Upload
vuongdiep
View
218
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Per diagnosi prenatale si intende l’insieme delle indaginistrumentali e di laboratorio finalizzate ad individuare determinate patologie su
base :
geneticainfettivaiatrogena
Attualmente l’indagine citogenetica per lo studio del cariotipo fetale
interessa circa l’80% delle diagnosi prenatali eseguite per evidenziare
patologie genetiche.
Indicazioni alla diagnosi prenataleIndicazioni alla diagnosi prenataleEta’ materna > 35 anni
(l'aumento del rischio di aneuploidie cromosomiche correla con l'etàmaterna)
Genitori con precedente figlio affetto da aneuploidia(rischio di ricorrenza circa 1%)
Genitori eterozigoti per anomalie cromosomiche bilanciate(aumento del rischio di concepimenti sbilanciati)
Anamnesi familiare positiva per patologia cromosomica(analisi del cariotipo su sangue del genitore a rischio) Anamnesi familiare positiva per malformazioni congenite
Evidenza ecografica di malformazioni fetali (circa il 20% di questi feti è sbilanciato)
Alterazioni biochimiche nella madre(aumento dei valori di gonadotropina corionica, riduzione dell'alfa-
fetoproteina e dell'estriolo non coniugato predicono nel Triplo-test il 70% delle gravidanze con feto
affetto da trisomia 21; >NT+free-beta hCG+PAPP-A predicono nel Bi-test l’80-85% delle gravidanze con feto affetto da trisomia 18 o 21 )
Malattie mendeliane(analisi del DNA su villi coriali)
•AMNIOCENTESI (16-18 sett.gestazione)
•VILLOCENTESI (11-12 sett.gestazione)
•FUNICOLOCENTESI (18 sett.- termine gravidanza)
Tecniche di diagnosi prenatale
FunicolocentesiFunicolocentesi
Approccio tardivo alla diagnosi prenatale(18 sett.->termine gravidanza)
•Fallimento della coltura dopo amniocentesi
•Mosaicismi presenti nelle cellule del LA
•Mosaicismi confinati alla placenta
•Riscontro ecografico di malformazione fetale
Cariotipo fetale da celluledi liquido amniotico
Materiale esaminato: cellule di liquido amniotico (cellule di desquamazione provenienti da: sacco amniotico, epidermide, mucosa del tubo digerente, del tratto respiratorio e di quello urogenitale).
Metodica d’indagine:•in situ: l’analisi avviene per colonie. Migliore valutazione diagnostica in caso di mosaicismo cromosomico o di contaminazione materna.Tempi di coltura più brevi.•in fiasca: si perde l’individualità dei cloni.Maggiore crescita cellulare.
CariotipoCariotipo fetale da villifetale da villi corialicoriali
Materiale esaminato: cellule del trofoblasto
Metodica d’indagine:•coltura diretta: si analizzano le mitosi spontaneepresenti nel citotrofoblasto, dopo 48-72 ore dal prelievo.Rapidità.Minore rischio di inquinamento da cellule materne.Attività mitotica e qualità delle metafasi inferiori rispetto alla tecnica della coltura.•coltura a lungo termine: le colture vengono allestite previo trattamento dei villi con enzimi proteolitici per disgregare le cellule del cito e del sinciziotrofoblasto.Contaminazione con cellule di origine materna.
Frequenza anomalieFrequenza anomalie cromosomichecromosomiche in in rapporto all’età maternarapporto all’età materna
1/301/2045 anni1/1101/6040 anni1/1461/8139 anni1/3501/17035 anni1/4741/24434 anni1/9001/39030 anni1/1.3501/48025 anni1/1.5301/53020 anni
Trisomia 21Anomalie numeriche
Età materna
Problemi tecnici ed interpretativi Problemi tecnici ed interpretativi collegati alla diagnosi citogenetica collegati alla diagnosi citogenetica
fetalefetale• Fallimento dello sviluppo della coltura cellulare in vitro (<1%)• Crescita in coltura di cellule di origine materna (CCM)
• Mosaicismo cromosomico, pseudomosaicismo (anomalie in vitro oppure derivate da tessuti extraembrionali)
• Riarrangiamenti strutturali
• ESACs (Extra Structurally Abnormal Chromosome) insorti de novo
MosaicismoMosaicismo
Presenza in uno stesso individuo di due o più linee cellulari a cariotipo diverso
•Livello III (mosaicismo vero)•Livello II (pseudomosaicismo a cellule multiple)•Livello I (pseudomosaicismo a singola cellula)
Caratteristiche dei Caratteristiche dei mosaicismimosaicismicromosomicicromosomici
Errori postzigotici
Variabili nel tipoVariabili nei diversi tessuti
Variabili nel tempo
Mosaicismo Mosaicismo XX/XYXX/XY
•Di solito è uno pseudomosaicismo (CCM in gravidanza 46,XY)
•Non documentabile in una gravidanza 46,XX
•Il mosaicismo XX/XY, di III livello si associa di solito ad una femmina 46,XX (linea XY vanishing twin)
•Importante e dirimente l’analisi ecografica dei genitali esterni
Mosaicismo Mosaicismo X/XYX/XY
•In postnatale fenotipo variabile : femmina con fenotipoTurneriano, neonato con genitali ambigui, maschio sterile
•In prenatale, maschi normale
•Monitoraggio ecografico
•Origine placentare della linea 45,X
Trisomia Trisomia 2020
•Di solito è contributo dagli amniociti, ed il feto ha un cariotipo normale
•Raramente il mosaicismo causa difetti
•Rischio di patologia legato alla presenza della linea aneuploide in >60% delle cellule
Mosaicismo Mosaicismo per per isocromosoma autosomicoisocromosoma autosomico
•Raro
•i(12p) associata alla Sindrome di Pallister Killiannon presente nel sangueprognosi grave
•forme molto rare, a prognosi infausta
Riarrangiamenti strutturaliBilanciati: spostamento di parti di un cromosoma
su di un altro o all’interno dello stesso, senza modificare il contenuto genomico dell’individuo (es.:traslocazioni, inversioni).
Frequenza nella popolazione 1:200• familiari ( 1% rischio aggiuntivo di patologia)
• de novo ( 3-5% rischio aggiuntivo di patologia)
Sbilanciati: aumento o perdita di materiale genetico (es.: duplicazioni, delezioni).
Frequenza 1:1000 diagnosi prenatali
Traslocazioni Traslocazioni de novode novo
Difficoltà a definire se il riarrangiamento sia realmente bilanciato
In postnatale la presenza di un fenotipo normale suggericse un’anomalia bilanciata
Frequenza: 1/2.000 amniocentesi; 1/9.000 quelle robertsoniane; 1/10.000 le inversioni
Meccanismi alla base di un effetto fenotipico:• delezione• duplicazione• rottura di un gene• effetto di posizione
Screening rapido delle aneuploidie dei cromosomi
•FISH (Fluorescence in situ Hybridization)Materiale esaminato: amniociti non coltivatiTempi di risposta: 48-72 ore dall’arrivo del campione in laboratorioLimiti diagnostici: valutazione parziale e limitata solo ai cromosomi specificatamente ricercati (cromosomi 21,13,18,X,Y).Limiti di affidabilità:materiale da esaminare scarsomosaicismi molto diluiti
•QF-PCR (Quantitative Fluorescence-PolymeraseChain Reaction)
QFQF--PCRPCREstrazione del DNA da amniociti non coltivati
Analisi dei microsatelliti (cromosomi 13,18,21,X) ed analisi del gene amelogenina in Xp ed Yp mediante PCR
Analisi dei prodotti di PCR per elettroforesi capillare, analisi dei frammenti e calcolo delle aree sottostanti gli amplificati (picchi)
Vantaggi: rapidità, meno laboriosa, automatizzabile, meno costosa
FISHFISH((FluorescenceFluorescence inin situsitu HybridizationHybridization))
• Studio delle traslocazionigenoteche cromosoma specifiche(painting)• Definizione più precisa dei punti di rottura• Individuazione di riarrangiamenti criptici(microdelezioni e/o microduplicazioni, riarrangiamenti subtelomerici)• Precisa definizione sullo status mono o dicentricodelle traslocazioni robertsoniane.• Caratterizzazione di marker sovrannumerari(ESAC)• Identificazione di delezioni causa di sindromi da geni contigui• Origine e struttura dei cromosomi ad anello
ESAC in diagnosi prenataleESAC in diagnosi prenataleFrequenza 1:2500
Importante l’analisi dei genitori(familiare vs de novo)
Mosaicismo vs aneuploidia omogenea
Con satelliti vs senza satelliti
1/3 presentano reperti ecografici patologici(Warburton, Am J Hum Genet 49,995-1013,1991)
Morfologia: ad anello (ring), metacentrico
ESAC FamiliariESAC Familiari
In genere non comportano rischi per il feto
ESAC de novo•I dati sui rischi empirici riflettono difetti di campionamento
•Non sono disponibili follow-up adeguati dei neonati
•Le anomalie diagnosticate sulle gravidanze interrotte riguardano solo idifetti principali
•15% per ESAC non satellitati•11% per ESAC satellitati•Sottoclassificazione con bande C, Ag-NOR, Distamicina A/DAPI, FISH
ESACsESACs in diagnosi prenatale:in diagnosi prenatale:approccio diagnosticoapproccio diagnostico
Caratterizzazione del marcatore contecniche di citogenetica molecolare (FISH)
Prelievo ematico ai genitori per controllo cariotipo
der 14/22 Ish.alfasat.14/22 +
ESACESAC(Extra (Extra Structurally Abnormal ChromosomeStructurally Abnormal Chromosome))
IDENTIFICAZIONE DI RIARRANGIAMENTI DELLE REGIONI SUBTELOMERICHE
LSI 1pter; LSI Xpter/YpterLSI 1qter; LSI Xpter/Ypter CEP X
Dalla citogenetica tradizionale alla CGH-Array
1970 Bandeggio standard
1980 Bandeggio ad alta risoluzione
1990 Citogenetica molecolare (FISH)
2002 Array-CGH (aCGH)