que utilizam modelos animais de diferentes idades para analisar a
influência do envelhecimento no processo de regeneração do sistema nervoso,
concordam quanto a relação da idade dos animais com as modificações orgânicas
observadas no envelhecimento (KANDA & HASHIZUME, 1998; COQ & XERRY,
2000; HESS et al., 2006). Desta maneira, pode-se classificar os animais em faixas
etárias correspondentes ao avançar da idade; portanto, ratos com média de idade de 3
meses são considerados adultos jovens, enquanto ratos de 13 meses de idade são
considerados maduros ou de meia-idade (Figura 4).
Fig. 4. Representação esquemática da idade relacionada às modificações encontradas
com o processo do envelhecimento (modificado de COQ & XERRY, 2000).
1.4 Exercício físico e neuropatia periférica
Na prática clínica, diversas intervenções terapêuticas são empregadas após
uma LNP, as quais buscam uma correta regeneração e recuperação da funcionalidade da
região acometida. Em alguns casos, dependente do grau de lesão do nervo, o paciente é
submetido ao procedimento cirúrgico e normalmente ao tratamento conservador, que
pode incluir o repouso inicial e a prescrição de antiinflamatórios não esteróides,
Senescência Pré-senescência Maduro Adulto
jovem
Nascimento
IDADE (meses)
8 24 28 15 17 3.5 5 0
12
analgésicos e corticóides por meio de infiltrações (RICARD, 2002). Ainda, se deve
destacar o tratamento fisioterapêutico como: exercícios de condicionamento e força
muscular, adaptações ergonômicas, orientações posturais, treinamento da flexibilidade e
recursos eletroterapêuticos (COX, 2002). Embora os exercícios sejam bem empregados
na prática clínica, ainda existem parâmetros não bem definidos e controvérsias entre os
estudos no que concerne ao tipo de exercício, sua duração, seu início pós-lesão e a
efetividade do mesmo com o processo de envelhecimento. Devido a essas questões,
estudos experimentais têm buscado elucidar os efeitos do exercício físico, como por
exemplo, o treinamento em esteira após LNP.
Os exercícios físicos diminuem as complicações comuns às patologias do SNP,
tais como as contraturas e fraqueza dos músculos desnervados, auxiliando na
recuperação funcional de pacientes com neuropatia periférica (LINDERMAN et al.,
1995; WRIGHT et al., 1996). Além disso, o suporte do próprio peso corporal parece ser
um fator importante na recuperação da função. Ratos com nervo ciático submetidos a
compressão obtiveram ganho na tensão tetânica muscular e na recuperação funcional no
grupo de animais que suportaram seu próprio peso do que quando comparado ao grupo
de animais que tiveram suas patas posteriores suspensas (MATSUURA et al., 2001).
Em outro estudo experimental, ratos foram forçados a alcançar o bico de sua
garrafa de água no topo de sua caixa moradia, desta maneira, realizando exercício com
seus membros posteriores por 4 horas diárias, durante 24 dias após a lesão. Os animais
obtiveram uma melhora no retorno da função sensoriomotora e da velocidade de
condução motora do nervo na fase inicial da recuperação da LNP (VAN MEETEREN
et al., 1997). Marqueste e colaboradores (2004) também corroboram com esse resultado
13
eletrofisiológico, os quais encontraram uma melhora da recuperação funcional sensorial
através de registros eletrofisiológicos do nervo.
O treinamento em esteira tem demonstrado ser capaz de auxiliar na
recuperação locomotora e regeneração quando comparado ao treinamento de força em
modelos de lesão nervosa periférica (ILHA et al., 2008), além disso, o exercício em
esteira é capaz de proteger os nervos periféricos por atenuar reações oxidativas,
preservando as células de Schwann e a bainha de mielina das mudanças patológicas, as
quais ocorrem durante o envelhecimento normal (SHOKOUHI et al., 2008).
Treinamento em esteira nas 2 primeiras semanas após LNP produz uma
acentuada melhora na regeneração dos axônios motores sem aumentar a propensão
desses axônios de serem conduzidos a alvos inapropriados de reinervação, que
poderiam alterar a funcionalidade da região acometida (ENGLISH et al., 2009).
Observou-se também forte evidência do envolvimento do treinamento em esteira com a
melhora da regeneração axonal após a LNP, estando diretamente relacionado à
intensidade e freqüência com que o exercício é realizado, sendo que em menor
frequência e maior intensidade, o exercício auxiliou no aumento do crescimento axonal,
enquanto que em menor intensidade e maior frequência parece não ter tanto impacto no
crescimento axonal (SABATIER et al., 2008).
Desta maneira, além da importância da especificidade do treinamento, período
de início, entre outros parâmetros de suma relevância para a indicação do mesmo após
uma LNP, é importante que estes parâmetros estejam associados a corroborar com a
regeneração durante o processo de envelhecimento, para que a mesma ocorra de
maneira benéfica e mais eficaz possível.
14
2 JUSTIFICATIVA
Vários estudos têm demonstrado que a idade mais jovem está associada com um
prognóstico mais favorável após o dano de nervos periféricos (VERDÚ et al., 2000;
HESS et al., 2006). Estas observações clínicas dependentes da idade são corroboradas
por trabalhos em modelos animais que mostram que os animais mais velhos
apresentaram capacidade de regeneração diminuída após esmagamento, transecção ou
dano do sistema nervoso periférico (BOWE et al., 1987; POLA et al., 2004).
Clinicamente, há certa predominância de pacientes com maior idade que
apresentam algum tipo de desabilidade devido a uma LNP. Apesar do treinamento em
esteira ser utilizado em estudos experimentais prévios como ferramenta para auxiliar no
processo de regeneração após a realização desse tipo de lesão em animais jovens (ILHA
et al., 2008; SABATIER et al., 2008), é necessário avaliar o efeito da aplicação do
exercício em esteira em animais maduros submetidos a diferentes modelos de LNP.
Desta maneira faz-se necessário estudar os efeitos do treinamento em esteira na lesão
nervosa periférica durante o processo de envelhecimento.
15
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
O presente estudo tem como objetivo geral analisar o efeito do treinamento em
esteira na regeneração nervosa periférica de ratos jovens e maduros submetidos ao
modelo de lesão traumática experimental do nervo ciático.
3.2 Objetivos específicos
- Avaliar a performance sensoriomotora dos animais submetidos à modelo de
lesão por esmagamento do nervo ciático em ratos jovens e maduros, após treinamento
em esteira.
- Analisar o efeito do treinamento em esteira no potencial evocado muscular em
ratos jovens e maduros submetidos à modelo de lesão por esmagamento do nervo
ciático em ratos de ambas as idades.
- Avaliar a regeneração do nervo ciático, utilizando uma análise morfométrica da
densidade de fibras mielínicas, maturação das fibras mielínicas, porcentagem da área de
fibras mielínicas e porcentagem da área de tecido conjuntivo endoneural, em ratos de
diferentes idades submetidos ao modelo de esmagamento do nervo periférico após
treinamento em esteira.
16
4 MÉTODOS E RESULTADOS
4.1 Artigo – Núbia Broetto Cunha, Jocemar Ilha, Lígia A. Centenaro, Gisele A.
Lovatel, Luciane F. Balbinot, Matilde Achaval. Effects of treadmill training on the
aging process after traumatic peripheral nerve lesion in rats.
17
The effects of treadmill training on the aging process after traumatic peripheral
nerve lesion in rats
Núbia Broetto Cunhaa,b
*, Jocemar Ilhaa,b
, Lígia Aline Centenaroa,b
, Gisele Agustini
Lovatela,b
, Luciane Fachin Balbinota,b
, Matilde Achavala,b
aPrograma de Pós-Graduação em Neurociências, Instituto de Ciências Básicas da Saúde,
UFRGS, Porto Alegre, RS, Brazil
bLaboratório de Histofisiologia Comparada, Departamento de Ciências Morfológicas,
Instituto de Ciências Básicas da Saúde, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brazil
Running Title: Exercise on Sciatic Nerve Regeneration
Address correspondence to Matilde Achaval, MD, PhD, Laboratório de Histofisiologia
Comparada, Departamento de Ciências Morfológicas, ICBS, Universidade Federal do
Rio Grande do Sul, Sarmento Leite 500, CEP: 90050-170, Porto Alegre, RS, Brazil.
Phone Number: 55 51 33083624. E-mail: [email protected].
18
Abstract
Treadmill training has been widely used as a therapeutic resource following peripheral
nerve injury. Although this technique has been shown to have a beneficial impact on
nerve regeneration, it is well known that the aging process can delay these positive
results. In this context, few studies have attempted to investigate the influence of
treadmill training on peripheral nerve regeneration during the aging process. In the
present study, a 5-week treadmill training program was employed 1 week after a sciatic
nerve crush, in order to investigate the possible effects on regeneration in young (3
months old) and mature rats (13 months old), using functional, electrophysiological, and
morphometrical analyses. After 5 weeks training, sensorimotor function was improved
in both young and mature groups, while muscle action potential amplitude was only
greater in the young group. The training program reduced myelinated fiber density in
the young group, which appeared to increase after nerve injury (poly-innervation), but
decreased with training, which means that the innervation became more functional. The
data indicate that treadmill training is capable of promoting functional,
electrophysiological and morphological recovery in young animals. However, in mature
animals, improvement was only seen in terms of functional recovery. Further
investigations are necessary in order to test whether observable improvements occur
following a longer training program and if the association of other therapies with
treadmill training, as observed in clinical practice, is able to accelerate recovery in aging
patients with peripheral neuropathies.
Key Words: Sciatic nerve crush; Peripheral nerve regeneration; Treadmill training;
Aging; Sensorimotor evaluations, Electrophysiological analysis, Stereological analysis.
19
Introduction
Peripheral nerves are often subject to traumatic injury, resulting in interruption
of correct nerve transmission, causing a decrease or loss of nerve sensitivity and
motricity in the innervated region.1 Regeneration following peripheral nerve injury may
be influenced by various factors such as type of injury, location of the injury, time lapse
between the injury and the surgical procedure, and the age of the patient.2,3
Following peripheral nerve injury, favorable prognosis is more often seen in
younger patients.4
These age-dependent results are based on clinical observations and
supported by experimental investigations with animals, which also suggest a decrease in
regeneration capacity after crush, transection or other peripheral nerve damage in older
subjects.5,6
For example, the regenerative potential of peripheral nerve was compared in
rats aged from 2, 8 and 17 months, with greater recovery being found in the 2-month-
old animals. These age-related differences in the regenerative process can be explained
by the lower speed and intensity of axonal growth that occurs with aging.7
Several experimental studies into the mechanisms involved in regeneration have
investigated the role of physical exercise therapy in nerve injury rehabilitation. In rats
with sciatic nerve traumatic injury, endurance training improves the degree of
myelinated fiber maturation, reduces the area of endoneurial connective tissue and
increases the area of myelinated fibers.8 Rats with sciatic nerve crush forced to exercise
by stretching maximally to reach the teat of a bottle suspended from the top of a
plexiglass box had greater functional recovery and motor nerve conduction speed.9
The elderly are more affected by nerve injuries and functional recovery is more
difficult. As far as we know, there are no findings on the influence of physical exercise,
such as treadmill training, on regeneration after peripheral nerve injury in individuals
20
undergoing the aging process. The aim this study was evaluate the therapeutic potential
of treadmill training in sciatic nerve crush injury in young and mature rats using
sensorimotor evaluation, muscle evoked potential and morphological nerve analysis.
Materials and methods
Experimental design and surgical procedures
The experiment was performed on male Wistar rats at 2 different ages: 3 months
and 13 months (age at the start of the experiment), from a local breeding colony (ICBS,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brazil). The rats were housed in standard
plexiglass box, under 12:12 h light/dark cycle, in a temperature controlled environment
(20 1 °C), with food and water available ad libitum. All the animals were cared for in
accordance with Brazilian law and the recommendations of the Brazilian Society for
Neurosciences, Review Committee of the School of Veterinary Surgery, University of
Buenos Aires and the International Brain Research Organization, and in compliance
with the National Institute of Health’s Guidelines for Care and Use of Laboratory
Animals (publication nr. 85-23, revised 1985), properly approved by the Ethical
Committee of the Universidade Federal do Rio Grande do Sul (nr. 2008193).
In the first step of the procedure, the animals were randomly divided in six
groups: (1) young untrained rats without sciatic crush (YCon, n = 8); (2) young
untrained rats with sciatic crush (YIn, n = 7); (3) young treadmill trained rats with
sciatic crush (YTr, n = 7); (4) mature untrained rats without sciatic crush (MCon, n = 8);
(5) mature untrained rats with sciatic crush (MIn, n=8); (6) mature treadmill trained rats
with sciatic crush (MTr, n=8). Thereafter, animals were anesthetized using sodium
21
thiopental (40 mg/kg, i.p.; Cristalia, Brazil) and the right sciatic nerve was crushed with
1 mm hemostatic forceps for 30 seconds.10
The animals in the YCon and MCon groups,
constituting the sham group, were submitted to sciatic nerve exposure, as were the
lesion groups, but they were not submitted to nerve crush.
Three days later, all animals underwent a 4-day treadmill training adaptation
program consisting of 10 minutes at 5 m/min. On the fifth day they were submitted to a
Maximal Exercise Test (MET).11
The test consisted of a graded exercise on the
treadmill, with speed increments of 5m/min every 3 minutes, starting at 5 m/min and
continuing up to the maximal intensity of each rat. The values attained in the MET were
used to plan the treadmill training program, which started 1 week after the sciatic nerve
crush.
Treadmill training
The treadmill training program was performed on a treadmill designed for
humans (Runner, Brazil) and modified for use by rats.8 This training program consisted
of running on a treadmill for 20 min on the first day with progressive increases every
day, reaching 60 min on the 7th day, which was maintained for the next 4 weeks. Each
training session included a warm-up period of 5 minutes running at 30% of the maximal
speed reached in the MET, 10 to 50 min running at 45 to 50% and 5 min recovery at
30% again, 5 sessions per week, once a day, during 5 weeks.12
This training program
was considered a moderate-intensity endurance regime, because the animals ran for a
long time at 45% to 55% of the maximal speed reached in their MET.
Sensorimotor evaluations
22
The horizontal ladder rung walking test (HLRWT) and the narrow beam test
(NBT) were used to examine hindlimb sensorimotor function. On the last day of
treadmill training, the animals were adapted 3 times to cross the narrow beam and the
horizontal ladder. The sensorimotor test was performed the following day. For each test,
the animals were filmed (DCR-DVD 205, Sony, USA) 3 times from a lateral view.
HLRWT apparatus was a 100 cm long and 15 cm wide, with horizontal parallel
metal rungs (3 mm diameter) which could be inserted in sequence to create a floor with
a minimum distance of 2 cm between rungs, elevated 30 cm above the floor and with a
little dark box at the end, the animals were required to walk along the horizontal ladder.
NBT consisted of walking crossing a 100 cm-long, 3 cm-wide flat surface beam,
elevated 30 cm above the floor, the animals were required to walk along the narrow
beam and reach a little dark box at the end.
The analyses of HLRWT and NBT consisted of observing the animal crossing
these apparatus and counting the number of hindlimb step errors. Failure to accurately
place the foot on the beam or ladder rung was considered an error.
Electrophysiological Technique
Following this 5-week period of treadmill training and tests, the animals were
anesthetized using sodium thiopental (40 mg/kg, i.p.; Cristalia, Brazil). After
trichotomy, 5 incisions of approximately 1 mm each were made into which and needle
electrodes were inserted to stimulate the right sciatic nerve (figure 1). Two electrodes
were positioned 1 cm apart, the first one close to the sciatic nerve trunk and the second
proximal to the crush site. The other two electrodes were inserted, 1 cm apart, into the
gastrocnemius muscle. Finally, one ground electrode was inserted. The two electrodes
23
positioned close to the sciatic trunk were responsible for stimulating the nerve trajectory
while the two electrodes positioned in the gastrocnemius muscle registered the action
potential. Muscular action evoked potential was determined by means of supra-
maximum electric current stimulation using a two-channel electromyograph
(Neurosoft®, Brazil), linked to a computer (Acer, Brazil) with Neuro-MEP.net software
for the evaluations. A sampling rate of 200 Hz to 80 Hz was used with a frequency filter
of 2 Hz.
Histological and Morphometrical Nerve Studies
Following the above-mentioned procedures, the animals were anesthetized with
sodium thiopental (50 mg/kg, i.p.; Cristália, Brazil). For nerve regeneration analysis, a
segment (∼3 mm) of the right sciatic nerve was rapidly excised, distal to the crush injury
site. The specimens were fixed by immersion in a solution of 0.5% glutaraldehyde
(Sigma Chemicals Co, St Louis, Missouri) and 4% paraformaldehyde (Reagen, Brazil)
in a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4; PB). After this, the material was postfixed in 1%
OsO4 (Sigma Chemicals Co) in PB, dehydrated in a graded series of alcohol and
propylene oxide (Electron Microscopy Sciences, USA), embedded in resin (Durcupan,
ACM-Fluka, Switzerland), and polymerized at 60°C. Transverse-semithin sections (1
μm) were obtained using an ultramicrotome (MT 6000-XL, RMC, Tucson, Arizona)
and stained with 1% toluidine blue (Merck, Germany) in 1% sodium tetraborate
(Ecibra, Brazil). Afterward, images of the right sciatic nerve were digitized (initially
1000× and further amplified 200× for analysis) using a Nikon Eclipse E-600
microscope (Tokyo, Japan) coupled to a Pro-Series High Performance CCD camera and
Image Pro Plus Software 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, Maryland). For
morphological evaluation, a set of 8 images was obtained from each nerve, 4 random
24
images from the periphery and 4 random images from the center of the nerve, in order
to ensure a representative area per nerve segment (1161.5 μm²; 100% of the area
analyzed per segment).13
The average number of fibers analyzed per nerve was 158.
Morphometrical measurements included the (1) myelinated fiber density
(number of fibers/mm2); (2) g ratio (the quotient axon diameter/fiber diameter, a
myelinated fiber maturation index); (3) percentage areas of myelinated fibers (%) and
(4) of endoneurial connective tissue (%).
Individual myelinated fibers were counted and the myelinated fiber density was
determined by examining the ratio of the myelinated fibers/total area analyzed. The
measurements of areas were estimated with a point counting technique using grids with
a point density of 1 point per 1.53 μm2 and the following equation:
Â=Σp.a/p,
where  is the area, Σp the sum of points, and a/p the area/point value (3.24 μm²). The
values of the areas of myelinated fibers and of endoneurial connective tissue were
shown in percentages, considering that 1161.5 μm² was 100% of the analyzed area in
each nerve segment. To estimate the axon and fiber diameters, the area of each
individual fiber was measured and the value obtained was converted to the diameter of a
circle having an equivalent area.
Data Analysis
Sensorimotor, electrophysiological tests and morphometric measurements of the
sciatic nerve were analyzed using repeated measures one-way ANOVA. All analyses
were followed by post hoc Duncan’s test. Data were run on SPSS® 11.5 (Statistical
Package for the Social Science, Inc., Chicago, USA) with significance set at p<0.05. All
means are presented as ± standard error of the mean (SEM).
25
Results
Sensorimotor tests
Hindlimb sensorimotor function was evaluated by applying the horizontal ladder
rung walking test (HLRWT) and narrow beam test. In the HLRWT, the number of the
hindlimb slips was significantly greater in the young untrained injured group (1.3±0.28;
p<0.05) when compared to the young control (0.4±0.07) and young trained injured
(0.6±0.34) groups. No difference was found between the mature groups (MCon, MInj
and MTr) and when the young and mature groups were compared (Figure 2A).
In the narrow beam test, the number of the hindlimb slips was statistically
greater in the young injured (0.8±0.18; p<0.05) when compared to young trained
(0.2±0.06) groups. The mature untrained injured group (1.5±0.26; p<0.05) had a greater
number of hindlimb slips when compared to the mature control (0.4±0.15) and mature
trained injured (0.5±0.08) groups. In the young and mature groups, fewer hindlimb slips
were seen in the young untrained injured group (0.8±0.18; p<0.05) when compared with
the mature untrained injured (1.5±0.26) groups (Figure 2B).
Electrophysiological Analysis
The electrophysiological analysis showed there was a greater action potential
amplitude in the gastrocnemius muscle in the young control group (27±0.11mV;
p<0.05) when compared to the young untrained injured (10±0.90 mV) and young
trained injured (15±1.08 mV) groups. However, the young trained injured group
(15±1.08 mV; p<0.05) had a significantly greater evoked potential of the same muscle
26
when compared to the young untrained injured group (10±0.9 mV), demonstrating the
benefit of the treadmill training in this evaluation.
Similarly, the mature control group (22±3.03 mV; p<0.05) had a greater action
potential amplitude in the gastrocnemius muscle when compared to the mature
untrained injured (6±0.73 mV) and mature trained injured (11±1.38 mV) groups.
When comparing the young and mature groups, a smaller action potential
amplitude was observed in the mature control group (22±3.03 mV; p<0.05) in relation
to the young control rats (27±0.11 mV), suggesting a possible decrease in the muscular
action potential with aging (Figure 3).
Histological and Morphometric Nerve Studies
Structural analysis of the nerves revealed some differences between the young
and mature groups (Figure 4). The mature control group had a greater myelinated fiber
diameter and a smaller myelinated fiber density. In addition, the histological
characteristics of the endoneurial connective tissue between the myelinated fibers were
greater in all mature groups.
The untrained and trained injured groups of the both ages were shown to have an
increased endoneurial connective tissue space between the fibers and degeneration
debris. The myelinated fiber density was higher in the young and mature untrained
injured groups and lower in the young trained injured group with a similar aspect to that
found in the young control group.
Analysis of the morphometrical data revealed that the young untrained injured
group (23.009±1.661 fibers/mm²; p<0.05; Figure 5A) showed a higher myelinated fiber
density when compared to the young control (16.521±905 fibers/mm²) and trained
injured (17.082±1.054 fibers/mm²) groups. In the mature groups we found a higher
27
myelinated fiber density in both the untrained injured (14.406±1.324 fibers/mm²;
p<0.05) and trained injured (15.469±429 fibers/mm²; p<0.05) groups in relation to the
mature control group (12.895±491 fibers/mm²). Comparing the different age groups, the
young control and young untrained injured groups had a higher density of myelinated
fibers in relation to the mature control and mature untrained injured groups (p<0.05),
respectively.
Myelinated fiber maturation, estimated by means of g ratio analysis, was more
scanty in the young untrained and trained injured groups (0.712±0.003 and
0.714±0.015, respectively) compared to the young control group (0.658±0.003; p<0.05;
Fig. 5B). Similarly, in the mature untrained and trained injured groups (0.746±0.009
and 0.728±0.013, respectively) the myelinated fiber maturation was more scanty when
compared to the mature control group (0.640±0.013; p<0.05).
When examining the morphometrical measurements for the percentage area of
myelinated fibers, the young untrained and trained injured groups (31±2.18% and
26±2.21%, respectively) had a smaller percentage area of myelinated fibers than the
young control group (73±2.28%; p<0.05; Fig. 6A) Likewise, the mature untrained and
trained injured (18±1.98% and 22±1.71%, respectively) groups had a smaller
percentage area of myelinated fiber than the mature control group (63±1.50%; p<0.05).
In relation to the different ages, we observed a greater percentage area of myelinated
fiber in the young control group when compared to the mature control group. The
opposite is true, in relation to the percentage area of connective tissue (Fig. 6B), the
young and mature untrained and trained injured groups have a greater percentage area
of connective tissue than the respective young and mature control groups. There is a
difference between different ages, with all the mature groups having a greater
percentage area of connective tissue than all the young groups.
28
Discussion
Experimental traumatic lesion of rat sciatic nerve produces similar hindlimb
motor function deficits to those found in peripheral neuropathies observed in
humans.13,14
Several studies have attempted to clarify the regenerative process of
peripheral nerves after injuries. During aging, the regenerative process after PNL tends
to be delayed due to the slow plasticity of the nerve.7,15,16
However, many studies report
functional and morphological benefits of treadmill training after sciatic nerve injury in
young rats,8,17
but there is a noticeable absence of findings regarding mature rats. Thus,
the object of the present study was investigate the different effects of treadmill training
on sciatic nerve regeneration after a crush model in young and mature rats.
A horizontal ladder rung walking test (HLRWT) and the narrow beam test were
used to investigate the sensorimotor functionality of the animals. These tasks are easily
performed in intact rats, requiring fine sensorimotor control and precise foot
placement.18,19,20
Our findings in the HLRWT test, showed that treadmill training were
not effective in improving the motor function of the injured limb. On the other hand, in
the narrow beam test, the treadmill training was shown to reduce the number of slips
made by young and mature injured animals. The reason for this apparent discrepancy is
not known, however, these tests assess different aspects of motor performance: the
narrow beam test is a very sensitive method of monitoring discrete deficits in foot
placement and body balance while the horizontal ladder walking test is more sensitive
for evaluating the sensorimotor coordination of the limbs and the descending motor
control of motor pathways.21
Therefore, the narrow beam test could be considered more
29
sensitive to peripheral nerve injuries, since this type of lesion especially causes deficits
in foot placement.8,10
It is known that the decrease in amplitude of the muscle action potential is
roughly proportional to the degree of axonal loss. This loss of amplitude is also related
to changes in the neuromuscular junction.22
Five weeks of treadmill training improved
muscle action potential in the young injured animals, although, regarding this
parameter, this intervention does not seem to achieve the same beneficial effect in
mature injured animals. Additionally, the mature control animals present smaller action
potential amplitude in the gastrocnemius muscle when compared to the young control
animals. Similarly to our results,9
found enhanced electromyographic parameters after
24 days of exercise training in adult rats submitted to sciatic nerve crush lesion.
In relation to the morphological findings, the myelinated fiber density increased
after injury and decreased after treadmill training in injured young animals. In some
early stages after peripheral nerve lesion (PNL), axons may increase the connectivity
with their target cells compared to normal adult rats.23,24
This polyneuronal innervation
is substituted by mononeuronal innervation, when synapses are competitively
eliminated from the new motor units through axonal sprouting and regeneration of
injured motor axons to endplates occupied by sprouts.25
The substitution of
polyneuronal by mononeuronal innervation is reestablished when the motor activity is
restored.26
In the present study, treadmill training possibly led to a decrease in poly-
innervation as well as an increase in the muscular action potential, suggesting that
motor units became more functional after exercise.
A reduction in the number or density of myelinated fibers in peripheral nerves
has been reported with aging.27,28,29
In this study, a smaller myelinated fiber density is
30
shown in the mature animals when compared to the young. This result may support the
muscle action potential amplitude findings reported here, since the mature control
animals present lower action potential amplitude in relation to the young control
animals. In agreement with our results, other studies have also detected evidence of an
age-dependent reduction in electrophysiological parameters.29,30
Furthermore,
spontaneous denervation, which normally occurs in aging muscle, is distinguished by a
reduction in the average number of motor units.29,31
Although axonal regeneration and reinnervation mechanisms are maintained
throughout life, they become slower and less effective with increased age.32,33
Normal
aging brings several changes in the peripheral nerves, including a decrease in the
number of myelinated fibers,34
impaired Schwann cell-axon interaction,35
splitting of
myelin sheaths, redundant myelin and disruption of Ranvier’s node.36
In agreement with
this, our results showed an increase in the myelinated fiber maturation index (g ratio) in
untrained and trained injured young and mature animals compared to the respective
control groups, representing a reduction in myelinated fiber maturation. In addition, the
percentage of myelinated fiber increased in injured and trained groups.
In conclusion, our data provide evidence that moderate treadmill training could
be used as therapy after traumatic crush injury in young animals. The aging process
reduces the effectiveness of this intervention due to the reduction of recovery in the
electrophysiological and morphological parameters analyzed. However, in mature
animals, treadmill training was able to increase the functionality of the animals
submitted to peripheral nerve injury. We suggest that more investigations are necessary
in order to test if a longer training program may lead to electrophysiological and
morphological gains, or if the association with other therapies used in clinical practice,
31
is able to accelerate improvement in patients with peripheral neuropathies during the
aging process.
Acknowledgments
We would like to thank Antonio G. Severino and Silvia Barbosa for their
technical assistance. This research was supported by UFRGS and the Brazilian funding
agency CNPq. N. B. Cunha was supported by an MSc scholarship from CNPq, and M.
Achaval is a CNPq investigator.
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36
Figure 1. Digitalized image of distribution the neddle electrodes during the electrophysiological
test. The first two electrodes were positioned at 1 cm of distance from each other, close to the
sciatic nerve trunk and proximal to the crush site; other two electrodes were inserted into
gastrocnemius muscle, also 1 cm of distance between them; finally, one ground electrode was
inserted.
Figure 2. Comparison of the sensorimotor analysis determined by (A) Horizontal ladder rung
walking test and (B) Narrow beam test on the rats of different ages. Graphics show the slips on
the trials of the test. Data are expressed as means and SEM. Letter “a” to p< 0.05 when
compared to the ConY group, “b ” corresponds to p< 0.05 when compared to the ConM group,
“c” to p< 0.05 when compared to the TrY group, and “d” to p< 0.05 when compared to the TrM
group. “*” to P < .05 when compared Y to the M group. Con, control; In, injured; Tr, trained;
Y, young; M, mature.
Figure 3. Analysis of treadmill training on the muscular evoked potential on the rats of different
ages. Graphics show the amplitude of evoked potential. Data are expressed as means and SEM.
Letter “a” corresponds to p< 0.05 when compared to the ConY group, “b” to p< 0.05 when
compared to the ConM group, and “c” to p< 0.05 when compared to the TrY group. “*” to p<
0.05 when compared Y to the M group. Con, control; In, injured; Tr, trained; Y, young; M,
mature.
Figure 4. Digitized images of transverse-semithin sections (1 µm) obtained from regenerated
sciatic nerves after 5 weeks of treadmill training. Note between the different ages, the apparent
unimodal fiber spectrum with a predominance of large diameter of the myelinated fibers in the
control mature group; also, note the greater endoneurial connective tissue between the nerve
fibers. In the untrained injured young and mature groups, mature group had smaller myelinated
fibers density, increase the endoneurial connective tissue between the nerve fibers and presented
degeneration debris. The trained injured young and mature groups was similar, the most
important difference was the increase endoneurial connective tissue between the nerve fibers in
the mature group. Mf indicates myelinated nerve fiber; Uf, unmyelinated nerve fiber; Sc,
Schwann cell; * (asterisk), endoneurial connective tissue; Db, degeneration debris; BV, blood
vessel. Semithin sections were stained with toluidine blue. Scale bar = 20 μm.
37
Figure 5. Effects of treadmill training on the morphometrical parameters of regenerating right
sciatic nerve fibers. Graphics show the density of myelinated fibers of the nerves (A); and the G
ratio of the nerves (B). Data are expressed as means and SEM. Letter “a” to p< 0.05 when
compared to the ConY group, “b ” corresponds to P < .05 when compared to the ConM group,
“c” to P < .05 when compared to the TrY group. “*” to p< 0.05 when compared Y to the M
group. Con, control; In, injured; Tr, trained; Y, young; M, mature.
Figure 6. Effects of treadmill training on the morphometrical parameters of regenerating right
sciatic nerve fibers. Graphics show the percentage area of myelinated fibers of the nerves (A);
and, the percentage area of endoneurial connective tissue of the nerves (B). Data are expressed
as means and SEM. Letter “a” to p< 0.05 when compared to the ConY group, “b ” corresponds
to p< 0.05 when compared to the ConM group. “*” to P < .05 when compared Y to the M
group. Con, control; In, injured; Tr, trained; Y, young; M, mature.
38
Figure 1
Figure 2
A B
Y M Y M Y M0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Control Injured Trained
a
Slip
s/T
ria
l
Y M Y M Y M0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Control Injured Trained
b
c
d
*
Slip
s/T
rial
39
Figure 3
Y M Y M Y M0
10
20
30
Control Injured Trained
*
a c
b
a
b
Am
plitu
de (
mV
)
Figure 4
40
Figure 5
A B
Y M Y M Y M0
10000
20000
30000
Control Injured Trained
a c
b b
*
*
Den
sit
y (
fib
ers/m
m2)
Y M Y M Y M0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Control Injured Trained
a ab
b
g r
ati
o
Figure 6
A B
Y M Y M Y M0
20
40
60
80
Control Injured Trained
aa
bb
*
* *
Are
a o
f m
yelin
ate
d f
ibers
(%
)
Y M Y M Y M0
20
40
60
80
100
Control Injured Trained
aa
b b
*
* *
Area o
f co
nn
ecti
ve t
issu
e (
%)
41
5 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Os dados apresentados neste trabalho sugerem evidências de que o treinamento
em esteira auxilia no processo de regeneração do nervo ciático após uma lesão
traumática experimental deste nervo em ratos jovens.
Observa-se, desta maneira, melhora na função sensoriomotora a partir da
redução do número de erros da pata posterior lesionada ao realizarem o Narrow beam
test; aumento da amplitude do potencial de ação do músculo gastrocnemio e redução da
densidade de fibras mielínicas do nervo ciático de ratos jovens após o treinamento em
esteira. Esses dois últimos resultados predizem que ocorreu uma inervação mais
funcional do músculo gastrocnemio, pois nos grupos somente submetidos à lesão houve
aumento da densidade de fibras mielínicas, caracterizando uma poli-inervação,
buscando compensar a inervação prejudicada com a lesão. Enquanto que com o
treinamento em esteira a densidade de fibras mielínicas foi menor, já que a mesma
possivelmente tornou-se mais funcional com o exercício.
O processo de envelhecimento reduziu a efetividade da intervenção terapêutica
proposta neste estudo, baseado na ausência da recuperação nos parâmetros
eletrofisiológicos e morfológicos analisados. Entretanto, houve melhora na função
sensoriomotora dos animais maduros com o treinamento em esteira, sendo observada a
partir da redução do número de erros da pata posterior lesionada; porém não houve
diferença significativa na análise eletrofisiológica e morfológica destes animais.
Portanto, sugerimos que sejam realizadas mais pesquisas com um período maior de
42
treinamento para observar se a melhora funcional é seguida da melhora dos parâmetros
eletrofisiológicos e morfológicos em animais maduros.
Além do retardo na regeneração associado ao envelhecimento e da influência do
período de treinamento serem fatores considerados de suma importância para uma
consistente recuperação de pacientes com neuropatia periférica, outro fator importante é
que na prática clínica a reabilitação é realizada com a associação de diferentes recursos
terapêuticos, como: treino proprioceptivo, exercícios de força muscular, treinamento de
equilíbrio e coordenação, entre outros, que somados ao treinamento em esteira são
responsáveis pela melhora do paciente com déficits devido à neuropatia periférica.
43
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