YUNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Facultad de Veterinaria

Departamento de Produccin Animal

LA PERFUSIN DE BRANQUIAS COMO MODELO DEVALORACIN DE LA CALIDAD DE AGUA YSURELACIN CON LA PRODUCCIN INTENSIVA DETRUCHAS

Jos Antonio Martnez-Pereda Calvo

Madrid, 1996

ACTA DEL GRADO DE DOCTORReunido el Tribunal axaminador,

constituido por los miembros que suscri-ben la presente Acttj, el aspirante defen-di su Tesis

Tesis presentada por Jos Antonio Martnez-Pereda Calvo para optar al grado de Doctor en

Veterinaria por la Universidad Complutense de Madrid.

Esta tesis doctoral ha sido realizada en el Area de Toxicologa del Medio Ambiente de]

Centro de Investigacin en Sanidad Animal del Instituto Nacional de Investigacin y

Tecnologa Agraria y Alimentaria (CISA-INIA), bajo la direccin del Dr. D. Jos Vicente

Tarazona Lafarga

y presentada como tutora por la Dra. D~. Blanca Mas Alvarez

aMINISTERIO DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACION

INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACION Y TECNOLOGA

AGRARIA Y ALIMENTARIACENTRO DE INVESTIGACION EN SANIDAD ANIMAL

D. Jos Vicente Tarazona Lafarga, Doctor en Veterinaria por laUniversidad Complutense de Madrid, y Coordinador del Aiea deToxicologa del Medio Ambiente del CISA-INIA

INFORMA

que el trabajo presentado por el Licenciado D. Jos AntonioMartnez-Pereda Calvo para optar al Grado de Doctor enVeterinaria, titulado La perfusin de branquias como modelo devaloracin de la calidad del agua y su relacin con la produccinintensiva de truchas ha sido realizado bajo mi direccin, eneste Aiea de Toxicologa del Medio Ambiente, y que lo consideroperfectamente apto para su exposicin y defensa.

Valdeolmos a 15 de Abril de 1996

FdO: Dr. Jos V. Tarazona Lafarga

28130 VALDEOLMOS - MADRID - Tei(91)202300 - FAXf91)~202247

INDICE

1. INTRODUCCION

1.11. Acuicultura

1.2. Importancia de la calidad del agua en

1.3. Contaminacin

1.3.1. Metales pesados

1.3.2. El cobre

1.3.3. Nitritos

1.3.4. Xileno de almizcle

1.4. Toxicocintica

1.4. 1. Modelos compartimentales.

1.4.2. Modelos no compartimentales.

1.4.3. Modelos fisiolgicos

1.5. Enfermedades infecciosas

1.5.1. Yersinia ruckeri

1.5.2. Renibacterium salmoninarum.

1.6. Metodos alternativos in vitre

1.7. La branquia como sistema fundamental.

1.8. La perfusin de branquias

1.8.1. Tipos de preparaciones

1.8.2.

1.8.3.

1.8.4.

1

la acuicultura

2

3

6

.7

.9

13

16

.18

.19

23

23

24

25

27

30

31

34

35

36

37

38

Preparacin de branquias en cabeza aislada.

Medida de la viabilidad de la tcnica

Estudios realizados

1.8.5. Utilidad de esta tcnica.

1.9. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION

11. MATERIALES Y METODOS

2.1. Materiales

2.1.1. Animales

2.1.2. Resumen de los materiales empleados

2.2. Mtodos

2.2.1. Perfusin branquial

2.2.1.1. Circuitos

2.2.1.2. Fase quirrgica.

2.2.2. Desarrollo experimental

2.2.2.1. Eliminacin in vivo de nitritos.

2.2.2.2. Eliminacin iii vitro de nitritos.

2.2.2.3. Metabolismo iii vitro de nitritos.

2.2.2.4. Absorcin iii vivo de nitritos.

2.2.2.5. Absorcin it vitro de nitritos.

2.2.2.6. Eliminacin it vitro de cobre.

2.2.2.7.

2.2.2.8.

2.2.2.9.

2.2.2.10.

2.2.2.11.

2 .2 .2. 12.

2.2.2.13.

46

47

.47

47

.49

.49

.49

.51

.53

53

.54

.54

.55

.55

.56

56

57

57

58

Eliminacin it vitro de cobre con clulas.

Absorcin it vitro de cobre

Absorcin in vitro de xileno de almizcle.

Eliminacin it vitro de xileno de almizcle

Eliminacin de xileno de almizcle con clulas..

Ingreso de prticulas va branquial

Ingreso de bacterias va branquial

.58

.59

.60

.43

.45

2.2.2.13.1. Cultivo

2.2.2.13.2. Inactivacin de las bacterias.

2.2.2.13.3. Perfusin branquial.

2.2.2.13.4. Inmunohistoquimica

2.3. Anlisis, clculos y estadsticas

2.3.1. Anlisis y clculos estadsticos

2.3.2. Clculos cinticos

111. RESULTADOS

3.1. Eliminacin a vivo de nitritos.

3.2. Eliminacin a vitro de nitritos

3. Metabolismo/captacin it vftro de nitritos por los

3.4. Comparacin a vivo la viero.

3.5. Absorcin a vivo de nitritos.

3.6. Absorcin a vitro de nitritos.

3.7. Eliminacin a vitro de cobre

3.8. Eliminacin a vitre de cobre con clulas.

3.9. Absorcin a vitro de cobre

3.10. Absorcin a vitro de xileno de almizcle.

3.11. Eliminacin iii vitro de xileno de almizcle.

3.12. Eliminacin de xileno de almizcle con clulas.

3.13. Ingreso de prticulas va branquial

3.14. Ingreso de bacterias va branquial..

eritrocitos.

.60

60

.61

62

.64

.64

.65

.71

.72

.74

.77

.79

80

.81

.85

87

.90

.90

.92

93

.95

96

IV. DISCUSION .99

4.1. Utilidad de la perfusin branquial para la produccin intensiva de truchas.. 100

4.2. La perfusin branquial como alternativa a los estudios a vivo.

4.2.1. Empleo de la tcnica en toxicologa

4.2.2. Empleo de la tcnica en los estudios toxicocinticos.

cuantitativa

4.3. La perfusin branquial como modelo para valorar

toxicocinticos

4.4. La perfusin branquial como modelo para el estudio del ingreso de

4.4.1. Uso de panculas inertes

4.4.2. Utilizacin de bacterias

102

104

Aproximacin

105

mecanismos

109

bacterias..113

115

116

V. CONCLUSIONES 119

VI. BIBLIOGRAFA 123

INTRODUCCIN

INTRODUCCION 2

1.1. Acuicultura.

La necesidad de alimentos proteicos en los pases en desarrollo, as como la tendencia hacia

dietas ms sanas, con menos grasas, en los pases desarrollados, presagia un continuado

aumento de la acuicultura (Tomasso y Brune, 1991). En este sentido la FAO ha hecho un

llamamiento al desarrollo de la acuicultura como una alternativa para la obtencin de

protenas de origen animal.

La produccin acucola mundial ha crecido en los ltimos diez aos de 6.9 millones de

toneladas a 15.9. Por otra parte, el 21 96 del pescado que se consume es producido en

cautividad. La acuicultura continental representa el 65 96 del total. La importancia de la

acuicultura continental ha crecido de tal modo que la produccin est un SO 96 por encima

de las capturas (Josupeit, 1995).

Dentro de la produccin acucola, la salmonicultura es el ms practicado y con un grado de

desarrollo tcnico y una explotacin ms racional. Los salmnidos, principalmente trucha

arco iris Oncorhynchus mykiss y salmn atlntico Salmo salar, son los ms importantes en

piscicultura, representando un 40 96 de la produccin total. La produccin anual de trucha

arco iris fue de 200.000 toneladas en 1985 (Shephered, 1988).

En el siglo pasado, ante el aumento de la pesca fluvial se pens en desarrollar piscifactoras

a fin de repoblar las aguas. Luego la demanda para el consumo hizo multiplicar la

produccin de truchas y la hizo ms intensiva.

INTRODUCCiON 3

Diversas razones hacen de nuestro pas un lugar muy adecuado para la acuicultura. La

produccin pisccola se ha incrementado notablemente en los ltimos 30 aos y, a pesar de

los problemas econmicos coyunturales, el ascenso de la piscicultura en detrimento de la

pesca tradicional es imparable.

Aun cuando se produce una gran variedad de especies en Espaa, la produccin de trucha

es la que reviste una mayor importancia econmica. Est orientada principalmente a la

produccin de ejemplares para el consumo y, en menor medida, para la repoblacin y laproduccin de huevos y alevines.

La produccin de trucha en Espaa se ha incrementado de 14.000 toneladas en 1986 a 19.700

en 1994. Son casi 115.000 toneladas anuales la produccin total de los paises mediterrneos

(Lacroix, 1995).

Oncorhynchus mykiss (Wa]baum) es la especie ms criada en aguas continentales. Fueimportada de Amrica del Norte, se ha adaptado anuestras condiciones climatolgicas y tiene

un desarrollo ms rpido que la trucha autctona Salmo truttafao.

1.2. Importancia de la calidad del agua en la acuicultura.

La calidad del agua es uno de los factores ms importantes a la hora de considerar la cra

intensiva de peces, pues de ella dependen una serie de factores que condicionan tanto la

productividad como la aparicin y desarrollo de procesos patolgicos, bien sean de tipo

infeccioso o toxicolgico (Rosenthal, 1989).

INTRODUCCION 4

Es esencial una mayor comprensin de las relaciones entre productividad acutica y calidad

del aguapara asegurar una continuidad en el crecimiento de la acuicultura (Tomasso y Brune,

1991).

La calidad de agua en los modernos sistemas de produccin tiene una incidencia directa en

la salud y el crecimiento de las especies criadas y de este modo juega un papel en eldesarrollo de los sistemas productivos. Esta relacin puede definirse grficamente como sigue

(Rosenthal, 1989):

Fig. 1.

Cualquier elemento txico en el ambiente puede causar una respuesta de estrs, lo que reduce

la capacidad del organismo para expresar su potencial gentico de desarrollo afectando a los

objetivos de los piscicultores (Schreck y Hiram, 1991).

Si los costes metablicos se incrementan en respuesta a los txicos, los procesos de

produccin deben reducirse. Esta reduccin puede ser mayor an si la exposicin al txico

conduce a una disminucin en el apetito, que es uno de los primeros signos de estrs por

pobres condiciones ambientales.

CALIDAfl tEL AGUA

~* RTOLDGICAti a ESTRHSINFERMEDAD

DENSIDAD DR PGRLLCION

INTRODUCCION 5

La construccin de los sistemas de cra intensiva requiere complejas infraestructuras y losinversores estn forzados a maximizar ]a produccin de biomasa por unidad de volumen para

mantener la viabilidad econmica. Por esto, los piscicultores tienden a utilizar densidades por

encima del lmite. Con una creciente densidad de poblacin, la calidad del agua desciende

y tiende a fluctuar dramticamente dentro del sistema (Rosenthal, 1989).

La calidad de agua en su ms amplio sentido incluye todas sus caractersticas fsicas,

qumicas y biolgicas (Boyd, 1981), y en el caso de una piscifactora industrial de trucha

arco iris este concepto no puede restringirse (Blanco, 1994). Sin embargo, hasta ahora la

calidad del agua se ha considerado habitualmente como una serie limitada de parmetros

como la temperatura, el oxigeno disuelto, la salinidad, la alcalinidad, la dureza, etc. Pero

actualmente, dada la extensin de la contaminacin del medio acutico y el riesgo de

determinados contaminantes, la ubicuidad de microcontaminantes orgnicos y metales pesados

hace considerar tambin estos factores.

La trucha arco iris se cra normalmente con un flujo continuo de agua para mantener lacalidad de la misma en la unidad de cultivo. De este modo, las piscifactoras estn expuestas

a dos tipos de agresiones en relacin con la calidad de agua: una, los propios efectos de sus

metabolitos; otra, los posibles contaminantes que entran con el torrente de agua. Por ello,

la calidad de agua se ha considerado uno de los factores limitantes para la acuicultura.

La muerte de los peces no es la nica respuesta a los problemas de calidad del agua.

Problemas a una escala subletal que afectan al crecimiento y a los ndices de conversin

pueden originar costes de todo tipo para las piscifactoras. Los efectos subletales ms

INTRODUCCION 6

importantes son aquellos que afectan a la reproduccin, crecimiento, y susceptibilidad a

enfermedades infecciosas (Tarazona y Muoz, 1995).

Condiciones habituales en la piscicultura industrial como altas densidades de peces, estrs por

manejo, etc. implican que las enfermedades infecciosas se conviertan en un riesgo constante,por afectar a las respuestas inmunolgicas del pez aumentando la susceptibilidad a bacterias

(Plumb, 1984), virus (Hetrick a al., 1979) y parsitos (Carballo y Muoz, 1991). La

reduccin en la inmunocompetencia puede estar asociada a la respuesta de estrs producida

por la exposicin a sustancias qumicas. Sin embargo, otros contaminantes como cobre,

amoniaco o hexaclorobenceno tienen mecanismos de inmunotoxicidad independientes del

estrs que produce la exposicin (Carballo y Muoz, 1991).

El riesgo derivado de la presencia de contaminantes no slo radica en su toxicidad para los

peces sino tambin en su influencia sobre el consumidor humano.

1.3. Contaminacin.

El concepto de contaminacin ha variado considerablemente. En 1983 la FAO aport esta

definicin: se entiende por contaminacin la introduccin por el hombre, directa o

indirectamente de sustancias o energas en el medio acutico, causando efectos perjudicialestales como daos a los recursos vivos, peligros para la salud humana, el deterioro de la

calidad de agua o la reduccin de los atractivos naturales.

No obstante, en la actualidad, y bajo los principios del desarrollo sostenible, se omite la

INiRODUCCION Y

necesidad de que se produzcan efectos perjudiciales. Por ello, la contaminacin podradefinirse como cualquier carga adicional de sustancias o energa como resultado de la

actividad humana (Lloyd. 1992).

Las causas de esta contaminacin hay que buscarlas en la industrializacin y el incremento

de la poblacin, lo que ha significado un aumento de las sustancias de desecho.

La gran capacidad de autodepuracin del agua ha motivado que, tradicionalmente, los cursos

de agua hayan sido los lugares ms utilizados para desprenderse de los residuos. La

capacidad asimiladora de los nos ha sido desbordada producindose el problema de la

polucin, es decir, la aparicin de efectos adversos producidos por niveles de contaminantes

capaces de producir efectos patolgicos sobre los seres vivos.

Existen multitud de contaminantes ambientales que pueden llegar a afectar a los peces. En

este trabajo se han utilizado tres sustancias concretas elegidas como modelo de~ algunos delos grupos de contaminantes ms caractersticos. En primer lugar, como ejemplo decompuestos inorgnicos metlicos, el cobre. En segundo lugar, como ejemplo de compuestosinorgnicos no metlicos, los nitritos. Por ltimo trataremos, como ejemplo de sustanciaorgnica, del xileno de almizcle.

1.3.1. Metales pesados.

Dentro de los contaminantes inorgnicos, los metales pesados son uno de los grupos de

mayor importancia para la toxicologa ambiental (Hodson, 1988). Entendemos por metales

INTRODUCCION 8

pesados aquellos elementos del sistema peridico de elevada densidad y pequeo volumen

atmico (Babor e Ibarz, 1973). Su importancia radica, entre otras caractersticas, en que no

se degradan, puesto que son elementos qumicos, no compuestos, y permanecen

indefinidamente en el medio.

En el agua, estos metales pueden ser absorbidos por los organismos acuticos penetrando

fundamentalmente por el sistema branquial (Hodson, 1988). Tras la absorcin estos metales

se distribuyen por el organismo, acumulndose en diversos rganos y tejidos. La eliminacines lenta y difcilmente completa (Hellawell, 1988).

En las piscifactoras existe un riesgo evidente relacionado con la contaminacin por metales

pesados, debido a una serie de factores que vamos a analizar. En primer lugar, las

piscifactoras aprovechan los cauces de los ros, tomando agua de ellos y devolvindola de

nuevo una vez utilizada. Dada la contaminacin existente por vertidos a los cursos de agua,

existe e] riesgo de que este problema se detecte tambin en los criaderos acucolas. Adems,

los sedimentos de los ros retienen fcilmente los metales, pudiendo stos liberarse ante

cambios del pH, etc.

Por otra parte, la alimentacin introduce una serie de metales en el medio acutico. En este

sentido, puede existir contaminacin de las materias primas o a travs de las mquinas de

elaboracin de los piensos. Adems estos alimentos llevan en su composicin metales

esenciales. Restos de alimentos no ingeridos pueden ceder al agua metales en proporcin

mayor a la tolerable. Pero el mayor peligro lo constituyen los tratamientos qumicos. El

sulfato de cobre, por ejemplo, es muy usado en piscifactoras como alguicida, molusquicida

INTRODUCCION 9

y antiparasitario. La utilizacin incorrecta de estas sales ha tenido como consecuencia grandes

prdidas en la produccin por la aparicin de grandes mortandades (Hellawell, 1988). De

este modo, en las explotaciones de piscicultura nos encontramos con problemas toxicolgicos

aadidos a los de las poblaciones naturales.

En funcin de lo hasta aqu expuesto, podemos concluir que existen tres posibilidades

fundamentales por las que un metal pesado puede ocasionar problemas en las piscifactoras:

contaminacin industrial aguas arriba de la piscifactora, contaminacin asociada a la

presencia del metal en el alimento y las excretas, y utilizacin directa del metal por el

piscicultor. Como hemos visto, el cobre, puede aparecer por cualquiera de los tres

mecanismos, al ser al mismo tiempo un contaminante industrial, un elemento esencial y

agente quimioterapetico, lo que justifica su eleccin como modelo en este trabajo.

1.3.2. El cobre.

El cobre se encuentra normalmente en el agua como un metal traza, en concentraciones

menores de 5 xg/l, aunque por diversas razones esta concentracin puede estar aumentada.

La toxicidad del cobre est determinada por la calidad del agua. As, la toxicidad se

incrementa al disminuir la dureza, temperatura y porcentaje de oxgeno disuelto y decreceen presencia de agentes quelantes como EDTA y NTA, cidos hmicos, aminocidos y

slidos en suspensin.

El principal factor que afecta a la toxicidad es la dureza (Lloyd, 1992). La diferencia de

INTRODUCCION 10

toxicidad del cobre en peces en aguas de diferente dureza podra ser dependiente de su

complejacin con carbonatos (Stiff, 1971).

Se ha sugerido que la mxima concentracin de seguridad debera basarse en los percentiles

anuales 50 y 95 de cobre soluble de 0.05 y 0.2 respectivamente de la LC5O umbral para

trucha arco iris. Este sistema, para distintos valores de dureza, se refleja en la tabla 1.

Tabla 1. Cobre. Valores de seguridad segn la dureza del agua.

Dureza del agua

(mg/l de CaCO3)

Percentil 50 Percentil 95

10 1.0 5.0

50 6.0 22.0

100 40.0

300 112.0

Un incremento en la temperatura puede acortar la supervivencia de peces, sin embargo la

CL5O se reduce por la reduccin de la temperatura.

Otros factores que afectan a la toxicidad del cobre son la disminucin de pH (Lauren y

MacDonald, 1986.), La reduccin de oxgeno (Lloyd, 1961.) y la alcalinidad (Miller y

McKay, 1980; Lauren y Mcdonald, 1986).

INTRODUCCION 11

Estos efectos de las condiciones de calidad del agua sobre la toxicidad pueden explicarse por

la especiacin del metal. El trmino especiacin hace referencia a las distintas formas

fisicoqumicas en que un metal puede existir en las aguas naturales (Han y Davies, 1979).

La toxicidad de un metal depende indudablemente de su especiacin. dado que la

biodisponibilidad est influida por la forma qumica en la que se encuentra.

El cobre puede encontrarse en el agua bajo diferentes formas qumicas. La forma ms txicaes el ion Cu2~ (Giesy a al., 1986). Por otra parte, el cobre puede unirse a iones carbonato

e hidrxido (Pagenkopf a al., 1974) formando compuestos de distinta toxicidad. El cobre

presenta gran afinidad por especies qumicas orgnicas, lo que facilita su complejacin conalgunos quelantes tales como EDTA, NTA y cidos hmicos. La presencia de materia

orgnica puede incrementar hasta 3 veces los valores de la tabla 1. De este modo, segn

determinadas condiciones de calidad del agua, como el pH, se pueden dar distintas formas

qumicas del cobre de distinta biodisponibilidad y, por tanto, toxicidad. La absorcin de

formas biodisponibles determina, pues, la toxicidad del cobre.

En cuanto al modo de accin del cobre no se conoce bien. La toxicidad se refleja enmodificaciones del comportamiento, alteraciones fisiolgicas, lesiones en branquias, acmulo

en rganos, alteraciones enzimticas y hemticas (Carbonel, 1993).

Dentro del comportamiento, el efecto tipico es un incremento en la actividad de los peces.

Tambin se ha citado, en trucha arco iris, una prdida de inters por el alimento (Left et al.,

1976) congruente con una disminucin en la tasa de crecimiento (Waiwood y Beaniish,

1978).

INTRODUCCION 12

Pasando al segundo aspecto, las alteraciones en la frecuencia respiratoria han sido observadas

frecuentemente por la accin del cobre (Drummond a aL, 1973; Sellers a al., 1975).

Bilinski y Jonas (1973) encontraron que la exposicin de la trucha arco iris a niveles letales

de cobre reduca la capacidad de oxidacin del lactato. La hiptesis de que la muerte se

produce por asfixia es probablemente una simplificacin.

En las branquias se producen diversas lesiones: imbibicin del epitelio, exceso de produccin

de mucus con posterior retraccin y disolucin de los tejidos. (Reichenbach-klinke, 1982).Por ltimo, en la sangre se han citado variaciones del contenido en hemoglobina, cortisol o

sodio (Beckman y Zaugg, 1988; Ckyriac a al., 1989).

De estos tres factores, el primero esta ligado a un mecanismo especifico de accin del cobre

descrito en mamferos pero no demostrado en el caso de las especies pisccolas; el segundo,

corresponde a la respuesta primaria de estrs, que debe esperarse ante cualquier exposicin

a un txico y que, en concreto, ha sido perfectamente descrita en el caso del cobre (Muoz

et al., 1991). En cuanto al tercero, es un mecanismo especfico de toxicidad del cobre en

peces (Lauren and McDonald, 1986; 1987) ligado a los efectos del metal sobre los flujos deiones a nivel branquial.

Por consiguiente, tanto los efectos de las condiciones de calidad del agua sobre la toxicidad,

como el propio mecanismo de accin estn ligados a la interaccin del metal con la branquia,

y en particular a la cintica del cobre en este rgano, lo que justifica la importancia de losestudios presentados en este trabajo.

INTRODUCCION 13

1.3.3. Nitritos

En la piscicultura industrial tienen gran importancia los compuestos nitrogenados, al ser

txicos y productos principales de excrecin del metabolismo de las truchas (Blanco, 1994).

Los nitritos, aunque txicos para los peces, no se suelen dar en sistemas acuticos naturales

en concentraciones consideradas txicas. En acuicultura, sin embargo, donde las

concentraciones de amoniaco puede ser altas, los nitritos tienen mayor probabilidad de

alcanzar concentraciones txicas. Adems, los salmonidos estn entre los peces ms sensibles

a los nitritos (Lewis y Morris, 1986).

Nitritos, amoniaco y nitratos estn interrelacionados a travs del proceso de nitrificacin, la

oxidacin biolgica del amoniaco a nitrato. Bajo condiciones aerbicas el amoniaco (NH3)se oxida rpidamente a nitrito (NO< por la accin bacteriana de las Nitrosomonas, de

acuerdo con la siguiente ecuacin:

2NH, + 302 2NQ + 2H~ + 2H,O

Los nitritos, a su vez, se oxidan a nitrato (N03-) por la accin bacteriana de Nitrobacter

2N0; -+ 20, 2N0;

En los sistemas acuticos bien oxigenados, la conversin de amoniaco a nitrito es el paso

limitante del proceso y la conversin de nitrito a nitrato ocurre rpidamente, por eso en la

mayora de los sistemas naturales las concentraciones de nitritos suelen ser bajas (Russo y

INTRODUCCION 14

Thurston, 1991).

La oxidacin de nitrito a nitrato en sistemas de agua recirculada en acuicultura no es tan

rpida, causando acumulacin de cantidades de nitrito potencialmente txicas. Los factores

que afectan a la conversin de nitritos son pH, temperatura, oxigeno disuelto, cantidad de

bacterias nitrificantes y la presencia de agentes inhibitorios como cido nitroso y amoniaco.

En solucin acuosa se establece el siguiente equilibrio:

N01{ + H~ = FINO2

Este equilibrio se ve afectado por el pH. A medida que la concentracin de H~ se

incrementa, la concentracin de nitrito ionizado (NO) decrecer, desplazando el equilibrio

hacia un incremento en la formacin de cido nitroso (FINO2).

La causa principal de toxicidad de los nitritos es la oxidacin del hierro de la hemoglobina

sangunea a su estado frrico, formndose metahemoglobina, molcula incapaz de unirse al

oxigeno, produciendo hipoxia y muerte (Rodriguez-Moreno y Tarazona, 1994).

La presencia de metahemoglobina suele delatarse por el color marrn que confiere a la

sangre. Unos niveles elevados de nitritos en el agua, incluso tan bajos como 0.015 mgl NO~N provocan niveles elevados de metahemoglobina en sangre de pez (Smith y Williams,1974). El efecto de la metahemoglobinemia se exacerba cuando la demanda de oxgeno es

alta (EIFAC, 1984).

INTRODUCCION 15

La intoxicacin por nitritos produce anemia, marcha vacilante y depsito de pigmento

hemtico en hgado, bazo y riones (Reichenbach-Klinke, 1982). Los nitritos tambin han

sido citados como implicados en la formacin de compuestos de nitrgeno nitroso (Archer

etal., 1971).

Resulta imposible ofrecer un valor nico como nivel de toxicidad aguda de los nitritos en

peces, ya que el rango de concentraciones txicas (por ejemplo, CL,~, o concentracionesletales umbrales) es muy amplio. Los dos factores fundamentales que explican esta enorme

dispersin son la diferencia en susceptibilidad de las diferentes especies de peces, y para cada

especie, la influencia de las condiciones de calidad del agua sobre la toxicidad de los nitritos.

Los principales factores que afectan a la toxicidad de los nitritos son el pH, cloruros y

calcio. Un incremento del pH implica una disminucin de N02-N y un aumento de HNO2-N.

Esta modificacin en la especiacin est ligada a fluctuaciones en la toxicidad. No obstante,

de todos los parmetros mencionados, el que produce mayores variaciones es la

concentracin de cloruros en el agua.

La toxicidad de los nitritos para trucha arco iris decrece cuando se incrementan las

concentraciones del ion cloruro (Brown, 1993), lo que ha sido citado para otras especies. Es

evidente que la absorcin de nitritos est relacionada con la de cloruros. Se ha visto que

branquias de trucha arco iris expuestas a nitritos tenan mayor nmero de clulas del cloruro

sugiriendo una respuesta para mantener los niveles fisiolgicos de cloruro en presencia de

nitritos (Gamo et al., 1984). La explicacin de este efecto es la siguiente. El ion nitrito es

absorbido por la branquia utilizando el mecanismo de absorcin del ion cloruro en un proceso

INTRODUCCION 16

competitivo entre ambos iones. Por lo tanto la influencia de la concentracin de cloruro en

el agua sobre la toxicidad de los nitritos es tan directa que pueden establecerse relaciones

lineales entre la toxicidad de los nitritos (expresada como CL50) y la concentracin de cloruro

en el agua (Gamo a aL, 1984).

La toxicidad, por tanto, depende de la cintica del compuesto en el animal. En consecuencia,

es necesario conocer la toxicocintica de los nitritos para comprender y preveer su accin

txica sobre las especies de cultivo. La existencia de relaciones cuantitativas permitir

extrapolar los resultados a las condiciones particulares de cada explotacin.

1.3.4. Xileno de almizcle

El xileno de almizcle ha sido utilizado en esta tesis como ejemplo de un compuesto orgnicoque, sin ser txico, puede tener una importancia comercial por su bioacumulacin en las

truchas, y el peligro potencial para el consumidor humano.

Los almizcles son sustancias que se utilizan para fijar los perfumes. Se obtienen de plantasy animales o por sntesis qumica. Los almizcles naturales son cetonas o lactonas

macrocclicas con un anillo de aproximadamente quince carbonos (Merck ndex, 1989).

El xileno de almizcle es una sustancia sinttica ntroaromtca muy usado en la industria

cosmtica, enjabones y cremas. El consumo mundial de almizcle, slo en detergentes, puederondar las mil toneladas por ao. Esto hace que acabe por aparecer en el medio, de hecho

ya se ha encontrado en muestras de aguas y peces. Tiene un alto poder de bioconcentracin

INTRODUCCION 17

y una distribucin ubicua (Yamasagishi et al., 1983; Rimkus y Wolf, 1995).

La toxicidad aguda es baja pero se ha citado como posible carcingeno. Tambin induce laactividad de algunas enzimas (Helbling et al., 1994). Este hecho, unido a que se ha detectadoen leche humana y grasa corporal ha levantado la alarma sobre las posibles rutas de

exposicin del ser humano.

El xileno de almizcle tiene un alto potencial como contaminante ambiental debido a su

estabilidad ante la degradacin qumica y biolgica y su alta lipofilia. Es esta ltima

caracterstica la que le confiere la capacidad de bioacumulacin, aunque algunos autores

afirman que, en el caso de las truchas, sta no es tan grande como permitira predecir su

lipofilicidad (Boleas a al., 1995).

En un estudio de distribucin en trucha arco iris, las concentraciones ms altas se

encontraron en intestino y las ms bajas en msculo y branquias (Fernndez et al., 1995).El problema de su acumulacin, debe ser estudiado desde el punto de vista cintico, sin

embargo, los escasos estudios it vvo han sido ineficaces, debido a su lenta eliminacin.

Los conocimientos sobre toxicocintica son muy limitados, Dada su baja toxicidad para pecespodra acumularse en estos inadvertidamente con los consiguientes riesgos para la salud

humana.

Tanto la acumulacin, como la posible eliminacin son procesos toxicocinticos que deben

ser estudiados para poder dar una solucin a los problemas que estos compuestos pueden

INTRODIJCCION 18

causar sobre el consumo humano.

1.4. Toxicocintica.

Como hemos visto en los apartados anteriores, existen muchos compuestos para los cuales

el factor fundamental que regula su toxicidad, y, por tanto, la aparicin de problemas en las

piscifactoras, es su cintica, y, en particular, su absorcin y/o eliminacin por las branquias.

La toxicocintica puede definirse como el estudio cuantitativo de los procesos que

experimenta, en funcin del tiempo, una sustancia txica en un organismo (Repetto, 1988).

El trmino toxicocintica no es ms que una adaptacin al terreno de la toxicologa de

farmacocintica acuado por E. H. Dost que la defini como la ciencia del anlisis

cuantitativo entre organismo y medicamento (Wagner, 1983). Su objetivo es estudiar el

trnsito de los medicamentos en el organismo en funcin del tiempo y sus cantidades en el

cuerpo y en la excreta, as como elaborar modelos cinticos aplicables a la interpretacin de

los datos obtenidos.

La farmacocintica ha sido definida como la ciencia matemtico-biolgica que estudia la

velocidad de los procesos de LADME (siglas de liberacin, absorcin, distribucin,

metabolismo y excrecin) y sus repercusiones en la concentracin de los compartimentos

que se consideran en medicamento y metabolitos (Pa y Pozo, 1974). La Farmacocintica

relaciona matemticamente concentraciones y velocidades y permite representar grficamente

el curso de los medicamentos en sus formas de dosificacin, en el organismo, en los lugares

INTRODUCCION 19

de absorcin y en los emunctorios en funcin del tiempo. Para ello utiliza modelos cinticos

sencillos pero adecuados (Pa y Pozo, 1974).

La aplicacin de la ciencia y tcnica de la cintica qumica al comportamiento qumico en

los sistemas biolgicos permite caracterizar matemticamente los procesos de absorcin,

distribucin y eliminacin. La caracterizacin matemtica de esos procesos permite hacer una

prediccin cuantitativa de cantidades y concentraciones de una sustancia qumica en el cuerpo

en funcin del tiempo y del rgimen de administracin. El valor de la farmacocintica en el

campo de la toxicologa acutica se ha incrementado pero an hay poca informacin (Barron

et al., 1990).

Existen diferentes modelos farmacocinticos, de los que mencionaremos los

compartimentales, no compartimentales y fisiolgicos.

1.4.1. Modelos compartimentales.

Un modelo compartimental es una descripcin matemtica simplificada del comportamiento

de una sustancia en un animal, donde el cuerpo est representado por un sistema de

compartimentos. Un compartimento no representa necesariamente rganos o tejidosespecficos, ms bien representa grupos de tejidos que son cinticamente indistinguibles parauna sustancia determinada, Los compartimentos del modelo normalmente no tienen una

fisiologa o anatoma real. Ellos simplemente caracterizan la dinmica de una sustancia. El

tamao del compartimento est caracterizado por el volumen de distribucin aparente.

INTRODUCCION 20

Desde el punto de vista farmacocintico se considera dividido el organismo en

compartimentos, que son sectores hipotticos en los que el frmaco se considera distribuido

en l uniformemente.

El nmero de compartimentos en que conviene dividir el organismo depende de la naturaleza

del frmaco objeto de estudio. Si ste no presenta afinidad por ningn elemento orgnico en

particular y se distribuye instantneamente por toda el agua corporal se utilizar un modelo

de distribucin monocompartimental. Si el frmaco no se distribuye instantneamente o lo

hace de un modo heterogneo convendr dividir el organismo en dos o ms compartimentos

(Pa y Pozo, t974).

Las dos asunciones primarias de un modelo compartimental son distribucin instantnea y

distribucin lineal. Distribucin instantnea significa que una vez que la sustancia entra en

un compartimento, se distribuye instantneamente dentro de l. La distribucin lineal

significa que la concentracin de la sustancia en cada tejido asociado con un compartimentoes directamente proporcional a la cantidad de sustancia en el compartimento. Mientras

diferentes tejidos pueden tener diferentes concentraciones de la sustancia, un cambio en laconcentracin en un tejido ser acompaada por un cambio proporcional en la concentracinde todos los dems tejidos dentro del compartimento. Esta asuncin permite el uso de untejido como referencia, de tal modo que la dinmica del xenobitico en el tejido de referencia

ser proporcional a su dinmica en el compartimento.

Los modelos farmacocinticos usan generalmente sangre o plasma como tejido de referenciapor su fcil recoleccin y su contacto ubicuo con todos los dems tejidos. Se puede analizar

INTRODUCCION 21

el cuerpo entero lo que permite una medida de todos los compartimentos y no slo del tejido

de referencia.

Generalmente, se asume una cintica de primer orden en los modelos compartimentales

(cintica lineal). La tasa de transferencia de una sustanca desde o hacia un compartimento

es directamente proporcional a la concentracin en el compartimento. La asuncin de una

cintica de primer orden es implcita en el modelo a no ser que un proceso no-lineal se

incorpore explcitamente. Aunque la asuncin de una cintica de primer orden es

normalmente una buena aproximacin de la mayora de los procesos de transferencia, la

asuncin puede ser verificada experimentalmente determinando los parmetros del modelo

a dos diferentes dosis, diferentes en al menos un factor de 5. Cuando los procesos cinticos

son de primer orden, los datos de concentracin-tiempo pueden ser superpuestos

normalizndolos para la dosis (principio de superposicin). Cinticas no lineales pueden ser

incorporados en el modelo si los procesos no lineales pueden ser caracterizados

experimentalmente.

El modelo monocompartimental fue el primero en desarrollarse. Considera al organismo

como un compartimento nico constituido por el agua plasmtica, el agua intersticial y el

agua intracelular. El frmaco se supone distribuido uniformemente, de tal modo que la

concentracin plasmtica es la misma que existe en todo el compartimento. El equilibrio de

concentraciones del frmaco entre plasma, fluido intersticial y agua intracelular es

instantneo.

Como se trata de un slo compartimento homogneo, existe un proceso de entrada y un

INTRODUCCION 22

proceso de salida de ese nico compartimento: agrupa los procesos de liberacin y absorcin

en uno slo (incorporacin o absorcin). Asimismo agrupa el metabolismo y excreccin en

un proceso nico (eliminacin). Ambos procesos (absorcin y eliminacin) se consideran

constantes.

Frente a este modelo se pueden hacer una serie de crticas:

- Noexiste ninguna sustancia que se distribuya instantnea y uniformemente en el organismo.

- Por el distinto aporte sanguneo que reciben los tejidos, existiendo zonas ms vascularizadas

que otras, habr sectores a los que el frmaco acudir antes y otros a los que tardar ms

en llegar (e irse). As, las zonas ms accesibles formaran un compartimento central, donde

se produciran los principales procesos de biotransformacin y excrecin y donde la

distribucin sera prcticamente instantnea. Habra tambin un compartimento perifrico en

el cual no sucederan esos procesos, donde el frmaco estara depositado de forma pasiva y

su eliminacin hacia el plasma dependera del grado de eliminacin en el compartimento

central.

- Por la propia heterogeneidad de los tejidos, se prev una afinidad distinta por los

medicamentos

No obstante, la importancia relativa en la prctica de cada uno de estos problemas depende

de las caractersticas del compuesto y del sistema biolgico, por lo que son los datos

experimentales los que deben condicionar la utilizacin de modelos monocompartimentales

o de modelos multicompartimentales, entre los que los bi y tricompartimentales son los ms

empleados.

INTRODUCCION 23

1.4.2. Modelos no compartixnentales

El modelo no compartimental usado en farmacocintica est basado en la teora del momento

estadstico. Se ha usado de forma limitada en toxicologa acutica pero cada vez se utiliza

ms en farmacologa y toxicologa de mamferos. La aplicacin del momento estadstico en

farmacocintica se desarrolla del concepto de que la eliminacin de una sustancia es un

proceso estocstico y que el tiempo de residencia de la sustancia en un animal es una funcin

de los tiempos de residencia individuales de cada molcula.

La teora de los momentos estadsticos, aplicada desde 1956 en otras reas de la ciencia como

en ingeniera qumica y en cromatografa, ha sido aplicada en farmacocintica para el clculo

de los parmetros de absorcin, distribucin y eliminacin.

Para solventar los defectos de los modelos compartimentales se aplic la teora de los

momentos estadsticos que muestra mediante integracin simple los parmetros que definen

la evolucin de la curva concentracin-tiempo.

Esta teora se basa en considerar la curva de concentracin-tiempo como una distribucin

estadstica cuyos momentos se definen de la siguiente manera

1.4.3. Modelos fisiolgicos

Se parte de la idea de que los parmetros estimados por modelos compardmentales pueden

tener poca relacin con la anatoma o fisiologa del animal. Un modelo farmacocintico

INTRODUCCION 24

fisiolgico pretende dar una descripcin ms realista, incorporando los procesos fisiolgicos

que tienen lugar.

Requiere, por tanto, informacin detallada acerca del pez y de las propiedades del frmaco:

anatmicas (volmenes de tejidos), termodinmicas (coeficientes de particin entre sangrey tejidos), fisiolgicas (perfusin de los distintos tejidos, biotransformacin). La mayorventaja es que, una vez que los principales mecanismos estn caracterizados, se puedeextrapolar el modelo a otras condiciones y especies distintas. Estos modelos se han usado

mucho en mamferos y en peces para el rojo fenol y el metotrexate.

Los modelos fisiolgicos usan un balance de masa, agrupando tejidos segn sus diferenciasde perfusin.

Para desarrollar estos modelos es necesario estimar el coeficiente de particin sangre/tejidopara todos los tejidos que se incluyen en el modelo. En peces, es necesa~Xxo usar peces

grandes pues se necesitan datos de concentracin-tiempo. En trucha se conocen muchos datos

de la fisiologa como para poder desarrollar estos modelos.

1.5. Enfermedades infecciosas.

La trucha, del mismo modo que otras especies, est expuesta a padecer una serie de

enfermedades infecciosas que provocan grandes mortandades en las poblaciones.

Por otra parte, los sistemas fisiolgicos de los organismos acuticos se ven influidos por los

INTRODUCCION 25

cambios que se produzcan en la calidad del agua. Son especialmente vulnerables el sistema

de osmorregulacin y el sistema respiratorio. Estas alteraciones en la calidad de agua son

responsables de la aparicin de estrs, lo que puede tener como consecuencia un proceso

patolgico (Parker, 1986). En este sentido, muchos estudios revelan la relacin entre

exposicin de los peces a contaminantes y aparicin de enfermedades (Brucke, 1991).

As, la relacin entre calidad del aguay enfermedad infecciosa puede ser debida a una accin

directa del contaminante o a la situacin de estrs inespecfica que provocan los txicos.

Por otra parte este estrs puede medirse de diversas maneras e incluso, en condiciones de

cra intensiva, por la eficiencia en la conversin del alimento (Smart, 1981), es decir: tiene

una influencia clara en la produccin.

Hay dos infecciones de una gran importancia en acuicultura: la producida por Yersinia

ruckeri, denominada boca roja y la llamada enfermedad bacteriana del rin, BKD,producida por Renibacterium salmoninarum.

1.5.1. Yersinia neckeri

Es el agente productor de la enfermedad de la boca roja (ERM -Enteric Red Mouth).Esta enfermedad se empieza a conocer en la dcada de los cincuenta. Hasta hace unos aos

la ERM estaba restringida a los salmnidos y a los EEUU. A partir de los setenta se

registran casos en Australia y Europa. Se ha encontrado en la mayora de las reas en que

se cultiva trucha arco iris (Brown, 1993). En Espaa, el primer aislamiento del germen fue

INTRODUCCION 26

en 1985 (De la Cruz et al., 1985) y desde entonces ha causado grandes prdidas econmicas.Afecta principalmente a salmnidos aunque tambin se han dado casos en no salmnidos

como carpas.

Actualmente se reconocen dos biotipos de bacterias: biotipo 1 (sorbitol negativas) que son las

ms patgenas, correspondindose al serotipo 01 y biotipo II (sorbitol positivas) que rene

5 serotipos (CAICYT, 1988).

La sintomatologa incluye inflamacin y erosin de las mandbulas y el paladar, hemorragia

subcutnea en boca y garganta, aunque esta ltima lesin, que le ha dado el nombre a la

enfermedad, no es patognomnica, ya que a veces no existe la boca roja (Brown. 1993).Puede presentarse obscurecimiento de la piel, hemorragias en la base de las aletas, exoftalmia

bilateral y tendencia al aletargamiento.

Entre las lesiones internas posibles estn la hipertrofia del bazo y hemorragias en el msculo

e intestino, donde se acumula un fluido amarillo. Se han descrito desde la forma hiperaguda

a la crnica.

El diagnstico se basa en el aislamiento e identificacin del agente causal a partir del rin

en placas de TSA, incubadas a 20-25 0C durante 24-48 h

Las colonias de Y. ruckeri son regulares, abultadas, blancas, de 2-3 mm de dimetro. El

microorganismo es un bacilo gram negativo, mvil, oxidasa negativo, que fermenta la

glucosa sin produccin de gas. Se diferencia de EdwardseIla tarda por ser indol negativa y

INTRODUCCION 27

por la presencia de gelatinasa. Se han empleado mtodos de deteccin rpida como el

API-20E, que permiten incluso distinguir los biotiopos por la reaccin del sorbitol.

Se han utilizado tambin mtodos serolgicos. Recientemente se han obtenido anticuerpos

monoclonales para utilizarlos en inmunofluorescencia, inmunohistoquimica y ELISA (Vallejosetal., 1995).

Se discute si hay portadores asintomticos que actan como reservorios. Se necesita que

exista un estrs para que los portadores sean capaces de transmitir la bacteria (Austin y

Austin, 1987). Algunos autores consideran a la bacteria como saprfita (Rucker, 1966).Otros consideran que es parte de la flora normal de las branquias (Brown, 1993).

Existen varias vacunas en el mercado pero, paradjicamente, no se conoce como son captadaspor el pez ni el exacto mecanismo de accin (Austin y Austin, 1987).

1.5.2. Renibacterium salmoninarum

Produce la enfermedad bacteriana del rin (BKD). Fue descrita por vez primera en los aos

treinta en el salmn atlntico en Escocia. Posteriormente se ha dado en un gran nmero de

pases. La infeccin es crnica y sistmica, limitada a las distintas especies de salmnidos.

La enfermedad se caracteriza por un hinchamiento y desorganizacin del rin, con abscesos

blanco-grisceos, los cuales pueden presentarse tambin en hgado y bazo. En peces de

mayor edad puede acumularse lquido asctico en la cavidad abdominal. Externamente los

INTRODIJCCION 28

peces pueden presentar exoftalmia, lesiones en los ojos, abdomen hinchado y lceras (Austin

y Austin, 1987).

El diagnstico presuntivo se realiza por observacin al microscopio de frotis teidos de

rin. Son bacilos cortos gram-positivos que estn localizados tanto intra como

extracelularmente. El diagnstico confirmativo debe realizarse por inmunofluorescencia

directa o indirecta.

Para el aislamiento del agente causal deben utilizarse medios especficos para Renibacterium

como KDM-2, SKDM y KDMC-C. La incubacin en estos medios se realiza a 15-20 C

durante 20-30 das. Se han descrito otras pruebas como ELISA o inmunofluorescencia aunque

son menos sensibles ante reducida carga microbiana (White et al., 1995). Sin embargo, otros

autores apuestan por el ELISA (Gudmundsdottir a al., 1993). Recientemente se ha puestoa punto una tcnica de PCR para detectar la bacteria en huevos y lquido ovrico (H4ie,

1995), tejido infectado y huevos (Figueroa et al., 1995)

R. salmoninarum es un bacilo corto, gram-positivo, oxidasa negativo y catalasa positivo. No

mvil, sin cpsula ni endosporas. Aerobio. Crecimiento entre 5 y 22 0C, siendo su

temperatura ptima 15 0C. Esta bacteria es incapaz de utilizar la mayora de los azcares y

no produce gelatinasa ni amilasa.

La HKD no es una enfermedad oportunista causada por un organismo ampliamente

diseminado en el medio ambiente aqutico. Sin embargo el microrganismo puede resistir unos

limitados perodos en el medio, al menos lo suficiente para asegurar una transmisin

INTRODUCCION 29

horizontal entre peces en el mismo acuario (Evenden et al., 1993).

El modo principal de transmisin es por contacto pez-pez, a travs de las heces o ingestin

de vsceras infectadas. Como tpico patgeno obligado el reservorio debe estar formado por

peces enfermos o portadores asintomticos (Austin y Austin, 1987) de hecho se ha

encontrado en Salvelnusfontnalis (Starliper y Teska, 1995). Se piensa tambin que puedantransmitirlo peces en libertad, como salmones (Roberts y Shepherd, 1986). Tambin juegaun papel fundamental en la diseminacin la transmisin vertical.

La manifestacin de la enfermedad est asociada a ciertos factores ambientales como

temperatura, salinidad, dureza del agua y dieta. Aparece caractersticamente al final del

invierno y primavera.

La supervivencia depende de la habilidad del patgeno para sobrevivir y multiplicarse dentro

de las clulas fagocticas del hospedador. Es importante escapar de la vacuola fagoctica y

quedar libres en el citoplasma. Al parecer R. Salmonnarum posee un factor daante de

membrana. Se ha demostrado que la incapacidad de los macrfagos para matar R.

Salmonnarum no es totalmente debida a la inhibicin de la actividad bactericida del

macrfago. Al parecer, la localizacin intracelular de R. salmoninarum proporciona un

ambiente de proteccin para el patgeno y un estimulo constante del sistema inmunitario del

hospedador que responde pero de una manera inadecuada (Evenden et al., 1993).

La BKD se considera una de las enfermedades bacterianas ms difciles de combatir. La

eritromicina aparece como el quimioterpico ms eficaz, si bien no elimina por completo al

INTRODUCCION 30

patgeno y es muy costosa. La desinfeccin de la superficie de los huevos con yodforos

reduce la incidencia de la enfermedad, pero no la elimina totalmente al transmitirse tambin

Reaibacrerium dentro del huevo (CAICYT, 1988).

En cuanto a la inmunizacin, los favorables resultados descritos por algunos investigadores

no han sido confirmados por otros. Las vacunas son orales, intraperitoneales. o por

inmersin con o sin coadyuvante (Evenden et al., 1993). La capacidad protectora de lasvacunas es cuestionable (Austin y Austin, 1987>.

1.6. Mtodos alternativos iii vitro

El pez constituye un sujeto ideal en lo referente a contaminacin del agua. Sin embargo, los

estudios farmacocinticos en peces presentan dificultades experimentales mucho mayores que

en mamferos o animales terrestres en general. Los problemas comienzan al intentar mantener

unos parmetros ambientales bajo control: temperatura del agua, salinidad, dureza, oxgeno,densidad de poblacin, alimentacin y manejo pueden afectar a los datos. Adems influyenfactores endgenos como tamao y estado fisiolgico (esmoltificacin, sexo, madurez sexual,

salud). No hay que olvidar que los procedimientos experimentales pueden alterar las

condiciones del pez: la anestesia, la toma de muestras, etc. Las tomas repetidas de muestras

de sangre de un mismo individuo son muy difciles de llevar a cabo, haciendo necesario

tomar muestras de distintos individuos, introduciendose por ello un factor de variacin

individual. De este modo, la extrapolacin de los datos para otras condiciones es difcil.

Es necesario, por tanto, encontrar mtodos alternativos iii vitro para estudiar la fisiologa de

INTRODUCCION 31~

los peces, en lo relativo a su relacin con el medio externo. Este nimo ha llevado a

investigar sistemas in vitro, incluyendo rganos aislados, para desarrollar en peces, igual que

han sido desarrollados para otros vertebrados. As se han desarrollado para diferentes

rganos, como la preparacin relativamente reciente de corazn de trucha (FarreIl et al.,

1989). No obstante y por razones que comentaremos a continuacin, las preparaciones ms

importantes y extendidas son las relacionadas con las branquias.

1.7. La branqula como sistema fundamental

La branquia es un rgano multifuncional especializado en funciones como el intercambio

respiratorio, la osmorregulacin, la eliminacin de productos de desecho del metabolismo del

nitrgeno y la regulacin del equilibrio cido-base (Girard y Payan, 1980). Posee una gran

rea irrigada lo que junto a una corta distancia entre sangre y agua les facilita esosintercambios. Esto implica que las branquias son la principal va de absorcin de compuestos

en disolucin (Prt y Svanberg, 1981).

En cuanto a la estructura, las branquias de un telesteo tpico comprenden dos series de

cuatro holobranquias que forman las paredes de la faringe. Cada holobranquia se compone

de dos hemibranquias que se prolongan desde el borde posterior del arco branquial. Las

hemibranquias estn formadas por una fila de laminillas primarias. Sobre toda la superficie

dorsal y ventral de cada laminilla primaria se disponen las laminillas secundarias. Los arcos

contienen arterias branquiales aferentes que provienen de la aorta ventral y arterias

branquiales eferentes que desembocan en la aorta dorsal.

INTRODUCCION 32

En la branquia se pueden distinguir dos tipos de epitelio de acuerdo a su irrigacin sangunea

y sus caractersticas celulares:

- El epitelio de la laminilla primaria, que contiene en su mayora clulas del cloruro y est

conectado a la circulacin venosa (parte de la arteria lamelar primaria, incluye el seno venosocentral de la laminilla primaria y est conectado al sistema venoso branquial).

- El epitelio de la laminilla secundaria, de clulas respiratorias e irrigado por circulacin

arterial (parte de la arteria lamelar aferente y va a dar a la arteria lamelar eferente).

Las clulas respiratorias representan el 96 96 de la superficie epitelial. El resto son las clulas

del cloruro y las productoras de mucus.

Los peces obtienen el oxgeno de la pequea cantidad que est disuelta en el agua. Para

extraer este oxgeno eficientemente, la estructura branquial consiste en un fino tamiz a travs

del cual el agua es bombeado. Las laminillas estn superpuestas unas a otras formando un

tupido filtro. (Lloyd, 1992). Durante la respiracin el agua pasa a travs de la boca hacia las

branquias y sale por los oprculos. Una corriente continua de agua se mantiene gracias a

movimientos de compresin y expansin de las cavidades bucal y opercular. La sangre

circula en las laminillas secundarias en el sentido opuesto al del flujo del agua, con un

rendimiento de la extraccin de oxgeno de hasta el 80% (Roberts, 1981).

El intercambio gaseoso tiene lugar por simple difusin, facilitado por una gran superficie

(300 cf/lOO g para la trucha arco iris), cortas distancias de difusin (2-10 ~m)y por un

movimiento de sangre y agua a contracorriente (Prt, 1989a). La estructura de las laminillas

secundarias consiste en una fina capa de clulas epiteliales hacia el exterior y espacios por

INTRODUCCION 33

los que fluye la sangre hacia el interior. As, el oxgeno disuelto en el agua tienen que

recorrer una corta distancia para llegar al torrente sanguneo (Lloyd, 1992).

Los peces, a diferencia de los organismos terrestres, tienen que mantener un equilibrio

osmtico con el agua en que viven. Por simple smosis el agua entra dentro del cuerpo. Este

agua es filtrado de la sangre por los riones pero, como en los peces no hay reabsorcin de

agua se produce un copioso flujo de orina. Los riones reabsorben bastante del sodio y

cloruro de la orina para prevenir una prdida de sal, ya que sta abandona el cuerpo tambin

a travs de la piel. Esta prdida es restituida por la absorcin activa de esos elementos en las

branquias, donde el sodio se cambia por hidrgeno y el cloruro por bicarbonato. De hecho

la mayor regulacin del equilibrio de sales la llevan a cabo las branquias y no el rin

(Lloyd, 1992).

En el intercambio inico, los diversos grupos celulares desempean distintas funciones. Las

clulas del cloruro tienen un importante papel en la adaptacin de los peces a agua salada,

presentando una serie de cambios morfolgicos durante este proceso. El intercambio

Na~/NI-1 y CIIHCO; se produce en las clulas respiratorias, interviniendo tambin en el

equilibrio cido-base y en la excrecin. No obstante, las clulas del cloruro podran

intervenir en la eliminacin de ciertas sustancias orgnicas (Girard y Payan, 1980).

En los telesteos, la piel, intestino y branquias estn en contacto directo con el agua externa

y podran ser consideradas lugares potenciales de absorcin de sustancias. Sin embargo la

piel es casi impermeable y, al menos, los peces de agua dulce, no beben agua, siendo estas

vas de menor importancia en la absorcin.

INTRODUCCION 34

Las sustancias disueltas pueden entrar en el epitelio por dos vas, a travs de las clulas

(transcelular) o entre las clulas, por sus uniones (paracelular). Las branquias de peces de

agua dulce tienen un epitelio con unas uniones muy apretadas lo que sugiere que la va de

penetracin es transcelular.

Las sustancias en el agua pueden ser absorbidas por las branquias, pasar al torrente

circulatorio y circular por el cuerpo. Si las concentraciones del txico son suficientemente

altas, las delicadas clulas de la laminilla secundaria pueden ser daadas afectando a las

funciones de respiracin y regulacin de sales. Las branquias son una ruta de principal

importancia para la captacin de sustancias txicas por los peces, y en la mayora de los

casos, la ingestin de esas sustancias con el alimento tiene mucha menor importancia (Lloyd,1992). Tanto los compuestos orgnicos hidrofbicos como los hidroflicos y los iones

metlicos entran en el pez a travs de las branquias; por ello, los estudios sobre la

biodisponibilidad de las sustancias deberan centrarse en este rgano.

El mecanismo de absorcin es el que determina si una determinada sustancia qumica estar

disponible. La tasa de absorcin podra usarse para estimar la biodisponibilidad (Prt, 1990).

1.8. La perfusin de branquias.

Desde principios de siglo se han venido desarrollando preparaciones de branquias para

estudiar la fisiologa branquial (Perry a al., 1984a).

Las preparaciones de perfusin branquial permiten medir muchas variables de la

INTRODUCCION 35

funcionalidad branquial. El control de la composicin del lquido, la presin y el flujo y laexclusin de la circulacin postbranquial, junto con una elevada precisin de las medidas,son las principales ventajas. Pero la compleja estructura de las branquias y su variedad defunciones pueden llevar a conclusiones errneas. Adems, la perfusin y el aislamiento

introducen nuevas variables como los efectos del anestsico, deformaciones mecnicas y

estrs, y la muerte gradual de los tejidos. El principal criterio para juzgar una preparacines su habilidad para reproducir el comportamiento fisiolgico del tejido en animales intactos.Las dificultades existentes para obtener informacin sobre la funcin branquial in vivo impide

realizar una comparacin entre ambos mtodos. De hecho, esa es la razn para desarrollar

preparaciones in vitro. (Perry et al., 1984a).

1.8.1. Tipos de preparaciones.

Las preparaciones pueden ser de cuatro tipos: arcos branquiales aislados, cestas branquiales

incluyendo todos los arcos, cabezas y cuerpos enteros.

Los arcos branquiales aislados han sido utilizados por muchos investigadores (Ellis and

Smith, ~983). La preparacin consiste en un arco branquial separado perfundido por la

arteria branquial aferente, recogiendo el perfusado por un catter en la arteria branquial

eferente.

Las cestas branquiales perfundidas fueron utilizadas por los primeros investigadores (Reite,

1969). Suponen la canulacin del bulbo arterioso y el corte de los arcos cerca del techo de

la boca.

INTRODUCCION 36

Las preparaciones de branquias en cabeza aislada se han utilizado ampliamente en los

experimentos de fisiologa branquial. Las cabezas tienen una cnula de entrada en la aorta

ventral o bulbo arterioso y una cnula de salida en la aorta dorsal.

Las preparaciones de cuerpo entero son iguales a las de cabeza aislada pero sin el catter

oclusivo en la aorta dorsal. En lugar de ello se utiliza una cnula no oclusiva para toma de

muestras y medidas de la presin.

1.8.2. Preparacin de branquias en cabeza aislada

La perfusin de cabeza ha sido muy utilizada en experimentos sobre la fisiologa branquial

(Prt y Svanberg, 1981; Prt et al., 1984; Gardaire a al., 1985; Prt a al., 1985;

Andersson y Prt, 1989; Avella y Bornancin, 1989; Block et al., 1991; etc).

El mtodo de perfusin ms empleado est representado en la Figura 2. Este mtodo incluye

un depsito de suero a una altura superior a la preparacin y una bomba cardiaca que

impulsa regularmente el lquido de perfusin. A flujo constante, cambios en la presin atravs de las branquias indican alteraciones en la resistencia vascular.

Las cabezas tienen la entrada en la aorta ventral o bulbo arterioso y una cnula de salida en

la aorta dorsal a la altura del oprculo caudal. La ventilacin se mantiene artificialmente

aunque algunas preparaciones ventilan espontneamente.

En una preparacin tpica, el 80 % del output cardiaco se recoge de la aorta dorsal mientras

INTRODUCCION 37

Figura 2. Esquema de la preparacin de branquias en cabeza aislada.

que el resto se lo lleva el flujo venoso. El flujo venoso se asume que est en contacto con

las clulas del cloruro que estn involucradas en el transporte inico, por lo que se ha dicho

que la circulacin venosa tienen una funcin ion-reguladora.

La utilizacin de sustancias radioactivas se ha generalizado por su facilidad y sensibilidad en

el anlisis. Sin embargo, para ciertos compuestos, como algunos orgnicos, la cromatografa

presenta ventajas, al no confundir los metabolitos con la molcula original.

1.8.3. Medida de la viabilidad de la tcnica

Las preparaciones de branquias estn limitadas por su deterioro natural. La viabilidad de la

preparacin se evala por tres mtodos:

OSi, C,RDhkOA un RuION

INTRODUCCION 38

- Presin de perfusin aferente

- Flujo neto de sodio- Examen histolgico

Una preparacin viable se caracteriza por una presin estable. Un incremento de la presin

es un signo de vasoconstriccin en el circulatorio. Ese incremento va acompaado por la

formacin de edema en la laminilla secundaria, producindose un incremento de las distancias

de difusin entre sangre y agua. el resultado es una reduccin en la capacidad de difusin

(Prt et al., 1982). La presencia de adrenalina en el liquido de perfusin previene la

vasoconstriccin.

Una preparacin viable se caracteriza por una concentracin de Na estable o ligeramente

a la baja en el agua. Es un indicador de viabilidad muy sensible porque la absorcin contragradiente requiere energa metablica. Las branquias con edema poseen un flujo negativo desodio, mostrando como pierden este ion.

1.8.4. Estudios realizados

Las preparaciones a vitro de branquias han sido ampliamente utilizadas para estudiar la

fisiologa branquial. Desde Krakow (1913) se han usado estas preparaciones permitiendo

controlar y medir muchas variables de la funcionalidad branquial.

Uno de los temas fundamentales de investigacin ha sido el intercambio inico en la

branquia. As, esta tcnica se ha utilizado para examinar el mecanismo de la excreccin de

INTRODUCCION 39

amoniaco y la absorcin de sodio. Primeramente Payan y colaboradores (1975) estudiaron

la bomba de sodio en la preparacin de perfusin branquial, comprobando que la entrada de

sodio era similar a la de peces a vivo. Tambin abordaron la exereccin de amoniaco en

dicha preparacin, comprobando el efecto de varias sustancias. De este modo vieron como

la adrenalina estimulaba la entrada de sodio y la excrecin de amoniaco. La acetazolamida

reduca la entrada de sodio y la excrecin de amoniaco, sin alterar la salida de sodio. Se

empez entonces a postular un intercambio normal en la branquia Na~/NH;.

Posteriormente se estudi el efecto de la temperatura y CO2 sobre la excrecin de amoniaco.

Un cambio brusco de temperatura reduca la permeabilidad de la branquia al amoniaco

mientras que la presencia de CO, activaba la excrecin (Payan y Matty, 1975). Payan (1978)

mostr nuevas evidencias de un intercambio Na~/NH; en la branquia de trucha, ofreciendo

un modelo en el que el sodio entraba gracias a la Na*1K4 ATPasa y el amoniaco atravesaba

la membrana en direccin contraria, en su forma no ionizada.

Sin embargo, otros autores (Avella y Bornancin, 1989) han rechazado el intercambio

sodio/amoniaco, vinculando la absorcin de sodio a la excrecin de iones H~.

Girard y Payan (1980) estudiaron las diferencias en agua dulce y agua salada y la

participacin de los distintos tipos celulares (clulas respiratorias y clulas del cloruro) en

la absorcin branquial de sodio. Esta lnea ha sido seguida por otros autores (Gardaire et al.,

1985) que demostraron que las clulas del cloruro de la primera laminilla contribuyen en un

20 96 a la misma. La absorcin de cloruro est relacionada con la concentracin de HCO3

y CO2 (Perry et al., 1984b) y est controlada adrenrgicamente, aumentada por la

estimulacin del receptor alfa e inhibida por la estimulacin del receptor beta (Perry et al.,

INTRODUCCION 40

1984c).

Perry y colaboradores (1985) compararon el transporte inico en la preparacin de perfusin

branquial usando suero Ringer y sangre como lquido de perfusin, analizando Cl, Na~ y

NR;. La absorcin de sodio se deterior ms rpidamente en la perfusin con Ringer,

mientras la de CI se mantuvo relativamente estable. La excrecin de amoniaco fue similar

con ambos lquidos de perfusin.

Muchos estudios hemodinmicos se han realizado en branquias (Wood, 1974; Payan y

Girard, 1977; etc.). De hecho, causas hemodinmicas influyen en el intercambio inico, por

ejemplo alteraciones hemodinmicas son las responsables de la estimulacin de la entrada deC1 por el HCO; (Perry et al., 1984b).

En cabeza aislada se ha estudiado tambin como varia la resistencia vascular al aadir

adrenalina en el suero (Prt et al., 1982a). La adrenalina aument la resistencia vascular

notablemente por una vasoconstriccin alfa-adrenrgica. En un posterior estudio (PArt et aL,1982b) midieron tambin el intercambio de oxgeno comprobando que en ausencia de

adrenalina, ste disminua y en su presencia se mantena estable, junto con la resistenciavascular, atribuyendo esos resultados a cambios estructurales en la laminilla secundaria.

Perry y colaboradores (1985) revisaron el comportamiento de la preparacin de branquiasen cabeza aislada en cuanto a intercambio gaseoso, equilibrio cido-base y respuesta

hemodinmica, utilizando suero fisiolgico o sangre como lquido de perfusin. La perfusin

con sangre estimul la captacin de 02 y la excrecin de CO2 a travs de las branquias, por

INTRODUCCION 41

un aumento en la capacidad de transporte de oxgeno y la presencia de anhidrasa carbnica

de los eritrocitos.

Ya centrados en el intercambio gaseoso, Prt et al. (1984) estudiaron la tensin de oxgeno

antes y despus de las branquias concluyendo que deba haber un shunt no respiratorio en

la segunda laminilla.

El papel de los eritrocitos y del epitelio branquial en la excrecin de CO2 fue estudiado por

Perry y colaboradores (1982). La entrada de HCO; en el eritrocito es el paso limitante en

la excrecin de CO2, no contribuyendo el paso de FICO; desde el plasma al epitelio

branquial.

Algunos trabajos se han llevado a cabo sobre la cintica de compuestos txicos. La principalruta de entrada de xenobiticos al pez son las branquias. La tcnica de la perfusin branquial

permite obtener informacin valiosa sobre la biodisponibilidad de los txicos, pues un primer

paso de esta consiste en como son captados por los organismos (Prt, 1990).

Ejemplo de cmo estos estudios pueden ir desarrollndose es el caso del cadmio.

Primeramente, Prt y Svanberg (1981) estudiaron la absorcin de cadmio por esta va viendo

como aumentaba al incrementarse el cadmio del medio. Se trataba de un experimento

preliminar sobre como se produca la absorcin de cadmio, lo que permiti trabajos

posteriores. As Prt et al. (1985) estudiaron la disponibilidad de cadmio en diferentes

calidades de agua. Por otra parte estudiaron la influencia de algunos agentes quelantes como

EDTA y citrato en la absorcin de cadmio (Prt y Wikmark, 1984). Posteriormente otros

INTRODUCCION 42

autores han estudiado la absorcin de cadmio en presencia de xantatos, as como la

distribucin intracelular del cadmio (Block ci al., 1991).

La preparacin de cabeza de truchaha sido empleada para estudiar la absorcin, metabolismo

y eliminacin del benzo[a]pyreno, demostrndose que las branquias contienen sistemas de

enzimas capaces de metabolizar xenobiticos y que probablemente modificarn la absorcin

y toxicidad de los contaminantes en el organismo (Andersson y Prt, 1989).

Prt (1989a) estudi con esta tcnica la relacin del coeficiente de particin octanol-agua y

del pH en la absorcin de diversos compuestos orgnicos. Mientras que el coeficiente de

particin tiene un valor limitado como indicador de la biodisponibilidad, la absorcin de

compuestos ionizables son pH-dependientes. Paralelamente estudi las distintas tasas de

absorcin branquial de fenoles en agua dulce y salada. La adaptacin al agua de mar reduce

la permeabilidad de las branquias para las formas no ionizadas de los compuestos (Prt,

1989b).

La absorcin de compuestos hidrofbicos ha sido ampliamente estudiada, en sus aspectos

metodolgicos (Prt et al., 1992) concluyendo que la preparacin es muy adecuada para

investigar los mecanismos de absorcin de estos compuestos en relacin con sus

caractersticas fisicoqumicas. Esta absorcin disminua al bajar la temperatura (Sijm et al.,

1993) y aumentaba con el flujo de sangre y agua (Sijm ci al., 1994). Posteriormente se

determin su relacin alomtrica (Sijm et al., 1995).

Sijm (1993) observ tasas de absorcin comparables para varios compuestos orgnicos y

INTROIMJCCION 43

sugiri el mtodo como una alternativa al uso de peces, reduciendo el nmero necesario para

cada experimento y el estrs de los mismos.

1.8.5. Utilidad de esta tcnica

La preparacin de cabeza perfundida posee muchas de los requerimientos de una buena

preparacin de perfusin branquial: ciruga rpida, no anestesia, se evitan largos perodos

de isquemia, las branquias estn bien irrigadas y perfundidas y el volumen del medio externo

pude ser pequeo. El mayor defecto es que la presin de la aorta dorsal se tiene a cero para

evitar que se derrame lquido de perfusin en el medio externo. Esto afecta al patrn de flujoa travs de las branquias y contribuye al rpido deterioro de la preparacin. Hay quien

aumenta la presin hasta valores que no suponen prdidas de suero.

El problema del deterioro hemodinmico puede ser superado aadiendo 10 M de adrenalina

o noradrenalina al liquido de perfusin o irrigando las branquias con agua hiperxica. El

deterioro hemodinmico est limitado a la trucha (en otras especies ocurre horas despus).

Si se usa este pez los experimentos no pueden superar 60 mm. (preferibles 30 mm.) y se

debe monitorizar la presin como un indicador de la viabilidad de la branquia.

Una gran ventaja de esta preparacin es que el flujo eferente puede ser partido en sus

componentes arteriales y venosos. Esto es posible porque el lquido que abandona la laminilla

en la branquia puede volver va eferente por las arterias filamentales y branquiales a la aorta

dorsal o ser enviado mediante anastomosis entre la arteria filamental eferente y el seno

venoso filamental a la circulacin venosa. Debido a esta particin es posible separar los

INTRODUCCION 44

flujos en un componente de epitelio respiratorio (flujo a travs de clulas respiratorias) y un

componente de epitelio no respiratorio (flujo a travs de clulas del cloruro). As se hademostrado que en agua dulce el flujo de Na~ y Cl es a travs del epitelio respiratoriomientras que en el mar tiene lugar en las clulas del clorhdrico. La preparacin de cabeza

no desarrolla estos flujos salvo el de sodio (aadiendo adrenalina).

Uno de los mayores problemas de esta preparacin es separar los efectos especficos e

inespecficos, sobre todo cuando se emplean sustancias vasoactivas. Por eso es esencial

monitorizar la presin. P.ej. adicin de FICO; eleva el flujo de CF pero no especficamente

sino por alteraciones hemodinmicas con alteracin de la presin.

En resumen, las mayores desventajas de esta preparacin son: su progresivo deterioro conel tiempo, hacindolo nicamente adecuado para experimentos a corto pazo y bajas tasas deflujo de iones y 02 en ausencia de catecolaminas. Las principales ventajas son: ciruga simpley rpida que no necesita anestsico, no prdidas de agua con o sin presin dorsal artica y

divisin del flujo eferente en componentes arteriales y venosos. Esta preparacin es la msadecuada para estudios de transferencias de iones y gas, de corta duracin (no ms de 60

mm). Estudios futuros deberan incorporar plasma o sangre como medio de perfusin, si

fuera posible. Esto podra solucionar los problemas de formacin de edema y baja capacidadde transporte de 02. Tambin se sugiere aplicar niveles fisiolgicos de presin en la aorta

dorsal. No se recomiendan altos niveles de catecolaminas pero si 10 10~ adrenalina, para

ayudar a solventar el deterioro progresivo.

INTRODUCCION 45

1.9. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION

La introduccin de este trabajo ha permitido sealar una serie de aspectos bsicos,relacionados con la entrada de sustancias qumicas y de microorganismos patgenos, que

tienen una enorme importancia cientfico-tcnica y que al mismo tiempo representan aspectos

de inters para la acuicultura comercial.

El objetivo bsico de este trabajo es valorar las posibilidades de una metodologa concreta,la perfusin de branquias en cabeza aislada, para abordar el estudio de aquellos aspectos que

tienen una aplicabilidad inmediata, as como desarrollar nuevas posibilidades de esta tcnica,

entre las que destacan el estudio de los mecanismos que regulan estos procesos, as como un

aspecto totalmente innovador: la posibilidad de estudiar esta metodologa para estudiar el

paso de microorganismos en la branquia.

Para ello pretendemos comprobar la validez del sistema en los siguientes apartados:

- Comprobar su capacidad para estudiar cuantitativamente la toxicocintica de compuestos

estudiando su adecuacin a los resultados obtenidos in vivo.

- Estudiar sus posibilidades para valorar los mecanismos que intervienen en la toxicocintica

de cada compuesto.

- Comprobar la posibilidad de crear modelos mecnicos de ingreso de partculas inertes.

- Estudiar el ingreso de bacterias va branquial mediante esta preparacin.

MATERIALES Y METODOS

MATERIALES Y METODOS 47

2.1. Materiales

2.1.1. Animales

Todos los experimentos se han realizado utilizando trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)

procedentes de la piscifactora de Somolinos de la Vega (Guadalajara). Los individuos seeligieron al azar, una vez aclimatados en los acuarios.

Para las preparaciones de perfusin branquial se utilizaron truchas de un peso entre 80 y 120

gramos. Los peces se mantuvieron en acuarios de 120 litros con flujo continuo y aireacin.Para los estudios in vivo se utilizaron animales de mayor tamao (500-1200 g) mantenidos

en grupos de 5-10 individuos en acuarios de 1600 litros.

2.1.2. Resumen de los materiales empleados

- Mantenimiento de los peces: acuarios de 120 1 y 1600 1

- Equipo experimental: motor de agua (SICCE, Italia), tubos de silicona, bomba cardiaca

(IWAKI, Japn), filtro 0.2 ~m(Millipore, EEUU), bao (Julabo, Alemania), registro de

presin (PAN-LAB, Blgica), transductor de presin (DRUCK, Gran Bretaa), polmetro conelectrodos de sodio y de referencia (Orion, EEUU), bomba peristltica (ISCO, EEUU).

- Material quirrgico: cuchillo de diseccin, pinzas (de relojero, recta, curva, bulldogvascular), tijeras rectas, seda 4/0 (Lorca-Marn, Espaa), tubo de polietileno RE-SO, PE-90

MATERIALES Y METODOS 48

y PE-190 (Clay Adams, EEUU), aro de plstico, grafes de Michel 18 x 3 mm (Medicon,

Alemania), preservativos.

- Reactivos experimentales: PVP-40 (Sigma, EEUU), albmina (Sigma, EEUU), adrenalina

(Sigma, EEUU), heparmna (LEO, Espaa), 2-fenoxietanol (Merck, Alemania), nitrito sdico(Merck, Alemania), sulfato de cobre (Merck, Alemania), xileno de almizcle (Merck,

Alemania), formaldehido (Merck, Alemania), Hexaclorobenceno (Merck, Alemania),

amoniaco (Merck, Alemania), cloruro de cadmio (Sigma, EEUU), cianuro potsico (Sigma,EEUU), bolas de poliestireno con modificacin del extremo carboxilo con fluorescencia roja(Sigma. Alemania).

- Material de histologa: xilol, hematoxilina, tripsina, alcoholes, anticuerpo monoclonal anti

Renibacterium, anticuerpo policlonal antiyersinia, PBS, anticuerpo conjugado con peroxidasa(Sigma, Alemania), anticuerpo puente para Renibacterium (Dako, Dinamarca), anticuerpo

antiperoxidasa, Diaminobenzidina, sustrato cromgeno, hematoxilina, entelln,

- Material analtico: centrfuga de capilares (Orto, Espaa), microjeringa (Hamilton, EEUU),tubos de ensayo, rotativa (Heidolph, Alemania), microscopio de fluorescencia (Zeiss,Alemania), espectrofotmetro (Unicam, Gran Bretaa), Espectrofotmetro de absorcin

atmica con cmara de grafito HGA 300 (PERKJN-ELMER, Alemania), centrfuga de mesa(IEC, EEUU), Cromatgrafo de gases con detector selectivo de masas (Hewlett-Packard,

EEUU).

- Reactivos analticos: sulfanilamida (Merck, Alemania), N-(- 1 -naftil)-etilen-diamina, cido

MATERIALES Y METODOS 49

ntrico suprapur (Merck, Alemania), n-hexano (Merck, Alemania)

- Medios de cultivo: SKDM (selective kidney disease medium), TSA (triptona soja agar).

2.2. Mtodos

2.2.1. Perfusin branquial

La tcnica de perfusin branquial es un mtodo de reproduccin in vitro de la fisiologa

branquial, en la que se asla esta parte del animal para un mayor control de las distintas

variables (Perry et al, 1984).

Para cada perfusin se sigui la siguiente metodologa:

2.2.1.1. Circuitos

El aparataje para realizar la perfusin consta bsicamente de las siguientes partes: (fig.3)

- Un circuito externo cerrado por el que circula el agua, por medio de un motor (SICCE,

Italia), que representa al medio en el que vive el pez.

- Un circuito interno abierto por el que circula el liquido de perfusin impulsado por una

bomba cardiaca (IWAKI, Japn). Se utiliz el suero salino Cortland (Wolf, 1963). Contena

40 g/l de PVP-40 (polivinilpirrolidona, PMt= 40.00, Sigma, EEUU) segn Prt y Wikmark

(1984).

.11

vn

MATERIALES Y MiETODOS 51

Una vez preparada la solucin salina, se filtraba con un filtro de 0.2 pm (Millipore, EEUU)

y posteriormente se proceda a gasearlo con una mezcla de N2 conteniendo 0.7 96 de CO2 y

5 % de 02 (Alphagaz, Espaa). A continuacin se aada 1 ml/lOO ml de una solucin de

albmina (Sigma, EEUU) 20 96 y 100 M11100 ml de adrenalina (Sigma, EEUU) 0.1 % para

prevenir la vasoconstriccin espontnea (Prt et al. 1982). El suero Cortland preparado se

colocaba en el circuito de perfusin y se drenaba para eliminar la existencia de burbujas.

- Un receptculo cilndrico donde est alojada la cabeza del pez.

- La temperatura del circuito externo e interno estn mantenida por un bao (Julabo,

Alemania) a una temperatura de 10 0C.

2.2.1.2. Fase quirrgica

En resumen, la operacin consiste en una decapitacin de la trucha, una canulacin de las

aortas y una preparacin para su posterior colocacin en el sistema.

Para la operacin se siguen los siguientes pasos:

- Se pesa la trucha, cuyo peso debe estar entre 80 y 120 g.

La fase quirrgica comienza a los veinte minutos de inyectar 2000 unidades de heparmna

(LEO, Espaa) por 100 g de pez.

- Se corta la cabeza de la trucha 0.5 cm por detrs del nacimiento de las aletas operculares.

- A continuacin se coloca la cabeza en la mesa de operacin, haciendo pasar agua de pozo

MATERIALES Y METODOS 52

a travs de la boca para preservar la funcionalidad branquial.

- Se extraen con pinzas los rganos abdominales que queden, normalmente el hgado y un

asa intestinal.

- Posteriormente, se corta el pericardio con unas tijeras rectas, quedando accesible elcorazon.

- Se prepara una ligadura con seda 4/0 (Lorca-Marn, Espaa) a la altura del bulbo articousando la pinza curva y la recta de relojero.

- Enseguida se corta con tijera la punta del ventrculo para evitar que bombee en vacio.

- A continuacin se introduce un tubo de polietileno PE-SO (Clay Adams, EEUU) hasta la

aorta ventral. Una vez hecho esto es cuando se completa la ligadura.

- Para evitar la prdida de agua por esta va, se cierra el esfago con una pinza bulldog

vascular.

- Por ltimo, a fin de mantener la rigidez de la pared ventral de la cabeza, se coloca un aro

de plstico en la cavidad abdominal y se grapa con tres grafes de Michel de 18 x 3 mm

(Medicon, Alemania).

Una vez terminada esta operacin se fija la cabeza al sistema para lo cual se coloca un

preservativo por detrs de las branquias, unindose luego al sistema, por lo que queda

impermeabilizada la cmara donde est instalada la cabeza.

Colocada la cabeza se conecta la bomba para hacer funcionar el circuito de lquido externo

(agua de pozo) con un flujo de 1.5 l/min.para mantener una buena irrigacin de las

branquias. De igual modo se pone en funcionamiento la bomba cardiaca a una frecuencia de

40 pulsaciones por minuto y un flujo de 2 ml por minuto y 100 g de pez. Se conecta el

MATERIALES Y METODOS 53

extremo libre del circuito interno a la cnula PE-SO de la aorta ventral.

Una vez que se haya drenado todo el contenido del sistema circulatorio del pez, se introduce

un tubo PE-90 (Clay Adams, E.E.U.U) en la aorta dorsal. Por esta cnula tiene su salida cl

lquido de perfusin que ya ha pasado por la branquia. Este lquido se recoge cada cierto

tiempo, dependiendo del experimento.

Se conecta el registro de presin (PAN-LAB, Blgica) que va unido al transductor de presin(DRUCK, Gran Bretaa) situado en el circuito interno. As mismo se introducen en la cubeta

los electrodos de sodio y de referencia (Orion, EEUU), para empezar a registrar estos

valores.

Cuando se han estabilizado los valores de presin y concentracin de sodio se considera que

la branquia est funcionando correctamente y puede procederse a la parte experimental

propiamente dicha. Una vez acabado el experimento se extrajeron las branquias y se

incluyeron en parafina para posteriormente realizar cortes histolgicos.

2.2.2. Desarrollo experimental

2.2.2.1. Eliminacin iii vivo de nitritos

Para el desarrollo de este apartado se utilizaron 5 truchas entre 800 y 1300 g. Para cada

animal se sigui el siguiente protocolo:

- Anestesia por inmersin en una solucin de 0.3 ml de 2-fenoxietanol (Merck, Alemania)

MATERIALES Y METODOS 54

por litro de agua.

- Pesado del pez.

Colocacin de una cnula rgida en la aorta dorsal.

Inoculacin intravenosa de 0.5 m] por kg de p.v. de una solucin de

ppm, para alcanzar una concentracin aproximada en el pez de 3 mg/l.

- Extraccin de sangre en los tiempos: 0. 2, 4, 7, 9, 11, 14, 20, 25, 30,

- Centrifugacin de la sangre en centrfuga de capilares (Orto, Espaa)plasma con microjeringa (Hamilton, EEUU).- Anlisis de las cantidades de nitritos en plasma.

nitrito sdico 600

37, 45 y 60 mm.

y extraccin del

2.2.2.2. Eliminacin in vitro de nitritos

Se realizaron 4 perfusiones branquiales: las dos primeras se hicieron perfundiendo lquido

con 3 ppm de nitritos. Las siguientes se realizaron perfundiendo, en la misma preparacin,

primero lquido con 1 ppm y a la mitad del experimento con 6 ppm.

Se tomaron muestras de lquido de perfusin de la cnula de la aorta dorsal cada 2 minutos

as como muestras del lquido externo del circuito (agua de pozo). Las muestras se analizaron

por colorimetra.

2.2.2.3. Metabolismo frs vitro de nitritos

Se dise un experimento para ver la capacidad de metabolizacin de los nitritos a vitro.

Para comprobar si haba elementos en la sangre que metabolizaran los nitritos se prepararon

MATERIALES Y METODOS 55

4 tubos, cada uno de los cuales contena: sangre completa, plasma, lquido de perfusin y

liquido de perfusin con hemates. Se les aadi un estndar de nitritos para obtener

alrededor de 3,5 ppm. Se colocaron en una rotativa (Heidolph, Alemania) y se mantuvieronall tomando muestras en los tiempos siguientes: 0,1,2,3, y 24 horas. Las muestras se

centrifugaron en una centrfuga de mesa, diluyendo posteriormente el sobrenadante, para su

anlisis. Todas las pruebas se realizaron por cuadruplicado.

2.2.2.4. Absorcin iii vivo de nitritos

Se utilizaron 3 truchas de pesos comprendidos entre 530 y 625 g.

Cada una de ellas se mantuvo en acuario con un flujo continuo de 2.7 mg/l de nitrgenonitroso (1/10 de la CL5O para las condiciones de calidad de agua empleadas). Considerando

la rpida transformacin de los nitritos, se consider necesario realizar una exposicin en

flujo continuo con el objeto de garantizar los resultados. Para ello se us una bombaperistltica (ISCO, EEUU) para suministrar la solucin de nitritos y un mezclador para

mezclar el flujo de entrada de agua de pozo con la fuente de nitritos.

Se realizaron extracciones de sangre en el seno caudal a los tiempos 0, 30, 60, 90, 120 mm.,

4, 6, 8 y 24 horas. Se analiz la concentracin de nitritos en plasma.

2.2.2.3. Absorcin in vitro de nitritos

Para la determinacin de la absorcin a vtro de nitritos se utilizaron 4 truchas. En cada

perfusin se mantuvo una concentracin de 3 ppm de nitritos en el agua externa del circuito.

MATERIALES Y METODOS 56

Para comprobar la capacidad del sistema para reproducir el funcionamiento in vivo, aplicado

al caso de los nitritos una de las preparaciones se realiz utilizando un medio externo sin

cloruros.

Se tomaron muestras de lquido de perfusin de salida cada 2 minutos as como muestras del

lquido externo. Las muestras se analizaron por colorimetra.

2.2.2.6. Eliminacin iii vitro de cobre

Se realizaron 4 preparaciones: dos con 1500 ppb de cobre y dos con 1500 y posteriormente

300 ppb. Las preparaciones se realizaron perfundiendo suero salino Cortland con las

concentraciones citadas de cobre en forma de sulfato. Se tomaron muestras de lquido de

perfusin de la cnula de la aorta dorsal cada 2 mm. y tambin de lquido externo.

2.2.2.7. Eliminacin u vitro de cobre con clulas

Se realizaron tres preparaciones en las cuales se perfundieron las branquias con cobre a una

concentracin de ISOO ppb. En la mitad de la preparacin se aadi al lquido de perfusin

sangre del propio animal extrada previamente (0.5 ml de sangre por 50 ml de lq