Fakultet veterinarske medicineUniverzitet u Beogradu

Laboratorija za genetiku zivotinjaKatedra za Biologiju

Postupci pripreme za obavljanje molekularno-

genetičkih аnаlizа

Izolacija (ekstrakcija)DNK i RNK

• Pre svega, te metode omogućavaju korišćenje bilo kog uzorka kojisadrži DNK životinje (osim krvi, mogu se koristiti dlake, saliva,brisevi bukalne i vaginalne sluznice, mleko, sperma, uzorci tkiva,koža, perje, nokti, kandže, kosti, zubi i arhivirani preparati) što jeznačajno za analizu uginulih ili ubijenih životinja i praćenje zaraza.

• Uzimanje uzorka za DNK analize iz živih jedinki je neinvanzivno,

• Uzorci DNK se lako mogu transportovati između laboratorija ijako dugo čuvati, što omogućava retrospektivnu analizu uslučajevima kada životinje više nisu dostupne.

Molekularno-genetičke analize koje sebaziraju na PCR metodologiji pružajubrojne metodološke prednosti u odnosu nasve druge metode tradicionalno primenjivaneu veterinarskoj medicini i stočarstvu.

• Analiza DNK može se obaviti u veoma ranim fazama životajedinke, odnosno čak i na stupnju embriona (prenatalnadijagnostika) nezavisno od pola.

• Prednost molekularne dijagnostike je i to što se, za razliku odklasičnih metoda, svi koraci mogu automatizovati.

• Automatizacijom se postiže istovremena i brža obrada većegbroja uzoraka pod standardizovanim uslovima i smanjuje rizik odkontaminacije i dobijanja lažno-pozitivnih rezultata.

• Korišćenjem internih kontrola, postiže se veća pouzdanost ipreciznost analize.

Zbog svega navedenog, molekularno-genetičke analizenalaze primenu u brojnim oblastima veterine, kao što su:

1. molekularna dijagnostika naslednih bolesti

2. detekcija i tipizacija virusnih, bakterijskih, gljivičnih patogena iparazita

3. determinacija pola ptica i embriona sisara

4. provera roditeljstva i verifikacija pedigrea

5. otkrivanje genskih lokusa vezanih za ekonomski značajneproizvodne karakteristike

6. odabir jedinki za odgajivačke programe i selekciju

7. kontrola namirnica

8. forenzičke analize

Izolacijanukleinskih kiselina

Izolacija DNK iz ćelije podrazumeva oslobađanje DNK iz virusa, prokariotskih i eukariotskih ćelija: - jedra - nuklearna DNK- mitohondrija-mtDNK i plastida-pDNK

Izolacija DNK

Izolacija DNK obavlja se primenom hemikalija i postupaka kojima se razbijaju i liziraju: • ćelijski zid • ćelijska membrana i • membrane organela (jedra, mitohondrija i plastida)

ali i veoma čvrsti zidovi spora (bakterija, protozoa) i brojne čvrste tvorevine (hitinska kutikula, kosti, rožne tvorevine, keratin ...)

http://slideplayer.com/slide/4448258/FORENZIKA

http://www.alo.rs/spreceno-krijumcarenje-lobanje-i-rogova-kozoroga/20463

FORENZIKA

FORENZIKA

What Happened to Richard III?

Missing for 500 years

Slain in battle in 1485, Richard III was the last medieval king of England. He did not have a state burial as the whereabouts of his body was unknown. A skeleton discovered in a carpark near Grey Friars Church in Leicester,

izolacija (ekstrakcija) DNK ili RNK iz biološkihuzoraka je PRVI KORAK procesa analize DNK/RNK.

Izolacija DNK

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/

Ekstrakcija DNK (klasičnom metodom – bez kolonica / silikatnih membrana)

Ekstrakcija DNK iz brisa bukalne sluznice obuhvata sledeće korake:

1) sakupljanje ćelija bukalne sluznice 2) razbijanje ćelija da se iz njih oslobodi DNK3) odvajanje DNK od proteina i ćelijskih ostataka 4) izolacija koncentrovane DNK

Oprema koja je potrebna za ekstrakciju DNK

- Uzimanje ćelija epitela bukalne sluznice obavlja se pomoću vatiranog vrha štapića za uzimanje brisa.

- Bris (vatirani vrh štapića) treba staviti u epruvetu (1,5 ml). Bris sadrži stotine „finih“ (tankomembranoznih) ćelija bukalne sluznice. Unutar svake ćelije nalazi se jedro, a unutar jedra je DNK.

Detalji svakog koraka ekstrakcije:

1) sakupljanje ćelija bukalne sluznice (bris)

2) razbijanje ćelija da se iz njih oslobodi DNK

- Odsecanje brisa (vrha štapića) kako bi epruveta mogla da se zatvori.

- Nalivanje lizirajućeg rastvora* (grč. lysis = razgradnja, raspadanje, razaranje, razlaganje)

- Inkubacija u vodenom kupatilu na 56C (10 min – 30 min, zavisno od tipa uzorka, ali dovoljno dugo da se

oslobodi DNK).

- *Lizirajući rastvor sadrži dva važna sastojka: deterdžent i enzim proteinazu K.

Deterdžent razbija ćelijsku i jedarne membrane čime omogućava pucanje ćelija i oslobađanje DNK iz njih.

Međutim, DNK je i dalje veoma čvrsto obavijena proteinima (histonima), te proteinaza K seče i odvaja histone da oslobodi DNK.

3) odvajanje DNK od proteina i ćelijskih ostataka

- Tokom prethodnog koraka (inkubacije u vodenom kupatilu) oslobođena je DNK i uklonjen vrh štapića iz epruvete. Sledeći korak je dodavanjerastvora koncentrisane soli u epruvetu.

- So obezbeđuje da se proteini i drugi ostaci (razbijenih) ćelija grupišu.

- Epruveta se stavlja u centrifugu

- Obezbedi se „balans“ stavljanjem druge epruvete sa istom zapreminom tečnosti (može i obična voda).

- Centrifugiranjem epruvete na velikoj brzini postiže se da teške grupe proteina i ćelijskih ostataka spadnu (stalože se) na dno epruvete, dok DNK lanci ostaju difuzno raspoređeni u tečnom sadržaju epruvete.

- Tečni sadržaj epruvete prenosi se u čistu epruvetu, dok talog (proteine i ćelijske ostatke) ostaje u epruveti koju bacamo.

- Dodaje se izopropil alkohol u epruvetu sa rastvorenom DNK i promeša okretanjem epruvete. Time se postiže da se DNK, koja nije rastvorljiva u izopropil alkoholu, izdvoji iz rastvora u vidu grupa (ugrušaka) vidljivih golim okom.

- Epruveta se centrifugira, pri čemu se ovog puta centrifugiranjem na dno epruvete „spušta na dno“ (taloži) zgrušana DNK.

- Tečna faza (supernatant) se ukloni iz epruvete, a DNK sačuva (može se ostaviti u tom stanju ili da se ponovo rastvori u adekvatnom (blagoslanom) puferu ili vodi.

4) izolacija koncentrovane DNK

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/

Prikaz opisanog procesa EKSTRAKCIJE DNK nalazi se na linku:

DNK izolacija iz uzoraka sperme i dlakakorišćenjem seta ”DNeasy® Blood & Tissue Kit”(Qiagen).

Izolacija DNK goveda

Uzorci sperme (minitube za VO)

Priprema uzorkovanih dlaka za izolaciju DNK

goveda

DNK izolacija iz uzoraka

krvi korišćenjem setova:

GeneJET™ Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific)

• DNeasy® Blood & Tissue Kit (Qiagen)

• Za izolaciju DNK pčela najčešće se koriste noge pčela

Izolacija DNK pčela

• DNeasy® Tissue Kit(Qiagen)

DNeasy Plant Mini Extraction Kit(Qiagen) + tečni azot

Izolacija DNK endoparazita pčela –mikrosporidija Nosema sp.

Izolacija DNK

Izolacija DNK

Za izolaciju DNK Varroa destructorkoriste se cele jedinke parazita

Izolacija DNK pčelinjeg krpeljaVarroa destructor

Kapa Express Extract kit(Kapa Biosystems)

Inkubiranje

http://bitesizebio.com/13516/how-dna-extraction-rna-miniprep-kits-work/

https://www.qiagen.com/us/Resources

Mol. Biol. Methods•DNA

What is DNA?DNA extraction technologies

Working with DNA: Good laboratory practiceConversions for nucleic acids: DNA

Molecular conversions for DNASpectrophotometric measurement of DNA concentration

Sample storage prior to extraction of genomic DNASample disruption for extraction of genomic DNAWorking with DNA: Good microbiological practice

https://www.qiagen.com/us/Resources

Mol. Biol. Methods•RNA

What is RNA?microRNA

miRNA mimics and inhibitorssiRNA and RNAi

General remarks on handling RNAStabilization of RNA in biological samples

RNA sizes and molecular weightsRNA isolation: Disruption and homogenization of starting materials

Special considerations for isolation of RNA from different sample sourcesStorage of RNA

Quantification of RNASpectrophotometric measurement of RNA concentration

Determining RNA quality

https://www.qiagen.com/us/ResourcesE-Learning

•Virtual Demos