Les examens biologiques

en Hématologie

Rémi Letestu

Laboratoire d’Hématologie

CHU Avicenne

UFR SMBH

DCEM1 (2006-07)

plaquettes éosinophiles

neutrophiles

monocytesérythrocytes

macrophages

basophilesB T

SANG

lymphocytes

Hématopoïèse

réticulocytes mégacaryocytes

Progéniteurs lymphoïdes

CFU-GEMM

BFU-E

CFU-E

MOELLE OSSEUSE

Tpo

Cellules souches

Les différents examens

SANGNFS ou hémogramme

Frottis sanguin

GANGLION (adénopathie)Ponction ggBiopsie gg

MOELLE OSSEUSEMyélogramme

Biopsie médullaire

BIOPSIESChirurgicales ou à l’aiguille

Les différentes techniques

CYTOLOGIECytochimie

HISTOLOGIEou

ANATOMO-PATHOLOGIE

CYTOMETRIE EN FLUXou

IMMUNOPHENOTYPAGE

CYTOGENETIQUE

BIOLOGIE MOLECULAIRE

Hémogramme ou NFS

• Définition: analyse quantitative et qualitative des éléments figurés du sang

– Décompte des GR, GB, et plaquettes par unité de vol de sang (numération)

– Décompte des ≠ sous-types de GB (formule sanguine)

– Analyse morphologique de ces éléments

La Numération Formule Sanguine (NFS)

– Ponction de sang veineux– Prélèvement sur anticoagulant : EDTA– Compteurs Automatiques :

• importance des contrôles ++

Valeurs Normales de l ’Hémogramme

La Numération– Globules Blancs : 4-10x109/L 4-15x109/L– Plaquettes : 150-450 x109/L 20 x109/L

– Globules Rouges– H : 4.5-6.2 x1012/L F : 4-5.4 x1012/L – E : 3.6-5 x1012/L NRS : 5-6 x1012/L

– Hémoglobine (Hb)– H : 13-18 g/dL F : 12-16 g/dL– E : 12-16 g/dL NRS : 14-20 g/dL

– Hématocrite– H : 40-54% F : 35-47%– E : 36-44% NRS : 44-62%

Valeurs Normales de l ’Hémogramme

• Les Réticulocytes– Automates / Coloration sur lame (/1000 GR)– Environ 1-/120° des GR– Expression en valeur absolue– 25000 à 100000 quand Hb Normale

• La Formule– Polynucléaires Neutrophiles : 1.7-7x109/L– Polynucléaires Eosinophiles : 0-0.5x109/L – Polynucléaires Basophiles : 0-0.05x109/L– Lymphocytes : 1.5-4x109/L– Monocytes : 0.1-1x109/L

Valeurs Normales de l ’Hémogramme

Ratio Hb Hte

Hb / /

Hte CCMH /

NbreGR

TCMH VGM

Les constantes de Wintrobe

– Volume Globulaire Moyen (VGM) 85-95 fl (83-97)– Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb (CCMH) 32-36%– Teneur Corpusculaire Moyenne en Hb (TCMH) 27-32 pg/cellule

Frottis sanguin

• Technique– Étalement d’une goutte de sang sur une lame– Coloration May-Grünwald-Giemsa (MGG)– Analyse au microscope

• Indications– Diagnostic d’anomalies morphologiques

• Des GR• Des GB• Des plaquettes

– Recherche et identification de cellules anormales• myélémie, • blastes• cellules lymphomateuses

– Vérification du nombre de plaquettes++

Quand prescrire un Hémogrammeen urgence

• Etat de choc

• Pâleur intense, asthénie,

• Angine ulcéro-nécrotique ou résistante aux antibiotiques

• Fièvre élevée après prise de médicament, surtout après chimiothérapie anti-mitotique

• Fièvre résistante aux antibiotiques

• Purpura pétéchial, syndrome hémorragique

Valeurs de l’hémogramme indiquant une consultation spécialisée en urgence

• Hématocrite supérieur à 60 %

• Anémie inférieure à 7 g/dl ou mal tolérée

• Neutropénie inférieure à 200/mm3 (0.2 G/L)

• Hyperleucocytose faite de cellules immatures supérieure à 20 000/mm3

• Thrombopénie inférieure à 20 000/mm3 (20 G/L) même sans syndrome hémorragique

• Après élimination d’une fausse thrombopénie à l’EDTA

Le Myélogramme• Historique

– 1920-1927 Arinkin -1935 Mallarmé

• Ponction Sternale / Iliaque Post > Antérieure

• Indications– Nombreuses : toute suspicion d’anomalie centrale de

production des éléments du sangAnémies normo ou macrocytaires arégénérativeset/ou Neutropénieset/ou ThrombopéniePancytopéniePic monoclonal

– Diagnostic– Analyses spécialisées

• Contre-indications– Très rares - Enfant - Contre indication sternale– Troubles graves de la coagulation

Le Myélogramme

• Précautions– Indispensables– Chez l ’enfant– Formation au geste– Règles strictes

• Déroulement du geste– Anesthésie locale– Ponction– Réalisation des frottis :

point essentielTrocart de type

Mallarmé Trocarts de typeJamshidi

Le Myélogramme

– Quantité & Qualité de la Moelle Osseuse

– Cellules à l ’origine des éléments circulants

– Exploration des lignées Myéloïde et Lymphoïde

MBMyéloblaste

PMLPromyélocyte

MLNMyélocyte neutrophile

MMLNMétamyélocyte

PNPolynucléaire neutrophile

La lignée granuleuse neutrophile

La lignée érythroblastiquePROERProérythroblaste

ERBÉrythroblaste basophile

ERPÉrythroblaste polychromatophile

ERAÉrythroblaste acidophile

L ’Adénogramme

• Organe lymphoïde

• Exploration des lignées Lymphoïdes

• Ponction aiguille

• Frottis

Facile, non douloureux, informatif ++

Les Biopsies

• Chirurgicales

• Masse tumorale (lymphomes)

• Ganglion : La biopsie ganglionnaire

• A l’aiguille

• Sous Scanner

• La Biopsie Ostéo-Médullaire (BOM)

La biopsie ganglionnaire

• Prélèvement ganglion entier par technique chirurgicale

• Morphologie, coupes histologique

• Immunomarquages sur lame

– immunocytochimie

• Suspension de cellules

La biopsie ostéomédullaire (BOM)

• Historique– 1920-1927 Arinkin– 1950 développement

• Ponction Iliaque Post• Indications

– Nombreuses– Diagnostic et Bilan d ’extension– Analyses spécialisées

• Contre-indications– Rares– Troubles graves de la coagulation– Thrombopénie sévère, thrombopathie

• Déroulement du geste

La Cytométrie en Flux

• Mélange cellulaire hétérogène et complexe

• Injection de la suspension cellulaire

• Liquide de gaine sous pression

• Etirement de la veine liquide

• Alignement et passage des cellules une par une dans la chambre d ’analyse

Système Fluidique

• Dans la chambre d’analyse : impact avec un faisceau LASER

• Lumière monochromatique cohérente

Paramètres Optiques

• «Eclairage de la cellules»

Taille relative : Forward Scatter ou FSC

Complexité cytoplasmique : Side Scatter SSC

• Excitation des fluorochromes et émission de fluorescence

Paramètres fluorescents

Pourquoi la cellule est-elle fluorescente ?

• Les cellules expriment des marqueurs antigéniques :

– Protéines

– Sucres

• En surface ou en intracytoplasmique

• Marqueurs classés en CD (Cluster de Differenciation)

• Sélection d’anticorps reconnaissant spécifiquement ces marqueurs

• Couplage des anticorps à différents fluorochromes

Signaux fluorescents recueillis :

– Nombre et type de marqueurs exprimés Qualitatif

– Densité d’expression Quantitatif

Conversion en données numériques

• Recueil des signaux optiques :

– Miroirs, filtres, photomultiplicateur

• Transformation en signaux électroniques pour une analyse informatique avec un logiciel dédié

• Mise en forme des données

• Analyse des graphes, positionnement des seuils de positivité et des populations d’intérêt, statistiques

Applications dans un Laboratoire de Recherche

• Etudes de la fonction Immune

• Cellules Hématopoïétiques

• Etudes Multi-drug résistance (cancer)

• Etudes cinétiques (fonction cellulaire)

• Analyse des plaquettes

• Détection des Microorganismes (Bactéries, Parasites)

• Analyse des échantillons de l’environnement (Giardia, Cryptospiridium)

• Détection Micro-Particules & Virus

• Immunophénotypage Leucémie et Lymphomes

• Suivi de la maladie résiduelle des hémopathies

• Immunophénotypage VIH

• Comptes Absolus CD4

• Numération cellules progéniteurs (CD34)

• Analyse des glycoprotéines plaquettaires

• Cycle cellulaire et ploïdie de tumeurs

• Numération des Réticulocytes

• Cross-Match (transplantation d’organe)

• Détection des Leucocytes Résiduels

Applications en Biologie Médicale

Cytogénétique

Caryotype

CultureMitoses

Classement des chromosomes

FISH

Hybridation in situ de sondes fluorescentes

• PCR : Polymerase Chain Reaction– Sur ADN– Sur ADN complémentaire RT-

PCR

Biologie Moléculaire

X2

X2

• Séquençage

X2

n Cycles=

2n copies

Biologie Moléculaire

PRAD1/BCL1/CCND1

14q32

11q13

VH DH JH

120kb

• Recherche d’équivalent moléculaire de translocation

– IgH-Bcl1 et t(11;14)

– IgH-Bcl2 et t(14;18)

• Recherche d’expression dérégulée d’un gène

– Cycline D1 (t(11;14))

• Recherche de transcrit de fusion

– BCR-Abelson et t(9;22)

D1D2D3

RT-PCR quantitative (RQ-PCR) pour le suivi des patients

0

25

50

75

100

0 0,001 0,01 0,1 0,2 0,5 1 5

N

PFCP

PV

Culture des progéniteurs hématopoïétiques

EEC

EEC = endogenous erythroid colonies

CFU-E

Formation des colonies érythroïdes « spontanées » in vitro

Conclusion : Orientation Diagnostique

Monotypiedouteuse

Lymphome T

CD19+5-Monotypie

CD19+5+Monotypie

Score 4-5 Score 1-2-3 Score bas 0-1-2-3Compléments CMF

LLCtypique :diagnostic

positifImmuno-

phénotypique

LNH du ManteauSLPC CD5+

(LLC atypique ou autre)

LNH Folliculaire LNH Zone marginaleL. à Tricholeucocytes

SLVLLNH lymphoplasmocytaire

L. Prolymphocytaire B (Galton)

Cytométrie en Flux

Syndrome mononucléosique

Hyperlymphocytose ou Lymphocytes atypiques

CytogénétiqueFISH

Anatomiepathologique

BiologieMoléculaire

Examens spécialisés complémentaires