LISTA DE ABREVIATURAS

ABTScido 2,2-azino-bis-(3-etilenbenzotiazolina-6-cido sulfnico) APCIIonizacin qumica a presin atmosfricaCCCromatografa en columna

CCCCromatografa en contra corriente

CCDCromatografa en capa delgada

CPCromatografa en papel DPPH2,2-difenil-1-picrilhidrazilo EMEspectro de masasEPRResonancia electrnica paramagntica

ESIIonizacin Electrospray

HPLCCromatografa lquida de alta eficiencia

HPLC-DADCromatografa lquida de alta eficiencia acoplada a un detector de arreglo de diodosHPLC-EMCromatografa lquida de alta eficiencia acoplada a espectrometra de masasRMNResonancia magntica nuclear

TOFTiempo de vuelo

CONTENIDO

Pgina

RESUMEN INTRODUCCIN1ESTADO ACTUAL DEL TEMA61.1DESCRIPCIN DE LAS FRUTAS ESTUDIADAS61.2ANTOCIANINAS91.2.1 Generalidades.91.2.2 Biosntesis de las antocianinas.111.2.3 Antocianinas en frutas.161.2.5 Extraccin y purificacin de antocianinas.191.2.6 Anlisis de antocianinas por espectrofotometra UV-Vis.211.2.7 Anlisis por cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas (LC/MS)231.3DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE MEDIANTE EL USO DE ESPECTROFOTOMETRA UV-Vis301.4DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR RESONANCIA ELECTRNICA PARAMAGNTICA (EPR)351.5APLICACIN DE COLORIMETRA TRIESTMULO EN LOS EXTRACTOS DE ANTOCIANINAS2METODOLOGA412.1MATERIAL VEGETAL412.2OBTENCIN DEL EXTRACTO ENRIQUECIDO EN ANTOCIANINAS (ERA)412.3ANLISIS POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTAEFICIENCIA (HPLC-DAD)422.4ANLISIS POR HPLC- MS-IT-TOF432.5DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE442.5.1 Obtencin de los extractos para actividad antioxidante.442.5.2 Determinacin de la actividad antioxidante por el mtodo45

TEAC-espectroscopa UV-Vis.2.5.3 Determinacin de la actividad Antioxidante frente al radical45DPPH por espectroscopa UV-Vis.

2.6DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE PORESPECTROSCOPA DE RESONANCIA PARAMAGNTICA (EPR).46

2.7ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DEL COLOR DE LOS ERA47

2.8ANLISIS ESTADSTICO83RESULTADOS Y DISCUSIN49

3.1DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN ANTOCINICA DE LOS ERA49

3.2DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS ERA93.2.1Espectroscopia UV-Vis.593.2.2Espectroscopia EPR.61

3.3EFECTO DEL PH Y TIEMPO DE ALMACENAMIENTO SOBRE ELCOLOR DE LOS ERAS65

4CONCLUSIONES78BIBLIOGRAFIA84

RESUMENColombia produce una amplia gama de frutas tropicales, de las cuales existen muy pocos estudios qumicos. La investigacin en el campo de los pigmentos naturales provenientes de frutas, permite establecer el potencial de ellas como alimento con propiedades biofuncionales y el desarrollo de productos con valor agregado que puedan ser usados como colorantes naturales. En este trabajo se realiz el anlisis cualitativo y cuantitativo de los pigmentos antocianicos en cuatro frutas tropicales colombianas:uvaderbol(Myrciaria affcauliflora(Mart.)D.Bery),coral (Hyeronima macrocarpa Mull. Arg), mora pequea (Rubus megalococcus Focke) y motiln(HyeronimamacrocarpaMull.Arg).Seobtuvieronlosextractos enriquecidos en antocianinas (AREs) por adsorcin selectiva sobre Amberlita XAD-7 del extracto metanlico de las frutas. Estos extractos se analizaron por cromatografa lquida acoplada a un detector de arreglo de diodos (LC-DAD) y cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas con interfase electrospray (LC/MS-ESI). Estos anlisis junto con la coinyeccin con patrones permitieron elucidar la estructura de la mayora de los compuestos. La cuantificacin se realiz mediante el mtodo de estndar externo.

Los anlisis realizados en el coral y el motiln, confirmaronla presencia de la antocianina delfinidina-3-rutinsido como compuesto mayoritario, seguido por delfinidina-3-glucsido, cianidina-3-rutinsido y petunidina-3-rutinsido.En estas dos frutas se identificaron las mismas antocianinas, siendo mucho mayor la concentracin en el motiln que en el coral.En la mora pequea se confirm la presencia de cianidina-3-glucsido como compuesto mayoritario junto con cianidina-3-rutinsido; y en la uva de rbol se identific la antocianina cianidina-3-glucsidocomo compuesto mayoritario junto con la antocianina delfinidina-3-glucsido.Posteriormente se evalu la actividad antioxidante de los extractos de las cuatro frutas frente a los radicales libres ABTS y DPPH mediante espectroscopa UV-Vis y EPR (Resonancia electrnica paramagntica). Con los resultados de espectroscopa UV- Vis se determin que el extracto ms activo fue el de motiln, seguido por el de uva, coral y mora. El uso de la tcnica de EPR permiti seguir el curso de la reaccin de atrapamiento de los dos radicales libres por las sustancias antioxidantes presentes en los AREs, observando una disminucin en la concentracin de radicales libres con el tiempo y una cintica de segundo orden. Al aplicar dicho modelo cintico, se confirm que el extracto ms activo frente a los dos radicales libres era el de motiln, y que frente al ABTS se encontraban diferencias de actividad ms significativas que con el DPPH. La tcnica de EPR es ms exacta porque permite la evaluacin directa de la cantidad de radicales libres en solucin.

Finalmente, se evalu la estabilidad de los diferentes extractos frente a variaciones de pH y durante un periodo de almacenamiento de un mes. Se confirm que el pH es un factor que afecta significativamente el color de los AREs y con base en las medidas de colorimetra triestimulo a diferentes pHs (1.5, 3.5, 5.5 y 7.5) se concluy que el extracto ms estable era el de uva de rbol porque se encontraron menores variaciones en el croma con respecto a las otras frutas.

Con estos resultados se comprob que las frutas estudiadas son una fuente promisoria de pigmentos naturales, siendo ms interesantes el motiln y la uva de rbol debido a su contenido de antocianinas, actividad antioxidante y estabilidad delcolor de los extractos.

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INTRODUCCIONEl consumo de frutas y verduras ha demostrado su efectividad en la prevencin de algunas enfermedades en los seres humanos y en los animales. Las hortalizas, frutas y sus semillas son ricas en vitaminas como C y E,-caroteno y polifenoles como proantocianidinasy antocianinas.Estoscompuestospodranprotegeralos organismos contra lesiones causadas por radicales libres1.

Entre estos compuestos, las antocianinas son pigmentos naturales que se clasifican dentro del grupo de los flavonoides. Se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y son responsables de los colores rojo, violeta y azul de frutas, bayas y flores. En las plantas la principal funcin que cumplen es la de atraer seres vivos (principalmente insectos y pjaros) para propsitos de polinizacin y dispersin desemillas2. Estos compuestos polifenlicos son solubles en agua, lo cual facilita suincorporacin en una gran variedad de sistemas alimenticios acuosos.Recientemente su estudio ha tomado importancia no solo debido a su actividad antioxidante sino tambin a sus posibles beneficios para la salud humana ya que se ha relacionado su consumo con la reduccin de la incidencia de enfermedades como el cncer, enfermedades cardiovasculares y otras patologas 3 . Por ejemplo algunos artculos sugieren que las estructuras qumicas de las antocianinas tienen un impacto significativo en su actividad biolgica, y los datos sugieren que las antocianinas monoglicosiladas y no aciladas son los ms potentes inhibidores de la proliferacin y crecimiento de las clulas de cncer de colon4. Estudios actuales sobre la actividad biolgica de las antocianinas muestran que estas podran sustituir algunos frmacos usados en el tratamiento de diferentes enfermedades. Es as como el extracto crudo de antocianinas de Vaccinium myrtillus fu administrado por va oral e intravenosa para reducir la fragilidad y la permeabilidad capilar de los vasos sanguneos 5 . Se hademostrado tambin que fracciones de antocianinas provenientes del vino son

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efectivas para atrapar especies reactivas del oxgeno (ROS), adems de inhibir la oxidacin de lipoprotenas y la agregacin de plaquetas.

A pesar de los beneficios antes mencionados, un tema controversial es la biodisponibilidad de las antocianinas en el ser humano, ya que metablicamente las antocianinas parecen ser muy diferentes de otros flavonoides con cantidades de excrecin mucho mayores en la orina en relacin con la cantidad consumida 6 . Mientras que la ciencia est empezando a sealar el gran potencial y los beneficios de los polifenoles, investigadores de la Universidad de Houston encabezados por el Dr. Ming Hu, han expresado que se deben realizar investigaciones sobre la biodisponibilidad y utilizacin de los antioxidantes, especialmente polifenoles, conel fin de ayudar al xito en la implementacin de los mismos como agentes quimio- protectores en el futuro7.

De acuerdo con los datos presentados por la OMS/FAO en el informe sobre la salud en el mundo del 2003, la ingesta insuficiente de frutas y verduras es uno de los 10 factores deriesgo principales quecontribuyenalamortalidadatribuible. Adicionalmente el informe plantea que la integracin de las frutas y verduras en la dieta diaria podra ayudar a prevenir importantes enfermedades no transmisibles, como las enfermedades cardiovasculares y algunos cnceres. El consumo de frutas y verduras variadas es beneficioso porque garantiza un consumo suficiente de la mayora de los micronutrientes, de fibra dietaria y de una serie de sustancias no nutrientes esenciales; adems, el aumento del consumo de frutas y verduras puede ayudar a desplazar los alimentos ricos en grasas saturadas, azcares o sal. Actualmente el consumo estimado de frutas y verduras es muy variable en todo el mundo,oscilandoentre100g/daenlospases menosdesarrolladosyaproximadamente 450 g/da en Europa Occidental8.

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En Colombia la gran biodiversidad de bayas, frutos, flores y plantas est determinada por la gran variedad de los pisos trmicos que ofrece la geografa Colombiana. Esta ventaja competitiva que nos ofrece nuestra riqueza natural nos permite plantear el presente trabajo con el objeto de evaluar y cuantificar la composicin antocinica de especies silvestres colombianas promisorias para el desarrollo de productos benficos para la salud humana como los colorantes naturales . Los frutos seleccionados fueron: La uva de rbol (Myrciaria cauliflora (Mart.)D.Bery), coral (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg), mora pequea (Rubus megalococcus Focke)y motiln (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg). Adicionalmente se evalu la actividad antioxidante in vitrode los extractos de estas frutas mediante espectroscopa UV-Vis y EPR.

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1ESTADO ACTUAL DEL TEMA

1.1DESCRIPCIN DE LAS FRUTAS ESTUDIADAS

La fruta Mora pequea (Rubus megalococcus Focke) (Rosaceae) (Figura 1) es una planta de vegetacin perenne, de porte arbustivo semierecto, conformada por varios tallos espinosos que pueden crecer hasta tres metros. Las hojas tienen tres foliolos, ovoides de 4 a 5 centmetros de largo con espinas ganchudas, las inflorescencias se presentan en racimos terminales aunque en ocasiones se ubican en las axilas de las hojas. La fruta es esfrica o elipsoidal de tamao variable, 1.5 a 2.5 cm, en su dimetro ms ancho, de color verde cuando se estn formando, pasando por un color rojo hasta morado oscuro cuando se maduran. Es originaria de las zonas altas tropicales de Amrica principalmente en Colombia, Ecuador, Panam, Guatemala,onduras, Mxico y Salvador9. Hasta el momento no existen estudios qumicos deesta especie.

Esta especie pertenece al gnero Rubus, el cual comprende unas 250 especies que se distribuyen en todo el mundo. Las frutas de esta especie son conocidas por ser ricas en vitaminas A, B y C, y se afirma que las races y las hojas tienen propiedades medicinales10. Recientes investigaciones han reportado la presencia de antocianinas en la fresa y en la mora en proporciones de 6 mg/kg y 508 mg/kg de cianidina-3- glucsido, respectivamente 11 , 12 y de acuerdo a las investigaciones dichas antocianinas son responsables del color rojo de dichas frutas en un espectro visiblemax=506 nm,

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Figura 1. Mora (Rubus megalococcus Focke)

La uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora. (Mart.)D.Bery) (Myrtaceae) (Figura 2), tambin conocida como guapur o jaboticaba, pertenece a la familia Myrtaceae al igual que otras ms conocidas como la guayaba, la feijoa y el camu-camu. Es un pequeo rbol de aproximadamente 2 metros de alto, ramificado, de corteza lisa que se desprende fcilmente y que crece generalmente bajo la sombra de rboles ms grandes. Sus frutos producen la impresin de estar pegados al tallo de 3-4 cm de dimetro, se concentran en el tronco principal y las ramas gruesas. Son morados al principio y negros al madurar. Se consume directamente como fruta fresca, pero tambin se usa para preparar refrescos, mermeladas, licores y vinagres caseros, entre otros productos. Adems, la cscara del tallo y del fruto es una eficaz medicina para la diarrea. 13 En esta especie se ha encontrado la presencia de taninos y de las antocianinas, cianidina-3-glucsido y delfinidina-3-glucsido.14,15 Esta fruta tambin ha mostrado actividad antioxidante ( IC50 = 35 g/mL de extracto) 16,17

En Colombia la industria de los colorantes naturales representa una oportunidad para el mercado, dada las actuales tendencias de usar compontes naturales para el consumo humano enmarcado en el importante papel que estos juegan en la salud humana.

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Figura 2. La Uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora (Mart.)D.Bery) 18

Las frutas coral (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg, Euphorbiaceae) y motiln (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg, Euphorbiaceae) (Figura 3) pertenecen al mismo gnero Hyeronima el cual consta de 15 especies distribuidas en Amrica tropical. Hyeronima macrocarpa es un rbol de corteza agrietada y griscea, de hojas elpticas, densamente lepidotadas de 4-9 cm de longitud y 2.5 4 cm de ancho, pecolos entre2-2.5 cm de longitud, inflorescencias axilares y subterminales, flores verde amarillentas, fruto elipsoide casi esfrico, rojo a morado al madurar, de hasta 1 cm de longitud en el coral y 2 cm en el motiln. Estas especies son promisorias para uso alimenticio y como fuente de pigmentos y hasta el momento no hay estudios qumicos publicados a excepcin de un trabajo realizado en motiln de Nario donde se evalu la actividad antioxidante y la eficiencia antiradical de extracto de la pulpade esta fruta.19 A pesar de haber sido identificadas como pertenecientes a la mismaespecie, estas frutas presentan caractersticas diferentes que ameritan un estudio botnico profundo para definir su variedad.

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Figura 3. Motiln y Coral (Hyeronima macrocarpa Mll.Arg)

1.2ANTOCIANINAS

1.2.1 Generalidades. Las antocianidinas (agliconas) son la estructura bsica de las antocianinas (Figura 4a). Constan de un anillo aromtico (A) unido a un anillo heterocclico (C) que contiene oxgeno, el cual est unido por un enlace carbono- carbono a un tercer anillo aromtico (B). El esqueleto bsico de las antocianinas es el2- fenilbenzopirilio de la sal de flavilio con diferentes sustituciones20. Cuando las

antocianidinas estn en su formaglicosidada se conocen como antocianinas. Los monosacridos comnmente encontrados son D-glucosa, L-ramnosa, D-arabinosa y D-xilosa (Figura 4b) aunque tambin pueden contener oligosacridos como gentobiosa, rutinosa y soforosa. Normalmente los monosacridos se unen con los grupos hidroxilo de la posicin 3 de la antocianidina, mientras que los disacridossustituyen los hidroxilos 3 y 5 o los de la posicin 3 y 721.

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Figura 4 (a). Estructura bsica de las antocianidinas 22(b). Estructura de los monosacridos ms comunes encontrados en las estructuras de las antocianinas23Se ha demostrado que las antocianinas relativamente simples son ms estables en un medio cido que en un medio neutro o alcalino. En medio cido la forma predominante es la del in flavilio, el cual da el color rojo; a medida que el pH se eleva, las antocianinas se transforman en una base quinnica de color azulado (Figura 5). El color de estas molculas fue explicado por primera vez en 1939 por Pauling, quien propuso que la estructura resonante del in flavilium era el responsable de la intensidad de su color.

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Figura 5. Cambios en la estructura de las antocianinas a diferentes valores de pH21

1.2.2 Biosntesis de las antocianinas. Los compuestos fenlicos son biosintetizados por varias rutas, entre las cuales sobresalen la del cido shikmico y la del cido malnico. En la ruta del cido shikmico, los carbohidratos simples derivados de la gliclisis, de la ruta de las pentosas fosfato y del ciclo de Calvin se convierten en diversos cidos orgnicos como el cinmico, p-coumrico, cafeico, ferlico, clorognico y fenilalanina. En el paso principal de la biosntesis de flavonoides, ordinariamente el p-coumaril-CoA, derivado de la L-fenilalanina en el metabolismogeneral del fenilpropanoide entra en una reaccin de condensacin con tres

molculas de malonil-CoA para formar un intermediario chalcona (C

). El Ces1515

formado para dar el precursor de la antocianina, por ej. El flavan-3,4-diol, que es transformado al catin flavilio antocianidina por una hidroxilacin en el C-2 seguida por dos deshidrataciones 24 (Figura 6). Finalmente, la molcula se estabiliza porglicosilacin del O-heterociclo, luego suceden las posteriores modificaciones de la

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antocianina que incluyen una hidroxilacin adicional, metilacin de los grupos hidroxilos, posterior acilacin y glicosilacin25.

Figura 6. Ruta general de la biosntesis de antocianinas.26

La fenilalanina amonio liasa (PAL), primera enzima en la ruta, juega un papel central en dirigir la sntesis hacia metabolitos secundarios y por ello ha sido extensamente estudiada. Un estudio realizado por Aoki et al27., Demostr que la actividad PAL en frutos de fresa maduros es mucho mayor que en frutos verdes. As, se encontr una correlacin muy estrecha entre la actividad de PAL y la concentracin deantocianinas, que se incrementa durante la maduracin28.

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1.2.3 Antocianinas en frutas. El estudio de las antocianinas en frutas tropicales, ha tomado fuerza la ltima dcada no solo por la capacidad colorante29, sino tambin por su capacidad antioxidante30. Es as como los extractos de distintas frutas como mora, frambuesa y diferentes cultivos de grosella han demostrado actuar de manera eficaz como inhibidores de radicales libres31.

Muchas frutas son ricas en antocianinas y en la mayora de los estudios publicados se ha realizado la identificacin y cuantificacin de estos pigmentos por HPLC-EM y HPLC-DAD. Mazza y Miniati han publicado una extensa revisin sobre antocianinas en frutas tropicales hasta el ao 1987 encontrando cerca de 20 compuestos responsables del color rojo en frutas32. Durante los ltimos aos se ha publicado la composicin de los pigmentos de una gran variedad de plantas de diferente origen geogrfico, de diferentes familias y con diferentes mtodos de extraccin.33,34 En unestudio realizado por De Brito et al 35, se realiz la identificacin y cuantificacin de

antocianinas en algunas frutas tropicales: acerola (Malphigia emarginata), jussara (Euterpe edulis), jambolo (Cumini syzygium) y Guajiru (Chrysobalanus icaco), por cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas, con el fin de demostrar la presencia de antocianinas en frutas tropicales. Se encontraron las antocianinas: cianidina, delfinidina, pelargonidina, petunidina y malvidina encantidades apreciables (75mg/100g y 275mg/100g peso seco). Vasco et al.Error! Bookmark not defined., Realizaron una investigacin en algunos frutos ecuatorianospara identificar y cuantificar los compuestos fenlicos responsables de la actividad antioxidante en estos frutos, se estudiaron tres pertenecientes a la familia de las Rosaceas (mora andina, fresa y ciruela capuli), otra especie de la familia Ericaceae (mortio) y tres frutas de la familia Passifloraceae. Entre los compuestos fenlicos encontrados, la antocianina cianidina estuvo presente en todos los frutos, ladelfinidina solo se encontr en el mortio y la pelargonidina en la fresa.

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Recientemente se han publicado varios estudios dedicados a la bsqueda de nuevas fuentes vegetales ricas en antocianinas (Tabla 1), entre las cuales se encuentran uvas, repollo morado, aceitunas, grosellas, manzanas, fresas, ciruelas y cerezas, entre otras.

Tabla 1. Composicin antocinica de algunas frutas tropicales

Nombre comn

Nombre CientficoAntocianina

Dp-3-O--glucopiransido

Uva CaimaronaPourouma cecropiifolia

Cy-3-O--glucopiransidoCy3-O--(malonil) glucopiransido36

Acerola

Jambolao

Malphigia emarginataCy-3-ramnsido, Pn-3-ramnsido

Syzygium cuminiDp-3-galactpiranosido,Pt-3-galactopiransidoDp-3-(6-acetil) galactopiransido.Pt-3-(6-acetil)galactopiransido,Dp-3-(6-

Jussara

Guajiru

Euterpe edulis

Chrysobalanus icaco

acetil) glucsido, Pt-3-(6 succinil) ramnsido,Pn-3-(6succinil) ramnsidoDp-3-5,diglucsido,Cy-diglucsido,Pt- diglucsido, Pn-diglucsido, Mv-diglucsido-3- sambubisido, Cy-3-glucsido, Cy-3-rutinsido, Pg-3-glucsido,Pg-3-rutinsido,Cy 3- ramnsido.Dp-3-O--glucopiransido, Cy-3-O--

BacuauEugenia umbelliflora

glucopiransido, Pt-3-O--glucopiransido Pg-3-O--glucopiransido, Pn-3-O-- glucopiransido, Mv-3-O--glucopiransido37

Manzana estrella

ChrysophyllumCainito

Cy-3-O--glucopiransidoCy-O--glucopiransido

Surinam cherry

Jaboticaba

Eugenia unifloraCy-3-O--glucopiransido

Myrciaria CaulifloraDp-3-O--glucopiransido38

Mango Chirimoya zapote

Mangifera indicaCy-diglucsido, Pt.diglucsido, Pn-diglucsidoAnnona cherimoliaMill.Cy-3-O--glucopiransido

Calocarpum zapotaPg-3-glucsido,Pg-3-rutinsido,Cy-3- ramnsido.Error!Bookmarknot defined.

corozoBactris guineensisCy-3-sambubisido,cy-3-glucsido,cy-3- rutinsido, Pn-3-glucsido, Pn-3-rutinsido, Cy-3-(6-O-malonil) glucsido.39

Mv: Malvidina, Pn: Peonidina, Cy: cianidina, Pg: pelargonidina, Dp:delfinidina

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En general el contenido total de antocianinas en frutas puede estar entre 20 y 1000 mg

/100g de fruta fresca (Tabla 2). En algunos estudios la cuantificacin se realiz por HPLC usando el mtodo de estndar externo con base en la respuesta de compuestos patrn; pero tambin se ha utilizado el mtodo de pH diferencial,40 para la obtencin de la concentracin de las antocianinas. Este mtodo se basa en las transformaciones reversibles que sufren las antocianinas con los cambios de pH, manifestado por un cambio en la absorbancia. La forma oxonium predomina a pH 1 y el hemiacetal a pH4.5 (Figura 5). El pH diferencial es un mtodo basado en esta reaccin, y permite una rpida y exacta medida de las antocianinas totales, incluso en la presencia de pigmentos degradados polimerizados y de otros compuestos interferentes. Este mtodo fue utilizado primero por Fuleki y Francis (1968),41 para medir el contenido de antocianina en arndano.

Tabla 2. Contenido de antocianinas totales en algunas frutas

TaxonomiaNombre comnConcentracin(mg/ 100g fruta )

EstndarReferencia

Vaccinium uliginosum L.Rubus occidental L.V. parvifoliumR. nigrum cvSambucus nigra V. vinifera Citrus sinensis

Arndano alpino256Mv-3-gluAndersen (1987)42

Frambuesa negra627Cy-3-gluMoyer et al. (2002)43Arandano rojo34Cy-3-glGrosella negra411Cy-3-glu"Cauco negro200-1000Cy-3-gluBridle et al.(1997)44Uva de vid30-750Cy-3-glu" Naranjo dulce200Cy-3-glu"

Mv: malvidina, Cy: Cianidina, glu: Glucosa

La metodologa para el estudio de los pigmentos de las cuatro frutas: uva de rbol (), coral (Hyeronima macrocarpa Mull.Arg), mora pequea (Rubus megalococcus Focke) y motiln Hyeronima macrocarpa Mull.Arg), fue

Para la obtencin de la concentracin de antocianinas (Tabla 2), se utiliza la frmula de pH diferencial:

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A= (A

A)

(A

A)

vis-max

700 pH1

vis-max

700 pH 4.5

En donde A

vis-max

es la lectura del pico ms alto a pH 1 y pH 4.5, y A

700

, es la

lectura a 700 nm, tanto para pH 1 como pH 4.5.

As por ejemplo, Khknen et al45., determinaron cuantitativamente los compuestos fenlicos por HPLC, presentes en algunas especies de arndano (Vaccinium myrtillus), arndano rojo (Vaccinium vitis-idaea) y grosellero negro (Ribes nigrum), encontrando que el mayor contenido de antocianinas de las bayas que se consumen en Finlandia se encuentra en los arndanos (300-600 mg/100g de peso fresco) y en el grosellero negro (80 a 810 mg/100 g). Otras bayas oscuras, tales como crowberries (Empetrum nigrum L.) tienen un contenido de antocianinas en el rango de 300-560 mg/100g.46

1.2.4 Antocianinascomocolorantesalimenticios. Las antocianinas se han convertido en una opcin interesante para la industria alimenticia como posibles sustitutos de los colorantes sintticos. Adicionalmente estas sustancias poseen un valor agregado por su capacidad antioxidante y citotxica47.

De acuerdo con su estructura, el color de las antocianinas vara segn los grupos que se encuentren unidos a ella como hidroxilo, metoxilo, azcares azucares acilados. As por ejemplo el aumento nmero de hidroxilos en el anillo B de la antocianidina causa un desplazamiento batocrmico en la longitud de onda de mxima absorcin de las antocianinas, en el caso de la pelargonidina se observa un cambio de color desdeel naranja ( mx. 520 nm) hasta la delfinidina azul-violeta ( mx. 545 nm).48 Porotro lado, la glicosilacin y la acilacin de los azcares tambin aumentan la estabilidad.49

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Otros factores como la concentracin, el pH, la temperatura, el oxgeno, las enzimas, la existencia de reacciones de condensacin, la formacin de complejos con metales o interaccin con otros componentes de los alimentos tambin afectan la estabilidad del color.32 La copigmentacin es un fenmeno que se da por la interaccin hidrfoba entre los ncleos aromticos de las antocianinas agrupadas (Figura 7), en donde una de las consecuencias de este estado es la intensificacin del color, lo que mejora lasperspectivas de la utilizacin de antocianinas como colorantes naturales en alimentos.50

Figura 7. Interacciones de coopigmentacin de las antocianinas49

Como se mencion anteriormente las antocianinas son sensibles a los cambios de pH, el cual tiene un efecto en la estructura y la estabilidad de estas. En soluciones acuosas a valores de pH inferiores a 2, bsicamente 100% del pigmento se encuentra en su forma ms estable o de in oxonio o catin flavilio de color rojo intenso, a valores de pH ms altos ocurre una prdida el protn y adicin de agua en la posicin 2, dando lugar a un equilibrio entre la pseudobase carbinol o hemicetal y la forma chalcona, o de cadena abierta. Tanto el hemicetal como la chalcona, son formas incoloras y bastante inestables. A valores de pH superiores a siete se presentan las formas quinoidales, de color prpura que se degradan rpidamente por oxidacin con el aire(Figura 5), por lo cual, el uso prctico de estos pigmentos como colorantes naturales

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se limita a alimentos cidos con pH inferior a 3.5 51, 52. La prdida de color a medida que el pH aumenta, puede ser evaluada registrando el espectro de absorcin del pigmento con un espectrofotmetro. En la figura 8, en el espectro de absorcin de cianidina-3-ramnoglucsido se observa una disminucin en el espectro a 510 nm a medida que el pH aumenta, lo que indica que hay una prdida del color rojo, existiendo un equilibrio entre las dos formas de la antocianina (catin flavilio y base carbinol)53.

Figura 8. Espectro de absorcin de cianidina-3-ramnoglucsido a distintos valores de pH54

En relacin a la extraccin de estos pigmentos, Rodrguez y Wolstrad40, sealan que el carcter polar de la molcula de antocianina permite su solubilidad en variados solventes, tales como alcoholes, acetona y agua. La eleccin del mtodo de extraccin debe maximizar la recuperacin de pigmentos con una mnima cantidad de solventes y una degradacin o alteracin mnima del estado natural. Dentro de los mtodos ms utilizados estn la extraccin con metanol y la extraccin con acetona y cloroformo.

Entre las posibles fuentes de antocianinas para su utilizacin como colorantes, se encuentran las uvas, los arndanos, el repollo morado y la zanahoria negra. Las

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principales antocianinas presentes en los arndanos son los glucsidos de cianidina y peonidina51. Algunos investigadores han estudiado la toxicidad de las antocianinas y compuestos relacionados concluyendo que estos compuestos son inocuos para la salud. 55 Estos compuestos, se encuentran dentro de la clasificacin de colorantes naturales aceptados sin restricciones sanitarias para su uso en la industria alimenticia.56

1.2.5 Extraccin y purificacin de antocianinas. La extraccin de pigmentos naturales, debe llevarse a cabo teniendo en cuenta los factores que pueden afectar la integridad de los mismos; por lo cual este es un paso muy importante debido a que los resultados obtenidos dependen en gran parte del proceso de extraccin realizado.

Las antocianinas son compuestos solubles en solventes polares y comnmente se extraen de sus fuentes naturales usando metanol o etanol con pocas cantidades de algunos cidos como cido clorhdrico, actico y frmico, ya que el cido mantiene el pH cido lo que previene el desplazamiento de los equilibrios qumicos de hidratacin y formacin de chalconas. Adicionalmente el uso de cidos dbiles previene la degradacin de las antocianinas no aciladas las cuales presentan mayor labilidad. Sin embargo, durante el proceso de evaporacin del solvente acidificado puede ocurrir degradacin de las antocianinas aciladas, por la hidrlisis parcial o total de los cidos enlazados a los azcares, especialmente en antocianinas aciladas con cidos dicarboxilicos como el cido malnico. Por lo anterior se recomienda para la extraccin de estos pigmentos el uso de cidos dbiles como el trifluoroactico,tartrico o ctrico.57

Degenhardt et al 58 ., encontraron que la mezcla bifsica terbutil-metil-ter/n- butanol/acetonitrilo/agua (acidificada al 1% con cido trifluoroactico) (2:2:1:5) es un buen sistema de solventes en el proceso de extraccin de antocianinas de repollo rojo(B. Oleracea L) y grosella negra (Ribes nigrum L).

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Woo et al59., estudiaron la extraccin de antocianinas a partir de los desechos del proceso de elaboracin de jugo de arndanos, realizando una extraccin con alcohol y cido, una purificacin parcial por medio de ultrafiltracin, y una concentracin posterior con aplicacin de smosis inversa, concluyendo que es posible la obtencin de un colorante a partir de los desechos de la industria de jugos de arndanos.

En la mayora de los casos, para la extraccin de las antocianinas se aprovecha la afinidad que tiene este tipo de compuestos por materiales adsorbentes como la Amberlita XAD-7. A diferencia de las resinas XAD-2 y XAD-4 formadas bajo una matriz de estireno y divinilbenceno con diferente grado de entrecruzamiento, la Amberlita XAD-7 tiene una estructura tipo acrilato (rea superficial 450 m2/g, radio de poro 45 , porosidad 1.14 ml/g, tamao de partcula 0.25-0.84 mm, densidad 1.24 g/ml). Este tipo de resina posee el cdigo de regulacin del consejo de Europa, sobre resinas de intercambio inico y adsorbentes usados en el procesamiento de alimentos, adoptadoporelComitdeMinistrosel30deseptiembrede1997, polivinilpirrolidona (PVP), octadecilsilano, Sephadex G-25, Sephadex LH-20,poliamidas, resinas de intercambio inico, almina cida, entre otras.60 Luego que los

pigmentos son retenidos es necesario eliminar otros componentes que no son de inters como azcares, cidos orgnicos, protenas y sales.

La complejidad de los extractos naturales enriquecidos en antocianinas hace necesario realizar su fraccionamiento mediante el uso de tcnicas cromatogrficas que permitan la obtencin de fracciones ms simples sin degradacin del material. Para esto se han usado mltiples tcnicas como la cromatografa en papel (CP), la cromatografa en capa delgada (CCD) en almina, la cromatografa en columna (CC) y la cromatografa en contracorriente (CCC). El fraccionamiento de este tipo de compuestos por CC, se puede realizar mediante el uso de resinas de exclusin portamao como lo demuestra un estudio realizado por Frytlog et al 61 , donde se

compar el uso de las resinas Toyopearl HW-40F con Sephadex LH-20, para el

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anlisis de antocianinas. As, se determin que el fraccionamiento obtenido con la resina Toyopearl presentaba una mejor resolucin de los picos de algunas antocianinas presentes en la muestra a evaluar. Las estructuras de las resinas Toyopearl y Sephadex se muestran en la (Figura 9).

Figura 9. Estructuras de las resinas de (a) Toyopearl (b) Sephadex LH-2061

1.2.6Anlisis de antocianinas por espectrofotometra UV-Vis. Debido a su estructura, las antocianinas presentan mximos de absorcin tanto en la regin visible como en la ultravioleta lo que resulta muy importante para la caracterizacin estructural de dichos compuestos. Sus espectros de absorcin se caracterizan portener dos bandas separadas una en la regin visible entre 465 y 550 nm y otra ms

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pequea en el UV alrededor de 275nm62 (Figura 4). Es as como se pueden identificar las antocianinas por su absorcin en la regin visible.63.

La glicosidacin conlleva a un desplazamiento hipsocrmico de los mximos de absorcin en el visible. As por ejemplo, entre (max 520nm) de la pelargonidina y de la pelargonidina-3-glucsido (505nm) , ocurre un desplazamiento de de 15/nm ; entre cianidina (max 535nm ) y cianidina-3-glucsido (max 523nm) un de 12/nm, entre delfinidina (max 544) y delfinidina-3-glucsido (max. 534nm) un de10/nm62.

Los derivados acilados no muestran diferencia con respecto a los correspondientes no acilados en la zona del visible, sin embargo, en la regin del ultravioleta suelen presentar un mximo adicional en el intervalo de 310-335 nm, correspondiente a la absorcin del grupo acilo (Figura 10); la esterificacin con cido p-cumrico aumenta la absorcin en torno a 308-313 nm y con cido cafico en 326-329 nm. Estehombro no se presenta cuando el cido sustituyente es el cido actico64 .

Figura 10. Espectros UV-Vis de las antocianinas aciladas y 3,5-glucosiladas (lnea continua); no aciladas y 3-glucosiladas (lnea discontinua) 65

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1.2.7 Anlisis por cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas (LC/MS). La cromatografa lquida en fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar y una fase estacionaria apolar. Debido a que las antocianinas son compuestos polares, este tipo de columnasse usa para el anlisis cualitativo y cuantitativo de mezclas de estos pigmentos63.

El orden de elucin de las antocianinas en columnas de fase reversa depende del patrn de hidroxilacin y metoxilacin de la aglicona, del grado de glicosilacin y acil sustitucin, as como tambin de la composicin de la fase mvil. Usualmente, el tiempo de retencin de las agliconas se da en el siguiente orden: delfinidina< cianidina