Unidad 2. TÉCNICAS BACTERILÓGICAS.

2.1 Preparación de Medios de Cultivo.

Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razón por la cual es difícil aislarlas. A menudo nuestro interés es caracterizar una especie bacteriana, para lo cual debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Si bien el aislamiento es un paso crucial en este camino, comenzaremos examinando los medios de cultivo, ya que en estos últimos se basan muchos de los principios del aislamiento.

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos.

La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo también lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado.Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan.

Las características de los microorganismos a tomar en consideración al momento de preparar un medio de cultivo adecuado para su desarrollo en el laboratorio son:− Tipo trófico: se refiere a los requerimientos de carbono y energía, según los cuales se los clasifica en autótrofos, heterótrofos, quimiotrofos (litótrofos u organotrofos) y fotótrofos.− Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerófilos.− Temperatura óptima de crecimiento: según el rango de temperatura al cual elmicroorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en psicrófilos, mesófilos y termófilos.− Rango de pH: en general el rango óptimo de pH para la mayoría de las bacterias oscila entre 6,6 y 7,2.

2.1.1 Características generales de un buen medio de cultivo.

Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentración adecuada, cantidad necesaria de sales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estéril y que no contenga sustancias inhibidoras.

Como ya se ha seña lado, la provisión de elementos nutritivos en concentración adecuada, depende del conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo en el hábitat natural.

La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona directamente con el pH, la fluidez y la presión osmótica que se le quiera brindar a los microorganismos.

Si se requiere sangre u otros componentes inestables, como antibióticos y compuestos fácilmente oxidables al calor, cuando se requiera estos se esterilizaran por otro método y se agregaran al medio cuando se encuentre entre 45 a 50 ºC.

En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como inhibidor para algunos microorganismos y no para otros.

2.1.2 Constituyentes habituales de los medios de cultivo.

Los elementos citados a continuación, son los más frecuentemente usados en la preparación de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los únicos e incluso alguno de ellos puede estar ausente de la preparación.

− Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento.− Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacárido, al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los 98°C) y al enfriarse forma un gel inodoro e insípido (se gelifica alrededor de los 42°C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser sólido a la temperatura de incubación. Con la excepción de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para preparar un medio sólido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega agar del 3 al 5 %.− Extractos. Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne, hígado, semillas, etc.) son extraídos con agua y calor, y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrógeno y carbono.− Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales que carecen de identidad química definida; se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína, etc.). Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteasas, peptonas, polipéptidos y aminoácidos.− Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino también con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.− Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos más comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviación del pH.− Indicadores de pH. Indicadores ácido- base se añaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.− Agentes reductores. Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que se añaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios.− Agentes selectivos. La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo (ver más adelante, clasificación de los medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sódica, telurito potásico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada, actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

2.1.3 Preparación.

En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparación de un medio de cultivo comienza por hacer un estudio de la fórmula que constituye una receta que deberá respetarse estrictamente.

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las instrucciones del fabricante y luego esterilizarlo.

Primero se agrega la mitad del volumen de agua destilada o desionizada a un matraz Erlenmeyer o balón, luego se incorpora el medio deshidratado, se homogeniza el medio en el agua y se vierte la volumen faltante de agua tratando de remover el medio que se quedo sobre las paredes del matraz. Es conveniente añadir todos los ingredientes en el orden indicado y disolverlos de a uno antes de agregar el siguiente. La disolución de los medios puede requerir hervir por 3 a 5 min.

Al finalizar la preparación y una vez que ésta se enfríe, se debe verificar que el pH sea el adecuado. En caso de ser necesario se ajusta con CO3Na2 (1N) o ClH (1N).

Si la presentación del medio será en tubo es necesario transferir el volumen adecuado a cada tubo y después realizar el proceso de esterilización. Si el medio se dispondrá en cajas se esteriliza en el matraz y se transfiere a las cajas una vez esterilizado cuando se encuentre a 45 °C, a esta temperatura el medio aún se mantiene en estado líquido y se formara la menor cantidad de agua de condensación en la tapa de la caja, recordemos que el agar se solidifica o gelifica a los 42 °C.

2.2 Control de Calidad para los medios de cultivo.

El laboratorio de Bacteriología debe asegurarse del adecuado funcionamiento de los medios de cultivo antes de usarlos, tanto si son comerciales como preparados en el laboratorio. A nivel nacional los laboratorios que comercializan o realicen sus propios medios de cultivo están obligados a cumplir lo indicado en la Norma Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo, así como lo descrito en el documento CLSI M22-A3 "Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard-Third Edition”.

Los medios de cultivo deben estar sometidos a un proceso de control de calidad interno que asegure que son estériles, que permiten el crecimiento de microorganismos específicos y/o inhiben el crecimiento de otros y que proporcionan una adecuada respuesta bioquímica.

Prueba de esterilidad. Se toma una muestra representativa de cada lote de medios de cultivo preparados y se introduce en la incubadora a 37°C durante 24 hrs. Una vez cumplido este tiempo se retiran de la incubadora y se revisa cada cajo o tubo sometido a esta prueba. Un medio de cultivo estéril no presentara desarrollo de bacterias y esto nos indicara que el lote preparado puede ser utilizado. El observar desarrollo bacteriano nos indica que el proceso de esterilización no fue eficaz y por lo tanto el lote preparado no se encuentra estéril y debe ser rechazado para su uso.

Prueba de promoción de crecimiento. Se toma una muestra representativa de cada lote de medio de cultivo preparado y estos son inoculados con cepas de referencia (ATCC), se introducen a la incubadora a la temperatura y el tiempo adecuado para cada cepa de referencia. Una vez que se cumple el tiempo de incubación se retiran los medios de la incubadora y se revisan verificando el crecimiento de las cepas de referencia.Esta prueba también nos permite validar el efecto inhibidor del medio de cultivo al inocular cepas que de manera normal no crecen en los medios de cultivo ya que estos presentan algún factor que inhiben su crecimiento. Cuando se observa el crecimiento de una cepa que debe ser inhibida, nos

indica que el factor inhibidor del medio esta fallando por lo cual no es conveniente utilizar este medio de cultivo. Esta prueba se realiza principalmente a los medios de cultivo selectivos.Es posible demostrar las características bioquímicas del medio de cultivo inoculando cepas de referencia que manifestaran los cambios característicos del medio cultivo los cuales se manifestaran la mayoría de las ocasiones por un cambio o vire de color que se puede observar en las colonias o en la superficie del medio. Esto debe realizarse principalmente en medios de cultivo diferenciales.

2.2.1 Medios de cultivo comerciales.

Es recomendable que sean proporcionados por el fabricante los certificados de calidad correspondientes a cada envío o lote fabricado de cada medio de cultivo. El fabricante debe aportar información sobre: el nombre del medio, número de lote, cantidad enviada y fecha de caducidad. Además, para cada lote de medio debe facilitar un certificado del control de calidad en el que se especifican las condiciones de conservación, control de esterilidad, criterios de aceptabilidad, control del funcionamiento indicando las cepas utilizadas, fecha de emisión y firma del responsable del laboratorio fabricante.

Antes de introducir un nuevo medio en el laboratorio, debe ser validado con cepas de referencia; este procedimiento debe repetirse siempre que el fabricante indique que las características del medio han cambiado o que se detecte alguna deficiencia en el uso rutinario. Tras la recepción de los medios en el laboratorio y antes de usarlos, hay que comprobar las características físicas (color, precipitados, placas rotas, excesivo número de burbujas, crecimiento de colonias, etc.) y se debe documentar cualquier anomalía detectada. El control de calidad se completa con el estudio de la esterilidad y la comprobación del crecimiento de microorganismos específicos y/o inhibición de otros, o bien producción de reacciones bioquímicas o morfologías típicas de los microorganismos ensayados.

Según los requerimientos de control de calidad los medios comerciales se clasifican en: - Medios exentos: no requieren que el laboratorio controle su esterilidad o su adecuado funcionamiento, siempre que el fabricante aporte las especificaciones de calidad correspondientes. - Medios no exentos: el usuario debe comprobar su esterilidad y funcionamiento, ya que puede variar en función del lote.

El documento del NCCLS (ahora CLSI) M22-A3 "Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard-Third Edition" proporciona una relación detallada de medios exentos y no exentos (ver Tabla 1B del documento citado). Algunos de los medios recogidos como exentos son:

- Agar sangre (no selectivo) - Agar Salmonella- Shigella (SS)

- Agar chocolate - Caldo Selenito o caldo GN

- Caldo tioglicolato - Agar CLED

- Caldo BHI o TSB - Agar Levine o Agar EMB

- Medios de hemocultivo - Agar MacConkey

- Agar sangre colistina - Agar para Legionella

nalidíxico CYE/BCY

- Agar manitol-sal - Agar Brucella

- Agar alcohol fenil etílico - Agar yema de huevo

- Agar selectivo para enterococo

- Agar sangre lacada con kanamicina

- Agar TCBS - Agar Sabouraud dextrosa

- Agar Hektoen - Agar cornmeal

- Agar XLD - Lowenstein-Jensen

- Agar CIN - Agar Middlebrook

Entre los medios no exentos se encuentran el agar Mueller-Hinton, los medios selectivos para cultivo de Neisseria spp. y Campylobacter spp., entre otros. El laboratorio debe repetir el control de esterilidad y funcionamiento en estos medios y en cualquiera de los relacionados anteriormente que demuestren alguna deficiencia en la recepción o durante su uso, hasta que el problema quede resuelto. El laboratorio puede decidir incluir también en el control del funcionamiento a los medios de cultivo exentos, y según la carga de trabajo, puede realizarlo únicamente en algunos lotes elegidos aleatoriamente.

Si los medios comercializados proceden de empresas no certificadas por la norma ISO o no cumplen con las especificaciones de calidad recomendadas, el usuario debe realizar el control de todos los lotes que se reciben como si se tratase de medios preparados en el laboratorio. Cualquier deficiencia en el aspecto físico, esterilidad, no crecimiento de la cepa deseada, o no inhibición de la cepa no deseada, será documentada y notificada a los fabricantes para que emprendan las medidas correctoras.

2.2.2 Medios de cultivo preparados en el laboratorio.

Algunos medios de cultivo se preparan en el propio laboratorio, bien porque es necesario que sean recientes para determinados cultivos o porque se debe disponer de ellos inmediatamente y no hay tiempo de solicitarlos a un fabricante. En este caso, hay que controlar el medio deshidratado, los aditivos que se van a utilizar, el procedimiento de la elaboración, el envasado, etiquetado y almacenamiento y por último, comprobar las características físicas, esterilidad y funcionamiento del medio preparado con cepas de referencia. Todas las fases del proceso han de estar documentadas en un manual de procedimiento y debe mantenerse un registro detallado de las mismas.

Los medios deshidratados y aditivos que se utilizan para preparar los medios deben estar etiquetados con las fechas de caducidad, de recepción y la fecha en la que se abrieron por primera vez y se deben almacenar en condiciones adecuadas.

El proceso de elaboración debe quedar registrado, anotando la identidad de los medios, número de lote o fecha de preparación, condiciones de almacenamiento, fecha de caducidad y la identidad de la persona que los ha preparado. Es recomendable que cada placa o tubo individual vaya identificado con el nombre del medio y número de lote o fecha de preparación. Los tubos o placas preparados se deben almacenar en las condiciones adecuadas establecidas.

Para realizar el control de calidad del medio una vez preparado, se seguirá el mismo procedimiento que para los medios comerciales no exentos.

2.3 Cultivo de Microorganismos.

En muchos aspectos, el pequeño tamaño de los microorganismos los hace sujetos ideales para la experimentación. Se pueden cultivar millones de organismos en un solo mililitro de medio para su estudio. La rápida multiplicación de estas diminutas criaturas constituye también una ventaja experimental, ya que se puede trabajar con muchas generaciones en un solo día, Es más, los conocimientos adquiridos en el estudio de los microorganismos pueden ser, a menudo, generalizados a los sistemas celulares, plantas y animales, incluida la especie humana. Para llevar a cabo experimentos con microorganismos es usualmente necesario cultivarlos en el laboratorio.

Cultivo. Método de propagación de bacterias invitro, para lo cual se requiere realizar un medio de cultivo óptimo que permita el crecimiento bacteriano.

Cepa. Variante fenotípica constituida por bacterias de la misma especie.

Cepario. Colección de cepas de referencia (ATCC), utilizadas para llevar acabo las pruebas de control de calidad en el laboratorio de bacteriología.

2.3.1 Curva de crecimiento microbiana.

El crecimiento se define como el aumento armónico de todos los constituyentes bacterianos, este crecimiento lleva a un incremento del tamaño y peso de las bacterias, generando la división bacteriana y con esto un aumento en el numero de bacterias, estos se denomina crecimiento poblacional que no se debe confundir con el crecimiento individual que implica solamente aumento del tamaño, del volumen y diferenciación de un solo individuo. En general cuando se hace referencia al crecimiento bacteriano, éste se considera como el crecimiento poblacional.

El crecimiento bacteriano es el resultado de la actividad concertada de más de 2000 reacciones enzimáticas entre las que destacan los siguientes tipos.

Reacciones de transformación y captación de energía. Reacciones de biosíntesis de moléculas pequeñas. Reacciones de biosíntesis de macromoléculas.

El tiempo necesario para que se formen dos bacterias a partir de una se llama tiempo de generación y el tiempo que se requiere para que una población bacteriana se duplique se denomina tiempo medio de generación, el cual, en la mayoría de los documentos escritos se considera sólo como el tiempo de generación.

El crecimiento microbiano siempre depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio, que son la composición química del mismo, la tensión de oxígeno, de bióxido de carbono, viscosidad, actividad de agua, presión osmótica, presencia de sustancias nocivas, temperatura, pH, entre otras. Los tiempos de generación son característicos para cada microorganismo y dependen de la condición del medio en el que se encuentren.

Si se construye una gráfica del crecimiento en función del tiempo, se obtendrá lo que se conoce como curva de crecimiento bacteriano.

Como se ve en la figura, la curva de crecimiento bacteriano consta de cuatro fases principales;

1) Fase de adaptación o latencia, también llamada fase “Lag” por ser ésta su designación en inglés, durante esta fase los bacterias se adaptan a las condiciones del medio de cultivo, se disponen a expresar su capacidad de utilizar los componentes del medio en las condiciones del cultivo. Las bacterias utilizan los nutrientes del medio de cultivo, los transforman e incorporan para obtener la energía necesaria para su reproducción. En esta fase no se observa un incremento en el número de bacterias, pero si se observa un incremento en el tamaño y en la actividad metabólica de cada bacteria, observándose un incremento en la producción de macromoléculas (RNA, DNA y Proteínas), lo cual se conoce como crecimiento desbalanceado. La duración de esta fase depende del tipo de microorganismo, de la edad y la composición del medio de cultivo del que proviene el inóculo.

2) Fase exponencial. Esta fase también es llamada de crecimiento exponencial o logarítmico, se caracteriza por que las bacterias despliegan todo su potencial metabólico, todos los componentes bacterianos se sintetizan en equilibrio, a esto se denomina crecimiento balanceado. Durante esta fase las bacterias transforman los nutrientes a la máxima velocidad y la obtención de energía es óptima. La población se duplica cada tiempo de generación provocando un incremente en exponencial en el número de bacterias, aquí es donde se producen los llamados metabolitos primarios, por ejemplo los aminoácidos y ácidos orgánicos.

3) Fase estacionaria. Es en esta fase donde la concentración uno o más componentes del medio de cultivo, se ha reducido hasta producir una disminución en la velocidad de las reacciones metabólicas. Esto también puede deberse a la acumulación de sustancias tóxicas para las propias bacterias o los cambios en el pH del medio de cultivo. En esta fase el número de bacterias se mantiene constante, ya no hay incremento en el número de bacterias pero se puede observar un incremento en el tamaño de cada bacteria. En esta fase las bacterias

liberan al medio de cultivo los llamados metabolitos secundarios como los antibióticos y los pigmentos.

4) Fase de muerte. En esta fase la población disminuye en una alta proporción cada cierto tiempo por lo que también es llamada fase de muerte exponencial. Esta fase refleja un deterioro metabólico de las bacterias lo cual causa que los individuos más susceptibles mueran, esto ocasiona una disminución en el número de bacterias del cultivo.

 2.3.1 Obtención de un cultivo puro o axénico

Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio.

La obtención de un cultivo axénico es un proceso de dos etapas. Primero, hay que esterilizar todos los materiales para eliminar todos los microorganismos presentes en ellos. Segundo, hay que aislar y cultivar un solo microorganismo, para producir un clon de descendientes.

2.4 Métodos de Esterilización.

Para obtener un cultivo axénico y el aislamiento de bacterias a partir de una muestra biológica se requieren tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes utilizados. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados para que se pueda obtener un cultivo axénico y en el proceso de muestra para evitar que estos microorganismos interfieran en la obtención de los resultados, recordemos que un microorganismos patógeno deberá competir por los nutrimentos con la microbiota asociada o normal presente en la muestra, así como con los microorganismos contaminantes si estos no son eliminados, lo cuál puede reducir la probabilidad de aislar al patógeno.

La eliminación de todos los microorganismos se denomina esterilización. En el laboratorio de bacteriología todo el material utilizado para el proceso de muestras debe ser esterilizado. Esto incluye el medio, las sustancias líquidas o sólidas que se añadan como nutrientes al cultivo, los matraces, tubos de ensayo, las placas, los utensilios necesarios para transferir los cultivos de un recipiente a otro (pipetas, jeringas), etc. Una vez esterilizado se debe cuidar que el material se conserve estéril para lo cual se debe preparar el material para ser utilizado, así a los tubos, matraces y otros recipientes se les coloca un tapón de algodón que evitara el acceso de microorganismos del ambiente al interior. También es necesario proteger este tapón con papel para evitar que se humedezca con agua de condensación. Algunos materiales son envueltos con papel para conservar su condición de esterilidad.

2.4.1 Conceptos básicos.

Para poder desempeñar correctamente las tareas en un laboratorio de microbiología, es indispensable contar con conocimientos teóricos acerca de los diferentes métodos de control del crecimiento microbiano (métodos de esterilización, desinfección, apepsia, etc.). También con un buen manejo práctico de los aparatos destinados a tal fin, del flameado de tubos y la esterilización de asas a la flama del mechero.

Esterilización. Es el proceso de destrucción o eliminación completa de toda forma de vida existente en el interior o en la superficie de cualquier material, por medio del calor, radiaciones, filtración, etc. Por lo tanto, la esterilización es un término absoluto e incluye la destrucción de las esporas y formas vegetativas, los virus, etc.

Desinfección. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los microorganismos más comunes pero no las esporas. Generalmente los desinfectantes son productos químicos excesivamente tóxicos para ser usados directamente sobre tejidos vivos. Muy pocos desinfectantes llegan a esterilizar.

Antisepsia. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los microorganismos patógenos más comunes, pero no necesariamente esporas, presentes sobre el cuerpo, la piel, las mucosas, los tejidos vivos, etc. El agente empleado se denomina antiséptico. Asepsia. Se refiere a la condición de ausencia de microorganismos de un objeto o área. Por ejemplo, las técnicas asépticas son las que evitan la contaminación propia de otros o de los materiales durante el trabajo.

Microbiostasis. Es una condición por la que el crecimiento o la multiplicación de los microorganismos están inhibidos, lo que no quiere decir que sean destruidos. Si el agente microbiostático es eliminado, el crecimiento microbiano puede resurgir. De igual definición pero de aplicación a la correspondiente categoría de microorganismos son los fungistáticos y los bacteriostáticos.

Microbiocida. Es el agente que destruye las formas viables de los microorganismos. De igual significado pero con ámbito más restringido son los términos fungicida y bactericida.

Sepsis. Es un término que proviene de un vocablo griego que significa “putrefacción”. El concepto se utiliza como sinónimo de septicemia, que es la afección generalizada que se produce por la presencia de microorganismos patógenos o de sus toxinas en la sangre.

Estéril. Condición que significa libre de toda señal de vida.

Pasteurización. Proceso de exponer un objeto a agua caliente a 77°C, durante 30 minutos. Su propósito: destruir todos los microorganismos patógenos, excepto esporas bacterianas.

Liofilización. Es una técnica de deshidratación por frio, un proceso común en la industria alimentaria conocido como deshidrocongelación (secado por congelación suena más sencillo…) el cual tiene la virtud de mantener al máximo las propiedades organolépticas de los alimentos, permitiendo la eliminación de bacterias al eliminar el agua de los alimentos.

2.4.2 Métodos de esterilización.

El proceso de esterilización se puede llevar acabo por métodos químicos y físicos, la selección de uno o de otro depende de la naturaleza del material que se piensa esterilizar.

2.4.2.1 Métodos Físicos

2.4.2.1.1. El Calor.

Fundamento de la esterilización por calor. El calor actúa desnaturalizando (coagulando) las proteínas. En las formas esporuladas (de resistencia), esta acción se ve disminuida por la presencia de lípidos formando parte de su estructura química, que actúa protegiendo las uniones peptídicas de las proteínas.

El calor es uno de los agentes físicos más usados. Su acción depende de la temperatura alcanzada y del tiempo de aplicación. De la consideración de éstos dos aspectos surgen las siguientes expresiones:

• Punto térmico mortal: es la menor temperatura capaz de matar una suspensión bacteriana en 10 minutos (tiempo constante y temperatura variable).

• Tiempo térmico mortal: es el menor tiempo necesario para matar una suspensión bacteriana a una temperatura determinada (tiempo variable y temperatura constante).

Para medir el efecto del calor se debe tener en cuenta si se trata de formas vegetativas o esporuladas (de resistencia). Para eliminar las formas vegetativas no se requiere de temperaturas muy altas ya que la mayoría se destruye a los 50 y 70°C, especialmente las patógenas. Las bacterias esporuladas requieren de temperatura superiores a los 100°C.

Además de la temperatura y el tiempo de exposición es importante tener en cuenta la humedad, el pH y la naturaleza del material a esterilizar. La humedad hace más efectivo el poder de penetración del calor; en cuanto al pH, el agregado de ciertas sales alcalinas aumenta la temperatura de ebullición.

FORMAS POSIBLES DE LA UTILIZACIÓN DEL CALOR COMO AGENTE ESTERILIZANTE

El calor puede ser aplicado para la esterilización de tres maneras diferentes:

Calor Seco. Es aire a temperatura elevada. Existen tres tipos:

a) Fuego directo: Consiste en exponer directamente a la llama el material a esterilizar, lo que se logra por oxidación violenta. Este método se utiliza para asas, agujas, flameado de bocas de tubos u otros recipientes y destrucción de material contaminado. En las llamas de los mecheros Bunsen se alcanzan temperaturas superiores a los 2.500°C, por lo que una breve exposición es suficiente. Sin embargo, cuando las asas de siembra están muy cargadas con microorganismos, la aplicación directa de la llama provoca la dispersión irregular del contenido de aquéllas, con el consiguiente peligro de la contaminación. Un sistema alternativo a los mecheros son los incineradores eléctricos bacterianos, en los que el riesgo de contaminación no existe, ya que la dispersión es recogida en el tubo del aparato.

b) Incineración en hornos crematorios: Se aplica a elementos contaminados de los que no importa su destrucción, como apósitos, cadáveres de animales infectados o material plástico contaminado (RPBI). Se utiliza la combustión directa o el horno crematorio.

c) Aire caliente (ej. Horno Pasteur): Se emplean las estufas de calor seco, en las que el aire caliente circula por el espacio que existe entre la doble pared, transmitiendo así el calor a los objetos que se encuentran en su interior. Los microorganismos se mueren por oxidación de sus estructuras previa deshidratación, pudiéndose llegar a una ligera carbonización.

Tiempo requerido: Una hora y media a dos horas, a una temperatura de 160 a 180ºC. El tiempo se mide desde el momento en que se alcanzó la temperatura indicada y está condicionado por la cantidad de material y su distribución dentro de la estufa. El aire caliente no tiene mucho poder de penetración, por esta razón es que se requiere mayor temperatura y tiempo que con otros métodos.Aplicación: se utiliza preferentemente para esterilizar material de vidrio. Descripción de la estufa: La estufa de esterilización a seco es una caja metálica de paredes triples. La pared interior es generalmente de acero inoxidable y presenta orificios para la libre circulación del aire caliente. La pared intermedia encierra, junto con la externa, el material aislante, que puede ser lana de vidrio o amianto. La fuente de calor es una resistencia eléctrica aunque también existen estufas a gas. Viene provista de un termorregulador para graduar la temperatura deseada. En la cara superior de la estufa existen orificios para permitir la salida de gases y vapores, pudiendo existir otro para la colocación de un termómetro en caso de no traerlo incorporado. En el interior posee rejillas metálicas de altura graduable para acondicionar sobre ellas el material a esterilizar.Uso: Esterilización de material de vidrio y otros materiales termorresistentes que interese mantenerlos secos. Todo el material a esterilizar debe estar debidamente empaquetado con papel de estraza o contenido dentro de cajas metálicas, de modo tal que una vez retirado de la estufa, permanezca estéril hasta el momento de ser usado.

Calor Húmedo. El vapor de agua es uno de los métodos más eficaces para destruir microorganismos, es mucho más eficaz que el calor seco (aire). Hay varias formas de emplear el calor húmedo.

a) Vapor a presión: Es uno de los métodos más utilizados; se emplea el autoclave para esterilizar material en general y particularmente para medios de cultivo y otros compuestos químicos utilizados en el laboratorio de microbiología.Este método tiene gran poder de penetración, razón por la cual la esterilización se puede llevar a cabo a menor temperatura y tiempo que cuando se emplea la estufa (calor seco) y está especialmente recomendado para la eliminación de formas esporuladas.

Descripción de la autoclave: El autoclave consiste en un cilindro de bronce, horizontal o vertical, con una tapa del mismo material que se apoya sobre una arandela de goma y se cierra por pestillos o cerrojos quedando herméticamente cerrado. Además, posee en la parte superior una llave de vapor (o espita), un manómetro y una válvula de seguridad. En el interior de la autoclave se coloca un volumen de agua que se hace hervir, ya sea por medio de quemadores externos que se encuentran en la parte inferior del aparato, o mediante calentadores eléctricos de inmersión. Se cierra luego la tapa, se atornilla dejando abierta la espita hasta que todo el aire del interior haya sido desplazado por el vapor. Debe dejarse que el vapor salga por la espita unos 5 minutos antes de cerrarla. Es muy importante que la eliminación del aire ya que, de lo contrario, la presión marcada por el manómetro indicará la temperatura a la que se encuentra la mezcla vapor aire en el interior, que es menor a la esperada para el vapor saturado a esa presión. Una vez que se ha cerrado la llave de vapor (espita), comienza a elevarse la presión en el interior del autoclave; usualmente se fija la válvula de seguridad para que se abra a 15 libras/pulgada2, estas presiones corresponden a 121ºC.

La presión se mantiene durante unos 20 minutos, no deben abrirse ni el autoclave ni la espita hasta que el manómetro indique “0” (cero). Si la presión se libera violentamente los líquidos en el interior del aparato hierven tumultuosamente, pudiendo aún reventar los elementos de vidrio.Una vez que el manómetro indique que no hay sobrepresión en el interior del aparato, se abre primero la llave de vapor y luego de algunos minutos se puede levantar la tapa de la autoclave. No se debe retirar el contenido inmediatamente.

Tiempo requerido: usualmente, para esterilizar medios de cultivo son necesarias temperaturas de 121ºC durante 15 a 20 minutos.Limitaciones: en función de la termolabilidad de ciertos materiales y componentes de medios de cultivo. Además es inadecuado para sustancias que son insolubles en agua, como las grasas, en las que la penetración del vapor es muy limitada.

b) Tyndalización: Es un procedimiento de calentamiento discontinuo creado por Tyndall, que permite esterilizar, a bajas temperaturas, aquellas sustancias que se alteran a altas temperaturas como algunos azúcares. Se puede realizar a baño María o autoclave abierta.La temperatura utilizada es generalmente de 60-80 ºC; a esta temperatura se eliminan las formas vegetativas pero no las esporuladas. Por esta razón es que después de un período de calentamiento de 30 minutos, se deja el material a 30-37ºC hasta el día siguiente, y se lo somete nuevamente al tratamiento inicial. Esta operación se repite después de 24 horas (esterilización fraccionada).La discontinuidad de calor- reposo permite a las bacterias desarrollar nuevas células vegetativas a partir de sus esporas, hasta que por último, en el tercer calentamiento, ya no quedarán formas esporuladas.

c) Pasteurización: Debe su nombre a Pasteur quien fue el primero en utilizar este método que actualmente presenta una serie de modificaciones. Tiene muy poca aplicación en bacteriología y es usada especialmente en leche, ya que destruye la totalidad de los gérmenes patógenos y la mayoría de la microbiota asociada, respetando la estructura física y composición química de la misma (otros ejemplos son la nata, bebidas alcohólicas, mosto, etc.).Consiste en someter el líquido a un calentamiento rápido seguido de un enfriamiento posterior. La temperatura aplicada es de 63ºC, durante 30 minutos con lo que se consigue la destrucción de las formas vegetativas, excepto las termófilas. Existe una pasteurización denominada alta o instantánea, en las que mantienen delgadas películas de leche vaporizada sobre tubos o placas a 71ºC, con lo que se requiere una exposición de sólo quince segundos.

2.4.2.1.2 Filtración.

Las bacterias pueden retirarse de los líquidos o gases por filtración. La filtración es lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razón, se utiliza sólo para los líquidos termolábiles, que no se pueden esterilizar en el autoclave. Los sólidos termolábiles también se pueden esterilizar por filtración, si previamente se disuelven en un líquido. Técnicamente, la filtración no esteriliza porque los virus pueden pasar a través de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayoría de los estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio.

Filtros de membrana. Estas membranas están compuestas de nitrocelulosa, con un poro de diámetro constante. La nitrocelulosa es un derivado químico de la celulosa, El diámetro de poro es aproximadamente de 0,45 a 4.0 µm; este tamaño es lo suficientemente pequeño como para eliminar todos los microorganismos, con excepción de los virus y algunas bacterias muy pequeñas. Un líquido se filtra haciéndolo pasar a través de un filtro de membrana acoplado a un matraz especial. Para hacer pasar el líquido por el filtro se utiliza una bomba de vacío; los microorganismos quedan en la superficie de la membrana. La filtración es el método de elección para esterilizar soluciones de vitaminas, antibióticos v otros compuestos termolábiles, que son añadidos a los medios.

Filtros HEPA: Son filtros de vidrio empleados para esterilizar el aire que penetra en habitaciones especiales como quirófanos, etc. También se emplean en cámaras de flujo laminar aparatos con forma cúbica (urna). Tienen una superficie donde se hacen las operaciones microbiológicas. El aire que penetra en la cámara pasa por los filtros HEPA, de manera que la superficie queda estéril.

2.4.2.1.3 Radiaciones.

Se denominan también esterilización fría. Se usa con material sensible al calor, ya que no produce calentamiento del material.

Radiaciones no ionizantes: Luz UV, muta el DNA (dímeros de timina), tiene bajo poder de penetración, se usa en superficies o ambientes como quirófanos o plantas de envasados.

Radiaciones ionizantes: Son los rayos X y los rayos gamma, tienen mucha energía y poder de penetración. Inducen la ionización de moléculas celulares tanto de organismos eucariotas como procariotas, provocando la muerte celular. Forman radicales hidroxilo y peróxidos que oxidan cualquier material dañando al ADN.

Los rayos X no se suelen utilizar porque son caros, pero sí los rayos gamma, y se obtienen fácilmente a partir del cobalto (60Co). Se emplean en procesos de enlatado y esterilización de material quirúrgico (bisturí, gasas...) Esto requiere altas medidas de seguridad deben practicarse en zonas especiales y las personas que los realicen deben ir protegidas.

2.4.2.2 Métodos Químicos.

Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos. En comparación con los procedimientos físicos, estos métodos tienen una importancia secundaria. Los antisépticos son considerados venenos protoplasmáticos que, al actuar sobre los gérmenes, los destruyen. Algunos de ellos ejercen su acción nociva sobre todas las células, por lo cual se les considera venenos generales, por el contrario otros actúan sobre algunas especies bacterianas, mostrándose como venenos específicos. Estos métodos son óptimos para la asepsia de las manos del operador, de locales, de mesas de trabajo, de jaulas de animales, y para destruir gérmenes que puedan contaminar el lugar de trabajo. Estos se pueden utilizar ya sea en forma de gas o líquidos.

Dentro de los compuestos químicos podemos encontrar agentes esterilizantes, desinfectantes y antisépticos.

La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actúan.

Concentración: varía con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma concentración del agente puede producir un efecto diferente en distintos microorganismos.

Tiempo: los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo.

pH: afecta tanto a los microorganismos como a los agentes químicos. El aumento de pH por encima de 7 incrementa la carga negativa de los microorganismos afectando la concentración del agente sobre la célula. El pH determina el grado de disociación y la efectividad del agente químico, pues a menor disociación mayor permeabilidad y mayor efectividad.

ANTISÉPTICOS Y DESINFECTANTES DE USO COMÚN EN HOSPITALES Y/O CENTROS ASISTENCIALES

Recordar:

1. Al utilizar cualquiera de éstos productos se debe tener en cuenta que la piel del paciente puede ser sensible a ellos.

2. Es conveniente que el antiséptico de elección sea el mismo en todas las áreas geográficas del hospital. Su uso debe estar previamente determinado, excepto áreas especiales donde el espectro del antiséptico que se elige debe ser amplio para eliminar el mayor número posible de gérmenes, también se tendrá en cuenta que no dañe las manos del personal.

3. Los antisépticos deben, una vez que llegan a los distintos servicios, fraccionarse en frascos pequeños, opacos y con tapa. El antiséptico que se coloca en estos frascos debe recambiarse diariamente, previo lavado y escurrido del frasco antes de proceder a su rellenado.

4. El alcohol al 70% puede colocarse en frascos comunes de vidrio blanco, pero éstos deberán tener tapa hermética.

5. Es importante mantener tapados los antisépticos ya que, por ejemplo, en el alcohol yodado, puede alterarse la concentración de cualquiera de sus componentes por evaporación.

6. La Iodopovodona jabonosa puede reemplazarse por gluconato de clorhexidina (Hibiscrub M.R.) según la evaluación que, en determinadas situaciones, realice la institución.

IODO-POVIDONA: (Pervinox M.R.) (Fada M.R.).

Es un iodóforo que resulta de la combinación de iodo con un agente solubilizador (PVP o povidona) que mantiene la eficacia germicida del iodo y resulta en un antiséptico relativamente libre de toxicidad e irritación.

Está disponible en forma de solución jabonosa y como solución tópica. Esta forma de iodo no irrita ni mancha y ha sido ampliamente aceptada en los últimos años para una gran variedad de aplicaciones preventivas, de limpieza (solución jabonosa para lavado de manos y baño previo prequirúrgico) y terapéuticas, incluyendo su uso en curación de heridas.

La más comúnmente empleada es la solución al 10%. Hay otros compuestos que están sometidos a investigación. Se cree que es microbicida, no meramente bactericida, lo que significa que además de las bacterias Gram (+) y Gram (-), eliminan virus, hongos, protozoos y levaduras. Se recomienda usarla sin diluir.

GLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL 4% (Hibiscrub M.R., Butyl M.R.).

Es un agente bactericida tópico eficaz contra gérmenes Gram (+) y Gram (-), pero de mayor eficacia sobre los primeros. Es también efectivo contra hongos y virus, pero su acción es muy baja sobre el Mycobacterium tuberculosis.

Presentación: Clorhexidina jabonosa y Clorhexidina alcohólica (no está en el mercado común). Se recomienda para: Baño del paciente (preferentemente no en cama ya que mancha las sábanas) y para el lavado de manos. La ventaja de éste antiséptico es una importante acción residual sobre la piel (entre 3 y 6 horas).

No se lo debe usar para desinfección de elementos o superficies, puesto que se inactiva en presencia de materia orgánica y materiales como corcho, algodón o goma.

HEXACLOROFENO (FISOHEX M.R.).

Es un agente bacteriostático más eficaz contra los gérmenes Gram (+) que contra los Gram (-), especialmente los estafilococos. Las materias orgánicas interfieren en su acción. Aunque una sola aplicación apenas modifica la flora cutánea, tiene efectos, acumulativos. Por lo tanto, puede usarse en duchas preoperatorias durante dos a cuatro días.

Cuando se ingiere o absorbe a través de una grieta en la piel o membranas mucosas (o incluso a través de piel intacta de algunos niños), el hexaclorofeno provoca una neurotoxicidad potencialmente cuando existen erupciones cutáneas, quemaduras o heridas abiertas. Se lo considera como a otros fenólicos, como desinfectante de nivel intermedio o bajo. Puede usarse en materiales no críticos y limpieza del ambiente hospitalario.

PERÓXIDO DE HIDROGENO (Agua oxigenada).

Ha sido empleado durante años para promover la limpieza de las heridas. Tiene un débil efecto germicida y fácilmente se degrada a oxígeno molecular y agua. Es muy importante su estabilidad, (6-10%), lo que es muy difícil de garantizar en nuestros mercados en relación al tiempo de almacenamiento. Su acción es mecánica, las burbujas de oxígeno desprenden tejido muerto y las bolsas de bacterias ayudan a eliminarlas de la herida. Tiene inconvenientes, puede crear ampollas llenas de aire en los nuevos epitelios, separándolos del tejido subyacente. Por consiguiente, el peróxido de hidrógeno no debe utilizarse cuando la herida está adecuadamente cicatrizada y se está formando epitelio nuevo. Tras su aplicación, debe eliminarse de la herida con solución fisiológica. Tampoco debe emplearse en ciertas heridas profundas ni en la cavidad peritoneal, pues podría provocar un émbolo gaseoso en los capilares y vasos linfáticos.

Se ha demostrado que es bactericida, virucida y fungicida. La inmersión de material limpio en una solución estabilizada al 6% proporcionaría una desinfección de alto nivel en treinta minutos. Su estabilidad no está garantizada en nuestro medio, por lo que no se la recomienda. Corroe metales como el cobre, aluminio y zinc. Debe mantenerse al abrigo de la luz.

ALCOHOL.

El alcohol etílico al 96% (etanol) es el que más comúnmente se encuentra en el ambiente hospitalario. Se recomienda para: Antisepsia de la piel en pacientes alérgicos al Iodo (debe dejarse actuar entre uno y dos minutos), desinfección de termómetros y desinfección de endoscopios fibroópticos.

Es eficaz contra la mayoría de las bacterias patógenas, pero de acción imprevisible contra los hongos y virus. Algo más potente es el alcohol isopropílico al 70% (Isopropanol). Ambos resecan la piel, lesionan el epitelio nuevo y provocan ardor cuando se aplican sobre heridas abiertas. El isopropanol también provoca vasodilatación bajo la superficie cutánea, de modo que las punciones con aguja sangran más que cuando se utiliza etanol.

El uso de isopropanol al 70% en las manos es un excelente método que reemplazaría en situaciones de emergencia el lavado con soluciones jabonosas, dada su alta eficacia. No tiene acción residual, pero varios estudios demostraron que es capaz de reducir en un 99,7% la concentración microbiana de la piel de las manos.

Actualmente el uso del isopropanol al 70% se recomienda para la sanitización de mesas de trabajo y equipo automatizado de laboratorio y para inactivar en caso de derrame accidental de RPBI.

ALCOHOL IODADO

Es una combinación de iodo con alcohol al 70%. Se debe utilizar en concentraciones al 2%. Actúa sobre bacterias Gram (+), Gram (-), Mycobacterium tuberculosis y hongos.

Se lo utiliza como antiséptico de elección para la preparación de la zona operatoria de la piel.

Debe mantenerse en recipientes opacos y tapados para evitar que por evaporación se alteren las concentraciones iniciales con que el producto llega proveniente de la farmacia del hospital.

AMONIOS CUATERNARIOS (Cl. de Benzalconio: Tersotyl M.R.) (DG6 M.R.)

Estos compuestos tuvieron amplio uso desde su inicio como germicida, son buenos agentes de limpieza, pero actualmente no se recomiendan como antisépticos de piel y tejidos, ya que diversos estudios han documentado que en ellos sobreviven y desarrollan bacterias Gram (-), que han podido relacionarse con brotes de infecciones hospitalarias. Materiales como el algodón y las gasas disminuyen su actividad, porque absorben los ingredientes activos.

No se los debe utilizar para la desinfección de elementos críticos o semicríticos. Solamente para el tratamiento de materiales no críticos. No eliminan esporas ni determinados virus, como por ejemplo el de la Hepatitis B. Debe usarse con cuidado, ya que se ha visto que algunas soluciones permiten el crecimiento de Pseudomonas sp.

HIPOCLORITO DE SODIO.

El producto clorado más utilizado en desinfección es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y además es efectivo en un amplio rango de temperaturas.

La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al ácido hipocloroso (HClO) y al Cl 2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua. La actividad germicida del ion hipocloroso es muy reducida debido a que por su carga no puede penetrar fácilmente en la célula a través de la membrana citoplasmática. En cambio, el ácido hipocloroso es neutro y penetra fácilmente en la célula, mientras que el Cl2 ingresa como gas.

El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l de Cloro activo), a pH alcalino y en envases oscuros que favorecen su estabilidad, pero es inactivo como desinfectante. A causa de ésto, es que deben utilizarse soluciones diluidas en agua corriente (que tiene un pH ligeramente ácido), con el objeto de obtener ácido hipocloroso. Generalmente, se utilizan soluciones con una concentración del 0.1-0.5% de Cloro activo.

FORMALDEHÍDO

Inactiva microorganismos a través de la alcalinización de las proteínas. Se presenta en concentraciones del 40%. La solución acuosa es bactericida, fungicida, esporicida y viricida.

Según su dilución actuará como esterilizante, luego de un tiempo prolongado o como desinfectante de alto nivel. Se lo utiliza para la inactivación de bacterias en los sistemas de distribución de agua tratada de los servicios de Hemodiálisis.

Los vapores de formaldehído tienen efectos tóxicos e irritantes, por lo que es necesaria la utilización de elementos protectores durante su manipulación. (Máscaras respiratorias, protectores oculares, guantes resistentes y delantales impermeables). El ambiente de trabajo debe contar con un adecuado sistema de recambio de aire. Concentraciones ambientales de 2 p.p.m. han ocasionado efectos tóxicos.

Las pastillas de formalina no deben utilizarse en cajas de instrumental, guantes, etc. Su acción germicida solo se produce en la vaporización por calor. Actualmente se desaconseja su uso en quirófanos o habitaciones de pacientes, por ser no solo un procedimiento riesgoso (efecto carcinogénico) sino también ineficaz.

Por las razones expuestas, su uso queda limitado a los servicios de Hemodiálisis.

OXIDO DE ETILENO.

Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.

Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y además cancerígeno.

2.4.3 Controles de esterilización.

Existen dispositivos de distinta naturaleza que sirven como indicadores de la calidad de la esterilización realizada. Los más simples son productos químicos que cambian de color a 121ºC. Se comercializan dentro de sobres, o en la superficie de cintas.

Se utilizan también monitores biológicos como controles de esterilización. Consisten en determinados microorganismos con una tolerancia conocida al método que se está empleando.

Las esporas de Bacillus stearotermophilus, por ejemplo, tienen una tolerancia conocida al calor húmedo. Se colocan ampollas con suspensión bacteriana o tiras impregnadas con esporas en lugares estratégicos en el interior del autoclave. Como regla general, los portadores de esporas deben colocarse en el centro del paquete de mayor carga, o en aquellos lugares dentro de la carga con posibilidades de no alcanzar la temperatura de esterilización.Cuando se abren los paquetes o recipientes luego de ser esterilizados, la ampolla con su contenido o la tira asépticamente colocada en un caldo de cultivo, se incuban durante 24 a48 horas. Si la esterilización fue eficiente no deberá haber desarrollo en estos cultivos.

Asimismo existen otros monitores biológicos para esterilización con calor seco, irradiación con rayos gamma, óxido de etileno etc., eligiendo las especies bacterianas a utilizar según su susceptibilidad conocida para cada procedimiento.

Algunas autoclaves modernas están equipadas con termómetros que producen un registro continuo y permanente de las temperaturas en el interior del aparato.

2.5 Métodos de aislamiento y recuento bacteriano.

El segundo paso para aislar un microorganismo patógeno de una muestra biológica es inocular o introducir en un medio solido o líquido, esterilizado previamente, la muestra analizada con el fin de promover el crecimiento de las bacterias facilitando su identificación. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido.

2.5.1. Métodos de aislamiento.

Para el aislamiento de bacterias se cuenta con varios métodos los más utilizados son: el método de la estría cruzada y el método de las diluciones.

El método de aislamiento por estría cruzada en placa. Es el método más fácil y el más usado para obtener colonias individuales. Para ello, con un asa de siembra se toma una cantidad representativa de la muestra (Inoculo) y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placas o cajas Petrí (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales.

El método de las diluciones. Este método consiste en realizar una serie de diluciones decimales de las cuales se toman alícuotas que se siembran en medios de cultivo sólido en placas o cajas Petrí, ya sea mediante la técnica de vertido en placa o por dispersión con la espátula de Drigalsky.

El método de las diluciones nos permite determinar las UFC/mL, presentes en la muestra por analizada.

2.5.2 Método de siembra.

Vertido en placa. En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en la placa o caja Petrí. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie.

Espatulado. Las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de una espátula de Drigalsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las colonias microbianas sobre la superficie.

Picadura: El medio de cultivo que se emplea semisólido en tubo y la siembra se realiza con asa recta, la que se introduce con el inóculo rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La punción se realiza en el centro del medio.

Picadura y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. Se introduce el asa recta en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo, se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta.

2.6 Morfología colonial.

Las colonias aisladas presentan características morfológicas diferentes debido a que cada grupo filogenético de bacterias tienen características peculiares que se ven influidas por las condiciones del medio. Una colonia se desarrolla en un medio sólido y procede de una sola bacteria o espora y conforma una agrupación de organismos de la misma especie. Por definición un buen aislamiento en placa es aquel que nos da colonias aisladas, con una distancia que permite distinguir y describir la morfología colonial que incluye:

Tamaño. Se describe en milímetros y puede variar desde colonias extremadamente pequeñas o puntiformes hasta aquellas que llegan a medir 10 mm o más.

Color. Las colonias pueden tener varios colores, debido a pigmentos propios o absorción de algunas sustancias del medio.

Forma. Pueden ser puntiformes, circulares o irregulares. Las colonias puntiformes son tan pequeñas que no pueden distinguir el resto de sus características.

Bordes. Pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lóbulos, filamentos, proyecciones como dientes de sierra o enrollados.

Elevación. Las colonia puede ser plana o elevada, está última a su vez puede ser convexa, pulvinada, umbonada, crateriforme o umbilicada.

Superficie. Puede ser lisa, rugosa o granular.

Aspecto. Puede ser húmedo o seco.

Luz reflejada. Puede ser brillante o mate.

Luz transmitida. Puede ser transparente, translúcida u opaca.

Producción de pigmento. Algunas bacterias producen pigmento soluble en agua que puede difundir al medio.

Consistencia. Dura o suave, esta última puede ser butirosa, mucoide o friable. Esta característica se determina tocando la colonia con el asa y por lo tanto de ser la ultima en describirse.

Otras. En ciertos medios de cultivo el crecimiento bacteriano ocasiona cambios visibles alrededor de la colonia, como la hemolisis en la gelosa sangre, acidificación que se manifiesta con un indicador de pH incorporado al medio de cultivo.

Con al experiencia en la observación de cultivos, las características de morfología colonial vienen a constituir una guía muy útil en el reconocimiento de los principales grupos de bacterias y también permite corroborar en muchos casos la pureza de un cultivo o alertar sobre una posible contaminación La certeza de tener un cultivo puro así como el reconocimiento de un cultivo mixto o impuro permite la caracterización e identificación correcta de un microorganismo patógeno.

Bibliografía

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Imágenes.

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