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1
Le corrette procedure
nella gestione dei dati di laboratorio
Dino Spolaor
Agenzia veneta
per l’innovazione
del settore primario
Thiene
LE LEVE PER
LA QUALITA’ DEL DATO
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 2
IL METODO L’ANALISTA
2
3
Ripetibilità
Proficiency testing
Prestazioni
dell’analista
Test del G2
Riproducibilità
intralaboratorio
VALIDAZIONEMETODO
Verifica prestazione
metodo
Assicurazione qualità
dati analitici
Utilizzo
MR
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio
Validazione di metodi microbiologici (5.4.5)
REQUISITI TECNICI della norma ISO17025
3
UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 p.to 5.4.5
Scopo: confermare con esame e apporto di
evidenze oggettive che i requisiti per
l’utilizzazione prevista siano soddisfatti
Quandoa. metodi non normalizzati
b. progettati dal laboratorio
c. normalizzati utilizzati fuori Campo di
Applicazione
d. estensioni e modifiche di metodi normalizzati
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 5
VALIDAZIONE DI UN
METODO DI PROVA INTERNO
La validazione è sempre un bilancio fra
costi, rischi e possibilità tecniche
Alcune riflessioni …
• Conviene al laboratorio?
• Responsabilità legali?
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 6
4
REGOLAMENTO (CE) n. 2073/2005
sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari
Metodi di prova alternativi
Articolo 5
“L’impiego di metodi d’analisi alternativi è accettabile
quando tali metodi sono validati in base al metodo di
riferimento di cui all’allegato I e se è utilizzato un
metodo proprietario, certificato da una parte terza, in
base al protocollo definito nella norma UNI EN/ISO
16140 o ad altri protocolli analoghi accettati a livello
internazionale.
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 7
Organismi di validazione
AFNOR Validation - Certificato COFRAC
www.afnor-validation.org
MicroVal - Certificato Lloyd Register QA
www.microval.org
NordVal (costituito da 5 Paesi nordici)
http://www.nmkl.org/Engelsk/index.htm
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 8
5
ISO 17994:2014
• Water quality -- Requirements for the
comparison of the relative recovery of
microorganisms by two quantitative methods
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 10
ISO 16140-2:2016
Microbiology of the food chain -- Method
validation -- Part 2: Protocol for the validation of
alternative (proprietary) methods against a
reference method
11
Ripetibilità
Proficiency testing
Prestazioni
dell’analista
Test del G2
Riproducibilità
intralaboratorio
VALIDAZIONEMETODO
Verifica prestazione
metodo
Assicurazione qualità
dati analitici
Utilizzo
MR
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio
6
ISO/IEC 17025 - 5.4.2
Verifica prestazione metodo
Il laboratorio deve confermare che può
correttamente eseguire i metodi normalizzati
prima di metterli in opera per le prove e/o le
tarature. Nel caso di cambiamento del metodo
la conferma deve essere ripetuta.
Stabilire modalità e frequenza della verifica
- ripetibilità,
- uso materiali riferimento,
- proficiency testing
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 12
Assicurazione della qualità
dei risultati di prova (5.9)
REQUISITI TECNICI della norma ISO17025
7
16
Ripetibilità
Proficiency testing
Prestazioni
dell’analista
Test del G2
Riproducibilità
intralaboratorio
VALIDAZIONEMETODO
Verifica prestazione
metodo
Assicurazione qualità
dati analitici
Utilizzo
MR
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 17
UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 p.to 5.2
La Direzione deve assicurare la competenza di coloroche eseguono prove e/o tarature, valutano i risultati e
firmano i R. di P …omissis…
Il personale deve essere qualificato sulla base di
appropriata formazione ed addestramento, esperienza e/o
comprovata abilità… omissis…
Deve essere valutata l’efficacia delle azioni di formazioneed addestramento.
PRESTAZIONI ANALISTA
8
Qualifica del personale tecnico
Mantenimento della qualifica
• Prove di ripetibilità nello svolgimento delle
prove
• Partecipazione a prove valutative in circuiti
interlaboratorio
• Valutazione della qualità delle prestazioni
analitiche (es. G2)
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 18
19
Proficiency testing
Lab.1 Lab.2 Lab.3 … Lab.n
RIP
ET
IBIL
ITA
’
RIPRODUCIBILITA’
INTRALABORATORIO
A1
A2
B1
B2
RIPRODUCIBILITA’
INTRALABORATORIO
RIP
ET
IBIL
ITA
’
Campione 1
Tecnico A Tecnico B
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio
c
9
Qualifica del personale tecnico
Mantenimento della qualifica
• Prove di ripetibilità nello svolgimento delle
prove
• Partecipazione a prove valutative in circuiti
interlaboratorio
• Valutazione della qualità delle prestazioni
analitiche (es. G2)
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 20
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio
Stesso campione
analizzato dallo stesso operatore
10 volte o più
21
N.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
…
n
RIPETIBILITA’
Sr - Scarto tipo di ripetibilità
r - Limite di ripetibilità (2,8 x Sr)
10
Monitoraggio Ripetibilità
Campioni
analizzati in doppio
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 22
Qualifica del personale tecnico
Mantenimento della qualifica
• Prove di ripetibilità nello svolgimento delle
prove
• Partecipazione a prove valutative in circuiti
interlaboratorio
• Valutazione della qualità delle prestazioni
analitiche (es. G2)
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 23
11
CONFRONTO ANALITICOYOGURT E LATTI FERMENTATI
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 25
CENTRALE DEL LATTEDI VICENZA
ASSOLATTE
VENETO AGRICOLTURA
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 26
1P
.2
1H
.6 1N
.2
1P
.6
1L.2
1L.1
1L.6 1L.8
1B
.1
1F
.4 1P
.1
1P
.5 1H
.5
1H
.3
1P
.3
1P
.4
1N
.1 1F
.2
1Z
.3
1Z
.2 1U
.5
1U
.3
1U
.1
1Z
.4
1E
.1
1Q
.2
1F
.1
1H
.1
1H
.2
1L.3
1U
.2
1U
.4
1E
.2 1T
.4
1G
.1
1V
.2
1Z
.1 1T
.2
1T
.3
1L.7
1L.4
1L.5
1Z
.5 1Q
.1
1G
.2
1F
.3
1T
.1
1H
.4
1V
.1
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Z-s
co
re
LABORATORI
RISULTATI CONFRONTOConteggio di Streptococcus thermophilus
12
MONITORAGGIO
Proficiency testing
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 27
Qualifica del personale tecnico
Mantenimento della qualifica
• Prove di ripetibilità nello svolgimento delle
prove
• Partecipazione a prove valutative in circuiti
interlaboratorio
• Valutazione della qualità delle prestazioni
analitiche (es. G2)
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 28
13
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 32
10-2
10-3
50 45
6 8
VALUTARE L’OMOGENEITÀ GENERALE TRA LE DILUIZIONI
E TRA LE PIASTRE RIPETUTE
Valutare se le variazioni, rispetto ai dati attesi,
sono più elevate di quelle dovute al caso
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 33
Parametro G2
Costituisce una stima della varianza relativa checomprende tutte le componenti casuali dell’incertezza(distribuzione di Poisson, effetti dell’incertezza dei volumie l’incertezza di lettura delle conte)
Esprime il grado di proporzionalità dei conteggi
PROPORZIONALITÀ DEI CONTEGGI
14
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 35
ISO 14461-2:2005 IDF 169-2:2005
VALUTAZIONE DATI
Confronto delle conte di piastre parallelecon i dati riportati in Tabella 1 per valutare la
Conformità (Probabilità (P) 99%)
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 36
Tab. 1 - Piastre parallele
• Esempio. Conte: 193 e 142• Si cerca in Tab. 1 il valore più alto dei due e si controlla
che il valore della 2a piastra sia all’interno dell’intervallo della tabella.
• In questo caso 142 non è conforme
15
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 37
ISO 14461-2:2005 IDF 169-2:2005
VALUTAZIONE DATI
Confronto delle conte di 2 diluizioni con i dati riportati in Tabella 2 per valutare la
Conformità (Probabilità (P) 99%)
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 38
Tab. 2 – diluizioni in successione
Prima dil Diluizione successiva
Conte su diluizioni successive:
140 e 26.
Si cerca nella tab. 2 il valore della
prima diluizione considerata (140).
Si verifica se il secondo valore è
compreso nell’intervallo 6 e 25riportato nella stessa riga.
In questo caso il valore 26 è al di
fuori dell’intervallo (non conforme).
16
VALUTACONTEMICROINCERT MAXI
IDROINCERT PLUS
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 39
ADiluizione
1
Piastra 1
BDiluizione
1
Piastra 2
CDiluizione
2
Piastra 1
DDiluizione
2
Piastra 2
DILUIZ.
1
A vs B
DILUIZ.
2
C vs D
A vs C A vs D B vs C B vs D
310 8 N.A. N.A. NC NC N.A. N.A. N.A.
160 8 N.A. N.A. OK OK N.A. N.A. N.A.
334 9 N.A. N.A. NC NC N.A. N.A. N.A.
174 9 N.A. N.A. OK OK N.A. N.A. N.A.
174 5 N.A. N.A. NC NC N.A. N.A. N.A.
310 322 8 12 OK OK NC NC NC NC NC
151 160 8 9 OK N.A. NC OK OK OK OK
324 324 7 9 OK N.A. NC NC NC NC NC
167 167 8 9 OK N.A. NC OK OK OK OK
167 167 5 7 OK N.A. NC NC NC NC NC
CONTE PER PIASTRA
DI
DUE DILUIZIONI SUCCESSIVE
CONFRONTO
PIASTRE
PARALLELE
CO
NFR
ON
TO
DIL
UIZ
ION
I S
UC
CE
SS
IVE
(SO
MM
A C
ON
TE
) CONFRONTO
DILUIZIONI SUCCESSIVE
(PIASTRE SINGOLE )
CONTE VALUTATE SINTESI VALUTAZIONE
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 40
CONTROLLO QUALITA' ANALITICA (per singolo analista)STATISTICA DEI GIUDIZI ESPRESSI TRAMITE IL TEST DEL G2
Numerosità giudizi Giudizi %
TECNICI OK Critico NC TOT OK % Critico % NC %
Tecnico 1 41 1 1 43 95,3% 2,3% 2,3%
Tecnico 2 0 0 0 0 - - -
Tecnico 3 72 1 0 73 98,6% 1,4% 0,0%
Tecnico 4 30 1 1 32 93,8% 3,1% 3,1%
Tecnico 5 8 1 0 9 88,9% 11,1% 0,0%
Tecnico 6 1 0 0 1 100,0% 0,0% 0,0%
Tecnico 7 0 0 0 0 - - -
Tecnico 8 0 0 0 0 - - -
Tecnico 9 0 0 0 0 - - -
CONTROLLO QUALITA' ANALITICA (del laboratorio)
Numerosità giudizi Giudizi %
OK Critico NC TOT OK % Critico % NC %
LABORATORIO 152 4 2 158 96,2% 2,5% 1,3%
Monitoraggio della validità delle prove tramite la valutazione delle prestazioni analitiche
17
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 41
Analisi delle tendenze
UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 p.to 5.4.5
Tecniche utilizzabili per
determinare le prestazioni di un metodo
(una o in combinazione)
• Utilizzo di Materiali di Riferimento (MR/MRC)
• Confronto dei risultati ottenuti con altri metodi
• Confronti interlaboratorio
• Valutazione sistematica dei fattori che influenzano i risultati
• Stima dell’incertezza di misura dei risultati
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 42
18
Stima dell’incertezza di misura (5.4.6)
5.4.6.2 I laboratori di prova devono avere e devono applicare delle
procedure per stimare l’incertezza di misura. In certi
casi la natura dei metodi di prova può escludere il calcolo rigoroso
dell’incertezza di misura, valido dal punto di vista metrologico e statistico. In
questi casi … almeno tentare di identificare tutte le componenti dell’incertezza
e fornire una stima ragionevole …
REQUISITI TECNICI della norma ISO17025
REGOLAMENTO (CE) n. 2073/2005 DELLA COMMISSIONE del 15 novembre 2005 sui criteri
microbiologici applicabili ai prodotti alimentari
Nei consideranda si afferma che:
A norma dell’articolo 4 del regolamento (CE) n. 852/ 2004, gli operatori delsettore alimentare sono tenuti a rispettare i criteri microbiologici; a questoscopo, attraverso il prelievo di campioni, essi devono procedere a controlliper accertare il rispetto dei valori fissati per i criteri, eseguire analisi eprendere provvedimenti correttivi, conformemente alla legislazione inmateria di prodotti alimentari e alle istruzioni dell’autorità competente. Èpertanto opportuno stabilire misure di attuazione relative ai metodianalitici, compresi, ove necessario, l’incertezza di misura, il pianodi campionamento, i limiti microbiologici, il numero di unità analitiche chedevono risultare conformi a tali limiti.
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 44
19
LIMITE DI UNA SPECIFICA
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 45
soglia di conformità
ISO / TS 19036:2006
Microbiologia degli alimenti
Linea Guida per la stima dell’incertezza dimisura per le determinazioni quantitative
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 46
20
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio
Stesso campione analizzato
da operatori diversi
dello stesso laboratorio
contemporaneamente
48
RIPRODUCIBILITA’ INTRALABORATORIO
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio
INCERTEZZA DI MISURA (ISO/TS 19036:2006 )
4. DOVE va espressa?Sul R. di P.: come incertezza estesa U associata al risultato nella sua stessa forma (log, n°) oppure espressa in percentuale (%)
Definiti: Livello di probabilità p
Fattore di copertura k
Gradi di Libertà: N.A. Recupero: N.A.
49
U = 2Sr
21
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 50
RIPETIBILITA’
MATERIALI
RIFERIMENTO
PROFICIENCY
TESTING
TEST G2
INCERTEZZA
DI MISURA
METODO ANALISTA
ISO 7218:2007 / Amd 1:2013
ARROTONDAMENTI: 2 cifre significative
ESPRESSIONE DEL RISULTATO:
- numero (N) compreso tra 1,0 e 9,9 (moltiplicato per
l’appropriato fattore 10, relativo alla prima diluizione
considerata) o come numero intero
UNITA’di MISURA: microorganismi (UFC) /g o ml
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 55
22
Risultato e intervallo di fiducia
210.000
190.000
170.000
Limite superiore
Limite inferiore
UFC/g185.818
214.970
166.670
Valori non arrotondati
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 56
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 59
Espressione del risultato
0
3
1
2
4
5
8
6
7
9
10
m.o. inferiori a 1 /Vd g o ml
m.o. presenti ma inferiori a 4 /Vd g o ml
UFC stimate per g o ml
UFC per g o ml
23
Grazie per l’attenzione
Dino [email protected]
D.Spolaor - Le corrette procedure nella gestione dei dati di laboratorio 60