Lakti~ne bakterije (LAB) i njihov zna~aj u prirodiLakti~ne bakterije (LAB) i njihov zna~aj u prirodiLakti~ne bakterije (LAB) i njihov zna~aj u prirodiLakti~ne bakterije (LAB) i njihov zna~aj u prirodi

Lacteal Acid Bacteria (LAB) and their importance in natureLacteal Acid Bacteria (LAB) and their importance in natureLacteal Acid Bacteria (LAB) and their importance in natureLacteal Acid Bacteria (LAB) and their importance in nature

Autor: Jana [aracJana [aracJana [aracJana [arac----Sto{i}Sto{i}Sto{i}Sto{i}, u~enica VIII razreda O[ “ Vojvoda Radomir Putnik ” Regionalni centar za talente, Beograd I-Zemun

Mentori: Du{anka JakDu{anka JakDu{anka JakDu{anka Jak{i}{i}{i}{i}----Nikoli}Nikoli}Nikoli}Nikoli}, specijalista mikrobiologije, diplomirani biolog

pomo}nik direktora Instituta za imunologiju i virusologiju , sektor proizvodnje -Torlak Svetlana Todorovi}Svetlana Todorovi}Svetlana Todorovi}Svetlana Todorovi}, diplomirani biolog

profesor biologije u M[ “ Radoje Daki} ”- Beograd RadmilaRadmilaRadmilaRadmila SamolovSamolovSamolovSamolov, diplomirani biolog

profesor biologije u O[ “ Vojvoda Radomir Putnik ”- Beograd

RezimeRezimeRezimeRezime

LAB (odnosno bakterije mle~ne kiseline, skra}eno, BMK) su bakterije ~ije je osnovno svojstvo da obavljaju razgradnju ugljenih hidrata do mle~ne kiseline. Zbog velike rasprostranjenosti u prirodi i procesa fermentacije, odavno privla~e pa`nju nau~nika. Danas se mnoge od njih gaje u laboratorijama i one i njihovi produkti koriste u proizvodnji hrane i napitaka. Posebnu pa`nju privla~e u poslednje vreme zbog njihovog svojstva da uti~u na zdravlje ljudi i `ivotinja, kao i mogu}nosti primene njihovih produkata - bakteriocina u le~enju nekih infekcija, izazvanih patogenim bakterijama, koje su postale otporne na delovanje velikog broja antibiotika. Klju~ne re~i : LAB, Lactobacillus, Bifidobacterium, bakteriocini, probiotik, fermentacija, API sistem

SummarySummarySummarySummary

LAB (Lacteal Acid Bacteria) are the bacteria whose basic function is to break down (dissolve) carbon hydrates to lacteal acid. Due to its widespread natural distribution and the process of fermentation, they have for a long time attracted attention of scientists. Today many of them are being cultivated in laboratories, they and their products being used in the production of food and beverages. They have drawn special attention lately, due to their effect on the health of people and animals, and the possibility of applying their products- bacteriocines in curing some infections caused by pathogenic bacteria that have become resistant to the action of great number of antibiotics. Key words: LAB, lactobacillus, bifobacterium, bacteriocines, probiotics, fermentation, API system.

UvodUvodUvodUvod

Definicija LAB i kratak istorijat njihovog izu~avanja

Grupa lakti~nih bakterija nije homogena grupa. Ona obuhvata ve}i broj bakterija raznih taksonomskih kategorija, koje su sve Gram pozitivne, koke ili bacili. Zajedni~ka osobina im je da su saharoliti~ke i da razgradnju ugljenih hidrata obavljaju do mle~ne kiseline , preko niza organskih proizvoda. Nisu patogene i ~esti su simbionti sisara. Mogu biti anaerobne, a naj~e{}e su mikroaerofilne i mogu se adaptirati na aerobne uslove `ivota. Tokom svog rasta ove bakterije mogu da sinteti{u antimikrobne supstance (mle~nu kiselinu, bakteriocine i H2O2), koje deluju inhibitorno na rast saprofitnih i patogenih mikroorganizama.

U 19. veku veliki ruski nau~nik Me~nikov je primetio da populacije koje u svojoj ishrani imaju mnogo mle~nih proizvoda (Bugari, Rumuni, Kavkazci, balkanski narodi) du`e `ive. To je navelo Luja Pastera da prvi primeni mle~nokiselinske proizvode u terapijske svrhe. Francuski mikrobiolog Tissier je 1899. godine prvi izolovao lakti~ne bakterije iz fecesa novoro|enih beba i nazvao ih Bacillus bifidus. Daljim otkri}ima velikog broja vrsta ovih bakterija i njihovim izu~avanjem izdvaja se u poseban rod Bifidobacterium, Orla-Jensen 1924. godine. Prvu bakteriju iz roda Lactobacillus izolovao je Keri 1881. godine iz fermentisanog kavkazkog mleka kefira. Od tada traje interesovanje nau~nika za ove grupe bakterija koje su {iroko rasprostranjene u prirodi i igraju veoma zna~ajnu ulogu u nizu procesa: fermentacijama, aromatizovanju hrane, antimikrobnoj za{titi, a novija istra`ivanja pokazuju da imaju i zna~ajnu imunomodulatornu ulogu [2,4,8,9].

1.Prirodno nalazi{te LAB i njihova uloga u prirodi

LAB su u prirodi {iroko rasprostranjene i mogu se na}i i u biljnom i u `ivotinjskom svetu. Nastanjuju se na svim biljnim delovima, a najvi{e ih ima na listovima i plodovima. Sa biljaka ishranom dospevaju u organizam `ivotinja i ljudi. Broj bakterija na biljnim organima nije veliki, najverovatnije zbog prisustva kiseonika, ali je taj broj sasvim dovoljan da naseli organizam `ivotinja i ljudi, kod kojih se naseljavaju uglavnom na sluzoko`ama i to usne duplje, gastrointestinalnog trakta, vagine, kao i mle~nim kanalima dojki kod sisara. LAB su uglavnom izolovane tokom spontanih fermentacija u prirodi, npr. fermentacije mleka, mesa, vo}a i povr}a. Tokom metaboli~kih procesa bakterije mle~ne kiseline proizvode razli~ite molekule koji poseduju antimikrobna svojstva i tako spre~avaju rast nepo`eljnih saprofitnih i patogenih mikroorganizama tj. imaju baktericidnu aktivnost. Osim kod sisara, lakti~ne bakterije prona|ene su i kod drugih `ivotinja , npr. u mednom `eludcu p~ela. Smatra se da asepti~ka svojstva meda omogu}avaju upravo lakti~ne bakterije prisutne u mednom `eludcu p~ela. Uloga LAB kod `ivotinja je za{titna i poreme}aj ove simbioze pra}en gubitkom laktobacilarne flore (kod febrilnih stanja, stresa, kori{}enja antibiotika, itd.) dovodi do te{kih poreme}aja i mogu}nosti naseljavanja patogene mikroflore [4,8,9].

2.Morfolo{ke, kulturelne,fiziolo{ke i biohemijske osobine najzna~ajnijih rodova iz grupe LAB

rod Lactobacillus i rod Bifidobacterium

Ove bakterije su Gram pozitivni {tapi}i, ne stvaraju spore, uglavnom su nepokretni i ne stvaraju pigment. Starije kulture mogu biti Gram negativne. Mogu biti u vidu pravih ili zakrivljenih {tapi}a, razli~ite du`ine i debljine. Raspore|eni su pojedina~no, u lancima ili palisadno, sa ili bez grananja. Rod Bifidobacterium ima izra`enu osobinu grananja, naro~ito u nepovoljnim uslovima `ivota. Grananje omogu}ava pove}anje apsorpcione povr{ine }elije i time stvara mogu}nost da se lak{e do|e do neophodnih supstanci za `ivot. Smatra se da je sposobnost grananja jedno}elijskih organizama primitivna karakteristika koja ukazuje na starost vrste, pa se bifidobakterije smatraju filogenetski starim bakterijama bliskim aktinomicetama, koje spadaju me|u najstarije bakterijske vrste. Kulturelne osobine specifi~ne su za svaku vrstu. Neophodni faktori rasta su: aminokiseline, peptidi, nukleinske kiseline, masne kiseline, vitamini, soli, fermentativni ugljeni hidrati. Energiju dobijaju anaerobnom fermentacijom ugljenih hidrata. Fermentacija glukoze mo`e biti homofermentativna i heterofermentativna. Homofermentativne vrste razla`u heksoze i daju 85%-95% mle~ne kiseline, minimalne koli~ine CO2 i sir}etnu kiselinu . Heterofermentativne vrste proizvode samo oko 50% mle~ne kiseline, ostatak {e}era pretvaraju u alkohol, sir}etnu i mravlju kiselinu i CO2. Proteoliti~ka aktivnost je slaba ili je nema. Rast je najbolji u mikroaerofilnim i anaerobnim uslovimai uz CO2.

Optimalni pH za rast ovih bakterija je od 5,5 do 6,5 ali, obzirom da su otporne na kiseline mogu da rastu i na znatno ni`oj vrednosti pH. Optimalna temperatura za rast varira, a najve}i broj vrsta dobro raste na temperaturi od 370C do 400C. Temperatura od 600C do 650C uni{tava ih za 30 minuta [2,3].

3.Zna~aj LAB u prehrambenoj industriji

Savremena prehrambena industrija ne mo`e se zamisliti bez lakti~nih bakterija. One su u prirodi mikroorganizmi koji izazivaju fermentaciju mleka, mesa, povr}a i vo}a.Ovi spontani procesi u prirodi, danas se u prehrambenoj tehnologiji obavljaju u kontrolisanim uslovima, zahvaljuju}i odabranim sojevima LAB. Starter kulture su odabrane vrste bakterija mle~ne kiseline koje poseduju odgovaraju}a svojstva koja im omogu}avaju da zapo~nu i izvedu `eljenu fermentaciju do kraja i daju visokokvalitetan proizvod. Njihova uloga je : a)da fermentacijom laktoze i drugih ugljenih hidrata proizvode mle~nu kiselinu, koja doprinosi osve`avaju}e kiselom ukusu mle~nih proizvoda i inhibira rast patogenih i saprofitnih mikroorganizama, a kod proizvodnje sira mle~na kiselina je va`na tokom koagulacije i obrazovanja grude; b)da proizvode isparljive komponente koje doprinose ukusu i aromi krajnjih proizvoda (diacetil i aldehid); c)da poseduju proteoliti~ke i lipoliti~ke enzime neophodne tokom zrenja pojedinih vrsta sireva. Danas su u upotrebi dva tipa startera: mezofilni sa optimalnom temperaturom od 300C i termofilni sa optimalnom temperaturom iznad 370C. Oba tipa starter kultura mogu biti monokomponentne i vi{ekomponentne, koje se danas uglavnom koriste. Izbor startera zavisi od vrste proizvoda koji se `eli dobiti. LAB i dobro konstruisane starter kulture koriste se u industriji mle~nih proizvoda, mesnoj industriji, vinarstvu, fermentaciji vo}a i povr}a kao i u industriji hleba i kiselog testa. Jedna od najva`nijih njihovih uloga je uloga u spre~avanju kvarenja prehrambenih proizvoda produ`avanje roka njihovog trajanja [7].

4.Proboiti~ki zna~aj LAB

Termin “probiotik” prvobitno je definisan kao “ `ivi mikrobni dodatak sto~noj hrani, koji povoljno uti~e na zdravlje stoke i zdravlje ljudi, doprinose}i uspostavljanju ravnote`e unutar mikrobne populacije intestinalnog trakta”. Ova definicija je znatno pro{irena i probiotik se defini{e kao `ivi mikrobni sastojak hrane koji ima pozitivan zdravstveni efekat, izvan uobi~ajenih nutritivnih vrednosti.Dakle, nisu sve bakterije LAB probiotske, ve} samo odabrani, ispitani sojevi. Namirnice koje sadr`e probiotike nazivaju se probiotskim i ~ine veliki deo funkcionalne hrane, gde pod funkcionalnom hranom podrazumevamo hranu konvencionalnog izgleda i na~ina upotrebe, a koja u okviru osnovnih nutritivnih sastojaka (proteina, ugljenih hidrata, masti, minerala, vitamina), sadr`i posebne biolo{ki aktivne komponente za koje je dokazano da imaju pozitivni uticaj na zdravlje ljudi (kod nas se naj~e{}e koristi termin “zdrava hrana“). Bakterije mle~ne kiseline, koje pripadaju probioticima veoma su zna~ajne, jer su ne{kodljive. One pru`aju mogu}nost da se putem ishrane vr{i stabilizacija flore intestinalnog trakta. Tako|e, pojavom patogenih bakterija sa izuzetnom virulentno{}u, zbog preterane upotrebe antibiotika, pojavio se problem nastao konvencionalnim le~enjem nekih infekcija. Probiotici mogu biti jeftina alternativa i re{enje problema sa malim rizikom, koje omogu}ava pravovremenu zdravstvenu za{titu od infekcija. Tako|e hrana koja sadr`i probiotike dovodi u organizmu do pobolj{anja usvajanja laktoze, antagonisti~kog delovanja u odnosu na crevne patogene, spre~avanja stvaranja kancera debelog creva putem prevo|enja potencijalnih prekancerogenih jedinjenja u manje {kodljiva, imunomodulacije preko stimulacije imunog odgovora, smanjenja serumskog holesterola i

smanjenja toksi~nih metabolita. Neki od ovih efekata su do sada dobro dokumentovani, a neki se jo{ uvek nalaze u fazi ispitivanja. Proizvodi koji sadr`e probiotike koriste se uglavnom kao mle~ni proizvodi. Probiotici se uglavnom kombinuju sa prebioticima, tj. nesvarljivim sastojcima hrane, koji podle`u fermentaciji u debelom crevu. Ovi dodaci su dijetalna vlakna, inulin, laktoza,itd koji deluju stimulativno na rast bifidobakterija. Zbog svega navedenog, smatra se da je budu}nost primene funkcionalne hrane koja sadr`i probiotike veoma velika, naro~ito u vreme kada se prevenciji pridaje sve ve}a pa`nja [7].

5.Zna~aj LAB za zdravlje ljudi i krupnih sisara

Lakti~ne bakterije su prvi i najva`niji simbionti ~oveka i krupnih sisara. Za ~oveka je najva`niji rod Bifidobacterium. Kolonizacija nastaje samim prolaskom bebe kroz poro|ajni kanal tokom ro|enja, jer sluzoko`a zdrave vagine sadr`i lakti~ne bakterije, kao i prvim podojem po{to se LAB nalaze i u mle~nim kanalima dojke. Bifidobakterije ~ine 99% bakterijske flore fecesa beba koje sisaju. Kod beba koje su na ve{ta~koj ishrani, predominantnu crevnu floru ~ine bakterije iz roda Lactobacillus. Ispitivanjima je utvr|eno da su bebe koje sisaju zdravije i otpornije na crevne zarazne bolesti. Kori{}enjem drugih namirnica u ishrani postepeno se menja i crevna mikroflora. Korisno dejstvo lakti~nih bakterija na zdravlje ljudi i bakterija ispoljava se u: 1)adheriranju na receptore na sluzoko`ama i takvom blokadom spre~avaju adherenciju patogenih bakterija; 2) produkuju ~itav niz korisnih metabolita koji imaju inhibitorno dejstvo na patogenu mikrofloru i pospe{uju obnavljanje o{te}ene sluzoko`e; 3)lakti~ne bakterije igraju ulogu imunomodulatora, ali se ti mehanizmi moraju detaljno istra`iti; 4)na nivou tankog creva ume}u se u metabolizam masti, ~ime uti~u na sni`enje nivoa holesterina u krvi; 5)vr{e razgradnju trule`nih materija koje ina~e dovode do lo{eg stanja organizma (nadutosti, gr~eva, lo{eg tena itd.). LAB ~ine normalnu mikrofloru organizama ~oveka i krupnih sisara. U slu~aju poreme}aja ili gubljenja ove mikroflore , ona se mora nadoknaditi, ina~e dolazi do veoma te{kih poreme}aja usled naru{avanja biolo{ke ravnote`e. Zbog toga LAB predstavljaju i dalje metu istra`ivanja mnogih stru~njaka.

6.Mogu}nost primene u terapijske svrhe kako `ivih bakterija tako i produkata njihovog metabolizma

Interesovanje istra`iva~a za izu~avanje lekovitog dejstva LAB odnosno njihovih derivata naglo je poraslo zbog pove}ane rezistencije patogenih mikroorganizama na antibiotike. Neke bakterije koje su pre upotrebe antibiotika bile saprofitne i samo uslovno patogene, postale su patogene.To je primoralo istra`iva~e da nastave sveobuhvatna istra`ivanja LAB i njihove primene i u terapijske svrhe. Poseban zna~aj ima otkri}e bakteriocina, tj. produkata metabolizma bakterija koji imaju antibakterijsko svojstvo prema drugim vrstama bakterija. Bakteriocini su specifi~ni produkti metabolizma bakterija koji imaju antibakterijska svojstva prema drugim vrstama bakterija. Od antibiotika se razlikuju po hemijskoj strukturi, na~inu i opsegu delovanja na druge bakterije. To su proteinski molekuli male molekulske mase koji zahtevaju receptor za adsorpciju i baktericidno delovanje na }elijskoj membrani. Me|utim, ne smeju se zanemariti i drugi produkti metabolizma lakti~nih bakterija, koji nisu proteinske strukture, a imaju ulogu u ovom mehanizmu. Neki autori smatraju da su bakteriocini aktivni samo prema srodnim vrstama bakterija i da se radi o mehanizmu kompeticije za `ivotne uslove. Sigurno je da bakteriocini

igraju kompetitivnu ulogu , ali se njihova priroda i mehanizam delovanja moraju dalje istra`ivati [4,8,9]. Va`na osobina lakti~nih bakterija je da su Gram pozitivne i da u muraminskom delu }elijske membrane sadr`e teihoi~nu kiselinu koja ima veliki zna~aj za pobu|ivanje celularnog imuniteta. Danas postoji mogu}nost dobijanja ~istih kultura ~ija se svojstva mogu ispitati i stabilizovati, {to je omogu}ilo pripremu preparata za terapijske svrhe. Najve}i broj tih preparata ~ine `ive liofilizovane kulture odabranih lakti~nih bakterija, u dovoljnom broju za brze i trajne terapijske efekte. Liofilizacija je proces su{enja bakterijskih kultura putem niskih temperatura u kontrolisanim uslovima. Tako se bakterijske kulture prevode u stanje potpunog fiziolo{kog mirovanja, sa o~uvanim specifi~nim osobinama. Kada ove kulture dospeju u pogodne uslove `ivota, one se revitalizuju i po~inju da se dele i produkuju svoje metabolite. U novijim istra`ivanjima dobijeni su produkti lakti~nih bakterija in vitro. Ispitivanja su pokazala da ovi produkti sadr`e protein male molekulske mase, koji se nalazi u opsegu bakteriocina, termostabilan je, biolo{ki veoma aktivan i potpuno ne{kodljiv. Biolo{kim ispitivanjem utvr|eno je da ima izuzetno antimikrobno dejstvo na veliki broj ispitanih mikroorganizama (npr. Staphylococcus, Enterococcus, Salmonella,Pseudomonas, Escherichia coli, Shigella). Da bi ovako dobijen preparat mogao da se primeni na ljudima, ura|eni su testovi ne{kodljivosti i sterilnosti. Isra`iva~kim radom kao i klini~kim ispitivanjem dobijeni su dobri rezultati u saniranju te{kih infekcija ko`e i sluzoko`e. Preparat je, osim antimikrobnog dejstva, pokazao i dobar antiinflamatorni efekat i pospe{ivanje obnavljanja tkiva [4,8,9].

Cilj radaCilj radaCilj radaCilj rada

Cilj rada je upoznavanje sa osnovnim karakteristikama bakterija Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium bifidum kao i ovladavanje odre|enim rutinskim procedurama karakterizacije kultura u bakteriologiji.

Materijal i metode radaMaterijal i metode radaMaterijal i metode radaMaterijal i metode rada

Ovaj rad obuhvata neke osnovne metode ispitivanja morfolo{kih, fizi~kohemijskih, biohemijskih i fiziolo{kih karakteristika LAB. Kod ispitivanja morfolo{kih osobina LAB, kori{}eno je : A-fiksiranje mikroskopskog preparata, B-metoda bojenja po Gramu i C- posmatranje obojenog preparata pod mikroskopom. Ispitivanja fizi~kohemijskih osobina kultura LAB obuhvatilo je : A- merenje pH vrednosti i B- merenje opti~ke gustine kultura. Ispitivanje biohemijskih i fiziolo{kih osobina LAB obavljeno je : A- pra}enjem fermentacije odabranih ugljenih hidrata.

Rezultati istra`ivanja i diskusijaRezultati istra`ivanja i diskusijaRezultati istra`ivanja i diskusijaRezultati istra`ivanja i diskusija

7.Ispitivanje morfolo{kih osobina LAB

A. Fiksiranje preparata

Mikroskopska plo~ica je odma{}ena brisanjem alkoholom. Specijalnom olovkom plo~ica je obele`ena sa donje strane. Plo~ica je pa`ljivo zagrevana nad plamenom {piritusne lampe.

Mikroskopskom ezom(predhodno zagrevanom nad plamenom do usijanja, radi dezinfekcije )

kap kulture je stavljena na mikroskopsku plo~u. Nakon {to se osu{io, preparat je fiksiran provla~enjem plo~ice nad plamenom {piritusne lampe, {to je ponovljeno nekoliko puta [5].

B. Bojenje po Gramu Bojenje po Gramu je slo`eno diferencijalno bojenje kojim se razlikuju Gram-pozitivne (ozn. gram +) od Gram-negativnih (ozn. gram -) bakterija. Potreban materijal : 1.fiksirani preparat 2.rastvor karbol gencijalne violet 3.Lugolov rastvor 4.etanol 5.rastvor karbol fuksina 6.odgovaraju}e posu|e-set od 6 kiveta. Postupak bojenja Fiksirani preparat se potopi u rastvor gencijalne violet u prvoj kiveti (90-120 sekundi, u zavisnosti od debljine preparata) U drugoj kiveti sa Lugolovim rastvorom preparat se dr`i 30 sekundi. U tre}oj kiveti vr{i se odbojavanje etanolom. Preparat se nekoliko puta, na kratko, potapa u etanol. Postupak se ponavlja dok se sa preparata sliva ljubi~asta boja. U ~etvrtoj kiveti nalazi se voda. Preparat se ispira dok voda ne po~ne pravilno da se sliva niz povr{inu staklene plo~e. Preparat se slede}ih 90-120 sekundi dr`i u petoj kiveti, u kojoj se nalazi rastvor karbol fuksina Nakon toga, preparat se ponovo ispira vodom u {estoj kiveti. Obojeni preparat se osu{i dr`anjem na sobnoj temperaturi ili filter-hartijom. Ovakvim postupkom bojenja se razlike u gra|i i hemijskom sastavu }elijskog zida ispoljavaju razli~itim bojenjem bakterijske }elije: ljubi~astim kod gram+ i crvenim kod gram- bakterija. Razlike u bojenju se javljaju kao posledica: 1)manjeg procenta peptidoglikana u }elijskom zidu gram- bakterija; 2)razli~itog broja i polo`aja peptidnih mostova izme|u lanaca naizmeni~no vezanih N-acetilglukozamina i N-acetil muraminske kiseline; 3)ve}eg procenta lipida i proteina u }elijskom zidu gram- bakterija. Zbog navedenih osobina znatno je ja~a veza gencijalne violet i }elijskog zida gram+ bakterija, dodatno stabilizovana u prisustvu Lugolovog rastvora. Otuda prilikom odbojavanja etanolom gram+ bakterije zadr`avaju gencijalnu violet, dok se u slu~aju gram- bakterija rastvaranjem i ispiranjem dela lipidnih komponenti }elijskog zida spira i najve}i deo boje. Tako su u trenutku potapanja mikroskopskog preparata u kivetu sa karbol fuksinom gram+ bakterije ostale i dalje ljubi~asto obojene a gram- bakterije obezbojene (odbojene u etanolu). Zbog toga se gram- bakterije u prisustvu kontrastne boje karbol fuksina oboje crveno.

C. Posmatranje obojenog preparata pod mikroskopom Na osu{eni, obojeni preparat je stavljena kap kedrovog ulja. Preparat je stavljen pod svetlosni mikroskop (uveli~anje 1000 puta). Pode{avanjem zavrtanja, preparat je nacentriran i njegov lik je izo{tren. Mikroskopiranjem smo dobili podatke o morfolo{kim osobinama posmatranih bakterija : a)obliku bakterijske }elije b)veli~ini bakterijske }elije c)me|usobnom rasporedu bakterijskih }elija (pojedina~ne, parovi, lanci, grozdovi) d)sposobnosti vezivanja bakteriolo{kih boja. I. Obojeni preparat kulture Lactobacillus acidophilus (crte` 1.) a)oblik bakterijske }elije- pravilni, kratki {tapi} ravnih i o{trih ivica (bacil) b)veli~ina bakterijske }elije- srednje dugi {tapi}i, a ima nekoliko i du`ih oblika (involutni oblik-oblik bakterijske }elije nastao pretrpljenim promenama,prete`no usled starosti }elije) c) me|usoban raspored bakterijskih }elija pojedina~an (po{to je uzorak iz te~ne kulture) i ponegde palisadan (kao crepovi na krovu) d) sposobnost vezivanja bakteriolo{kih boja- bakterije su se ljubi~asto obojile.

Obojeni preparat kulture Lactobacillus acidophilus (crte` 1.)

Obojeni preparat kulture Bifidobacterium bifidum (crte` 2.)

Lactobacillus acidophilus - coloured (fig.1.) Bifidobacterium bifidum - coloured (fig. 2.)

Zaklju~ak: Prema Gramovom postupku bojenja, ljubi~asta boja bakterija Lactobacillus acidophilus ukazuje na pripadnost gram+ bakterijama. II.Obojeni preparat kulture Bifidobacterium bifidum (crte` 2.) a) oblik bakterijske }elije- pravilni, kratki {tapi} ravnih i o{trih ivica (bacil) b) veli~ina bakterijske }elije- kratka c) me|usoban raspored bakterijskih }elija- pojedina~an ili palisadan d)sposobnost vezivanja bakteriolo{kih boja- bakterije su se ljubi~asto obojile. Zaklju~ak: Prema Gramovom postupku bojenja, ljubi~asta boja bakterija Bifidobacterium bifidum ukazuje na pripadnost gram+ bakterijama.

8.Ispitivanja fizi~kohemijskih osobina LAB

A. Odre|ivanje vrednosti pH kulture Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium bifidum pH je vrednost eksponenta sa pozitivnim predznakom u vrednosti koncentracije hidronijum jona. Neutralni rastvor ima pH=7, kiseo rastvor ima pH<7 a bazni rastvor ima pH>7. Vrednost pH uzoraka odre|uje se pH-metrom. pH-metar je uklju~en pola sata pre po~etka procedure odre|ivanja pH uzoraka. Elektroda je obrisana alkoholom, zatim isprana vodom i obrisana.Pomo}u rastvora sa poznatim pH kontroli{emo pode{enost instrumenta. Uzeti su uzorci kultura Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium bifidum. Pre merenja pH vrednosti, uzorci u posudama su promu}kani radi spre~avanja talo`enja. Posuda sa uzorkom kulture Lactobacillus acidophilus je stavljena pod elektrodu tako da je kraj elektrode zaronjen u kulturu. Pri tome se posuda lagano protresa sve dok se ne ustali vrednost pH na ekranu. Za uzorak te kulture o~itana je vrednost pH=4,37. Na isti na~in za uzorak kulture Bifidobacterium bifidum odre|ena je vrednost pH=4,39. Po obavljenim merenjima elektroda je o~i{}ena vodom i alkoholom i potopljena u KCl. Zaklju~eno je da su oba uzorka kisela (pH< 7), pri ~emu je kiselost uzorka kulture Lactobacillus acidophilus ve}a od kiselosti uzorka kulture Bifidobacterium bifidum[6]. Merenje pH slu`i za procenu kiselosti kultura. PH vrednosti ni`e od 7,0 ukazuju na kiselost uzorka. Na{i uzorci su imali pH pribli`no 4,0. Pri merenju pH koristili smo pH-metar (instrument za odre|ivanje pH vrednosti uzorka).

B. Merenje ekstinkcije kulture Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium bifidum Ekstinkcija izra`ava ukupan broj }elija u uzorku (mrtvih i `ivih). Instrument za merenje ekstinkcije naziva se kolorimetar. Kolorimetar je uklju~en pola sata pre merenja. Izvr{eno je ba`darenje na po~etnu vrednost (0) pomo}u kivete ispunjene fiziolo{kim rastvorom. Uzeti su uzorci, koji moraju biti iste starosti radi valjanosti rezultata upore|ivanja, kulture Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium bifidum.

Uzorak kulture Lactobacillus acidophilus sipan je u kivetu za merenje do nivoa iznad obele`ene crte. Kiveta je stavljena u kolorimetar u prostor za merenje. Sa skale na instrumentu je o~itana vrednost ekstinkcije 1,10 tog uzorka. Po istom postupku za uzorak kulture Bifidobacterium bifidum utvr|ena je ekstinkcija 1,15. Zaklju~eno je da je ekstinkcija uzorka kulture Bifidobacterium bifidum ve}a od ekstinkcije uzorka kulture Lactobacillus acidophilus. Dobijene vrednosti ekstinkcije (oko 1,0) odgovaraju 109CFU/ml broju vijabilnih mikroorganizama, gde je CFU skra}enica za “colony forming unit “. Merenje ekstinkcije govori o gustini kulture. [to je ve}a ekstinkcija, ve}i je ukupan broj bakterija (`ivih i mrtvih). Gu{}i uzorci propu{taju manje svetlosti i daju ve}u vrednost ekstinkcije, a re|i uzorci propu{taju vi{e svetlosti i daju manju vrednost ekstinkcije-opti~ke gustine. Pri merenju na{ih uzoraka koristili smo kolorimetar sa `utim filterom za svetlost. Na{i uzorci su kulture LAB i izmerene vrednosti pokazuju visoke vrednosti opti~ke gustine (pribli`no 1,1). To nam ukazuje na veliki ukupan broj }elija u uzorcima.

9.Fiziolo{ko ispitivanje LAB po API - sistemu

Fiziolo{ko ispitivanje LAB po API - sistemu jedno je od najkompletnijih i najpouzdanijih ispitivanja bakterija, a radi se o komercijalnom preparatu za humanu upotrebu, koji se zasniva na bazi mikrogalerijskog sistema sa polihidroksilnim alkoholima i osu{enim {e}erima na koje deluju (ili ne deluju) dodatne suspenzije bakterijske kulture. Tipovi pozitivnih rezultata upore|uju se sa standardnim tablicama, odakle se o~itava ta~na vrsta iz date bakterijske suspenzije. Ova metoda je predlo`ena od francuskih stru~njaka. Va`na karakteristika LAB je njihova fermentacija. LAB su dobile ovaj naziv po tome {to fermentuju laktozu do mle~ne kiseline kao glavnog, ~esto i jedinog proizvoda. Po svojim fermentativnim osobinama ova grupa bakterija deli se na podgrupe: homofermentativne i heterofermentativne vrste. Ispitivali smo da li odabrani uzorci kultura Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium bifidum fermenti{u odabrane ugljene hidrate. U tome nam je pomogao API 50 set komplet karakteristi~nih (odabranih) polihidroksilnih alkohola i ugljenih hidrata (glicerol, riboza, galaktoza, laktoza, arabinoza, celobioza, rafinoza,...), koje LAB na sebi svojstven na~in fermenti{u. Destilovana voda je uzeta pomo}i pipete i stavljena u udubljenja u posudi (u svaki ugao i u sredinu stavljena je kap vode). Zatim je u posudu stavljena API galerija. Za svaku od kultura Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium bifidum, kori{}en je poseban set API 50 galerije. Uzorcima kultura pojedina~no smo zasejali bunar~i}e sa pripremljenim ugljenim hidratima i kontrole. I. Lactobacillus acidophilus (tabela 1.) Eza je zagrejana nad plamenom. Pomo}u nje je, blagim grebanjem, skinuta kultura sa podloge. Kultura je prethodno inkubirana 24 ~asa na 37 0C u Petrijevim {oljama. Eza sa uzetim uzorkom kulture je zagrejana u epruveti sa destilovanom vodom. Primerenim me{anjem uzorka pomo}u laboratorijske me{alice, uzorak je razmu}en u vodi. Nakon toga, epruveta je stavljena u kolorimetar i odre|ena je ekstinkcija 1. Uzeta je ampula medijum suspenzije. Sterilnom testericom skinut je vrh ampule. Pipetom je uzorak uzet iz epruvete i stavljen u ampulu. Potom je sadr`aj ampule homogenizovan. Pasterkom je prenet deo materijala iz ampule u bunar~i}e API galerije na ~ijem se dnu nalaze razli~ite supstance. Pri preno{enju materijala se vodilo ra~una da vazduh ne dopre u bunar~i}e. Materijal je sipan do prve crte. Pomo}u obi~ne pipete materijal u ampulama je prekriven parafinskim uljem, radi stvaranja anaerobnih uslova i spre~avanja isparavanja. Posuda sa ampulama je zatim poklopljena i stavljena u termostat. Zasejane bunar~i}e termostatirali smo na 370C , a vremenske intervale pra}enja procesa fiksirali na 24~asa i na 48 ~asova. II. Bifidobacterium bifidum (tabela 2.)

Kori{}en je isti postupak kao kod kulture Lactobacillus acidophilus.

Tabela 1 Table 1

Tabela 2 Table 2.

Zaklju~ak : Za Lactobacillus acidophilus smo saznali da fermenti{e celobiozu i da delimi~no fermenti{e rafinozu. To smo zaklju~ili po promeni prvobitno plavo-ljubi~aste boje u `utu boju nakon termostatiranja. Za Bifidobacterium bifidum smo saznali, izme|u ostalog, da ne fermenti{e celobiozu i rafinozu, po tome {to se nije promenila plavo-ljubi~asta boja sadr`aja u bunar~i}u. Pored ovih razlika u fermentaciji kultura Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium bifidum, ove LAB pokazuju i izvesne sli~nosti. Naime, obe vrste fermenti{u laktozu a ne fermenti{u arabinozu. Biohemijska karakterizacija spada u rutinske testove identifikacije bakterija [5,7].

Zaklju~akZaklju~akZaklju~akZaklju~ak

Obzirom da su LAB brojna grupa mikroorganizama od velikog zna~aja, kako u prirodi tako i u mogu}nostima primene, ovim radom postignut je osnovni cilj upoznavanja i ovladavanja tehnikama ispitivanja morfolo{kih, fizi~kohemijskih, biohemijskih i fiziolo{kih osobina rodova Lactobacillus (predstavnik kultura Lactobacillus acidophilus) i Bifidobacterium (predstavnik kultura Bifidobacterium bifidum).

ZahvalnostZahvalnostZahvalnostZahvalnost

Posebnu zahvalnost dugujem mojim mentorima za izvanredno znala~ko i strpljivo mentorsko vo|enje kroz izuzetno interesantna i neiscrpna, kako prakti~na tako i teorijska, znanja o svetu bakterija. Zahvaljujem svim institucijama, posebno Institutu za imunologiju i virusologiju-Torlak, i pojedincima, a najtoplije mr Nadi Tr{i}-Milanovi}, diplomiranom biotehnologu i dr Vesni Cvetkovi}, lekaru, sa Instituta za virusologiju i imunologiju-Torlak, kao i Mirjani Pongrac, diplomiranom hemi~aru, profesoru Hemijsko-tehnolo{ke {kole u Beogradu, koji su mi pru`ili izuzetno korisnu stru~nu i tehni~ku pomo} pri realizaciji ovog rada. Za odli~an prevod apstrakta na engleski jezik, srda~no zahvaljujem dr Radmili Nasti}, profesoru Engleske knji`evnosti na Filozofskom fakultetu na Palama u Republici Srpskoj. Na moralnoj, materijalnoj i tehni~koj podr{ci koju su mi pru`ili, najtoplije zahvaljujem mojoj porodici i prijateljima.

LitLitLitLiteraturaeraturaeraturaeratura: [1]A.J.Salle, B.S.,M.S.,Ph.D. , Osnovni principi bakteriologije, Medicinska knjiga, Beograd-Zagreb, 1974. [2]Marko Radoj~evi}, Bo`idar Mihajlovi}, Branko Trbi}, Mikrobiologija, Zavod za izdavanje ud`benika SR Srbije, Beograd, 1970. [3]D`avec, Melnik, Adelberg, Medicinska mikrobiologija, Savremena administracija, Beograd, 1998. [4]D. Nikoli}, R. Daki}, V. Milovanovi}, M. Vlahovi}-[vabi} and Lj. Dimitrijevi}, Antibacterial and consecutive anti-inflammatory effects of the compound produced by Bifidobacterium bifidum culture, Nau~ni sastanak imunologa Jugoslavije, VMA , Beograd, 1997.,9th European Congress of Clinical Microbiology and Infections Diseases, Berlin, 1999. [5]Valentina Arsi} i dr., Praktikum iz mikrobiologije i imunologije, Katedra za mikrobiologiju i imunologiju Medicinskog fakulteta u Beogradu, Savremena administracija, Beograd, 2000. [6]Nada Tr{i}- Milanovi}, Optimizacija uslova su{enja bakterija mle~ne kiseline postupkom liofilizacije, magistarski rad, Tehnolo{ko-metalur{ki fakultet Univerziteta u Beogradu, Beograd, 1998. [7]Maja S. Vuka{inovi}, Biohemijska i geneti~ka karakterizacija bakterija mle~ne kiseline za proizvodnju fermentisanih napitaka i sireva, magistarski rad, Tehnolo{ko-metalur{ki fakultet Univerziteta u Beogradu, Beograd, 1998. [8]. D. Nikoli}, R. Daki}, Lj. Dimitrijevi}, D. Prekajski and M. Vlahovi}-[vabi}, Antibacterial effects of rafined products of metabolism of Bifidobacterium bifidum, 8th European Congress of Clinical Microbiology and Infections Diseases, Lausaune, 1997. [9].D. Nikoli}, R. Daki}, V. Beljanski i S.[eatovi},New possibilites for treatment of Bacterial infections with purified products of Bifidobacterium bifidum metabolism, I kongres na mikrobiolozite na Makedonija, so megunarodno u~estvo, Skopje, 1997.