LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

IMUNOSNIH TROMBOCITOPENIJA

prim. dr. sc. Maja Tomičić, dr. med.

spec. transfuzijske medicineznanstveni suradnik

Hrvatski zavod za transfuzijsku medicinuPetrova 3, Zagreb

voditelj Odjela za trombocitnu i leukocitnu dijagnostiku i hemostazu

Zagreb, 11. studeni 2017.

1. TROMBOCITI

2.TROMBOCITOPENIJA

3. IMUNOSNE TROMBOCITOPENIJE; podjela,

pato mehanizam nastanka (trombocitni antigeni i

anti trombocitna protutijela)

4. METODE ZA DOKAZIVANJE

ANTITROMBOCITNIH PROTUTIJELA I

TROMBOCITNIH ANTIGENA

5. ALGORITAM ZA DIJAGNOSTIČKI-

POSTUPAK ZA IDIOPATSKU IMUNOSNU

TROMBOCITOPENIJU (ITP) I HEPARINOM

IZAZVANU TROMBOCITOPENIJU (HIT)

TROMBOCITOPENIJA

Normalan broj trombocita u odrasle osobe

iznosi od 150-450 x10/9/L

TROMBOCITOPENIJA-sniženi broj trombocita

Blaga (100-150 )

Umjerena (50-100)

Teška (<50)

TROMBOCITI

Trombociti su stanični fragmenti, bez jezgre

Nastaju u koštanoj srži iz megakariocita

Procjenjuje se da iz svakoga megakariocita nastane 1000-5000 trombocita

Dnevna proizvodnja trombocita je ~35-50 x10/9/L krvi

Ona može porasti 8 puta u slučaju pojačane razgradnje trombocita

www.UpToDate.com

VWF

VWF

VWF

VWF VWF VWF

kolagen

kolagen

kolagen

Krv-protok

Trombociti-

adhezija

Trombociti-

nakupljanje

Stabilna adhezija

Trombocti

aktivacija/agregacija

TROMBOCITI-FUNKCIJAsprječavanje krvarenja, održavanje hemostaze-PRIMARNE

adhezija, aktivacija, sekrecija, agregacija

formiranje ugruška

TROMBOCITOPENIJA-

KRVARENJE

Klinička slika:

asimptomatska

krvarenja u kožu

i sluznice

petehije

purpura

hematomi

Spontana krvarenja

ne nastaju ako je

broj trombocita viši

od 10-20 x10/9/L

Kirurško krvarenje

obično ne nastaje

ako je broj

trombocita viši od

50 x10/9/Lwww.UpToDate.com

TROMBOCITOPENIJA- UZROCI

SMANJENA PROIZVODNJA TROMBOCITA

POVEĆANA RAZGRADNJA TROMBOCITA

TROMBOCITOPENIJA ZBOG RAZRJEĐENJA

(dilucijska)

SPLENOMEGALIJA (sekvestracija T)

PSEUDOTROMBOCITOPENIJA (lažna)

SMANJENA PROIZVODNJA

TROMBOCITA

Supresija koštane srži

Virusne infekcije

HIV (direktno oštećenje megakariocita)

Kemo ili radijacijska terapija

Kongenitalna ili stečena aplazija ilihipoplazija koštane srži

Toksično oštećenje koštane srži

Nedostatak vitamina B12 ili folata

SPLENOMEGALIJA

(sekvestracija T)

Normalno, ~1/3 trombocita je sekvestrirano u slezeni

U ekstremnoj splenomegaliji, do 90%trombocita može biti zarobljeno u slezeni

Veličina trombocita i njihov životni vijek obično je normalan

Ciroza, portalna hipertenzija i splenomegalija također su obilježene trombocitopenijom ali ovi pacijenti obično nemaju povećani rizik krvarenja

POVEĆANA RAZGRADNJA TROMBOCITA

(imunosna, neimunosna)

Idiopatska imunosna trombocitopenija (ITP)

(Idiopatska Trombocitopenijska Purpura, do 2010.)

Lijekovi-heparin (HIT), kinidin, antihipertenzivi, antibiotici…

Aloimunosna razgradnja-poslijetransfuzijska,

poslijetransplantacijska, neonatalna (PTP,

refraktornost, NATP)

Trombotička Trombocitopenijska Purpura (TTP)

Hemolitičko uremijski sindrom (HUS)

Antifosfolipidni sindrom (AFS)

Gestacijska

Diseminirana intravaskularna koagulacija (DIK)

U IMUNOLOŠKI UZROKOVANIM BOLESTIMA

TROMBOCITA-TROMBOCITOPENIJAMA,

TROMBOCITNI ANTIGENI I ANTITROMBOCITNA

PROTUTIJELA IMAJU ZNAČAJNU ULOGU

- klinička opažanja upućivala su na postojanje

antitrombocitnih protutijela već ranih 1950-tih godina

- prvi trombocitni aloantigen Zwa ili Pl A1 otkrio je

Longhem 1959. godine, a neovisno o njemu Shulman I

sur. 1960. godine (ITP)

IMUNOSNE TP POSLJEDICA SU REAKCIJE

ANTIGEN-PROTUTIJELO

trombocitni antigen-GP-receptor

NA TROMBOCITNOJ MEMBRANI NALAZE SE:

* specifični trombocitni antigeni, koji se nalaze

“uglavnom” na trombocitima (HPA 1-16)

(trombociti, megakariociti, receptorne molekule

staničnog matriksa )

* zajednički krvnim stanicama i tkivima (ABH,Le,

I, P, HLA klasa I A,B, C slabo)

ANTITROMBOCITNA PROTUTIJELA

Antitrombocitna autoprotutijela, usmjerena na

antigene na vlastitim stanicama bolesnika

Antitrombocitna aloprotutijela nastaju nakon

izloženosti trombocitnim

aloantigenima tijekom :

* trudnoće

* transfuzija krvi

* nakon transplantacije (rijetko)

ANTITROMBOCITNA AUTOPROTUTIJELA

ITP (idiopatska trombocitopenija)

* akutna (dječja dob)

* kronična

AITP - sekundarna

* autoimune bolesti (SLE, topla AIHA,

kolagenoze)

* maligne bolesti (limfoproliferativne)

* HIV- infekcija

• uzrokovana lijekovima (antibiotici, heparin:HIT-II)

• panreaktivna pt ili usmjerena na GP komplekse

ANTITROMBOCITNA ALOPROTUTIJELA

Imunološki odgovor na specifične trombocitne

antigene vrlo je rijetka pojava.

U populaciji bijelaca najčešće se opaža anti-HPA-1a

protutijelo; 80-90% slučajeva, a zatim anti-HPA-5b u

10-15% slučajeva, dok su ostala protutijela vrlo rijetka.

Najčešće se javljaju anti-HLA klase I

ANTITROMBOCITNA ALOPROTUTIJELA

• PTP (poslijetransfuzijska purpura)

- HPA

• REFRAKTORNOST (na trombocitne

transfuzije)

- HLA I, HPA

• FNATP (fetalna i neonatalna aloimuna

trombocitopenija)

- HPA

METODE ZA ODREĐIVANJE

ANTITROMBOCITNIH PROTUTIJELA

I SKUPINA: tromboaglutinacija (po Dusset-u )

inhibicija vezanja komplementa, promjene trombocitne funkcije (više se ne primijenjuju zbog slabe osjetljivosti i specifičnosti)

II SKUPINA:

- imunoblot

- radio-imuno-esej (RIA)

- enzim-imuno-esej (EIA)

- imunofluorescencija (IF) –ODREĐIVANJE PRISUTNOSTI ATA (AUTO PT, vezanih na trombocite i slobodnih u plazmi)

III SKUPINA:

testovi “čvrste podloge” (solid phase); MAIPA (test imobilizacije trombocitnih antigena pomoću monoklonskih protutijela)-

ODREĐIVANJE PRISUTNOSTI ATA (AUTO PT, vezanih na trombocite i slobodnih u plazmi)

ODREĐIVANJE SPECIFIČNOSTI ATA (ALO PT)

LUMINEX metoda IF (kuglice obložene HPA antigenima, AHG obilježen bojom, detekcija laserom)

Nove metode:

SA SPA (simultaneous analysis of platelet spec. ab. (cytometric bead array)

SRP (SURFACE PLASMON RESONANCE-bio-molekularna metoda, refleksija polariziranog svjetla)

MICROARRAY

PCR

IF

Test imunofluorescencije po

van dem Borne-u

direktni, indirektni

• prilagođeni antiglobulinski test

• AHG obilježen FITC-om

• čitanje rezultata :

fluorescentni mikroskop

protočni citometar,

• eluat daje bolje rezultate zbog male količine vezanih autoprotutijela i slabog afiniteta vezanja

• za IT treba koristiti klorokinom

obrađene trombocite-razlikovanje

HLA od spec. tr. pt.

20

MAIPATROMBOCITNI GLIKOPROTEINSKI KOMPLEKSI-CD (Mo. At.)

HPA specifični trombociti-antigeni

Antigeni

sistem-

HPA

Glikoprotein

Drugi naziv CD

HPA-5a/b

GPIa/IIa

21, VLA-2,

ECMRI

CD49b/29

GPIc/IIa

51, VLA-5,

FNR

CD49e/29

GPIc/IIa

61, VLA-6

LMR

CD49f/29

v/IIIa

v3, VNR CD51/61

HPA-1a/b

HPA-3a/b

GPIIb/IIIa IIb3 CD41/61

GPIb CD42b

GPIb CD42c

HPA-2a/b GPIX CD42a

GPV CD42d

HPA-15a/b Gova/b CD109

21

MAIPA

(monoclonal immobilization of

platelet antigens)

EIA test “čvrste podloge”

AHG- obilježen enzimom

(peroksidazom)

koristi mišja monokl. pt. specifična za GP komplekse trombocitne membrane

prednosti:

osjetljiv i specifičan test

razlučivanje između HLA i specifičnih trombocitnih pt.

kvantitativan rezultat

moguće dulje čuvanje testnih trombocita

nedostaci:

dugotrajna i složena izvedba testa

neka se monoklonska pt. mogu natjecati za isti epitop kao humana (lažno negativan rezultat)

TROMBOCITNI ANTIGENI:

METODE

SEROLOŠKE: MAIPA (rijetko)

MOLEKULARNE: (polimorfizam HPA alela, poznat slijed AK)

Izolacija stanične DNA (iz pune krvi, limfocita, amniocita)

Amplifikacija (dobivanje dovoljne količine dijela DNA koji sadrži

odgovarajući alel)

Određivanje HPA genotipa; uporaba oligonukleotidnih proba

specifičnih za slijed baza-PCR-SSP (sequence specific primers),

restrikcijskih enzima specifičnih za mjesto mutacije-ASO (allele

specific oligonukleotide)

HPA genotipizacija: potvrda seroloških nalaza, HPA genotip DDK

HPA antigen negativnih koncentrata trombocita za transfuzijsko

liječenje aloimuniziranih bolesnika, epidemiološke studije

(učestalost aloimunizacije na HPA, povezanost s bolestima)

TROMBOCITOPENIJA

-STACIONARNI BOLESNICI

Sekundarna (uz drugu osnovnu HEMATOLOŠKU ili multisistemsku bolest)

ITP

Lijekovi (heparinom inducirana trombocitopenija-HIT)

Bolesti jetre

Sepsa s diseminiranom intravaskularnom koagulacijom-DIK

Maligne bolesti s DIK-om

Trudnoća- preeklampsija, HELLP sindrom, abrupcija placente s DIK-om

rjeđe TTP, HUS

ITP

SEROLOŠKA DIJAGNOSTIKA ITP I

Imunofluoroescentni test za antitrombocitna protutijela (IF- manualni ili protočna citometrija), pregledno ispitivanje

- direktni test (Pt vezana na T ispitanika

- indirektni test (Pt slobodna u serumu ispitanika)

Enzimsko-imunološki test vezanja trombocitnih GP pomoću Moab (MAIPA):

- direktni test (Pt vezana na T ispitanika

- indirektni test (Pt slobodna u seumu ispitanika)

indirektni (određivanje specifičnosti Pt u plazmi: GP kompleksni. HPA specifičnost; EIA, LUMINEX

HPA GENOTIPIZACIJA-potvrda serološkog ispitivanja ALOPROTUTIJELA, antigen negativne transfuzije

SEROLOŠKA DIJAGNOSTIKA ITP II

TUMAČENJE REZULTATA TESTA-MAIPA (IF)

- direktni TEST (PAIg)-protutijela vezana na trombocite bolesnika

osjetljivost-zadovoljavajuća

- prosječna količina PAIgG koja se može dokazati na trombocitu prema raznim autorima, kreće se od 100 do 40 000 molekula IgG po trombocitu

specifičnost- niska

- povišena količina PAIgG-a nije specifična za AITP nego je opažena i u bolesnika s neimunološkim trombocitopenijama

cirkulirajući imuni kompleksi nemaju utjecaja na patogenezu u kroničnoj ITP

- indirektni TEST (autoprotutijela u serumu/plazmibolesnika)

Serološka dijagnostika

HEPARINOM IZAZVANE

TROMBOCITOPENIJE (HIT)

Definicija HIT- II

HIT je reakcija (nuspojava) tijekom liječenja heparinom

SNIŽENI BROJ TROMBOCITA=TROMBOCITOPENIJA

HIT je kliničko-patološki sindrom čija se dijagnoza postavlja temeljem kliničkih opažanja i dokazivanja specifičnih protutijela

dva oblika HIT-a; tip I i tip II

HIT II –autoprotutijela usmjerena na kompleks HEPARINA i TROMBOCITNOG FAKTORA 4 (PF4)

Sumnja na HIT II:

4T ZBIR ZA KLINIČKU PROSUDBU HIT-a

KONTROLA BROJA TROMBOCITA

LABORATORIJSKO ISPITIVANJE: PROBIRNI

TESTOVI ZA HPF4 PROTUTIJELA IgG (GEL I EIA

TEST)

FUNKCIJSKI TEST

ZAMJENSKI LIJEK ZA HEPARIN

Testovi za anti-heparinska protutijela

- dokazivanje protutijela na kompleks heparina i

PF4

PaGIA (PF4-H, Ag-Pt, latex

particle-gel, MK-IgG AHG),

gel test

LF ID (lateralna

imunodifuzija)

EIA (PF4-H, Ag-Pt, enzym

immuno assay, IgG AHG

(ili IgG/M/A), enzimsko-

imunološki test

Testovi za anti-heparinska protutijela

- funkcijski

PAA ( platelet aggregation assay)-agregacija T

HIPA (heparin induced platelet

activation/aggregation–

aktivacija/agregacija T)

SRA (serotonin release assay–

test oslobađanja serotonina iz T)

Tumačenje rezultata: LF ID, GEL TEST, EIA TEST

Ovi testovi imaju podjednaku osjetljivost (80-90%) i

specifičnost (89-97%).

Za LF ID (IgG) i gel test (IgG/M/A); brzi probirni

testovi najznačajnija je prednost visoka negativna

prediktivna vrijednost (>95%) u isključivanju HIT-a

II.

EIA IgG) test dulje traje (složena izvedba),

prednost, kvantitativan rezultat, procjena titra

protutijela putem OD vrijednosti.

Tumačenje rezultata

LFIA, GEL TEST, EIA TEST

• Negativan test za PF4/H protutijela uz klinički 4T

score ima visoku negativnu prediktivnu vrijednost

(>90%) u isključivanju HIT-a.

• Pozitivan rezultat imunoloških testova za PF4/H

protutijela čini dijagnozu HIT-a vjerojatnom.

• OD >0,800 (1,000) u EIA testu, uz 4T>5 velika

vjerojatnost HIT II

• dodatno ispitivanje funkcijskim testom (potreba za

procjenom trombogenosti anti-heparinskih

protutijela, negativni probirni testovi i visoki 4T,

subklinički HIT)

HVALA NA PAŽNJI!