LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE · 2015-10-12 · La normale fecondazione avviene secondo una serie di LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA RIPRODUZIONE AM 2004 eventi che si

LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLALABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA

RIPRODUZIONERIPRODUZIONE

AM 2004AM 2004

Il controllo della fertilizzazione e la qualità Il controllo della fertilizzazione e la qualità

embrionariaembrionaria



AM 2004AM 2004

processoprocesso cheche portaporta allaalla fusionefusione deldel patrimoniopatrimonio geneticogenetico

maternomaterno ee didi quelloquello paternopaterno concon lala formazioneformazione didi unun

nuovonuovo individuoindividuo

FECONDAZIONEFECONDAZIONE

La normale fecondazione La normale fecondazione avviene secondo una serie di avviene secondo una serie di



AM 2004AM 2004

avviene secondo una serie di avviene secondo una serie di eventi che si svolgono in tempi eventi che si svolgono in tempi

differenti per ogni ovocita.differenti per ogni ovocita.Payne et al., 1997Payne et al., 1997

EventiEventi nelnel processoprocesso didi

fecondazionefecondazione::



AM 2004AM 2004

� aumento intracellulare del calcio

� esocitosi dei granuli corticali

� modificazione della ZP e blocco

alla polispermia

Fattori coinvolgenti l’esito delle tecniche di fecondazione assistita



Stimolazione Stimolazione

ovaricaovarica

ManipolazioneManipolazioneInfertilitàInfertilità

AM 2004AM 2004

TransferTransferCondizioni di Condizioni di

colturacoltura

ManipolazioneManipolazioneInfertilitàInfertilità

ClassificazioneClassificazione

CRITERICRITERI

L’osservazione viene eseguita all’invertoscopio

dopo 16-18 ore dall’inseminazione

Si valuta sia la presenza dei 2PN ravvicinati al

centro dell’ovocita con la configurazione dei

nucleoli in num. ridotto e la presenza dei 2 PB;



AM 2004AM 2004

CRITERICRITERI

PRATICIPRATICI

Per la FIVET si esegue prima la rimozione

meccanica del cumulo ooforo e della corona

radiata;

Per l’ICSI: osservazione diretta

ValutazioneValutazione nellanella colturacoltura inin vitrovitro



AM 2004AM 2004

Scott & al, 2000Scott & al, 2000

Timing:Timing: 16 16 -- 18 ore post18 ore post--inseminazioneinseminazione

Parametri:Parametri:-- disposizione PN e disposizione PN e

ValutazioneValutazione delladella qualitàqualità dellodello zigotezigote

Tesarik & Greco,1999Tesarik & Greco,1999

TimingTiming: 12 : 12 -- 20 ore post20 ore post--

inseminazioneinseminazioneParametriParametri::



AM 2004AM 2004

-- disposizione PN e disposizione PN e nucleolinucleoli

-- aspetto citoplasma “Haloaspetto citoplasma “Halo-- timing breakdown timing breakdown membrana dei PN (24membrana dei PN (24--26 h)26 h)

ParametriParametri::-- numero di nucleolinumero di nucleoli-- disposizione dei disposizione dei nucleolinucleoli

L’L’ asincroniaasincronia nellanella formazioneformazione ee nellanella polarizzazionepolarizzazione puòpuò

severamenteseveramente comprometterecompromettere lolo svilupposviluppo dell’dell’ embrioneembrione ee ilil

suosuo impiantoimpianto..Van Blerkom , 1990; Tesarik and Greco, 1999; Scottet al., 2000

NUCLEOLINUCLEOLI



AM 2004AM 2004

Tesarik e Greco, 1999

Sta

0 PN0 PN2 PN2 PN

Pronu



AM 2004AM 2004

adio

3 PN3 PN > PN> PN

ucleare

FERTILIZZAZIONE ANOMALAFERTILIZZAZIONE ANOMALA



AM 2004AM 2004

Presenza di un pronucleo (1pn):

� Rappresenta circa l’1% degli ovociti fertilizzati in vitro;

� Può risultare da un’attivazione partenogenetica

dell’ovocita

� Può risultare da un’asincronia nella formazione dei

pronuclei;

� Può risultare da una singamia precoce




AM 2004AM 2004

Presenza di tre pronuclei:

� Rappresenta circa il 5% degli ovociti fertilizzati

in vitro;

� Può derivare dalla fertilizzazione di un’ovocita

con uno spermatozoo diploide;

� Può derivare dalla fertilizzazione di un’ovocita

con due spermatozoi.




AM 2004AM 2004

� dovuto ad un fallimento nell’attivazione

ovocitaria;

� dovuto a difetti nella struttura ovocitaria;

� dovuto a incorretta localizzazione del

centrosoma spermatico.

Arresto del clivaggio allo stato di zigote

Pattern 1Pattern 1 Pattern 2Pattern 2 Pattern 3Pattern 3



AM 2004AM 2004

L’embrione si sviluppa per una continua successione di:

Divisione citoplasmatica Divisione cellulare

SVILUPPO EMBRIONALESVILUPPO EMBRIONALE



Il primo clivaggio è l’unica divisione sincrona che porta alla

AM 2004AM 2004

Il primo clivaggio è l’unica divisione sincrona che porta alla

formazione di due blastomeri uguali che contengono la stessa

allocazione dei due poli animale e vegetale dell’ovocita.

Nel caso in cui essa si verifichi a 24 Nel caso in cui essa si verifichi a 24 –– 27h 27h dall’inseminazione, si parla di Early dall’inseminazione, si parla di Early

CleavageCleavage



SVILUPPO EMBRIONALESVILUPPO EMBRIONALE

Il secondo clivaggio è invece asincrono e associato ad una

rotazione che porta alla formazione di un embrione a 4

cellule. Tutti i successivi clivaggi sono asincroni e avvengono

sempre nello spazio delimitato dalla zona pellucida

AM 2004AM 2004

sempre nello spazio delimitato dalla zona pellucida

Il criterio di valutazione della qualitàembrionale è principalmente morfologico:



AM 2004AM 2004

� N° e grandezza dei blastomeri

� Assenza di frammentazioni

� Assenza di multinucleazioni



L’embrione viene sempre osservato all’invertoscopio e si esegue una L’embrione viene sempre osservato all’invertoscopio e si esegue una

classificazioneclassificazione

UnUn inegualeineguale clivaggioclivaggio cellularecellulareèè unun indicatoreindicatore delladella qualitàqualitàembrionariaembrionaria ee delladella suasuacapacitàcapacità didi svilupposviluppo..

UnUn embrioneembrione èè consideratoconsiderato didibuonabuona qualitàqualità quandoquando presentapresenta44 cellulecellule inin IIII°° giornatagiornata ((3636--5050 hh

AM 2004AM 2004

Conseguenze:Conseguenze:InegualeIneguale distribuzionedistribuzione didimRNA,mRNA, mitocondrimitocondri ee organelliorganellicitoplasmaticicitoplasmatici tratra lele duedue cellulecellulegemellegemelle..

44 cellulecellule inin IIII°° giornatagiornata ((3636--5050 hhdall’insemindall’insemin..)) ee 66--88 cellulecellule inin IIIIII°°

giornatagiornata ((7272 hh dall’insemdall’insem..))



Cellule di uguale Cellule di uguale Ben espanse Ben espanse

GRADO IGRADO I

AM 2004AM 2004

AssenzaAssenza didi frammentiframmenti

Cellule di uguale Cellule di uguale grandezzagrandezza

Ben espanse Ben espanse nello spazio nello spazio perivitellinoperivitellino

GRADO IGRADO I



AM 2004AM 2004

10…20% frammenti10…20% frammenti



•• Cellule di grandezza simile Cellule di grandezza simile

GRADO IIGRADO II

AM 2004AM 2004

•• Cellule di grandezza simile Cellule di grandezza simile

ma con una differenza non ma con una differenza non

superiore al 20% tra l’una superiore al 20% tra l’una

e l’altrae l’altra

•• 20 20 –– 50% di 50% di

frammentazioneframmentazione



GRADO IIIGRADO III

•• Cellule con una differenza nelle Cellule con una differenza nelle

dimensioni dei blastomeri superiore dimensioni dei blastomeri superiore

AM 2004AM 2004

dimensioni dei blastomeri superiore dimensioni dei blastomeri superiore al 20% tra l’uno e l’altroal 20% tra l’uno e l’altro

•• > 50% di frammentazione> 50% di frammentazione

•• Basso numero di cellule rispetto Basso numero di cellule rispetto a quelle attesea quelle attese

Il criterio principale di selezione embrionale sibasa su valutazioni morfologiche:




AM 2004AM 2004




ClassificazioneClassificazione DescrizioneDescrizione

Tipo I Frammentazione minimaFrammentazione minima

Tipo IIFrammenti localizzati perifericamente Frammenti localizzati perifericamente

allo PVSallo PVS

Piccoli frammenti sparsi tra le cellule o Piccoli frammenti sparsi tra le cellule o



AM 2004AM 2004

Tipo IIIPiccoli frammenti sparsi tra le cellule o Piccoli frammenti sparsi tra le cellule o

in tutto il PVSin tutto il PVS

Tipo IVGrandi frammenti,blastomeri di Grandi frammenti,blastomeri di

differente misuradifferente misura

Molti preembrioni contengono frammenti cellulari nello pvs per le continue modificazioni di forma e rottura dei blastomeri

durante la loro divisione.

Il criterio principale di selezione embrionale sibasa su valutazioni morfologiche:




AM 2004AM 2004






MultinucleazioniMultinucleazioni

Presenza di due o più nuclei nei blastomeriPresenza di due o più nuclei nei blastomeri

Presenti in circa il 30% di embrioniPresenti in circa il 30% di embrioni

CauseCause Parziale frammentazione di nucleiParziale frammentazione di nuclei

Assenza di citochineAssenza di citochine

AM 2004AM 2004

““…… SinceSince mulinucleationmulinucleation inin earlyearly embryosembryos maymay reflectreflectgrossgross chromosomalchromosomal abnormalitiesabnormalities oror developmentdevelopment ofofmosaicmosaic embryos,embryos, itit isis advisableadvisable notnot toto replacereplace embryosembryoswithwith MNBMNB.. OccasionalOccasional transfers,transfers, howeverhowever cancan bebeconsideredconsidered becausebecause defectivedefective embryosembryos maymay sometimessometimesdevelopdevelop normallynormally..””

Balakier et al., Hum. Rep., 1997Balakier et al., Hum. Rep., 1997

CauseCause Parziale frammentazione di nucleiParziale frammentazione di nuclei

Difetti nella migrazione dei cromosomiDifetti nella migrazione dei cromosomi



PP

II

TT

AM 2004AM 2004

Desai et al, 2000Desai et al, 2000

TT

II

NN

GG

La presenza di granulosità nel citoplasma La presenza di granulosità nel citoplasma



ASPETTO DEL CITOPLASMAASPETTO DEL CITOPLASMA

AM 2004AM 2004

La presenza di granulosità nel citoplasma La presenza di granulosità nel citoplasma pare non sia correlato con la morfologia pare non sia correlato con la morfologia

dell’embrione e quindi che non abbia dell’embrione e quindi che non abbia impatto sulla percentuale di impiantoimpatto sulla percentuale di impianto

(Rienzi et al. 2003).

Dal Dal



..Alla ..Alla FASI DELLO FASI DELLO

AM 2004AM 2004

giorno +3...giorno +3... blastocistiblastocisti

FASI DELLO FASI DELLO

SVILUPPOSVILUPPO

I singoli blastomeri non sono distinguibiliI singoli blastomeri non sono distinguibili

Giorno +4 : Giorno +4 : COMPATTAZIONECOMPATTAZIONE



AM 2004AM 2004

Si vede l’inizio della cavitazioneSi vede l’inizio della cavitazione

Le cellule della morula compattataLe cellule della morula compattata

iniziano a polarizzarsi.iniziano a polarizzarsi.

Inizia la formazione del blastocele.Inizia la formazione del blastocele.

Giorno +5 : Giorno +5 : CAVITAZIONE ED ESPANSIONECAVITAZIONE ED ESPANSIONE



AM 2004AM 2004

L’embrione aumenta di volume eL’embrione aumenta di volume e

la ZP si assottiglia.la ZP si assottiglia.

TE e ICM divengono identificabili.TE e ICM divengono identificabili.

Il volume del blastocele aumenta.Il volume del blastocele aumenta.

Giorno +6 : Giorno +6 : ESPANSIONEESPANSIONE



AM 2004AM 2004

L’embrione accresce il suo volume.L’embrione accresce il suo volume.

La ZP si assottiglia.La ZP si assottiglia.

L’embrione continua ad aumentareL’embrione continua ad aumentare

di volume.di volume.

Giorno +6 / +7 : Giorno +6 / +7 : HATCHINGHATCHING



AM 2004AM 2004

Si crea una breccia nella ZP e iniziaSi crea una breccia nella ZP e inizia

a fuoriuscire una porzione di TE.a fuoriuscire una porzione di TE.

L’embrione “sguscia” completamenteL’embrione “sguscia” completamente

dalla ZP e si rigonfia.dalla ZP e si rigonfia.



AM 2004AM 2004

Prolungare la coltura in vitro fino alProlungare la coltura in vitro fino al

giorno +5 e trasferire gli embrioni a giorno +5 e trasferire gli embrioni a

blastocisti non è una strategia blastocisti non è una strategia

che può migliorare i risultati di unche può migliorare i risultati di un

programma di PMA.programma di PMA.



AM 2004AM 2004

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