よくあるLC/MSトラブルとその解決法～サポートセンターのノ … · 複数回インジェクションに適す ©2013 Nihon Waters K.K. 15 穴が開くまではPTFEとして、穴が開いた後はシリコンとしての対薬品性

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よくあるLC/MSトラブルとその解決法

～サポートセンターのノウハウ大公開～

日本ウォーターズ株式会社

©2013 Nihon Waters K.K. 1

JASIS 2013 新技術説明会

9月4日（水） 15:50～16:15

感度に関するトラブル

キャリーオーバ及びゴーストピークに関するトラブル

再現性に関するトラブル

本日の内容本日の内容


MS検出器の問題？

分析に関するトラブルは、原因がMS側に起因するのか、LC側の問題なのか、それともカラムに由来するのかを見極める事が重要です。


ポンプの送液の問題？

サンプル注入に関する問題？

カラム分離に関する問題？検出器問題

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感度低下の原因分類と確認方法感度低下の原因分類と確認方法

標準品– 保存中の分解→再調製

試料注入– 注入正確性の低下→注入量を変えて測定（レスポンスの直線性を確認）

– 試料残量の低下→試料量を増やす

LC/MSシステムにおける分解– UVで分解、熱分解→装置構成や測定条件を変更していないかどうか

LC/MSシステムへの吸着（バイアルを含む）– バイアルやカラムへの吸着→濃度を変えて測定（レスポンスの直線性を確認）


イオン化の抑制– カラムの劣化による分離能の低下、移動相の汚染、LC/MSシステムの汚染

→感度低下前と異なる点がないかどうか

MS内の透過量の低下– MSの汚染→感度確認用の標準試料を測定（システムチェック）

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感度に関するトラブル感度に関するトラブルフローチャート例フローチャート例

今までは測定可能標準溶液の問題の可能性Yes 標準溶液再調製

(標準溶液の原因か否か探る)

Yes

N

分析条件は変更していない

No

LC、MS、カラムなどトラブルの原因箇所の切り分け

Yes

No 以前の条件で再測定(メソッド類が原因か否か探る)

No


今回、初めてメソッド開発分析対象物質は、そもそもLC/MSでイオン化するのか？分析対象物質の構造式や化学的特性は調べたか？

分析条件の最適化

Yes

Yes

測定条件の確認方法測定条件の確認方法過去と現在のメソッドの設定過去と現在のメソッドの設定//実測内容実測内容

感度良好時（過去）のクロマトグラムとExperimental Record

感度低下時（現在）のクロマトグラムとExperimental Record


これらの内容を比較(印刷も可能)

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見えない妨害成分によるマトリックス効果見えない妨害成分によるマトリックス効果

的成分グ

目的成分

高濃度にリン酸塩を含む試料を測定

リン酸イオンのSIMネガティブモード、MSスキャン

目的成分のクロマトグラムポジティブモード、MRM


移動相Bのプロファイル(%)

LCLCの洗浄方法の洗浄方法例例


参考文献：MSメソッド開発時などのLC洗浄方法、サポート番号:TUTR134684447http://www.waters.com/japan_masslynx_tips

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MSMS洗浄方法洗浄方法例例

6000回血漿検体分析後

1.21e3

100

%

Reserpine_004 MRM of 1 Channel ES+ 609.25 > 195

1.21e3S/N:PtP=94.73

分析後

0

サンプルコーン洗浄後

1.16e5

0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30Time0

100

%

Reserpine_005 MRM of 1 Channel ES+ 609.25 > 195

1.16e5S/N:PtP=2059.45


P/N ： 1402271品名： POLISHING COMPOUND (HYPREZ)



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キャリーオーバ及びゴーストピークのキャリーオーバ及びゴーストピークの原因分類と確認方法原因分類と確認方法

キャリーオーバ

– 1回以上前に注入した測定成分が、その後の測定において検出されること

– ニードルの洗浄不足注入バルブへの残留→オートサンプラーを使わずに測定ニドルの洗浄不足、注入バルブへの残留→オトサンプラを使わずに測定

ゴーストピーク

– 測定成分とは異なる成分が検出され、測定上の妨害となること

– 移動相→移動相交換、または、グラジェントの平衡化時間を変えて測定

– カラム→カラムを外す、または、カラムを交換

– LC/MSシステムに由来→カラムを外す、システムの洗浄

– バイアルの内部→バイアルの変更、バイアル洗浄後に測定


– バイアルの蓋→蓋を外して測定

キャリーオーバとゴーストピークに関するトラブルキャリーオーバとゴーストピークに関するトラブルフローチャート例フローチャート例

ブランクサンプルを数回連続注入してピーク強度が下がる

キャリーオーバYes

No

ニードル洗浄液の種類の見直しニードル洗浄回数や量の見直し

LCシステム、インジェクタ、カラム、サンプルバイアルなどゴーストピーク原因箇所の切り分け


まず最初に、インジェクタを動かさずに分析(Empower-プレップ注入、MassLynx-グラジエントブランク)※MassLynx Tips参照

ピークが検出したら・・・

移動相、カラム、またはLCシステム由来


ピークが検出しなかったら・・・

インジェクタ、またはサンプルバイアル由来移動相交換、及び、カラム有り無しなどで何処由来かを確認

0(ゼロ) mL注入で通常分析を行い、ピークが検出するかどうかを確認

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キャリーオーバ及びゴーストピークのキャリーオーバ及びゴーストピークの対処方法対処方法

キャリーオーバ

– ニードルの汚染

o 測定成分が溶解する溶媒測定成分溶解する溶媒

高極性→水の割合を増やす、低極性→有機溶媒を増やす

o 酸、又は、アルカリの添加→溶解度を高めるようにpHを調製

– バルブへの残留

o 注入前にバルブを駆動


– 移動相

o 測定ごとに調製 LC/MSグレードベンダーを変更


o 測定ごとに調製、LC/MSグレド、ベンダを変更

– カラム、LC/MSシステム

o 「MSメソッド開発時などのLC洗浄方法」を実行

– バイアルの内部及び蓋

o バイアルの変更

バイアル選択例バイアル選択例


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セプタムの素材・デザイン特徴

PTFE ▪ 1回限りのインジェクションに適す

▪ 対溶媒性・対薬品性に優れる

バイアル選択例バイアル選択例蓋の材質と特徴蓋の材質と特徴

▪ 対溶媒性・対薬品性に優れる

▪ サンプルの長期保存には適さない

PTFE/シリコン ▪ 複数回インジェクションやサンプルの保存に適す

▪ 複数回の使用でも高い密閉性を維持

▪ 穴が開くまではPTFEとして、穴が開いた後はシリコンとしての対薬品性

プレスリットPTFE/シリコン ▪ サンプル吸引時の陰圧状態を防ぎ、サンプル吸引量の再現性に優れる

▪ 高い密閉性を維持

▪ 複数回インジェクションに適す


▪ 複数回インジェクションに適す

▪ 穴が開くまではPTFEとして、穴が開いた後はシリコンとしての対薬品性

セプタムレスPE（ポリエチレン） ▪ 対溶媒性・対薬品性に優れる

▪ セプタム使用しないためセプタム脱落等のトラブルなし

▪ 1回限りのインジェクションに適す

▪ 穴が開くまでは密閉状態

▪ PFOSやPFOAなどのパーフルオロ化合物分析の際にリスクがない



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再現性低下の原因分類と確認方法再現性低下の原因分類と確認方法

測定メソッド

– データポイント数が適切でない→メソッドと生データのクロマトグラムを確認

試料注入試料注入

– 注入精度の低下→試料を計量するシリンジのプライムの前後で、標準溶液の連続測定結

果を比較

マトリックス効果

– 試料由来のマトリックスがカラムに残留し、後の試料に影響

→標準溶液の連続測定を、実試料の連続測定の前後で実施

MSイオン源


– イオン化（液滴形成と溶媒の気化）が不安定→ESIのキャピラリー交換の前後で、標準溶

液の連続測定結果を比較

再現性に関するトラブル再現性に関するトラブルフローチャート例フローチャート例

ピークの開始点～終了点までのデータポイント数15ポイントの確認済

No 現在のデータポイント数の確認とMSメソッドのDwellTime調整

Yes

標準溶液の連続注入(n=6以上)で確認

No Yes

Yes

サンプルシリンジのプライムは実施済み

No

Yes

日間差や挟み込み分析の再現性を問題にしているのであれば、まずは標準溶液の連続注入を実施。その結果、再現性の問題は無し。

Yes

装置的な問題は無し。日が変わるところで何か変化はなかったかを確認。挟み込み分析の場合は、未知試料の分析を行ったことで再現性に問題が生じたと考えられる。No

サンプルシリンジのプライムを実施後、標準溶液の連続注入を再確認


※基本的な診断パターンです

オートサンプラー(サンプルシリンジ、洗浄シリンジ、ニードルシール)のリークテストを実施

Yes日間差、または挟み込み分析の合間で、カラム洗浄メソッドを入れる(InletPreRun、InletPostRun)イオン源（ESIスプレー）のメンテナンス

等

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測定メソッドの設定測定メソッドの設定データポイント数の確認データポイント数の確認

データポイント1コをプロットするのに必要な時間がDwell Time

1つのピーク当たり15ポイント程度のデータポイントが理想

データポイントが足りないため、再現性悪い

クロマトグラム画面：[Display]メニュ → [View] で横軸表示を[Time]から[Scan]へ


マウスで右ドラッグした範囲のデータポイント数を表示しています。

クロマトグラムの横軸を[Scan]にすると、データポイントを確認する事ができます。

試料注入の精度試料注入の精度サンプルシリンジのプライム（エアーの除去）サンプルシリンジのプライム（エアーの除去）

試料が計量される経路


FLタイプのインジェクタの流路図

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マトリックス効果マトリックス効果挟み込み分析による確認挟み込み分析による確認

標準溶液サンプル(1回目)

未知試料サンプル



マトリックス効果マトリックス効果試料測定後にカラム洗浄メソッドを追加試料測定後にカラム洗浄メソッドを追加

標準溶液サンプル(1回目)(1回目)

未知試料サンプル



分析後に実行されるInletMethod (注入操作は無し)

分析前に実行されるInletMethod (注入操作は無し)カラム洗浄の効果が認められれば、測定で使用するLCのメソッドの洗浄時間や有機溶媒組成を変更する

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イオン源における液滴形成、溶媒気化が不

安定になると再現性が低下する可能性

移動相の有機溶媒組成が低く、移動相の

イオン源イオン源キャピラリーの劣化キャピラリーの劣化

機

流速が高い場合には、脱溶媒ガスの温度

及び流量を高めに設定する

イオン化の際には、試料溶液が通るステンレ

スキャピラリーには、数kVの高電圧がかかる

ため、ステンレスキャピラリーは徐々に先端が

劣化（表面が平滑ではなくなる）してくるESIイオン源


それに伴い、スプレーが不安定になる可能

性がある




本日の内容本日の内容


MS検出器の問題！

分析に関するトラブルは、原因がMS側に起因するのか、LC側の問題なのか、それともカラムに由来するのかを見極める事が重要です。

• 丹念に原因を切り分け、同一条件の測定を最低2回以上繰り返す

• 原因の可能性があるものを排除し、問題が解決したら、一つ一つ元に戻し、原因を特定する


ポンプの送液の問題！

サンプル注入に関する問題！

カラム分離に関する問題！検出器問題

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（参考）トラブルシューティング（参考）トラブルシューティング操作ガイド集操作ガイド集 --MassLynxMassLynxhttp://www.waters.com/japan_masslynx_tips http://www.waters.com/japan_masslynx_tips


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