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M.Sc. Ricardo Venturar.ventur@ig.com.br

© 2008

II Curso de Monitoramento Teórico e Prático da Fermentação Etanólica

Maiores produtores mundiais de etanol*

Brasil EUA

Produção 2006 17,5 bilhões litros 18,3 bilhões litros

Monitoramento da fermentação

Contagem bactérias; pH; acidez total

Quantificação de Metabólitos

Equipamento utilizado

Microscópio ótico; pHmetro

HPLC

* Aproximadamente 70%

Glicólise(S. cerevisiae; BAL)

Glicólise

Destino do piruvato - BAL

Lactato oxidase

Relação estimada entre número de bactérias na fermentação etanólica e respectivas perdas equivalente em álcool

Bactérias (UFC/mL)

Perda de álcool1(% v/v)

Perda de álcool2

(litros)

105 0,1 – 0,2 303.000

106 0,2 – 0,4 848.000

107 0,6 – 1,0 2.120.000

108 0,9 – 1,2 2.544.000

109 1,0 – 1,5 3.180.000

1 Depende da linhagem da bactéria lática.2 Perda máxima calculada com base em uma produção de 151.000 m3/ano.

Bases teóricas para quantificação de ácido lático em fermentação etanólica

Crescimento da população de microrganismos X quantidade de produtos metabólicos (Pelczar, 1996)

Predominância de BAL na fermentação etanólica (MacKenzie & Kenny, 1965; Rosales, 1989; Gallo, 1992; Skinner e Leathers, 2004)

A produção de ácido lático segue a mesma tendência da contaminação bacteriana na fermentação alcoólica (Alves, 1994)

Ácido lático (principal produto do metabolismo das bactéria contaminantes) é um indicador bastante preciso do grau de contaminação (Amorim, 1996)

O nível de ácido lático aumenta com a contaminação da fermentação etanólica (Skinner & Leathers, 2004)

Principais rotas metabólicas nas BAL

Glucose

Homofermentação2 Ácido lático

HeterofermentaçãoÁcido lático + etanol + CO2

Ácido lático

• Ácido 2-hidroxipropanóico: CH3CH(OH)COOH; p.f. 18°C; p.e. 122 °C

• Produzido por bactérias e tecidos de vertebrados em anaerobiose

• Principal produto das BAL (Lehninger et al.,2000)• Primeiro ácido orgânico produzido industrialmente

por processo fermentativo (EUA, 1880)• Produto de valor comercial e inúmeras aplicações• Inibidor da fermentação etanólica

Transporte do ácido lático em S. cerevisiae

Ácido lático (pKa = 3,86)95,8% não dissociado

Meio externopH 2,5

CitoplasmapH 5,4

CH3CH(OH)COOH

CH3CH(OH)COO – + H+

92,7% dissociado

H+ATP

Representação de célula de levedura, adaptado de Narendranath et al. (1997)

Pontos de amostragemFermentação etanólica com recirculação de levedura

Como medir o ácido lático?

Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)Titulometria (indireto)ColorimetriaSpectrofotometriaReagentes enzimáticosBiosensor enzimático /AmperométricoBiosensor enzimático / Fotométrico

Tecnologia enzimática – fotométricaPrincípio de funcionamento

1) Lactato + medf1 piruvato + mediador red

Lox

2) Med.red + fosfomolibdato azul de molibdênio + medf2

Interpretação dos resultados

Contagem microscópica (bast./mL)

Teor ácido lático

Condição da fermentação

< 5x105 < 300 Excelente

5x105 – 5x106 301 – 500 Bom

6x106 – 5x107 600 – 1200 Regular

6x107 – 9x107 1300 – 1900 Preocupante

>1x108 ≥ 2000 Muito Ruim

Fatores que interferem na dosagem de ácido lático

• Temperatura da amostra• Temperatura do ambiente• Turbidez / cor da amostra (para sistemas

colorimétricos)• Período de fabricação dos reagentes• Condições de guarda dos reagentes• Quantidade de amostra inserida no equipamento• Formação de bolhas na câmara de amostra