KURS ELKİTABI · 2010-10-08 · Umuyoruz ki bu kitabın yap ve içeriı ği, kurs katılımcılarının (ve diğer tüm okur ve kullanıcıların) kazandıkları becerileri ve edindikleri

EĞİTİM KURSU

GIDA ÖRNEKLERİNDE GENETİĞİ DEĞİŞTİRİLMİŞ ORGANİZMA

ANALİZLERİ

KURS ELKİTABI

Editörler: Maddalena Querci, Marco Jermini ve Guy Van den Eede

Bu yayına elektronik ortamda ulaşmak için: http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm

ISBN 978-92-79-13574-3

Katalog No. LB-X1-06-051-TR-C

Asli Basım 2006

Çeviri 2010

WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION R E EGIONALBÜRO FÜR UROPA

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE

ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО

http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm


EĞİTİM KURSU

GIDA ÖRNEKLERİNDE GENETİĞİ DEĞİŞTİRİLMİŞ ORGANİZMA

ANALİZLERİ

KURS ELKİTABI

Editörler: Maddalena Querci, Marco Jermini ve Guy Van den Eede

Bu yayına elektronik ortamda ulaşmak için: http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm

ISBN 978-92-79-13574-3

Katalog No. LB-X1-06-051-TR-C

Asli Basım 2006

Çeviri 2010

WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION R E




EGIONALBÜRO FÜR UROPA



II

YASAL UYARI Avrupa Komisyonu, yahut Komisyon adına faaliyet gösteren hiç bir şahıs, bu yayından yararlanılması

ve kullanılma biçimi ile ilgili herhangi bir sorumluluk taşımaz.

Avrupa birliği ile ilgili daha ayrıntılı bilgi Internet’de mevcuttur.Europa sunucusu üzerinde aşağıdaki adresten temin edilinebilir

http://www.europa.eu

Luksemburg: Avrupa Birliği Resmi Yayınlar Dairesi

ISBN-978-92-79-13574-3

Avrupa Birliği, 2010

Kaynak göstererek çoğaltılabilir

Italya’da basılmıştır

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri

http://www.europa.eu/

III

EDİTÖRLER Maddalena QUERCI European Commission Joint Research Centre Institute for Health and Consumer Protection Molecular Biology and Genomics Unit Molecular Biology Scientific Area Coordinator E-mail: [email protected] Marco JERMINI Repubblica e Cantone Ticino http://www.ti.ch Dipartimento della sanità e della socialità Divisione della salute pubblica Laboratorio Cantonale - Bellinzona E-mail: [email protected] Guy VAN DEN EEDE European Commission Joint Research Centre Institute for Health and Consumer Protection Molecular Biology and Genomics Unit Head of Unit E-mail: [email protected] Türkçe editör Sadiye Birep AYGÜN European Commission Joint Research Centre Institute for Health and Consumer Protection Molecular Biology and Genomics Unit Applied Molecular Biology Competence Group E-mail: [email protected]


mailto:[email protected]

http://www.ti.ch/




IV

ÇEVİRENLER Remziye YILMAZ, Dr. Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkezi Laboratuvar Moleküler Biyoloji ve Biyoteknolji Ar-Ge Merkezi E-posta: [email protected] Füsun EYİDOĞAN, Dr. Başkent Üniversitesi Eğitim Bilimleri Fakültesi E-posta: [email protected] M. Tufan ÖZ Orta Doğu Teknik Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü E-posta: [email protected] Meral YÜCEL, Dr. Orta Doğu Teknik Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkezi Laboratuvar Moleküler Biyoloji ve Biyoteknolji Ar-Ge Merkezi E-posta: [email protected] Hüseyin Avni ÖKTEM, Dr. Orta Doğu Teknik Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü E-posta: [email protected]







V

Önsöz Avrupa Komisyonu Ortak Araştırma Merkezi (JRC) Sağlık ve Tüketiciyi Koruma

Enstitüsü (IHCP), Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Çevre ve Sağlık Avrupa Merkezi -

Roma Birimi’nin (ECR) Gıda Güvenliği Programı ile birlikte “Gıda Örneklerinde

Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri” üzerine bir dizi eğitim kursu

düzenlemiştir.

Ortak Araştırma Merkezi, üye ülke laboratuvarları ve Avrupa enstitü, organizasyon

ve işletmeleri ile iletişim ve AB Genel Yönetim Kurulu (EU Directorates General) ile

işbirliği içinde AB politikalarına bilimsel ve teknik destek vermektedir. WHO –

ECR’nin görevi çevre ve sağlık alanlarında hem karar verici mercilere, hem de

Avrupa vatandaşlarına tam ve düzenli bir şekilde destek vermektir. Bahsi geçen

eğitim kursları, AB sınırları içinde ve ötesinde, AB 'ne girmeye aday ülkeleri ve geçiş

ekonomisine sahip diğer ülkeleri de göz önünde tutarak, WHO Avrupa Bölgesi’nde

gıda güvenliği ile ilişkili konuların teşvik ve desteklenmesi için iki enstitü arasındaki

işbirliğinin bir parçasıdır.

Bu kurslar kapsamında , kontrol laboratuvarları personeline moleküler tanı

tekniklerine aşinalık kazandırmak, laboratuar tesislerinin ve çalışma programlarının

biyoteknoloji alanında dünya çapındaki düzenleyici yasalara uygun analizleri

içerecek şekilde düzenlenmesi ve uyarlamalar yapılmasına yardımcı olmak

hedeflenmektedir. Kurslar iyi bir analitik bilgi seviyesine sahip fakat bahsi geçen özel

alanda hiç ya da çok az bilgili laboratuvar personeline moleküler tanı tekniklerini

öğretmeye yönelik olarak tasarlanmıştır.

Ortak Araştırma Merkezi, GDO tanımlama ve miktar tayininde eğitim sağlama

konusunda kararlı bir irade ile sağladığı genel eğitim kurslarının yanı sıra geçmişte

olduğu gibi bugun de çeşitli ihtiyaçlar için özel eğitimler de sunmaktadır. Mevcut ve

gelişmekte olan AB yasama sistemine uygunluğa duyulan ihtiyaç ve bunun önemi

nedeniyle GDO tanımlama ve miktar tayini uzerine eğitimler sıklıkla talep

edilmektedir.


VI

Biyoteknoloji ve GDO Birimi ( yenı adı ile Moleküler Biyoloji ve Genomik Birimi), yıllar

boyunca GDO tanımlama, miktar tayini ve ilgili alanlarda derin bir bilgi birikimi

geliştirmiş; tanımlama ve ölçüm için yöntemler geliştirmiş, uyarlamış , geçerliliklerini

onaylamış ve doğrulamıştır.

Bu tekniklere ait bilgi, yayınlar, ortak projeler, özel eğitimler ya da kurslar ile işbirliği

içinde bulunulan laboratuvarlara aktarılmıştır. Teknik detaylar kursiyerlere sözlü

sunumlar ya da kısa yazılı özetler olarak da sağlanmıştır. Kalıcı bilgi kaynağına

duyulan ihtiyacın farkındalığı ile Molekuler Biyoloji ve Genomik birimi çalışanları

laboratuvarlarımızda kullanılan bazı teknikleri içeren bu el kitabını hazırlamışlardır.

Kurslar sırasında ele alınan alanlar şu şekildedir;

- Ham ve işlenmiş materyallerden DNA izolasyonu

- GDO varlığını tespit için gıdaların Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase

Chain Reaction, PCR) ve nested PCR ile taranması

- Eş zamanlı (real-time) PCR ile GDO miktar tayini

- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ile GDO miktar tayini

Bu el kitabı Ortak Araştırma Merkezi (JRC) Sağlık ve Tüketiciyi Koruma Enstitüsü

(IHCP) tarafindan kurs katılımcıları için temel bilgi kaynağı olarak hazırlanmıştır.

Günümüzde kullanılan metot ve yöntemlerle ilgili teorik ve deneysel bilgiyi sağlaması

amaçlanmıştır. Kitabın içeriği GDO tesbit, tanımlama, nitelendirme ve miktar tayini

için kullanılan bir çok tekniği kapsamakta ve GDO belirleme alanında çalışmayı

isteyen herhangi bir kişi için önemli temel bilgi olduğu düşünülen teorik bilgiyi

barındırmaktadır.

Umuyoruz ki bu kitabın yapı ve içeriği, kurs katılımcılarının (ve diğer tüm okur ve

kullanıcıların) kazandıkları becerileri ve edindikleri bilgileri, farklı çalışma ortamları ve

ihtiyaçlar doğrultusunda yayma ve dağıtmalarında yardımcı olacaktır.

Diğer kitap ve bilimsel dergilerde bulunan bilgiler ile herhangi bir biçimde rekabete

girmek hiç bir şekilde niyetimiz değildir. Bu el kitabı alanın uzman eserlerinde varolan

bilgiyi tamamlamayı amaçlamaktadır.


VII

Bilgiyi yayma ve danışmayı hızlandırmak ve kolaylaştırmak için bu yayın

http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm adresinde

mevcuttur.

Bu el kitabının hazırlanmasına katılmış olan Ortak Araştırma Merkezi (JRC)

çalışanları Maddalena Querci tarafından gözetilerek denetlenmiş ve her biri

İçindekiler bölümünde katkıları doğrultusunda anılmıştır.

Bireysel olarak anılmış olmasalar da, bu el kitabının başarı ile hazırlanmasına

katkıda bulunmuş olan tüm Molekuler Biyoloji ve Genomik Birimi çalışanlarına da

burada özel takdir ve teşekkürler sunulmaktadır.

Ayrıca bu el kitabının düzeltme ve yenilenmesinde destek ve işbirlikleri için Sabrina

Miglierina, Elisabeth Dilger, Manuela Zingales, Stephen Langrell ve Steven Price’a

teşekkürler sunulmaktadır.

Maddalena Querci, Dr.

Kurs koordinatörü

Haziran 2004



VIII

Dünya Sağlık Örgütü’nden Giriş Niteliğindeki Görüş ve Açıklamalar

Dünya Sağlık Örgütü (WHO) gıda üretimi ve işlenmesinde modern biyoteknolojinin

güvenli kullanımı ve uygulanmasına büyük öncelik vermektedir. Bu nedenle WHO

90’ların başından beri biyoteknolojik yöntemlerle elde edilen gıdaların güvenliği

konusunda uzman danışmanlığının organizasyonu alanında son derece etkin

olmuştur. Mayıs 2000’de, 53. Dünya Sağlık Toplantısı (53rd World Health Assembly)

WHO’nun, genetiği değiştirilmiş gıdalar ile ilgili sağlık konulu kararlarda, üye ülkelere

bilimsel temeller sağlama biçiminde destek olmasına karar vermiştir. Buna ek olarak

WHO Yönetim Kurulu ilgili konuların diğer kuruluşlarla işbirliği içinde araştırılması ve

çözümlenmesini öngörmüştür.

Codex Gıda Heyeti (Codex Alimentarius Commission, CAC) gıdalar konusunda

uluslararası standartların oluşturulması için kurulmuş devletlerarası bir

organizasyondur. Heyetin temel amacı tüketici sağlığını korumak ve gıda ticaretinde

doğru ve adil uygulamaları garanti etmektir. WHO, 1963’te kuruluşundan itibaren

Codex Heyetinin üst kuruluşlarından birisi olmuştur. WHO ve kardeş organizasyonu

BM (Birleşmiş Milletler, UN) Gıda ve Tarım Örgütü (FAO), Codex sistemi içerisinde

yer alan Codex Biyoteknoloji ile Üretilen Gıdalar Çalışma Kolu (Ad Hoc

Intergovernmental Codex Task Force on Foods Derived from Biotechnology), Codex

Gıda Etiketleme Komisyonu (Codex Committee on Food Labeling) ve Codex Analiz

Metotları ve Örneklendirme Komisyonu (Codex Committee for Methods of Analysis

and Sampling) ile çalışmaktadır.

Avrupa’daki WHO Gıda Güvenliği Programı, 2000 yılından itibaren gıdalarda

Genetiği Değiştirilmiş Organizma (GDO) saptama teknikleri üzerine eğitim kursları

düzenlenmesinde Avrupa Komisyonu Ortak Araştırma Merkezi (JRC) ile işbirliği

içinde olmuştur. Bu kursların amacı gıda kontrol laboratuvarı çalışanları için analitik

biyoteknoloji yöntem ve becerileri sağlamak ve Avrupa ve dünyada GDO saptama

için doğrulanmış ve onaylanmış yöntemlerin kullanılmasını teşvik etmek olmuştur.

Analiz ve örneklendirme için uygun metodlar, gıdaların doğru etiketlendirilmesi yolu

ile üretim süreçlerinde şeffaflığın arttırılması ve izlenebilirliğin hızlandırılması ve


http://http//www.codexalimentarius.net/

IX

boylelikle gıda güvenliği sistemlerinin kuvvetlendirilmesine katkıda bulunması

açısından esas ve temeldir. Bahsi geçen yöntemlere geniş çaplı erişim imkanı

vermek için JRC/WHO ortak eğitim kurslarında kullanılan eğitsel el kitabının sanal

ortamda (internet ortamında) yayınlanmasına karar verilmiştir. Bu kitapta sunulan

yöntemler Codex Analiz Metodları ve Örneklendirme Komisyonu tarafından dikkate

alınan yöntemler ile uyum içindedir.

Avrupa WHO Gıda Güvenliği Programı, GDO’lar konusunda dünya çapında tanınmış

bilimsel bir enstitü olan Avrupa Komisyonu Ortak Araştırma Merkezi (JRC) ile

işbirliğinin öneminin farkındadır ve gıdalarda GDO saptama yöntemleri alanında

kapasite arttırmaya yönelik etkinlikleri Avrupa ve diğer bölgelerde desteklemeye

devam edecektir.

Cristina Tirado, V.Dr., Dr.

Avrupa WHO Besin Güvenliği Programı Bölgesel Danışmanı


X

ÇEVİREN ÖNSÖZÜ

Günümüzde Genetiği Değiştirilmiş Organizma (GDO) kavramı bilim insanlarının yanı

sıra toplumun da sıklıkla kullandığı ve sorguladığı bir kavram olmuştur. Bu nedenle

GDO’ların belirlenmesi ve bu amaçla kullanılan analiz yöntemleri giderek artan bir

önem taşımaktadır. Türkiye’nin bu konudaki resmi politikası olası beklenmeyen

etkilere karşı biyolojik çeşitlilik, insan ve hayvan sağlığının korunmasının temel ilke

olmasını benimsemekle birlikte ulusal gereksinimler doğrultusunda şimdi ve gelecek

için modern biyoteknoloji ve elde edilen ürünlerden yararlanılması olarak resmi

otoriteler tarafından açıklanmıştır(?). Bu nedenle, ülkemizde bu konu ile ilgili yasal

düzenlemelerin oluşturulması ve yayımlanması süreci devam etmekle beraber,

analiz yöntemleri konusunda doğru ve anlaşılır bilgiye ulaşılması büyük önem

taşımaktadır. GDO’ların belirlenmesi konusunda altyapı imkanlarının iyileştirilmesi ve

Türkçe kaynak ihtiyacının giderilmesi öncelikle ele alınması gereken hususların

başında gelmektedir. Konuya olan ilgiyi arttırabilme ve ülkemizde GDO tayini

yapacak araştırmacılara ve resmi laboratuvarlara referans oluşturabilmek için bu

kaynağın Türkçe’ye çevrilmesinin faydalı olacağı düşünülmüştür.

Bu kitap, Avrupa Komisyonu Ortak Araştırma Merkezi (JRC) Sağlık ve Tüketiciyi

Koruma Enstitüsü (IHCP) ile Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Çevre ve Sağlık Avrupa

Merkezi Roma Birimi’nin (ECR) Gıda güvenliği Programı tarafından birlikte

düzenlenen “Gıda örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri” konulu

Çalıştay’da yapılan çalışmaları içermektedir. El kitabının içeriğinde, Genetiği

Değiştirilmiş Organizmalar, AB Kanunları Hakkında Genel Bilgi, DNA Ekstraksiyonu

ve Saflaştırılması, Agaroz Jel Elektroforezi, PCR ve ELISA teknikleri, GDO’ların nitel

ve nicel belirlenmesi ile ilgili bilgilerin yanısıra MON810 mısır, Bt-176 mısır ve

Roundup Ready Soya gibi transgenik hatlar ile ilgili örnek çalışmalar ve AB’de kabul

görmüş ve uygulanmakta olan standart protokoller bulunmaktadır.

Kitabın çevirisi sırasında hataları önlemek için gerekli özeni fazlası ile göstermiş

olmamıza rağmen çeviri çalışmalarının zorluğundan kaynaklanan çeşitli

hatalarımızın olabileceğini biliyoruz. Siz değerli kullanıcıların sözkonusu hataları fark

ettikçe tarafımıza bildirmeleri bu Türkçe kaynağın güncelleştirilmesi çalışmalarında

bizlere destak sağlayacaktır.


XI

Kitabın Türkçe olarak çevrilmesine gönüllü olduğumuzu bildirdikten sonra her

aşamada bizi manevi olarak destekleyen ve yayınlanmasını sağlayan Sayın

Maddalena Querci ve Sayın Guy Van den Eede ve onların nezdinde JRC IHCP

Moleküler Biyoloji ve Genombilim Ünitesi’ne teşekkür ederiz.

Kitabın ülkemizde bitki biyoteknolojisinin gelişmesine ve GDO’ların bilimsel bir

platformda değerlendirilmesine katkı sağlaması dileklerimizle.



XII

Eğitim Kursu

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma

Analizleri

KURS ELKİTABI

İÇİNDEKİLER

Bölüm Başlık Yazarlar

1 Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar, AB Kanunları Hakkında Genel Bilgi

M. Querci, G. Van den Eede, M. Jermini

2 El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri

M. Querci

3 Kurs Sırasında Kullanılan Örnekler

M. Querci, N. Foti

4 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

M. Somma

5 Agaroz Jel Elektroforezi

M. Somma, M. Querci

6 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

M. Somma, M. Querci

7 MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri

M. Querci, M. Mazzara

8 El kitabında tanımlanan Nitel PCR sistemlerinin Özellikleri


9 MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya’nın PCR ile Nitel Saptanması

M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara

10 GDO’ların Saptanması için Nicel PCR

F. Weighardt

11 Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real-Time) PCR ile Nicel Saptanması

N. Foti

12

Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanması

F. Eyquem

Ek

Çalışma Programı Örneği

M. Querci


Bölüm 1

Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar, AB Kanunları Hakkında Genel Bilgi

M. Querci, G. Van den Eede, M. Jermini






Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar, AB Kanunları Hakkında Genel Bilgi 2

İçindekiler

Bölüm 1

Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar, AB Kanunları Hakkında Genel Bilgi

Giriş 3

Bitkilerde genetik mühendisliği 4

AB Kanunları 5

Modern biyoteknoloji yaklaşımı ile üretilen gıdaların güvenlik ve etiketlendirilmesi - WHO

yaklaşımı 13

EK-1. GDO’ların pazarda yer alması ile ilgili belli kontrol programları ve ilgili etiketlendirmeyi

de içeren AB mevzuatı 17

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 1


Giriş

Dünyada belli bolgelerde yetistirilen genetiği değiştirilmiş tahıl hatları dışında, günümüzde

ekilmekte olan bütün tahıl ürünleri, zararlı hayvanlara direnç sağlamak veya daha önceki

yabani hallerinden daha kaliteli ya da farklı ürün üretebilmek için yoğun biçimde ıslah

edilerek geliştirilmistir. İnsanların kullanımı için bitkilerin ilk ıslahından beri süregelen bu tip

değişiklikler,ayni türün uzun süreler boyunca iç çaprazlanmasi yahut aralarında üreme

bariyeri bulunmayan yakın türler arasi istenen özelliklerin (genlerin) aktarımını veya değiş

tokusunu içerir. Son yıllarda, sadece doğal olarak gen çaprazlaması mümkün olan yakın

türlerde değil doğada çaprazlanmaya karşı steril olan türlerde de gen değişimi yapmak

mümkün olmuştur. Bu amaçla kullanılan tekniklerden bazıları embriyo-kurtarma metodları, in

vitro – in vivo embryo kültürü, yumurta ve yumurtalık kültürleri, in vitro tozlaşma ve in vitro

fertilizasyondur. Buna ek olarak, mutasyonel değişiklikler, örneğin tohumların radyasyona

maruz bırakılması gibi yollarla da elde edilebilir.

Geleneksel hibridizasyon ve seçme prosedürlerinin bir takım zorlukları mevcuttur. Bunların

başında, ıslahçıların bütün bir genomu transfer ederek çaprazlamak yerine seçilmiş tek

özelliği transfer etmek istemesi gelmektedir. Ayrıca genetik olarak sabit çeşitlerin seçilimi ve

ayrımı çok yavaş bir işlemdir.

Bu tarz engellerin rekombinant DNA ve transformasyon teknolojileri kullanılarak aşılabileceği

görülmektedir. Genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO) terimi, genetik materyali doğada

çaprazlama veya doğal rekombinasyon yolları dışında değişikliğe uğramış organizmaları

tanımlamak için kullanılmaktadır. GDO, kendi başına çoğalıp genetik materyalini transfer

edebilen biyolojik bir sistem olmalıdır.

Tahıllara uygulandığında bu terim, farklı türlerden gen ya da genlerin genetik mühendisliği

yöntemleri ile alıcı genomuna kalıcı olarak aktarıldığı ve birçok durumda aktarılan genlerin

protein sentezlediği bitkileri ifade eder. Birbiri ile ilişiksiz türler arasında gen aktarımı ve

onlardan fonksiyon elde etme işlemi genetik transformasyon olarak tanımlanır.

Avrupada deneysel amacli salınım bildirimleri incelendiginde en sık test edilen özelliklerin

herbisit toleransı, erkek sterilite/fertilite yenilemesi, Bt-kaynaklı böcek direnci, virüs direnci,

mantar direnci, ve nişasta biyosentezinin değişikliği olduğu görülmektedir (daha detaylı bilgi

için http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/).


http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/


Bitkilerde genetik mühendisliği

Bitki transformasyonu konusunda pek çok farklı yaklaşım olmakla birlikte, bitkilerde genetik

modifikasyon sağlamak için kullanılan için bir kac temel yöntem vardır. Bu teknolojilerden en

eskisi, 1980’lerde geliştirilmiş olup ilgilenilen genin alıcı bitkiye aktarılmasında bir bakteri

türünü (Agrobacterium tumefaciens) kullanmaktadır.

Agrobakter, 20. yüzyıl başlarından beri bilinen ve bitkilerde crown gall hastalığına sebep olan

bir mikro organizmadır. Doğada Agrobacterium tumefaciens, tümör oluşumuna sebep olan

(Ti) plazmidinden belirli bir DNA parçasını (T-DNA) enfekte olan hücrenin çekirdeğine

aktararak alıcı genomuna kalıcı olarak entegre olup eşlenmesi ile tümör oluşturma

yeteneğine sahiptir. Aktarılan bu T-DNA parçasının her iki yanında transfer için cis element

sinyali olarak görev yapan 25 baz dizilik (bp) tekrarlar yer alır.

Bilim adamları, T-DNA sınırları arasına yerleştirilmiş herhangi bir yabancı DNA’nın bitki

hücrelerine transfer edilebilmesi avantajını kullanarak, normalde yer alan hastalığa sebep

olan genleri, aktarımı istenen özel DNA dizisi ile değiştirerek modifiye Agrobakter suşları

geliştirmislerdir.

Bitki biliminin gelişimiyle birlikte, Agrobakter yoluyla bitki hücrelerine gen transferinin

anlaşılması hakkında önemli gelişmeler kaydedilmiştir. Ancak doğada Agrobakter yalnızca

çift çenekli bitkileri enfekte etmektedir. Bu nedenle tahılları (tek çenekli) da içine alan

ekonomik önemi olan bitki uzun süre genetik manipulasyona ile erişilmez olarak kalmıştır.

Bunun için, polietilen glikol-yoluyla transfer, mikroenjeksiyon, protoplast ve sağlam hücre

elektroporasyonu ve gen silahı (gen bombardımanı) teknolojisi gibi alternatif direkt transfer

metodları geliştirilmiştir.

Ancak Agrobakter yoluyla gen transferinin direk gen transferi yöntemlerine göre önemli

avantajları vardır. Transgenin kopya sayısını azaltarak transgenin ko-supresyonu ve sabit

(kalıcı) olmaması ile ilgili problemleri azaltır. Her iki durumda da, hücreler (Agrobakterle

enfekte olanlar veya biolistik uygulananlar) yeni geni veya genleri taşıyan bitkilere rejenere

olurlar. Bu bitkiler test edilir, yogun bicimde cogaltilir ve nihayetinde , yeni nesil genetiği

değiştirilmiş bitki hatlarinin eldesi için tohum sağlar.




AB Kanunları 1,2

Genetik olarak değiştirilmiş organizmaların kullanımı – çevreye salınımı, ekimi, ithalatı ve

özellikle gıda ve gıda katkısı olarak kullanımı – Avrupa Birliği icinde titizlikle uygulanan bir

dizi işlemle düzenlenmiştir.

İlk hukuksal birlik dayanağı (Konsey Direktifi 90/220/EEC ve Konsey Direktifi 90/219/EEC)

1990’da insan ve hayvan sağlığını ve çevreyi korumak özel amacı ile oluşturulmuştur.

Günümüzde temel hukuksal birlik dayanağı, Avrupa Birliği içinde biyoteknoloji ile ilgili yatay

kanuni çerçeve olarak kabul gören ve GDO’ların onceden tasarlanmış olarak çevreye

salınımını da içeren Avrupa parlementosunun ve Konseyinin 12 Mart 2001 tarihli

2001/18/EC Direktifidir.

Konsey Direktifi 2001/18/EC, Konsey Direktifi 90/220/EEC’yi fesh ederek GDO’ların

çevreye salınımı ile ilgili daha önceki kuralları kuvvetlendirmekte ve bu kapsamda çevresel

risk değerlendirme prensipleri, pazara salınımından sonraki zorunlu (cevresel) gözlemleme,

halkın bilgilendirilmesi zorunlulugu, pazara salınım için bütün safhaların etiketleme ve

izlenebilirliği zorunlulugu ve moleküler kayıt envanterlerinin oluşturulması konularında yeni

prensipler getirmektedir.

Direktif 2001/18/EC , Konsey Direktifi 90/220/EEC altında varolan muvafakatnamelerin

uygunsuzluklardan kaçınmak için 2001/18/EC Direktifinin koşulları göz önünde tutularak

yenilenmesini gerektirmektedir.Muvafakat yayınlandığı günden itibaren 10 yıl süre için

geçerlidir. GDO yahut GDO içeren bir ürünün pazarda yer almasının ardından, muvafakat

basvurusunu yapmis olan taraf ( bildiren) muvafakat koşulları çerçevesinde pazara salınım

sonrası izleme ve raporlama ile mükelleftir.

Ulusal kanunlar kapsamında her üye ülkede uygulanan Direktif 2001/18/EC, hem küçük

ölçekli tarla denemeleri (deneysel amaçlar için gönüllü salınımlar, direktiftin B bölümü) hem

de GDO’ların pazarlama koşulları (direktifin C bölümü) ile ilgilidir. Tablo 1’de gösterildiği gibi

daha önceki 90/220/EEC prosedürü kapsaminda onay almış18 GDO bulunmaktadır(15’i bitki

kökenli, 3 tanesi icin üye ülkeler muvafakatı). Bu güne dek Direktif 2001/18/EC kapsamında

GDO’ların pazarda yer alması ile ilgili 25’den fazla muvafakiyet başvurusu yapılmıştır

(Dosyaların son durumu için http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/). 1 EK-1’de GDO’lar ile ilgili AB düzenlemelerinin detaylı olmayan tam listesine bakınız. 2 09.06.2004 statüsü

http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/


Tablo 1. 90/220/EEC Direktifi altında AB’de pazarlanması onaylanan genetik olarak

değiştirilmiş organizmalar

Ürün Hat Tebliğ eden

Bildirilen ana özellik Komisyon kararı Sayı / Tarih

Karanfil Florigene Değiştirilmiş çiçek rengi

20.10.98 MS muvafakat

Karanfil Florigene Değiştirilmiş çiçek ömrü

20.10.98 MS muvafakat

Karanfil Florigene Değiştirilmiş çiçek rengi

01/12.97 MS muvafakat

Mısır Zea mays L. MON810

Monsanto BtcryIA(b) geninin ifadesi

98/294/EC 22 Nisan 1998

Mısır* Zea mays L. Novartis Glufosinat amonyuma tolerans ve BtcryIA(b) geninin ifadesi

98/292/EC 22 Nisan 1998

Mısır Zea mays L. Hat T25

AgrEvo Glufosinat amonyuma tolerans

98/293/EC 22 Nisan 1998

İlkbahar Swede Kolza

Brassica napus L. ssp oleifera

AgrEvo Glufosinat amonyuma tolerans

98/291/EC 22 Nisan 1998

Swede Kolza

Brassica napus L. oliefera metzg, MS1, RF1

Plant Genetic Systems

Glufosinat amonyuma tolerans

97/393/EC 6,6,1997

Swede Kolza

Brassica napus L. oliefera metzg, MS1, RF2

Plant Genetic Systems


97/392/EC 6.6.1997

Mısır Zea mays L. Hat Bt176

CibaGeigy Glufosinat amonyuma tolerans

97/98/EC 23.1.1997

Steril erkek hindiba**

Cicharium intybus L.

Bejo-Zaden BV


96/424/EC 20.5.1996

Soya Fasülyesi*

Glycine Max L. Monsanto Glifosinata tolerans 96/281/EC 3 Nisan 1996

Swede Kolza

Brassica napus. L. oliefera Metzg. MS1BnxRF1Bn

Plant genetic Systems


96/158/EC 6.2.96

Tütün TB100x çeşit SETTA Bromoxynil toleransı 94/385/EC 8.6.94

*Avrupa Birliğinde ekimi onaylanmamıştır.

**Yanlızca tohum üretimi içindir.



‘Kardeş’ bir direktif genetiği değiştirilmiş mikroorganizmaların kapalı kullanımını kontrol eder

(26 Kasım 1998 tarihli 98/81/EC Konsey Direktifi, daha önce Konsey Direktifi 90/219/EEC ile

düzenlenen genetiği değiştirilmiş mikroorganizmaların kapalı kullanımına tashih).

Yukarıda bahsedilen direktiflere ek olarak, insan tüketimi için hedeflenen GDO’ların güvenli

kullanımı ve onayı ile ilgilenen bir dizi yatay hukuki dayanak yıllar boyunca uygulanmış ve

detaylandırılmıştır. Yakin bir zamana dek birlik içinde pazara yeni gıda ve yeni gıda

içeriklerinin sunulmasi, dikey kanuni çerçeve ile düzenlenmiştir. 258/97 nolu kanun (AB)

özellikle aşağıdaki durumlarda uygulanır:

-90/220/EEC Direktifi içinde GDO içeren yahut GDO olan gıda ve gıda içerikleri

-GDO’lardan üretilen fakat GDO içermeyen gıda ve gıda içerikleri

-Yeni ve-veya primer molekül yapısı ozellikle değiştirilmiş gıda ve gıda içerikleri

-Bakteri, mantar veya alg’den izole edilmiş ya da bunları içeren gıda ve gıda içerikleri

-Güvenilir gıda kullanımına sahip ve geleneksel ıslah veya üretim yöntemleri ile elde edilmiş

gıda ve gıda içerikleri dışında, hayvanlardan izole edilen gıda içerikleri ve bitkilerden izole

edilen gıda ve gıda içerikleri

-Gıdanın besin değeri, metabolizması veya istenmeyen maddelerin seviyesini etkileyebilecek

şekilde gıda ve gıda içeriklerinin yapısında önemli değişiklikler yaratabilecek bicimde, yaygın

olarak kullanılamayan yahut yeni üretim işlemleri uygulanmış gıda ve gıda içerikleri

Genetiği değiştirilmiş gıdaların etiketlenmesindeki özel konular birden fazla yasal dayanak ile

ele alınmıştır. Etiketleme ihtiyaçlarına ilk olarak 258/97(EC) kanununda (Orijinal Gıda

Kanunu) değinilmiştir. Fakat bazi GM mısır ve soya hatları ozel olarak Konsey Direktifi

1139/98(EC) ile etiketlendirilmişlerdir.

Esasında bu iki GDO (Roundup Ready® soya ve Maximizer Mısır), 258/97(EC)

düzenlemesinden önce pazarda yer almış olup, bu GDO’lar için özel etiketleme

düzenlemesi sonradan 1139/98 Konsey Direktifi ile yapılmıştır.

258/97 Direktifi, gıda içeriği veya varolan gıdanın eşdeğeri olmayan gıda içeriği ya da yeni

gıda haline gelen besinlerin yaygın kullanımı veya besin değeri ya da içeriğinde değişiklik

yapılan gıdalardaki herhangi bir farklılığın son kullanıcı tarafından bilinmesini sağlamak

amacı ile geliştirişmiştir. Günümüzde, genetiği değiştirilmiş vakalardan üretilen 17 gıda ürünü

onaylanmış ve Avrupa Birliğinde resmi olarak satışa sunulabilmektedir (Tablo 2). Bunlardan

bir GD Soya ve bir GD Mısır, Orijinal Gıda Yasası zorunlu olmadan önce 90/220/EC direktifi

çerçevesinde onay almıştır. Diğerleri (7 GD Kolza ve 5 GD Mısır’dan türetilen işlenmiş gida



ve 2 GD Pamuk tohumundan üretilen yağ) Orijinal Gıda Direktifine uygun olarak tebliğ

edilmiş ve sadelestirilmiş prosedür ile onaylanmıstir.

1139/98 Konsey Direktifi, herhangi bir genetiği değiştirilmiş gıda veya gıda içeriğinde

genetik modifikasyon sonucu ortaya çıkan DNA veya protein belirlenebilir ise, bu ürünün

GDO olmayan eşdeğeri ile eşit kabul edilmediği prensibine dayanır. Katkı maddeleri,

Komisyon Direktifi 50/2000 devreye girene dek etiketleme düzenlemesi dışında

değerlendirilmiştir.

1139/98 Direktifi, 10 Ocak 2000 tarihli Komisyon düzenlemesi (EC) 49/2000 ile tashih

edilerek eşik kavramı tanımı getirilmiştir. Kasıtsız kontaminasyon probleminin üstesinden

gelmek icin konulan “eşik düzenlemesi” ile kanun iyileştirilmiştir. Bu yasa, gıda içeriğinde

GDO’dan elde edilen materyaller bulunan gıda ürünlerinde, her bir ayrı materyal için

%1’den fazla olmayacak oranda GDO taşıyan gıdalar için ek etiketleme zorunluluğu

olmadığını taahhüt eder.

Buna ek olarak, bu materyalin varlığının tesadüfi olduğunun ispatı için operatörler, GDO

kullanımından kaçınmak için gerekli tedbirlerin uygulandığının kanıtını sağlamak zorundadır.

GDO’lar ile ilgili çeşitli kullanıcı birliklerinin farklı ve çakışan görüşlere sahip olmasi, süreç

boyunca yayınlanan yasal dayanakların yorumlanması ve uygulanmasındakı sıkıntılar,

diğerlerinin yanında genetiği değiştirilmiş yemler icin özel bir AB düzenlemesinin olmaması

gibi sebepler bu konuda birleştirilmis, güncellenmiş ve bütünsel yasal dayanaklara olan

ihtiyaca dikkat çekmiştir.

Sonuç olarak Ekim 2003’de daha önceki yasal dokümanları iptal edip iyileştiren ve daha açık

bilgi veren iki yeni düzenleme yayımlanmıştır.




Tablo 2. Avrupa Birliğinde onaylanan genetiği değiştirilmiş (GD) gıdalar3

3 Kaynak Avrupa Komisyonu (http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm.- accessed January 2010) Haziran 2004

Vaka Tahıl Başvuran Özellik Potansiyel gıda kullanımı

Tarih Kanuni dayanak

1 GTS40/3/2 Soya Monsanto Böcek koruma ve herbisit dayanıklılığı

Soya gıdaları, soya içecekleri, tofu, soya yağı, soya unu, lesitin

03.04.1996 Dir. 90/220/EEC Madde 13

2 Bt 176 Mısır Ciba-Geigy Böcek koruma ve herbisit dayanıklılığı

Mısır gıdaları, tane içeren mısır gıdaları,mısır unu, şeker, şurup

23.01.1997 Dir. 90/220/EEC Madde 13

3 TOPAS 19/2 Kolza AgrEvo Herbisit toleransı

24.06.1997 Reg(EC) 258/97 madde 5

4 MS/1/RF2 Kolza Plant Genetic Systems

Herbisit toleransı

24.06.1997 Reg(EC) 258/97 madde 5

5 MS1/RF1 Kolza Plant Genetic Systems

Herbisit toleransı

24.06.1997 Reg(EC) 258/97 madde 5

6 GT73 Kolza Monsanto Herbisit toleransı

Kolza tohumu yağı, kolza yağında yapılan kızartmalar, aperatifler

21.11.1997 Reg(EC) 258/97 madde 5

7 MON810 Mısır Monsanto Böcek direnci 06.02.1998 Reg(EC) 258/97 madde 5

8 T25 Mısır Agr/Evo Herbisit toleransı

06.02.1998 Reg(EC) 258/97 madde 5

9 Bt11 Mısır Novartis Böcek direnci 06.02.1998 Reg(EC) 258/97 madde 5

10 MON809 Mısır Pioneer Böcek direnci

Mısır türevleri, mısır yağı, mısır unu, şeker ve şurup, mısırdan yapılan aperatifler, fırınlanmış ya da kızartılmış gıdalar, şekerlemeler.

23.10.1998 Reg(EC) 258/97 madde 5

11 Falcon GS 40/90

Kolza Hoechst / AgrEvo

Herbisit toleransı

08.11.1999 Reg(EC) 258/97 madde 5

12 Liberator L62 Kolza Hoechst / AgrEvo

Herbisit toleransı

08.11.1999 Reg(EC) 258/97 madde 5

13 MS8/RF3 Kolza Plant Genetic Systems

Herbisit toleransı

Kolza tohumu yağı, kolza yağında yapılan kızartmalar, aperatifler

26.04.2000 Reg(EC) 258/97 madde 5

14 1445 Pamuk Monsanto Herbisit toleransı

19.12.2002 Reg(EC) 258/97 madde 5

15 531 Pamuk Monsanto Böcek direnci

Pamuk yağı, pamuk yağından yapılan kızartmalar, aperatifler 19.12.2002 Reg(EC) 258/97

madde 5

16 pRF69/pRF93 Bacillus subtilis

F.Hoffmann - La Roche

Riboflavin Vitamin B2 23.03.2000 Reg(EC) 258/97 madde 5

17 Bt11 Mısır Syngenta Böcek direnci Tatlı mısır 19.05.2004 Reg(EC) 258/97 madde 5

http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm.-


Bu iki yeni düzenleme; genetiği değiştirilmiş gıda ve yem hakkında 22 Eylül 2003 tarihli

Konsey Avrupa Birliği Direktif (EC) 1829/2003 ve izlenebilirlik ve etiketleme ve GDO’lardan

üretilen gıda ve yem ürünlerinin izlenebilirliği ve iyileştirilen Direktif 2001/18/EC ile ilgili 22

Eylül 2003 tarihli Konsey Avrupa Birliği Direktifi 1830/2003’ tür.

1829/2003 (EC) Kanunda, güvenlik değerlendirmesi ile ilgili kurallar kuvvetlendirilmiş ve

genişletilmistir. Bu kanun, ilk defa GD yem ile ilgili özel kuralları belirler ve bugüne kadar

1139/98 ve 49/2000 (EC) komisyon düzenlemesinin içinde kapsanan GD gıda ve GD yem

için etiketleme ihtiyaçlarını kapsar.

Temel özellik olarak bu kanun “bir anahtar – bir kapı” yaklaşımını taşır. Tek bir yetki, hem

gıda hem de yem kullanımını kapsar. Böylece yem ürünlerinin “eşdeğerlik” kavramına dayalı

basitleştirilmiş prosedürü terk edilirken, yem ürünlerinin onayı durumunda ortaya çıkan yasal

boşluğu doldurur.

1829/2003 EC Kanunu altında (18 Nisan 2004’den itibaren zorunlu) onay için başvuran kişi-

kurum, sorgulama altındaki vaka için bir tayin metodunu da içeren tam bir dosya sunmalıdır.

Dosya ve özellikle çevre ve gıda güvenliği risk değerlendirme bölümleri Avrupa Gıda

Güvenlik otoritesi tarafından değerlendirilir (28 Ocak 2002 tarihli Konsey ve Avrupa

parlamentosu 178/2002 Kanunu). Aday tarafından sunulan tayin yöntemleri AB Referans

Laboratuarları (1829/2003 Kanunu ile kurulan) tarafından değerlendirilir ve onaylanır.

Kanunda etiketlendirme için minimal seviye belirlenmiştir. 49/2000 Komisyon Düzenlemesi

kapsamında , resmi onayı bulunan bir GDO’nun tesadüfi varliği için belirlenen %1 sınır

seviyesi %0,9’a düşürülmüştür. Buna ek olarak, onaylanmamış GDO’ların tesadüfi

varlığında, ilgili bilimsel kurul(lar)ın olumlu görüş belirtmesi durumunda %0,5 sınır seviyesi,

geçici kural olarak belirlenmiştir.

AB, bilgilendirme ve etiketlemeyi, tüketicilerin bilgili tercih yapması için bir araç olarak

tanımlar. 1997’den itibaren bir ürünün GDO olduğu veya ürün içinde GDO varlığının

etiketlendirilme ile belirtilmesi zorunludur.

1830/2003 (EC) Kanunu GDO gıdaların şu anki etiketlendirme kurallarını sağlamlaştırır.

Zorunlu etiketlendirme bütün gıda ve yemlerde, tayin edilebilirliğe bakılmaksızın genişletilmiş

ve izlenebilirlik tanımı, pazarda yer alan GDO, GDO’dan türetilen ve/veya GDO içeren tüm

ürünlerin üretim ve dağıtım zincirleri boyunca her aşamada izlenebilirliği olarak yeniden

düzenlenmiştir.



Dolayısıyla artık gıdalardaki GDO varlığını tayin eden yöntemlerin yanı sıra,her bir ozel GDO

vakasını tespit edebilen ve değişik gıda ve yem içeriklerindeki GDO miktarını belirleyen

yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır.

Gıda ürünlerinde nitel analiz, herhangi bir ürünün yahut içeriğinin GDO olup olmadığını tespit

için tarama amaçlı olarak uygulanabilir. Bu testler ile ürün muhteviyatında GDO’ya ait (DNA

ve/veya protein) varlığı tayin edilir. Bu analizler süpermarket raflarındaki ürünler, tedarikçi

stokları yahut satış zinciri boyunca herhangi bir noktada gerçekleştirilebilir.

Eğer nitel analiz GDO varlığını işaret ediyorsa, etiketleme zorunluluğu kapsamında karar

verilebilmesi için nicel testler yapılır.

Daha önce bahsedildiği gibi yasama işleminin yeni iç elemanı: Birlik Referans Laboratuarı

(European Union Reference Laboratory, EURL) resmi olarak sisteme girer. 1829/2003 (EC)

Kanun şartlarında Avrupa GDO laboratuarı ağı tarafından desteklenen Ortak Araştırma

Merkezi JRC (Joint Research Center) Gıda ve Yem’de Birlik Referans Laboratuarı (EURL)

olarak tayin edilmiştir (http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/). Bu laboratuarlar ihtilaf durumunda

teknik ve bilimsel yardım sağlamak ve mevzuat muvafakatı amacını sağlayacak analitik

yöntemleri değerlendirme ve onaylama vekaletine sahiptir.

Yasanın temel içeriği, hassas ve sağlıklı analiz yöntemleri bulunmasını gerektirmektedir. Bu

durum, AB’deki bütün GDO yürürlülük ve kontrol laboratuarlarında, analitik prosedür ve

performansları harmonize eden ve standart yaklaşımı garanti altına alan bilimsel araştırma

aktivitelerini gerektirir.

AB kontrol laboratuar prosedür ve performanslarının standartizasyonu ve harmonizasyonu,

JRC tarafindan bundan bir kaç sene önce kontrol mevzuatının herhangi bir aşamasının

başarısı için olmazsa olmaz olarak işaret edilmiştir.

JRC Sağlık ve Tüketici Koruma Enstitüsünün Molekuler Biyoloji ve Genomik Birimi, 1999’dan

beri GDO’lar ile ilgili konularda çalışan yetkili kontrol laboratuarlari arasinda zorunlu bir ağ

oluşturulmasını önermiş ve halihazırda da desteklemektedir.

Aralık 2002’den beri Avrupa Birliğinde resmi olarak GDO laboratuarları için zorunlu bir ağ

bulunmaktadır. Bu ağ ENGL (European Network of GMO Laboratories

http://engl.jrc.ec.europa.eu/) olarak adlandırılmıştır ve Avrupa Komisyonu (DG Joint


http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/

http://engl.jrc.ec.europa.eu/


Research centre – JRC) tarafından koordine edilmekte ve AB uyesi tum ulkelerin yani sira

Isvicre ve Norvec de dahil olmak uzere kontrol laboratuarlarını temsil eden yaklaşık 100

laboratuarı içine almaktadır. Bu ağ için başkanlık ve genel sekreterlik görevleri JRC Sağlık

ve Tüketici Koruma Enstitüsünün bir birimi olan “Molekuler Biyoloji ve Genomik Birimi”nin

sorumluluğu altındadır. Amaç, GDO’ların – çevre örnekleri, gıda, yem ve tohumda –

örnekleme, tanı, belirleme ve ölçümü konularında uzmanlaşmış birimler için ortak bir

platform yaratmak ve böylelikle

Nitel ve nicel analizler için yöntem geliştirilmesi

Moleküler biyoloji teknoloji transferi ve kapasite geliştirimi

Var olan GDO miktarlarının tespiti veya çeşitli ortamlarda GDO taraması ve

varlığının tayini için uygun yöntemlerin yeterlilik ve geçerliliğinin sağlanması

Referans materyaller (Bu çalışma paketi için sorumluluk JRC Referans materyaller

ve Ölçümler Enstitüsünde bulunmaktadır.)

Farklı GDO hammaddeleri için örnekleme stratejileri ve prosedürleri (tohumlar,

tahıllar, ham materyal, son tüketici ürünleri, vb.)

Moleküler verileri içeren veritabanlarının kurulması ve GDO'ların birim

tanımlaması için ihtiyaçlar ve veritabanı ve biyoinformatik yaklaşımları

gibi alanlarda ihtiyaçların belirlenmesi ve gderilmesi adına ortak bir tanım ve

tartışma zemini oluşturmaktır.

.

Network (ağ) aktiviteleri çerçevesinde yukarıdaki hedeflere ulaşabilmek için en önemli

araçlardan biri de eğitim kurslarıdır.




Modern biyoteknoloji yaklaşımı ile üretilen gıdaların güvenlik ve

etiketlendirilmesi - WHO yaklaşımı4

GDO’ların çevreye salınımı ve GDO iceren gıda ürünlerinin pazarda yer alması dünyanın bir

çok yerinde toplum tarafından tartışma konusudur. Biyoteknolojinin diğer yaygın kullanım

alanları (örneğin beşeri ilaçlar) ve bunların toplum üzerinde yarattığı sonuçlar

düşünüldüğünde bu tartışmaların daha da kapsamlı olarak devam etmesi hayli muhtemeldir.

Tartışma altındaki konuların (maliyet ve yararlar, güvenlik konuları) oldukça benzer olmasına

rağmen, tartışmaların sonuçları ülkeden ülkeye değişmektedir. Günümüzde halen tüketici

kaygılarının giderilmesinin bir yolu olarak GDO gıdalarının etiketlendirilmesi ve izlenmesi

uzerine genelgeçer ortak bir karar yoktur. Bu durum son bir kaç yılda Codex Alimentarious

komisyonundaki tartışmalarla açığa çıkmıştır. Codex Alimentarius komisyonu (Codex;

http://www.codexalimentarius.net/web/index_en.jsp) FAO/WHO ortak yapılanması olarak

(Codex Alimentrius’u oluşturan uluslararası gıda kodu) standartların derlenmesinden, pratik

kodlardan, rehberlerden ve tavsiyelerden sorumludur. Bu başlıklarda ortak görüş eksikliğine

rağmen, risk değerlendirmesi ile ilgili görüşlerin harmonizasyonu üzerinde önemli gelişmeler

sağlanmıştır. Codex uluslararası düzeyde daha kapsamlı bir anlayışla pazara salınım

öncesi risk değerlendirmesi uzerine bir dizi prensibi benimsemek üzeredir. (Bakınız: Modern

biyoteknolojiden ile elde edilen gıdaların risk analizi prensipleri "Principles for the risk

analysis of foods derived from modern biotechnology" CAC/GL 44-2003

ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/princ_gmfoods_en.pdf).

Farklı GDO’lar, belli bir organizmaya farklı organizmalardan, değişik yollarla eklenen farklı

genleri içerir. Bu GD gıdaların ve güvenliğinin her vakada ayrı değerlendirilmesi gerekliliği ve

bütün GD gıdaların güvenliği hakkında genel değerlendirme yapmanın mümkün olmadığı

anlamına gelir. Dünya sağlık örgütüne göre şu anda uluslararası pazarda yer alan GD

gıdalar risk değerlendirmesinden geçmiştir ve insan sağlığı için bir risk taşıma ihtimalleri

muhtemelen yoktur. Buna ek olarak, GDO tüketimini onaylanan ülkelerde, geniş kitleler

tarafından bu tip gıdaların tüketilmesi sonucunda insan sağlığına herhangi bir olumsuz etkisi

gösterilmemiştir. Codex prensiplerine göre risk değerlendirmelerinin, (uygun olduğunda)

pazara salınım sonrası izlemeyi de içerecek biçimde daimi kullanımı, GD gıdaların

güvenliğinin değerlendirilmesinde temel oluşturmalıdır.

4 For exhaustive information on the activity of WHO and other UN agencies on Foods derived from Modern Biotechnologies see http://www.who.int/foodsafety/en/

ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/princ_gmfoods_en.pdf

http://www.who.int/foodsafety/en/


Biyoteknoloji yoluyla elde edilen gıdaların etiketlenmesi bizzat gıda güvenliği ile ilgili olabilir

veya olmayabilir. Her halükarda bu yaklaşım WHO tarafından gıda üretim işlemlerinin

şeffaflığının arttırılması için bir araç olarak görülmektedir. Etiketlendirme uygulamaları ulusal

gıda güvenlik programlarının geliştirilmesine katkıda bulunacak izlenebilirlik stratejilerinin

geliştirilmesini destekler ve böylece dolaylı yoldan gıda güvenliğine olumlu katkı yapar.

Analiz ve örnekleme için uygun yöntemlerin olmasının önemi açıktır.

WHO biyoteknoloji yoluyla elde edilen gıdaların risk değerlendirme ve güvenliği için tavsiye

ve prensiplerin geliştirilmesinde aktif olarak yer alir. Çeşitli uzman konsultasyonları

sonucunda geliştirilen sonuçlar, ulusal seviyede temel rehberleri oluşturmaktadır.

Günümüzde bu rehberler, uluslararası tanımlanan rehberlerle birleştirilmektedir. “Eş

değerlik” prensibine dayalı olan yaklaşım ilk nesil GDO’ların güvenlik değerlendirilmesi için

geliştirilmiş ve birçokları tarafından yeterli bir yaklaşım olarak bulunmuştur. Bununla beraber,

bu yaklaşım devam eden eleştirilerin konusudur. Güncel yaklaşım bu tartışmaları dikkate

almalı ve bilime dayalı düzenlemelerin ve ilerlemelerin geliştirilmesine katkıda bulunmalıdır.

FAO/WHO Genetiği değiştirilmiş gıda ve bitki güvenlik komisyonu uzmanları, 2000 yılındaki

kararlarında eş değerlik prensibinin, bir GDO ile doğal halinin benzerlik ve farklılıklarını

karşılaştırmak için kullanılabileceğini ifade etmiştir. Ayrıca eş değerlik prensibi kavramının,

başlı başına bir gıda güvenliği aşamasi yahut güvenlik değerlendirmesinin son basamağı

değil, kapsamlı sürecin ilk basamağı olarak görülmesi gerektigi görüşü ifade edilmistir.

(http://www.fao.org/ag/agn/food/risk_biotech_aspects_en.stm).

Yeni nesil GD gıdalar,hayli muhtemeldir ki geliştirilmiş besin değerine sahip olan tahıllar

olacaktır. Dolayısıyla doğal gıdalar ile fonksiyonel gıdalar yahut sağlık katkılı arasındaki fark

açılacaktır. Gelecekte gıda güvenliği değerlendirme stratejileri, yapilan genetik modifikasyon

sonucunda orataya cikacak daha karmaşık metabolik değişiklikleri göz önünde bulundurmak

zorunda kalacaktır. Değerlendirmeler giderek artan biçimde, bir GDOlu gıda ürününün

gelişen ve gelişmekte olan ülkelerin farklı beslenme ihtiyaçları üzerindeki etkisini de dikkate

almayı gerektirecektir.

Halihazırda uygulamada olan hiç bir özel uluslararası düzenleme sistemi bulunmamaktadır.

Ancak, bir takım uluslararası organizasyonlar, GDO’lar için protokol geliştirilmesinde yer

almaktadır. Yukarıda bahsedildiği gibi Codex, GD gıdaların insan sağlığı açısından risk

analizleri için kullanılacak prensipleri geliştirmektedir. Bu prensiplerin öncülleri her bir vaka

icin ayri olarak yapılan pazara sunulum öncesi değerlendirmenin, aktarılan genin direkt

etkilerinin yanısıra, (yeni genin aktarılması sonucu ortaya çıkan)

beklenmeyen/öngörülmeyen etkilerin de icerilmesini gerektirir. Tam olarak


http://www.fao.org/ag/agn/food/risk_biotech_aspects_en.stm


benimsenmemekle beraber, geliştirilen pernsipler ileri seviyededir. (Bakınız : Modern

biyoteknoloji ile elde edilen gıdaların risk analizi prensipleri (Principles for the risk analysis of

foods derived from modern biotechnology CAC/GL 44-2003

ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/princ_gmfoods_en.pdf).

Bunlar ve geliştirilmekte olan diğer Codex prensiplerinin (analiz ve örnekleme yöntemlerinin

prensipleri dahil olmak üzere) ulusal kanunlarla bağlayıcılığı yoktur. Fakat özel olarak Dunya

Ticaret Orgutu WTO (World Trade Organization)’nun sağlık ve bitki sağlığı anlaşması

içeriğinde yer almaktadır ve ticaret anlaşmazlıklarında referans olarak kullanılabilir.

Biyoteknolojik olarak üretilen gıdalar içinde 1999-2003 yılları arasında AdHoc hükümetler

arası Codex görev gücü (http://www.fao.org/ag/agn/agns/biotechnology_codex_en.asp),

gıda etiketlenmesinde Codex komitesi ve analiz ve numunelendirme yöntemleri için Codex

komitesinde yapılan çalışmalar göz önüne alınarak, biyoteknolojik olarak elde edilen

gıdaların güvenlik değerlendirmesi için genel olarak kabul edilen rehberlerin geliştirilmesi,

risk iletişim konuları (etiketlendirme gibi) ve böylece uygun analiz yöntemlerinin geliştirilmesi,

WHO aktivitelerinin odağı olarak devam edecektir.

WHO bu nedenle biyoteknoloji yoluyla elde edilen gıdaların risk iletişim, risk yönetimi, ve risk

değerlendirmesi için prensip ve yöntem geliştirmek üzere uzman konsultasyonu belirlemeye

devam etmektedir (http://www.who.int/foodsafety/biotech/consult/en/). WHO, tanı yöntemleri

alanında, gelişmiş ve gelişmekte olan ülkeler arasında işbirliğini de koordine eder.

WHO içindeki Gıda Güvenlik Birimi, modern gıda biyoteknolojisinin insan sağlık ve gelişimi

üzerindeki etkisi hakkında kanıta dayalı bir çalışmayı sonuçlandırmak üzeredir. Bu calışma

kararı, 2000 yılı Mayıs ayında 53. Dünya Sağlık Kongresinde, WHO’ya üye ülkelerin

modern gıda biyoteknolojisi hakkında kararlar için bilimsel temeller oluşturulmasını

desteklemek ve ortaya çıkan düşüncelerin şeffaf, doğru ve bağımsız olduğundan emin olmak

için kapasite arttırımı konularında WHO’nun daha etkin olması yolundaki ifadeler üzerine

alınmıştır.

Çalışma (http://www.who.int/foodsafety/biotech/who_study/en/index.html) WHO vekaletinde

varolan bilgiyi karşılaştırarak uygun bir biçimde analiz etmeyi ve diğer uluslar arası

ajansların çabalarını tamamlamayı hedeflemektedir. İşlemdeki şeffaflığı arttırmak için WHO,

FAO ile işbirliği yapar ve diger paydaşları ve ilgili grupları süreçlere dahil eder.

Temel amaç üye ülkeler, uluslararası standardizasyon kurumları ve diğer paydaşlar için,

biyoteknoloji uygulama ve değerlendirmesi konularında kapsamlı görüş birliği ve şeffaflık

sağlamak üzere erişilebilir bir bilgi dayanağı oluşturmaktır. Sonuç olarak, WHO gelecekte

biyoteknolojinin bütünsel değerlendirmesi için kanıta dayalı alt yapı oluşturmayı istemektedir.


ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/princ_gmfoods_en.pdf

http://www.fao.org/ag/agn/agns/biotechnology_codex_en.asp

http://www.who.int/foodsafety/biotech/consult/en/


Bu çalışma modern gıda biyoteknolojisinin insan sağlığı ve gelişimine ne tür katkılar

sağlayabileceğini belirlemeyi amaçlamaktadır. Modern gıda biyoteknolojisinin

mikroorganizma, bitki ve hayvanlarda uygulanmasını içermektedir. İnsan sağlığı ve gelişimi

için direkt ya da dolaylı olarak etkili anahtar konularını belirlemek ve mevcut bilgi ile geçerli

kanıt oluşturabilmek için bütünleştirilmiş yaklaşım benimsenmiştir.Kanıtlanmış bilgi istenen

ana konular:

Araştırma ve geliştirme

İnsan sağlığı üzerine etkiler (gıda güvenliği ve çevresel etkiler)

Gıda güvenliği,maliyet, teknolojiye erişim

Etik, yasal ve sosyal konular

Kapasite arttırma girişimleri

Veriler, Mayıs 2002’de yaygın literatür, internet ve paydaş ve uzmanları içerecek biçimde

derlenmiş kaynaklardan, 120 soruluk sorgulamaya dayalı araştırma yolu ile toplanmıştır.

Haziran ve Nisan 2003 tarihleri arasında elektronik paydaş tartışmasından alınan yorumlara,

5-6 Haziran Cenevre’de paydaş toplantısına katılan gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerin

hükümet temsilcileri, tüketici, endüstri, araştırmacı, ve sivil toplum örgütlerini de kapsayan

katılımcıların fikirleri de dahil edilmiştir.

Bu müzakere işleminden elde edilen rapor WHO tarafından modern biyoteknolojinin insan

sağlığı ve gelişiminde kullanımı ve uygulanması hususunda gelecekteki faaliyetleri

planlamak icin kullanılacaktır.



EK-1. GDO’ların pazarda yer alması ile ilgili kontrol programları ve

ilgili etiketlendirmeyi de içeren AB mevzuatı

GDO’ların çevreye kasıtlı salınımı ile ilgili Konsey Direktifi 90/220/EEC

(OJ L 117, 8.5.1990, p. 15)

Yürürlükten kaldırma:

Avrupa Parlamentosu ve 12 Mart 2001 tarihli GDO’ların çevreye salınımı ile ilgili

2001/18/EEC Direktifi, 90/220/EEC Konsey Direktifini yürürlükten kaldırmıştır

(OJ L. 106, 17.4.2001, p.1)

Genetiği değiştirilmiş mikroorganizmaların kullanımı hakkında 90/219/EEC 23 Nisan 1990

tarihli Konsey Direktifi

(OJ L 117, 8.5.1990, p.1)

Tashih:

26 Ekim 1998 tarihli Konsey Direktifi 98/81/EC, 90/219/EEC Direktifini iyileştirmiştir

(OJ L 330, 5.12.1998, p.13)

Avrupa Parlementosunun 258/97(EC) düzenlemesi ve orijinal gıda ve gıda içerikleri

hakkında 27 Ocak 1997 tarihli Konsey kararı

(OJ L 43, 14.2.1997, p.1)

Gıda güvenliği ile ilgili prosedürleri şart koşan ve Avrupa Gıda Güvenlik Otoritesini kuran,

gıda yasalarının ihtiyaç ve prensiplerini şart koşan 28 Ocak 2002 tarihli Konsey ve Avrupa

Parlementosunun 178/2002 (EC) Düzenlemesi

(OJ L 31, 1.2.2002, p. 1)

Direktif 79/112/EEC de sağlananlar dışında kalanlara, hususi genetiği değiştirilmiş

organizmalardan elde edilen yiyecek maddelerinin etiketlenmesi zorunluluğu ile ilgili 26

Mayıs 1998 1139/98 Konsey Düzenlenmesi (EC)

(OJ L 159, 3.6.1998,p.4)

Yiyecek maddelerinin reklamı, tanıtımı ve etiketlenmesi ile ilgili üye ülkelerin kanunlarının

yaklaşımı hakkında 79/112/EEC Direktifi iyileştiren 27 Ocak 1997 tarihli Konsey ve Avrupa

Parlamentosunun 97/4/EC Direktifi

(OJ L 43, 14.2.1997, p.21)



Direktif 79/112/EEC ile ilgili olanlar dışında bazı gıda maddelerinin etiketlenmesi zorunluluğu

ile ilgili olan 94/54/EC Komisyon direktifini iyileştiren 29 Mart 1996 tarihli 96/21/EC komisyon

direktifi

(OJ L. 88,5.4.1996, p.5)

Direktif 79/112/EEC ile ilgili olanlar dışında bazı gıda maddelerinin etiketlenmesi zorunluluğu

ile ilgili olan 94/54/EC Komisyon Direktifi

(OJ L 300, 23.11.1994, p.14)

Direktif 79/112/EEC ile ilgili olanlar dışında GDO’lardan üretilen bazı yiyecek maddelerinin

etiketlenme zorunluluğu ile ilgili (EC) No 1139/98 nolu Konsey düzenlemesini iyileştiren 10

Ocak 2000 tarihli 49/2000 Komisyon Düzenlemesi (EC)

(OJ L. 006, 11.1.2000, p.13)

Genetiği değiştirilmiş veya genetiği değiştirilmiş organizmalardan üretilmiş tatlandırıcı veya

katkı maddelerini içeren gıda maddeleri ve içeriklerinin etiketlendirilmesi ile ilgili 10 Ocak

2000 tarihli 50/2000 Komisyon Düzenlemesi (EC)

(OJ L 006, 11.1.2000, p.15)

Gıda maddelerinin resmi kontrolü ile ilgili 14 Haziran 1989 tarihli 89/397/EEC Konsey

Direktifi

(OJ L 186,30,06,1989, p.23)

Gıda maddelerinin resmi kontrolü ile ilgili ek ölçümleri içeren 19 Ekim 1993 tarihli 93/99/EEC

Konsey Direktifi

(OJ L 290,24.11.1993, p. 14)

2002 için gıda içeriklerinin resmi kontrolü hakkında eşgüdümlü programı ile ilgili 25 Ocak

2002 tarihli Komisyon Tavsiyesi (2002/66/EC)

(OJ L 26,30.1.2002, p.8)

Genetiği değiştirilmiş gıda ve yem hakkında 22 Eylül 2003 tarihli konsey ve Avrupa

Parlamentosunun 1829/2003 (EC) Düzenlemesi

(OJ L 268, 18.10.2003, p.1)




Direktif 2001/18/EC iyileştiren ve genetiği değiştirilmiş organizmalardan üretilen gıda ve yem

ürünlerinin izlenebilirliği ve genetiği değiştirilmiş organizmaların etiketlemesi ve izlenebilirliği

ile ilgili 22 Eylül 2003 tarihli konsey ve Avrupa Parlamentosunun 1830/2003 (EC)

Düzenlemesi

( OJ L 268, 18.10.2003, p.24)

Olumlu risk değerlendirmesinden yararlanan genetiği değiştirilmiş materyalin teknik olarak

beklenmedik ya da zorunlu varlığı ve var olan ürünlerin bildirilmesi, genetiği değiştirilmiş yeni

gıda ve yem yetkisi için uygulama hakkında Konseyin ve Avrupa Parlamentosunun

1829/2003 No’lu Düzenlemesinin yerine getirilmesi için detaylı kuralların 6 Nisan 2004

641/2004 (EC) Komisyon Düzenlemesi

(OJ L 102,7.4.2004, p.14)

Yiyecek maddelerinin reklamı, tanıtımı ve etiketlenmesi ile ilgili üye ülkelerin kanunlarının

yaklaşımı hakkında 18 Ocak 1978 tarihli 79/112/EEC Direktifi

(OJ L 33,8.2.1979, p.1)

Genetiği değiştirilmiş organizmaların özgün belirleyicilerinin atanması ve geliştirilmesi için

sistem kurulması hakkında 14 Ocak 2004 tarihli 65/2004(EC) Komisyon Düzenlemesi

(OJ L 10, 16.1.2004, p.6)

Gıda ve Yem Yasası, Hayvan Sağlığı ve Hayvanlara iyi muamele kurallarına uygunluğu

denetlemek için yapılan yasal kontrollere ilişkin Avrupa parlamentosu ve Konseyinin 29

Nisan 2004 tarihli No.882/2004 Düzenlemesı (EC)

(OJ L 165, 30.4.2004, p.141)


Bölüm 2

El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri

M.Querci






El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri 2

İçindekiler

Bölüm 2

El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri

GDO’lar nasıl belirlenir? 3

DNA ve proteine dayalı yaklaşımların sınırları ve avantajları 4

El kitabının genel sunumu ve dikkat edilecek noktalar 7

Kaynaklar 11



GDO’lar nasıl belirlenir?

Daha önce de belirtildiği gibi transgenik bitkiler genomlarına yeni gen veya genlerin

eklenmesi ile karakterize edilirler. Aktarılan bu yeni gen ile yeni bir protein ifade edilir.

Bu da bitkiye bazı böceklere ve/veya yabancı otlara direnç gibi yeni bir özellık

kazandırı. GDO tanı teknolojisinin temelini değiştirilmemiş çeşit ile transgenik bitki

arasındaki bu farkın kullanılması oluşturur. Bu işlem aktarılan yeni DNA’nın veya

ifade edilen yeni proteinin belirlenmesi, yahut (eğer enzim ise) enzimatik

reaksiyonların ürününü tespit etmek için kimyasal analiz yöntemleri kullanılması yolu

ile olur.

Günümüzde mısır, soya, pamuk gibi tarla bitkilerinde genetik modifikasyonların

belirlenmesi için iki bilimsel yaklaşım kullanılmaktadır. Birincisi, ELISA (Enzyme

linked immuno sorbent assay) antijen ve antikor arasındaki bağlanma özelliğini

kullanarak özel proteinlerin varlığını test eder, diğeri PCR (Polymerase Chain

Reaction), tahıla aktarılmış olan DNA sekanslarının belirlenmesine dayanır. Bu

yöntemler örnekteki miktar (yüzde) hakkında bilgi verebilir. AB’de geçerliliği

onaylanan ilk yöntem, pazara sunum için onaylanan birçok GDO’nun tespit

edilebildiğii PCR’a dayalı tayin yöntemidir (Lipp ve ark. 1999).

Pietsch ve ark. (1997) tarafından geliştirilen bu metot, aktarılan genin konakçı

organizmada işlevselliği için gerekli olan 35S promotor ve nos terminatör kontrol

tayinine dayanır. Yöntem geçerliliği IHCP (JRC)’nin Gıda Üretimi ve Tüketici Malları

Birimi (Food Products and Consumer Goods Unit) tarafından uygun sertifikalı

referans materyallerinin üretiminden sorumlu olan JRC, IRMM (Referans Materyaller

ve Ölçümler Enstitüsü) ile işbirliği ile koordine edilmiştir.

Yukarıda bahsedildiği gibi araştırmalar ayrıca proteine dayalı yöntemlerin

geliştirilmesine de yönelmiştir. Roundup Ready® soyanın tayininde hassasiyeti

yüksek, ELISA tabanlı bir yöntem kullanılması geçerlilik onayı almış olup (Lipp ve

ark. 2000) diğer yöntemler de geliştirilmiştir

(http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm).


http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm


DNA ve proteine dayalı yaklaşımların sınırları ve avantajları

DNA’ya dayalı yaklaşım

PCR teknolojisine dayalı analitik yöntemler GDO’larda bulunan DNA sekanslarının

tayininde artarak kullanılmaktadır.

PCR, diğer DNA sekansları ile karışık olan ve düşük miktarlarda bulunan özel DNA

parçalarının seçici olarak çoğaltılmasına izin verir. PCR reaksiyonun başlangıcı için

gerekli olan küçük tamamlayıcı DNA parçaları primer olarak adlandırılır ve çift olarak

kullanılır. Bu primerler ilgilenilen genin zıt dizilerine bağlanmak üzere düzenlenirler (5’

ve 3’). Böylece birçok döngü boyunca primerler arasındaki sekans özel bir DNA

polimeraz tarafından kopyalanarak çoğaltır. Bu çoğaltılan parçalar elektroforeze tabi

tutulur, böylece varlıkları ve boyutları belirlenebilir.

Tarımsal gıda ve yemlik tahıllarda da GDO’nun belirlenmesi ve ölçülmesini sağlayan

bir çok PCR’a dayalı yöntem geliştirilmiştir. Buna ek olarak, genetik kimliğin

tanımlanması, GDO tahılların destek zinciri (üreticiden tüketiciye) boyunca

ayrılabilmesine ve izlenebilirliğine olanak sağlar.

GDO tayini için önşart, gerçekleştirilmiş olan genetik modifikasyon(lar)un türü

hakkında, kullanılan promotör ve terminatörü de içine alacak biçimde aktarılan genin

moleküler oluşumu üzerine sahip olunan bilgidir. Analiz, hedef geni de kapsayan

bütün DNA’yı içeren minimum miktarda örnek materyal ile yapılır.

PCR, eğitimli eleman ve özel ekipman gerektiren laboratuvara dayalı hassas bir

tekniktir.

PCR’a dayalı tanının bazı ana özellikleri aşağıdaki gibidir:

Bir organizmanın tüm genetik materyali ya da genomunda, araştırılan genin

bir ya da birkaç kopyasını tespit edebilecek kadar hassas olabilir.

Bu yüksek hassasiyetin sonucu olarak, dikkatsizlik sonucu meydana gelen

çok düşük seviyelerdeki kontaminasyon dahi yanlış pozitif sonuç verebilir. Bu

nedenle çapraz kontaminasyonu önlemek için çok dikkat edilmelidir.

İmmunolojik analizlerle kıyasla (primer sentezi ile antikor üretimi

karşılaştırıldığında) çok daha kısa bir kimyasal hazırlık süresi gerektirir.



Analiz için gerekli olan kimyasalların hemen hepsi ticari olarak mevcut olup,

bir çok kaynaktan kolayca temin edilebilmektedir. Ancak bunların bazıları,

tanısal kullanım için lisans gerektirmektedir.

Numune analizi yaklaşık bir gün sürmektedir.

Uygun şekilde geliştirilirse PCR, farklı genetik modifikasyon tipleri (transgenik

hat olarak da tanımlanır) arasında ayrım yapabilme özelliğine sahiptir. Özel

transgenik hatların tanımlanması için var olan tanı yöntemleri ekstra bir

geliştirme süreci ve geçerlilik çabasını gerektirir.

Proteine dayalı yaklaşım

Proteine dayalı yaklaşım, ilgi duyulan proteine karşı geliştirilmiş özel antikorlar

kullanır. ELISA özel olarak, yahut diğer benzer olmayan proteinlerin de bulunduğu

örnekte, ilgi duyulan proteini belirler veya ölçer. ELISA yöntemi özel bir proteine

bağlanması için bir antikor, tespiti çoğaltabilmek için ikinci bir antikor (tercihe bağlı)

ve ilgilenilen protein standardı ile karşılaştırılarak, reaksiyonun sonucunu bir renk

ürünü olarak ölçebileceğimiz, antikora bağlı bir enzim kullanır.

Testin doğru biçimde yapılabilmesi için eğitilmiş personel ve özel ekipman

gerekmektedir.

ELISA analizinin anahtar özellikleri;

PCR’dan daha az hassastır, bu nedenle, düşük seviyelerdeki kontaminasyon

sonucu oluşan “yanlış pozitif” sonuçlarla PCR’a nazaran daha nadiren

karşılaşılır.

Analiz geliştirilmesi ve antikor ve protein standartları oluşturmanın yüksek ön

maliyeti vardır.

Kimyasallar geliştirildikten sonra örnek başına maliyeti düşüktür.

Aynı protein özelliğini gösteren farklı transgenik vakalar arasında farkı ayırt

edemeyebilir.

Proteine dayalı yöntemler kimyasallar ve yöntem gelişimi için önemli bir ön

hazırlık zamanı gerektirir.

Proteine dayalı testler, ölçülebilir bir protein üretildiğinde pratik ve etkili bir

analiz yöntemidir. Ancak genetik olarak değiştirilmiş ürünler yalnızca bazı

gelişim safhalarında veya belli bitki bölümlerinde üretilirler ve bunları ELISA

ile kolayca ölçmek mümkün olmayabilir.



Buna ek olarak, özellikle endüstriyel işlemler proteinlerin kolayca bozulmasına

sebep olabilir ve bu nedenle işlenmiş gıdalarda ELISA yöntemini kullanmak

problemli olabilir.

Bu noktalar düşünüldüğünde ELISA ve PCR ayrı ve biri diğerinin yerine geçer

yaklaşımlar olarak değil, birbirini tamamlayıcı yöntemler olarak dikkate alınmalıdır.

Tablo 1. ELISA ve PCR yöntemlerinin karşılaştırılması

Yöntem Test

yapılan

molekül

Süre Kullanım kolaylığı Sonuçlar

ELISA Protein 2-8

saat

Orta; laboratuar bilgisi

gerektirir; testler

tahıla ve çeşide

özeldir

Özel genetik modifikasyonu

tespit edebilir, test numunesinde

GDO için nicel tayin yapmak

mümkündür

PCR DNA 1-3

gün

Zor; özelleşmiş alet

ve eğitim gerektirir

Çok hassas, yanlış pozitiflere

maruz kalabilir; GDO DNA’nın

varlığını tespit eder, test

numunesinde GDO için nicel

tayin yapmak mümkündür



El kitabının genel sunumu ve dikkat edilecek noktalar

Yöntem geçerliliği hem laboratuvar hem de kontrol otoriteleri açısından kritiktir.

İdealinde, performans doğrulama amaçlı olarak, her yöntem hassas, tekrarlanabilir

ve hedefe özel sonuçlar sağlamak açısından, sınırlı sayıda deneyimli laboratuarlarca

onaylanmalıdır. AB’nin JRC birimi ilk olarak Roundup Ready® soya içeren

işlenmemiş materyal için ELISA ve PCR yöntemlerine, Maximizer mısır (Bt-176) için

PCR yöntemine ve işlenmiş gıdada Bt-176 ve Roundup Ready® için PCR yöntemine

geçerlilik onayı vermiştir (Lipp ve ark. 1999, 2000, 2001). O zamandan beri, hem nitel

hem de nicel analizler geliştirilmiş ve onaylanmıştır (GDO tayini ve ölçümü için

onaylanmış yöntemler hakkında son bilgi için

http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm). Gerek DNA’ya, gerekse

de proteine dayalı yöntemlerde GDO belirleme ve miktar ölçme işlemleri için örnek

hazırlama aşaması kritiktir. İlgilenilen soruna bağlı olarak (örn. nitel veya nicel) her

prosedürün sınırlarını bilmek önemlidir. Hem örnek boyutu, hem de örnekleme

işlemleri herhangi bir test yönteminden elde edilecek sonuçlar üzerinde büyük etkiye

sahiptir.

Uygun sertifikalı referans materyallerinin (RM) bulunabilirliği her tayin yöntemi için

temel gerekliliktir. Bu kursta kullanılan referans materyaller JRC IRMM’de üretilmiştir

(Trapmann ve ark. 2002 ve 2001). RM özellikleri ve sertifikaları Bölüm 3’de

verilmiştir. Örnek homojenizasyonu kurs kapsamında yer almamakla beraber önemli

bir işlemdir.

Şekil 1. Kurs sürecinde gerçekleştirilen farklı analiz basamaklarını özetlemektedir.

DNA izolasyonunun optimize edilmesi, PCR ile çoğaltılmaya uygun DNA’nın kalitesi

ve varlığı için temel işlemdir. Bu konu, özellikle marketteki bir çok gıda ürünü,

endüstriuel olarak işlenmiş soya ve mısırdan türetildiği için çok önemlidir. DNA

gıdanın işlenmesi esnasında, özellikle suyun varlığındaki ısıl işlemler sebebi ile

parçalanabilir. Böylece gıdadaki GDO’ ların varlığının belirlenmesine izin verecek

kadar uzun olan DNA parçalarının miktarı( araştırmaya konu olan yeni gen diziliminin

tamamını içerene), gıda işlendikçe azalabilir. Ek olarak, uygun DNA izolasyonu,

örnekte bulunan önleyici maddelerin ortamdan ayrıştırılmasına olanak vermelidir. Bu

konudan Bölüm 4’de bahsedilecektir. DNA izolasyonu için farklı metotlar

geliştirilmiştir. Bir çok ticari şirket tarafından özel kullanıma hazır kitler de piyasa da

mevcuttur. Farklı uygun protokollerin performans ve geçerliliği kurs esnasında


http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm


tartışılacaktır. Ancak ticari şirketler ile ilişiklendirilmemek için,farklı örneklerde

uygunluğu gösterilmiş, geçerli ve çok yönlü ir protokol olan CTAB metodu DNA

izolasyonu için kullanılmıştır.

DNA izolasyonundan sonra örnekler (ve PCR ürünleri) agaroz jel elektroforezi ile

analiz edilir (Bölüm 5). PCR yönteminin prensipleri , avantajları ve zorluklarından

Bölüm 6’da bahsedilmiştir.

Yukarıda belirtildiği gibi, GDO tayini için modern tekniklerin etkili kullanımı, yeterli

bilginin varlığına bağlıdır. GDO tayini, genetik modifikasyonun tipi ve hedef gen

sekansı hakkında en azından kısmi bilgi de gerektirir. Transgenik hatlar MON810

mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready® soyanın özellikleri Bölüm 7’de verilmiştir.

Onaylanmış GDO’ların tayininde farklı PCR yaklaşımları geliştirilmiştir. PCR

hassasiyeti doğru primerlerin seçilmesine dayanır. PCR primerleri, transformasyon

işleminde kullanılan farklı genetik elementlere yönlendirilebilir. “Genel kapsamlı” PCR

tayin sistemleri – genellikle “tarama yöntemleri” olarak adlandırılır –

transformasyonda en sıklıkla kullanılan ortak sekanslara özel primerlerin dizaynı ile

elde edilebilir. Bunlar genellikle promotör ve terminatör gibi düzenleyici sekanslardır.

Genetik olarak değiştirilmiş bitkiler, aktarılan yapısal gene göre kategorize edilebilir.

Reaksiyon hassasiyetini yönlendirmenin diğer bir yolu, değişik genetik elementlerdeki

yerleşmiş DNA sekanslarına özel (promotor-yapısal gen, yapısal gen-terminatör)

primerler seçmektir. Özel ve tam sekans bilgisi varlığında ise, genetik olarak

değiştirilmiş bitki için gerçekten özel analiz metotları geliştirmek mümkün olur.

Yalnızca bu özel hatta bulunan “özgün” bir sekans kombinasyonu seçme yolu ile bu

hatta özel analiz yöntemleri geliştirilebilir. Bu genellikle entegre edilen yabancı DNA

ile konak DNA arasındaki birleşme bölgesini boydan boya kapsayan DNA dizilimine

karşılık gelen bir primer geliştirilerek elde edilir. Eklenen DNA (T-DNA) ile konak-DNA

arasındaki birleşme bölgesi, oldukça hassas PCR testi için ideal bir hedef sağlayan,

gerçekten özgün bir nukleotid sekansıdır.

Kurs boyunca uygulanan metotlar Şekil 1’de özetlenmiştir. Bölüm 8’de detaylı bir

biçimde açıklanacaktır. Metotların deneysel kısımları ve protokoller Bölüm 9’da

bulunabilir.

Yukarıda belirtildiği gibi numunede GDO varlığının nicel tespitine duyulan ihtiyaç,

yalnızca nitel cevaba (varlığı/yokluğu) değil, verilen numunede GDO varlığının

göreceli ölçümün az veya çok hassas göstergesine (seçilen metoda bağlı olarak) izin



veren bir çok PCR’a dayalı yöntemin geliştirilmesine neden olmuştur. En sıklıkla

kullanılan DNA’ya dayalı iki yaklaşım karşılaştırmalı PCR ve real-time PCR’dır

(Bölüm 10).

Real time PCR halihazırda sadece bir kaç ticari şirket tarafından üretilen çok özel ve

karmaşık bir cihaz kullanılarak yapılır. Kurs süresince takip edilecek protokoller

Bölüm 11’de bulunabilir.

Son olarak, Bölüm 12’de , genetik olarak değiştirilmiş organizmaların varlığının tespiti

için serolojik yaklaşım hakkında genel bilgi verilerek özellikle ELISA tekniği

anlatılacak ve Roundup Ready® özel ELISA testinin protokolü sağlanacaktır.



Kurs sırasında

uygulanmayacaktır.

İşlenmiş ve işlenmememiş

materyaller

Soya için lektin-PCR ve mısır için zein-PCR

Bitki DNA’sı Bitki DNA’sı saptandı saptanamadı

Düzenleyici elementlerin saptanması (35S promotör ve nos terminatör)

GD bitki GD olmayan bitki

DNA ekstraksiyonu

Bitki DNA’sının PCR ile kontrolü

+

PCR ile tarama

GD bitkiyi ELISA ile

tanımlama

-

Örnekleme Homojenizasyon

+ -

GD bitkiyi nested PCR ile

tanımlama

Spektrofotometre ile DNA miktarının

belirlenmesi

Real-time PCR ile GD miktar

tayini

Şekil 1. Kurs sırasında uygulanacak yöntemler için iş akış şeması




Kaynaklar

Lipp, M., Anklam, E. and Stave, J.W. (2000). Validation of an Immunoassay for

detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food

fractions using reference materials: Interlaboratory study. Journal of AOAC

International 83, 919-927.

Lpp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and

Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction

for the detection of genetically modified organisms in various processed

foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.

Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J., and Anklam,E. (1999). IUPAC

collaborative trial study of a method to detect genetically modified soybeans and

maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923-928.

Pietsch, K., Waiblinger, H.U., Brodmann, P., and Wurz, A. (1997). Screening-

Verfahren zur Identifizierung “gentechnisch veranderter” plfanzlicher Lebenmittel.

Deutsche Lebensmittel Rundschau 93, 35-38.

Trapmann, S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E.,

Le Guern, L., Kramer, G.N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R.

Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M and Anklam, E.

(2002). The certification of reference materials of dry-mixed soya powder with

different mass fractions of Roundup Ready TM soya. Certified Reference Materials

IRMM-410S.

(https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/atta

chements/ERM-BF410_report.pdf) (accessed January 2010)

Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G.N., Schimmel, H.,

Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, and Anklam, E. (2002). The certification

of reference materials of dry-mixed maize powder with different mass fractions of

MON810 maize. Certified Reference Materials IRMM-413.



https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/attachements/ERM-BF410_report.pdf





Bölüm 3

Kurs Sırasında Kullanılan Örnekler

M. Querci, N. Foti






Kurs Sırasında Kullanılan Örnekler 2

İçindekiler

Bölüm 3

Kurs Sırasında Kullanılan Örnekler

Kurs sırasında kullanılan örnekler 3

Sertifikalı referans materyal 3

Ham ve işlenmiş materyallerin kompozisyonu 4

Kurs sırasında kullanılan örneklerin listesi 6

Beklenen PCR sonuçları 6

Kaynaklar 7



Kurs sırasında kullanılan örnekler

Kurs sırasında farklı materyallerde MON810 mısır ve Roundup Ready® Soya

varlığını saptamak için değişik yöntemler test edilecektir. Bu amaçla, farklı

konsantrasyonlarda GD içermeyen örnekler ile GD mısır (MON810) veya soya

(Roundup Ready® soya) karışımları kullanılacaktır.

İki tip materyal kullanılacaktır:

Sertifikalı Referans Materyaller

Farklı ham ve işlenmiş materyaller

Sertifikalı referans materyal

Kurs sırasında kullanılan ham bitki materyalleri, Sertifikalı Referans Materyaller

(SRM) olan IRMM-410S (Roundup Ready® Soya) ve IRMM-413 (Mon810 Mısır)’tür.

IRMM-410S ve IRMM-413 farklı kütle fraksiyonlarında (% 0; 0,1; 0,5; 1; 2; 5) genetik

modifiye Roundup Ready® soya ve MON810 mısır içerecek şekilde toz formda

hazırlanmış iki set soya ve mısır SRM’lerdir. Bu SRM’ler, Fluka Chemie AG (Buchs,

Switzarland) adına Referans Materyaller ve Ölçüm Enstitüsü (IRMM –

http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/homepage.htm) tarafından Avrupa Komisyonu Ortak

Araştırma Merkezi’nin (Eu JRC Ispra, Italy) bir kolu olan Sağlık ve Tüketiciyi Koruma

Enstitüsü (IHCP – http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/) işbirliğiyle hazırlanmıştır (Trapmann

ve ark., 2002 ve 2001). Bu SRM’ler genetik modifiye gıdaların tespitinde kullanılan

metotların geçerliliğini denetlemek için kullanılır. DNA ve/veya protein miktar

tayini,türüne bağlı olarak değişebildiğinden, SRM’lerden biri veya daha fazlası,

bilinmeyen örneklerin ölçümünden miktar tayini sonuçları oluşturulması için

denemeye alınmak zorundadır. DNA ve/veya protein miktarı farklı türlerde (hatlarda)

değişkenlik gösterebildiği için bilinmeyen örneklerden miktar tayini yaparken çok

dikkatli olunmalıdır.

GD Roundup Ready® soya içeren toz formda soya, modifiye olmayan bir soya hattı

(Asgrow A1900) ile genetik modifiye Event 40-3-2 Roundup Ready® soya (Asgrow

AG5602 RR)’nın tohumlarından üretilmiştir. GD MON810 mısır içeren toz formda

mısır, modifiye olmayan çeşit DK512 ile MON810 DK513’ün mısır tanelerinden

üretimiştir.


http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/homepage.htm

http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/


Ham ve işlenmiş materyallerin kompozisyonu

Farklı materyaller test edilecektir: Bisküvi, süt tozu, aperatif gıda, un.

Ham Materyaller

Karışık Un: Her bir GDO’yu temsilen kuru ağırlık üzerinden %0,5 oranı elde

edebilmek için %1 RR soyaya (IRMM-410S) %1 MON810 (IRMM-413) eklenmiştir.

Her iki undan 50 mg tartılmış ve DNA ekstraksiyonu için reaksiyon tüpüne direkt

olarak eklenmiştir. %1’lik MON810 un IRMM-413 Sertifikalı Referans Materyaldir (%1

MON810 mısır).

Aperatif Gıda

Bu örnek bir GDO yeterlilik testinden (GeMMA Scheme, Round 06, test materyali

GMO-06B) alınmıştır. Test materyali, ticari olarak kullanılan GD içermeyen soya bazlı

aperatif gıda ve GD içerikli soya aperatif gıdadan hazırlanmıştır.

Aperatif Gıda 1372 g GD içermeyen soya, 28 g GD soya

Karıştırmadan önce, iki materyal homojenize kırıntı karışımını elde etmek için

öğütülmüş, elenmiş ve sonra bir gece boyunca karıştırılmıştır . Son olarak,

materyaller yaklaşık bir saat karıştırıcı kullanılarak harmanlanmıştır. Materyaller -

20°C’de depolanmıştır.

Bisküvi

Materyal, Ortak Araştırma Merkezi, Sağlık ve Tüketiciyi Koruma Enstitüsü’nde

üretilmiş ve işlenmiş gıdalardaki Roundup Ready® soya ve Maximizer mısır (Bt-176)

için bir PCR yöntemini onaylamak için kullanılmıştır (Lipp ve ark., 2001).

Kuru soya ve mısırdan elde edilen un tartılmış ve aşağıda verilen malzemelerle

karıştırılmıştır.

Bisküvi 1

250 g mısır (%0 GDO), 250 g soya (%0 GDO), 300 g

buğday, 200 g şeker, 100 g tereyağ, 10 g tuz, 16 g

vanilin, 2 yumurta.



Malzemeler, 600 ml oda sıcaklığında su ile dikkatlice karıştırılmış, homojenize edilmiş

ve pişirme kabına eşit olarak yayılmıştır. Önceden ısıtılan fırında 180°C’de 10 dakika

pişirilmiştir. Materyal fırından çıkarılmış, kontaminasyona karşı korumak için örtülmüş

ve takiben oda sıcaklığında soğutulmuştur. Depolama -20°C’de yapılmıştır.

Soya sütü tozu

Bu örnek GeMMA Yeterlilik Testi Round 05’den alınmıştır.

1700 g Amerikan soya sütü tozu, 300 g Roundup Ready® soya protein izolatı ile

birlikte bir gece boyunca karıştırılır. 10 g ağırlığındaki farklı alt örnekler, üstü vidalı

plastik kaplara dağıtılmış ve kullanım öncesi oda sıcaklığında depolanmıştır.

Bisküvi MON810

Bu materyal JRC IHCP Biyoteknoloji ve GDO Birimi’nde üretilmiştir.

Kuru mısırdan elde edilen un tartılmış ve aşağıda verilen miktarlarda diğer

malzemelerle karıştırılmıştır.

Bisküvi MON810

200 g buğday unu, 100 g mısır unu (%2 GDO)*, 150 g

şeker, 100 g tereyağ, 1 yumurta

* %2 MON810 mısır unu, %100 MON810 ununa işlem görmemiş mısır unu katılarak

ve bunlar 30 dakika karıştırılarak elde edilmiştir.

Malzemeler dikkatlice karıştırılmış, pişirme tepsisine eşit olarak yayılmıştır. Önceden

ısıtılmış fırında 10 dakika süreyle 180°C’de pişirilmiştir. Materyal etüvden alınmış,

kontaminasyonu önlemek için üzeri örtülmüş ve oda sıcaklığında soğutulmuştur.

Ürün, 4°C’de saklanmıştır.



Kurs sırasında kullanılan örneklerin listesi

% GMO Özellikleri (Spesifik ingredient) Örnek

RR soya MON810

Bisküvi 1 %0 %0 Karışık un (MON, RR) %1 %1 MON810 un - %1 Aperatif gıda %2,2 - Soya sütü tozu %8,9 - Bisküvi MON810 - %2

Beklenen PCR sonuçları

Örnek zein lectin 35S nos E35S/hsp70(b) CTP/EPSPS

IRMM-410S-0(%0) - + - - - - IRMM-410S-1(%0,1) - + + + - + IRMM-410S-2(%0,5) - + + + - + IRMM-410S-3(%1) - + + + - + IRMM-410S-4(%2) - + + + - + IRMM-413S-0(%0) + - - - - - IRMM-413S-1(%0,1) + - + - + - IRMM-413S-2(%0,5) + - + - + - IRMM-413S-3(%1) + - + - + - IRMM-413S-4(%2) + - + - + - Bisküvi 1 + + - - - - Karışık un + + + + + + MON810 un + - + - + - Aperatif gıda - + + + - + Soya sütü tozu - + + + - + Bisküvi MON810 + - + - + -




Kaynaklar

Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G., and



foodstuffs. European Food Research Technolgy 212, 497-504.

Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E. (1999). IUPAC

collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and

maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923-928.

Trapmann, S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E.,

Le Guern, L., Kramer, G.N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R.,

Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M. and Anklam, E.

(2002). The certification of reference materials of dry-mixed soya powder with

different mass fractions of Roundup Ready TM soya. Certified Reference Materials

IRMM-410S.



Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G.N., Schimmel, H.,

Pauwels, J., Querci, M. Van den Eede, G. and Anklam, E. (2001). The

certification of reference materials of dry-mixed maize powder with different mass

fractions of MON810 maize. Certified Materials IRMM-413.



GeMMA Scheme-GMO analysis Round 06. GMO Proficiency Testing, (October

2001). Report N. GMO 06

GeMMA Scheme-GMO analysis Round 05. GMO Proficiency Testing, (October

2001). Report N. GMO 05






Bölüm 4

DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

M. Somma






DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 2

İçindekiler

Bölüm 4

DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Giriş 3

Ekstraksiyon yöntemleri 4

Saflaştırma yöntemleri 4

CTAB ekstraksiyon ve pürifikasyon yöntemi 6

Spektrofotometre ile DNA miktar tayini 9

DNA’nın spektrofotometrik olarak belirlenme ilkeleri 9

Nükleik asit konsantrasyonunun belirlenmesi 11

Deneysel 13

Kaynaklar 17



Giriş

Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması çoğu moleküler biyolojik çalışmada

ve rekombinant DNA tekniklerinin tümünde ilk adımdır. Nükleik asit ekstraksiyon

yöntemlerinin buradaki amacı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) kullanarak bir GD

spesifik analiz için farklı kaynaklardan nükleik asit saflaştırılmasını sağlamaktır.

Nükleik asitlerin kalitesi ve saflığı PCR analizleri için en önemli faktörlerden

bazılarıdır. Yüksek saflıkta, inhibisyon bulaşanlarından arındırılmış nükleik asitleri

elde etmek için, uygun ekstraksiyon yöntemleri uygulanmalıdır. PCR analiz

performansını inhibe eden olası bulaşanlar Tablo 1’de listelenmiştir. Örnekteki PCR

inhibitorlerinin varlığından kaynaklanan yanlış (negatif) bir sonucun ortaya çıkmasını

engellemek için PCR inhibisyonu test edilerek kontrollü bir deney gerçekleştirilmesi

önemlidir. Bu amaçla, bir bitki-spesifik (ökaryot veya kloroplast) veya türe spesifik

PCR analizi sıklıkla kullanılır.

Tablo 1. PCR işleminin bazı inhibitörleri

İnhibitör İnhibisyon Konsantrasyonu

SDS >%0,005 Fenol >%0,2 Etanol >%1 İzopropanol >%1 Sodyum asetat >5 mM Sodyum klorit >25 mM EDTA >0,5 mM Hemoglabin >1 mg/ml Heparin >0,15 i.u./ml Üre >20 mM Reaksiyon karışımı >%15

Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve pürifikasyonu için çok çeşitli yöntemler vardır, en

uygun tekniğin seçimi genellikle asağıdaki kriterlere bağlıdır:

Hedef nükleik asit

Kaynak organizma

Başlangıç materyali (doku, yaprak, tohum, işlenmiş materyal vb.)

İstenen sonuçlar (verim, saflık, pürifikasyon için gerekli süre)

Bir sonraki uygulama (PCR, klonlama, işaretleme, blotlama, RT-PCR, cDNA

sentezi),vs

Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için günümüzde en yaygın olarak

kullanılan bazı yöntemlerin ilkeleri aşağıdaki bölümlerde açıklanacaktır.



Ekstraksiyon yöntemleri

Biyolojik materyalden nükleik asitlerin ekstraksiyonu hücre parçalanması, hücre

nükleazların inaktivasyonu ve nükleik asitlerin parçalanmış hücreden ayrımını

gerektirir. Genellikle ideal parçalama prosedürü birtakım tekniklerin bileşiminden

oluşur. Bu süreç karmaşık baslangıç materyalini (doku gibi) parçalayacak kadar sert,

ancak hedef nükleik asidi koruyacak kadar da yumuşak olmalıdır. Temel parçalama

prosedürü aşağıdaki yöntemlerle gerçekleştirilebilir:

Mekanik parçalama (öğütme, hipotonik parçalama gibi)

Kimyasal uygulama (deterjanlarla parçalama, tıol ile redükleme, kaotropik katkı

madeleri,vs gibi)

Enzimatik parçalama (Proteinaz K gibi)

Hücre içi nükleazların inaktivasyonu ve hücre membranının parçalanması işlemleri

birleştirilebilir. Örneğin, tek bir çözelti hücre membranını parçalamak için deterjanlar,

hücre içi enzimleri inaktive etmek için de güçlü kaotropik tuzlar içerebilir. Hücre lizizi

ve nükleaz inaktivasyonundan sonra hücre içi diğer faktörlerin uzaklaştırılması

filtrasyon veya presipitasyon(çökeltme) gibi işlemlerle kolayca yapılabilir.

Saflaştırma yöntemleri

Hücre ekstraktlarından nükleik asitlerin saflaştırılması yöntemleri genellikle aşağıdaki

tekniklerden iki veya daha fazlasının birlikte kullanımını gerektirir:

Ekstraksiyon / presipitasyon

Kromatografi

Santrifügasyon

Afinite kolon ayrımı

Bu tekniklerin kısa açıklamaları takip eden paragraflarda verilecektir (Zimmermann

ve ark., 1998).

Ekstraksiyon / Presipitasyon

Çözücü ekstraksiyonu nükleik asitlerden kontaminantları uzaklaştırmak için sıklıkla

kullanılır. Örneğin, fenol ve kloroform kombinasyonu proteinleri uzaklaştırmak için,

izopropanol ve etanol ile presipitasyon genellikle nükleik asitleri konsantre etmek için

kullanılır. Hedef nükleik asitlerin miktarı düşük olduğunda, presipitasyonun etkisini

artırmak için karışıma bir inert taşıyıcı (glikojen gibi) ilave edilebilir. Nükleik asitlerin

diğer presipitasyon yöntemleri yüksek konsantrasyonlu tuz (salting out) kullanılarak



yapılan seçici presipitasyon ve pH’daki değişiklikler kullanılarak yapılan protein

presipitasyonunu içerir.

Kromatografi

Kromatografi yöntemleri jel filtrasyonu, iyon değişimi, seçici adsorpsiyon veya affinite

ile bağlanma gibi farklı ayrıştırma tekniklerinden oluşabilir. Jel filtrasyonu, jel

partikülleri porlarının moleküler eleme özelliği ile işler. Belirli por çapına sahip bir

matriks daha küçük moleküllerin difüzyon yolu ile porlara girişine izin verir, daha

büyük moleküller porlar tarafından içeri alınmaz ve boş hacimle ayrıştırılılar. Böylece

moleküller molekül büyüklüğü azalışına bağlı olarak sırayla elüye edilir. İyon değişimi

kromatografisinde, bir hedef molekül ve kolon matrisindeki fonksiyonel gruplar

arasındaki elektrostatik interaksiyondan yararlanılır. Nükleik asitler (yüksek negatif

yüklü, lineer polianyonlar) iyon değişimi kolonundan basit tuz tamponları ile

ayrıştırılır. Adsorpsiyon kromatografisinde, nükleik asitler diğer biyolojik moleküllerin

aksine, belirli tuzlar varlığında (örn. kaotropik tuzlar vb.) seçici olarak silika veya cam

yüzeyler üzerine tutunur. Daha sonra düşük konsantrasyonlu bir tuz tamponu veya

su ile nükleik asitleri, bir sonraki uygulamada direkt olarak kullanabilen bir örnek

oluşturacak biçimde, ayrıştırmak mümkündür.

Santrifügasyon

Seçici santrifüj güçlü bir saflaştırma yöntemidir. Örneğin yüksek g-gücünde kendi

kendine oluşan CsCl gradientlerdeki ultrasantrifügasyon, plazmit saflaştıması için

uzun süredir kullanılmaktadır. Genellikle, santrifüj bir başka yöntemle kombine

edilerek kullanılır. DNA ve RNA’yi daha küçük kontaminantlardan (tuzlar, nükleotidler,

vb) tampon degişimi veya büyüklük tespiti amacıyla saflaştırmak için jel filtrasyonla

santrifügasyonu birleştiren spin kolon kromatografisi buna bir örnektir. Bazı

prosedürler, kromatografik bir matriks ( bknz. Bir üst paragraf) üzerindeki selektif

adsorpsiyon ile santrifugal elüsyonu bir nükleik asit çeşidinin seçici saflaştırılmasi için

kombine eder.

Afinite kolon ayrımı

Son yıllarda bir çok saflaştırma yöntemi nükleik asitlerin afinite immobilizasyonunu

manyetik ayrıştırmayla birleştirmiştir. Örneğin, poly(A)+mRNA, biyotin işaretli

oligo(dT) ile streptavidin kaplı manyetik partiküllere bağlanabilir. Bu bağlanmış

partiküller solusyondan ve bağlanmamış kontaminantlatdan bir mıknatıs yardımı ile

ayrıştırabilir. Bu katı faz tekniği, santrifugasyon, organik ekstrasyon ve faz



ayrıştırmanın bazı aşamalarını basit, hızlı bir manyetik ayrıştırma ile yaptığı için

nükleik asit saflaştırma olayını basitleştirir.

CTAB ekstraksiyon ve pürifikasyon yöntemi

İlk kez Murray ve Thompson tarafından 1980’de geliştirilen CTAB

(Cetyltrimethylammonium bromide) protokolü Wagner ve arkadaşları tarafından

1987’de yayınlanmıştır (Wagner ve ark., 1987). Bu yöntem bitki ve bitki kaynaklı gıda

maddelerinden DNA ekstraksiyonu ve pürifikasyonu için kullanılır. Yöntem özellikle

polisakkaritlerin ve polifenolik bileşenlerin elimine edilmesine uygundur; diğer bir

deyişle saf DNA eldesi ve dolayısıyla da DNA kalitesinde etkilidir. Bu prosedür bitki

moleküler genetiğinde yaygın bir biçimde kullanılmakadır ve GDO’ların

saptanabilmesi için yapılan validasyon denemelerinde test edilmiştir (Lipp ve ark.,

1999; 2001). Birkaç değişiklik tekniğin birçok ham ve işlenmiş gıda matriksinde

kullanılabilmesi için geliştirilmiştir (Hupfer ve ark., 1998; Hotzel ve ark., 1999; Meyer

ve ark., 1997; Poms ve ark., 2001).

CTAB yönteminin ilkeleri: Liziz, ekstraksiyon ve presipitasyon

Bitki hücreleri, az tuzlu bir ortamda nükleik asitlerle birlikte çözünmez bir kompleks

oluşturan, iyonik bir deterjan olan CTAB ile lize olabilir. Bu koşullarda, polisakkaritler,

fenolik bileşenler ve diğer kontaminantlar süpernatantta kalır ve ortamdan yıkama ile

uzaklaştırılabilir. DNA kompleksi tuz konsantrasyonu arttırılarak çözünülür ve etanol

ve izopraponal ile presipite edilir. Bu bölümde, bu üç temel aşamanın ilkeleri, hücre

duvarı lizizi, genomik DNA ekstraksiyonu ve presipitasyonu açıklanacaktır.

Hücre duvarı lizizi: Daha önce açıklandığı gibi, DNA ekstraksiyonunun ilk aşaması

hücre ve çekirdek duvarlarının parçalanmasıdır. Bu amaçla, homojenize örnek ilk

aşamada EDTA Tris/HCl ve CTAB içeren ekstraksiyon tamponu ile muamele edilir.

Bütün biyolojik membranlar kovalent olmayan bağlarla birbirine bağlı lipit ve protein

moleküllerinden oluşan temel bir yapıya sahiptir.



Şekil 1. Hücre membranlarının basit gösterimi (Şekil 1, 2, 3 Genetic Science

Learning Center, University of Utah http://gslc.utah.edu)

Şekil 1’de gösterildiği gibi, lipit molekülleri, içinde protein moleküllerinin bulunduğu,

süreklilik gösteren bir çift tabaka biçiminde dizilmiştir. Lipit molekülleri baş olarak

isimlendirilen hidrofilik uçlar ve kuyruk olarak isimlendirilen hidrofobik uçlardan

oluşur. CTAB yönteminde membran lizizi, ekstraksiyon tamponu içinde bulunan bir

deterjan (CTAB) ile yapılır. Lipitler ve deterjan benzer kompozisyonlara sahip olduğu

icin, ekstraksiyon tamponunun CTAB bileşeni hücre ve çekirdek membranını

oluşturan lipitleri tutma özelliğine sahiptir. Bir deterjan kullanılarak çözünen lipitlerin

mekanizmasi Şekil 2’de gösterilmektedir.

Şekil 2. Lipit çözünmesi

Şekil 3, hücre membranının CTAB ekstrasyon tamponuna maruz kaldığında

deterjanın genomik DNA’yı çıkararak lipitleri ve proteinleri nasıl yakaladığını

göstermektedir. Spesifik bir tuz (NaCl) konsantrasyonunda, deterjan nükleik asitlerle

çözünmez bir kompleks oluşturur. EDTA magnezyum dahil farklı metallere

bağlanabilen kelatlayıcı bir bileşendir. Magnezyum DNAaz enziminin kofaktörüdür.

Mg ve EDTA bağlanması ile, varolan DNAaz’ın aktivitesi azalır. Tris/HCl pH’yı

tamponlama kapasitesine sahip bir çözeltidir (düşük veya yüksek pH DNA’ya zarar

verir). Nükleik asitler saflaştırmanın bu aşamasında kolayca degrade olabildiği için

örneğin homojenizasyonu ve CTAB tampon çözeltisinin eklenmesi arasındaki

zamanın en aza indirilmesi önemli bir noktadır. Hücre ve organel membranları


http://gslc.utah.edu/


(mitokondri ve kloroplast gibi) parçalandıktan sonra DNA pürifikasyonu

gerçekleştirilir.

Şekil 3. Hücre membranının parçalanması ve genomik DNA’nın ekstrasyonu

Ekstraksiyon: Bu aşamada polisakkaritler, fenolik bileşikler, proteinler ve sıvı

çözeltide bulunan diğer hücre lizatları, CTAB nükleik asit kompleksinden ayrılır. Çok

sayıda enzimatik reaksiyonu inhibe etme yetenekleri nedeniyle fenolik bileşiklerin

olduğu gibi polisakkaritlerin de yok edilmesi özelikle önemlidir. Düşük tuz

konsantrasyonlarında ( 0,5 M NaCl), nükleik asit kompleksi kontaminantları çökmez

ve solüsyonun klorofomr ile ekstraksiyonu sırasında uzaklaştırlıbailir. Kloroform

proteinleri denatüre eder ve sıvı ile organik fazların ayrılmasını kolaylaştırır. Normal

olarak, sıvı faz formu üstteki fazdır. Ancak, sıvı faz tuz konsantrasyonu nedeniyle

yoğun ise alt fazı oluşturacaktır. Buna ek olarak, sıvı çözeltinin pH’sı 7,8-8,0

değerlerine yeteri kadar denkleştirilmemiş ise nükleik asitler organik faza

dağılacaktır. Gerektiğinde sıvı fazdaki kirleticileri tamamen ortadan kaldırabilmek için

kloroform ekstraksiyonu iki veya üç kez uygulanır. Nükleik asitleri en iyi şekilde geri

kazanabilmek için organik faz geri özütlenerek bir önceki ekstrakta eklenebilir.

Nükleik asit kompleksi bir kez saflaştırıldığında, prosedürün son aşaması olan

presipitasyon gerçekleştirilebilir.

Presipitasyon: Son aşamada, nükleik asitler deterjandan ayrılır. Bu amaçla, ilk

olarak sıvı solusyon yüksek konsantrasyonlu NaCl ( 0,8 M NaCl) ve CTAB

karışımından oluşan bir presipitasyon çözeltisi ile muamele edilir. Tuz nükleik asit

presipitatı oluşumu için gereklidir. Sodyum asetat tamponlama kapasitesi nedeniyle

NaCl yerine tercih edilebilir. Bu koşullar altında, alkol içerisinde suda olduğundan

daha çözünür olan deterjanlar, nükleik asitler presipite olurken yıkanıp atılabilirler.

Takip eden %70 alkol ile muamele, nükleik asitlerin geri kalan tuzdan arındırılarak ek

bir saflaştırma yapılmasını sağlar.



Spektrofotometre ile DNA miktar tayini

DNA, RNA, oligonükleotidler ve hatta mononükleotidler seyreltilmiş veya

seyreltilmemiş sıvı solusyonlar içinde, ultraviyole ışığı altında (aynı zamanda görünür

dalga boylarında) sahip oldukları absorbsiyon A (optik yoğunluk, OD) üzerinden

direkt olarak ölçülebilir. Örnek saf olduğunda (örneğin proteinler, fenol veya agaroz

gibi kontaminantlar çok düşük miktarlda mevcut yahut yoksa) nükleotid bazları

tarafından absorbe olan ultraviyole radasyonun miktarı spektrofotometrik olarak basit

ve doğru biçimde ölçülebilir. Bu yöntem için, düşük iyon konsantrasyonlu sıvı

tamponlar (örneğin TE tamponu) idealdir. Nüklek asitlerin konsantrasyonu genellikle

bir köre (boş örnek) karşı 260 nm’de A ölçülerek belirlenir. Kontaminantların varlığı,

oran hesaplaması ile ayırt edilebilir. Proteinler 280 nm’de absorbladığı için A260/A280

oranı nükleik asitin saflığını hesaplamak için kullanılır. Saf DNA yaklaşık 1,8 , saf

RNA ise yaklaşık 2,0 değerini vermelidir. 230 nm’de görülen absorpsiyon, örneğin

karbonhidratlar, peptitler, fenoller veya aromatik bileşenler gibi maddelerle

kontaminasyonu gösterir. Saf örneklerde A260/A230 oranı yaklaşık 2,2 olmalıdır.

Alternatif bir yöntem olan etidiyum bromidli agaroz yöntemi, nükleik asitlerin düşük

miktarlarda mevcut olduğu durumlarda kullanışlıdır. Nükleik asit miktarı, bir seri

konsantrasyon standardıyla karşılaştırılarak, UV ışığına maruz bırakıldığında

etidiyum bromid tarafindan ışınan floresanın yoğunluğundan hesaplanabilir.

DNA’nın spektrofotometrik olarak belirlenme ilkeleri

Spektrofotometrik ölçümde, bir çözeltideki çözüntü konsantrasyonunu belirlemek için

ışığın çözeltide iletilme oranını kullanır. Cihaz, belirli bir dalga boyunda bir ışık

hüzmesinin bir örnekten geçtiği ve iletilen ışık enerjisi miktarının örneğin diğer

tarafında bir fotosel ile ölçüldüğü basit bir ilkeyle çalışır.

Şekil 4’te gösterildiği gibi tek ışık yolu olan bir spektrometre, ışık kaynağı, prizma,

örnek kuyucuğu ve fotoselden oluşur. Bunların her birine aydınlatma yoğunluğunu ve

dalga boyunu kontrol etmek ve fotoseldeki enerjiyi voltaj dalgalanmasına

dönüştürmek için uygun elektrik ya da mekanik sistemler bağlanmıştır. Oluşan voltaj

dalgalanması daha sonra metre ölçeğinde görüntülenir veya daha sonraki

incelemeler için bir bilgisayara kaydedilir.



Şekil 4. Işık iletimi şeması

Bütün moleküller ışık enerjisini belirli bir dalga boyunda emerler. Böylece bir çözelti

içindeki çözüntünün konsantrasyonunu bulmak olasıdır. Beer-Lambert kuralına göre

absorsiyon (emilim, soğurma) A (optik yoğunluk, OD olarak da adlandırılır) ile makro

molekülün konsantrasyonu (c) arasında aşağıdaki denklemde verilen doğrusal bir

ilişki vardır:

A=OD= ε.I.c

ε molar sönüm katsayısı (molar extinction coefficient), c konsantrasyon ve l küvetin

ışık yolu uzunluğudur. Proteinler ve nükleik asitler, ultraviyole alanda ışığı 210 ve 300

nm arasında emerler. Daha önce açıklandığı gibi DNA ve RNA çözeltilerinin

maksimum emilimi 260 nm’de, protein çözeltilerinin ise 280 nm’de olmaktadır. DNA

ve RNA çözeltileri ışığı kısmen 280 nm’de ve protein çözeltileri 260 nm’de

soğurduğundan 260 ve 280 nm (A260/A280) ölçüm aralığındaki bir oran, nukleik

asitlerin saflık değerini verir. DNA ve RNA yaklaşık olarak 1,8 ve 2,0 değerlerinde

A260/A280’e sahiptir. 10 mm’ lik bir ışık yolu ve 260 nm’lik bir dalga boyu için A=1

absorpsiyon, yaklaşık 50 µg/ml dsDNA, 37 µg/ml ssDNA, 40 µg/ml RNA veya 30

µg/ml oligonükleotidlere denk gelmektedir. Eğer proteinden kaynaklanan bir

kontaminasyon varsa A260/A280 yukarıda verilen değerlerden daha az olacaktır ve

nükleik asit miktarının doğru ölçümü mümkün olmayacaktır. Burada, DNA

çözeltilerinde RNA’dan kaynaklanan kirlenmelerin spektrofometre ile sağlıklı bir

şekilde tespit edilemeyeceğinin altını çizmek gerekir. 325 nm’de A ölçümü,

çözeltideki çöküntü varlığını ya da küvetin kirli olduğunu göstermede kullanılır.



Nükleik asit konsantrasyonunun belirlenmesi

Küvet seçimi: Absorbans (A) ölçümü için kullanılan nükleik asit miktarı küvet

kapasitesine bağlıdır. Örnek konsantrasyonuna, seyreltme faktörüne ve mevcut

örnek hacmine bağlı olarak uygun bir küvet, seçilmelidir. GDO saptaması için

kullanılan birçok prosedürde elde edilen genomik DNA’nın hacmi 50 ile 100 µl

arasındadır. Düşük hacimli nükleik asitlerin spektroskopik ölçümü için 5 ile 70 µl

kapasitede, mikro hacimli küvet çeşitleri kullanılır.

Kurulum : Spektrofotometrenin kalibrasyonu şu nedenlerle önemlidir :

Doğru ışık yolu uzunluğunu ayarlamak,

dsDNA, ssDNA veya RNA için doğru faktörü belirlemek,

Su ya da bir tampon solüsyonundan (A260=0) oluşan boş bir solüsyonu ölçmek

(kör),

Kurulum referansını belirli aralıklarla yenilemek,

Kurulum referansının güvenilirliliğini kontrol etmek için saf nükleik asitten belirli bir

miktar ölçmek

Bilinmeyen örneklerin ölçümü : Kullanılan küvetin kapasitesine bağlı olarak belirli

miktarda DNA çözeltisi konsantrasyon değerlendirmesi için kullanılır (örneğin 0,2

ml’nin altında kapasitesi olan bir küvet için 5 µl DNA 195 µl su ile seyreltilir).

Spektrofotometre ayarlandıktan ve nükleik asit çözeltisi eklendikten sonra küvetin

kapağı kapatılır, çözelti karıştırılır ve absorbans ölçülür. Pipetten kaynaklanan

hataları aza indirmek için ölçüm en az iki kere tekrarlanmalı ve her zaman en az 5 µl

DNA çözeltisi kullanılmalıdır. 0,02’den az veya 1 ile 1,5 (kullanılan cihaza bağlı

olarak) arasındaki A260 ölçümleri, yüksek hata payı olasılığı nedeniyle tavsiye

edilmemektedir.

Bir çözeltide bulunan belirli bir nükleik asitin c konsantrasyonu A260’ın 260 nm’de

ölçülen absorbans olduğu düşünülerek aşağıdaki denklemler kullanılarak hesaplanır.

Tek zincirli DNA c(pmol/µl) = A260/0,027

Çift zincirli DNA c(pmol/µl) = A260/0,020

Tek zincirli RNA c(pmol/µl) = A260/0,025

Oligonükleotid c(pmol/µl) = A260100/1,5NA+0,71NC+1,20NG+0,84NT



Referans DNA’nın, 50 µg/ml icin A260=1 olduğu dsDNA olduğu düşünülerek, 10 mm duvar

kalınlığı olan bir küvette 1x TNE tamponunda çözülmüş saf calf thymus DNA’nın absorbans

ölçümleri Tablo 2’de örneklenmiştir. DNA konsantrasyonu 25 µg/ml’dir.

Tablo 2. 1x TNE tamponundaki çok saf calf thymus DNA’nın absorbans ölçümleri

Dalga boyu Absorbans A260/A280 c (µg/ml)

325 0,01 - -

280 0,28 - -

260 0,56 2,0 28

230 0,30 - -



Deneysel

Ekipman

NOT

Ekipmanların tamamı kullanımdan önce sterilize edilmeli ve herhangi bir olası DNA kalıntısı

uzaklaştırılmalıdır. Kontaminasyondan kaçınmak için, aerosoldan korunmuş filtreli pipet

uçları kullanılmalıdır.

Steril bir jilet, veya bir havan gibi, örneğin boyutlarını küçültmede kullanılacak

aletler

Su banyosu veya ısıtıcı blok

Mikrosantrifüj

Mikropipetler

Vorteks karıştırıcı

1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri

Tartım kapları veya eşdeğeri

Spatüller

Terazi (0.01 g tartabilen)

Looplar

Mikrosantrifüj tüpleri için taşıyıcı raf

Opsiyonel : DNA peletlerini kurutmak için vakum desikatör

Çözeltiler

NOT

Kimyasalların tümü moleküler biyolojide kullanılabilir saflıkta olmalıdır. Deiyonize su ve

tamponlar kullanımdan önce otoklavlanmalıdır. Ayrıca, hiçbir kimyasal, DNA ve DNaz

içermemelidir.

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) CAS 124-03-8

Kloroform

İsopropanol

Na2EDTA CAS 6381-92-6



Etanol

NaCl

Proteinaz K

RNaz A

Tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)

Steril deiyonize su

CTAB tampon çözeltisi

20 g/l CTAB 4 g

1,4 M NaCl 16,4 g

0,1 M Tris HCl 3,15 g

20 mM Na2EDTA 1,5 g

100 ml deiyonize suya eklenir.

1 M NaOH ile pH 8’e ayarlanır.

Deiyonize su ile 200 ml’ ye tamamlanır ve otoklavlanır.

4°C’de maksimum 6 ay depolanır.

CTAB presipitasyon çözeltisi

5 g/l CTAB 1 g

0,04 M NaCl 0,5 g

Deiyonize su ile 100 ml’ ye tamamlanır.

Çözeltinin pH’sı 1 M NaOH ile 8’e ayarlanır.

Deiyonize su ile 200 ml’ye tamamlanır ve otoklavlanır.

Çözelti 4°C’ de maksimum 6 ay saklanır.

1,2 M NaCl

7 g NaCl deiyonize suda çözülerek 100 ml’ye tamamlanır.

Otoklavlanır ve oda sıcaklığında saklanır.

%70 (v/v) Etanol çözeltisi

70 ml saf etanol 30 ml steril deiyonize su ile karıştırılır.



RNAaz A 10 mg/ml -20°C’de saklanır.

Proteinaz K 20 mg/ml -20°C’de saklanır.

Prosedür

Bu prosedür steril koşullar gerektirir. Kontaminasyon, örnek hazırlama sırasında tek

kullanımlık ekipman ve dekontaminasyon çözeltileri kullanılarak ve toz oluşturmaktan

kaçınılarak engellenebilir.

Homojenize örnekten 100 mg steril bir 1,5 ml’lik mikrosantrifüj tüpe aktarılır.

300 µl steril deiyonize su eklenir, bir loop ile karıştırılır.

500 µl CTAB-tampon çözeltisi eklenir, bir loop ile karıştırılır.

20 µl Proteinaz K (20 mg/ml) eklenir, sallayıcı karıştırıcıda 65°C 30-90 dakika inkübe

edilir.

20 µl RNaz A (10 mg/ml) eklenir, sallayıcı karıştırıcıda 5-10 dakika inkübe edilir.

Yaklaşık 16000x g’de 10 dakika santrifüjlenir.

Süpernatant 500 µl kloroform içeren bir mikro santrifüj tüpüne eklenir, 30 saniye

karıştırılır.

Faz ayrılana kadar 16000x g’de 10 dakika santrifüjlenir.

Üst tabakanın 500 µl’si, 500 µl kloroform içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne

aktarılır ve karıştırılır.

16000x g’de 5 dakika santrifüjlenir.

Üst tabaka yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır.

2 hacim (çektiğimiz üst tabaka çözeltinin 2 katı) CTAB presipitasyon çözeltisi eklenir,

pipet ile karıştırılır.

60 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir.


Süpernatant atılır.

Pelet 350 µl NaCI (1,2 M)’de çözündürülür.

350 µl kloroform eklenir ve 30 saniye çalkalanır.

Faz ayrılana kadar 16000x g’de 10 dakika santrifüjlenir.

Üst tabaka yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır.

0,6 hacim izopropanol eklenir ve çalkalanır.



%70’lik Etanol çözeltisinden 500 µl eklenir ve dikkatlice karıştırılır.





Pelet kurutulur ve 100 µl steril deiyonize suda DNA tekrar çözündürülür.

DNA çözeltisi buzdolabında maksimum iki hafta, veya dondurucuda -20°C’de daha

uzun bir süre saklanabilir.



Kaynaklar

Hotzel, H., Müller, W. and Sachse, K. (1999). Recovery and characterization of

residual DNA from beer as a prerequisite for the detection of genetically modified

ingredients. European Food Research Technology 209, 192-196.

Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. and Engel, K.H. (1998). Detection of the genetic

modification in heat-treated products of Bt maize by polymerase chain reaction.

Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 206, 203-207.

Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and



foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.

Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E. (1999). IUPAC

collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and

maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923–928.

Meyer, R. and Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in

processed food products: development and validation of PCR assay for the

specific detection of glyphosate-tolerant soybeans. In Amadò, R. Battaglia (Eds.).

Proceedings of the ninth European conference on food chemistry (Vol. 1).

Authenticity and adulteration of food-the analytical approach. 24-26 September

1997. Interlaken 1, 23-28. ISBN: 3-9521414-0-2.

Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight

plant DNA. Nucleic Acids Research 8, 4321–4325.

Poms, R.E., Glössl, J. and Foissy, H. (2001). Increased sensitivity for detection of

specific target DNA in milk by concentration in milk fat. European Food Research

Technology 213, 361-365.

Wagner, D.B., Furnier, G.R., Saghay-Maroof, M.A., Williams, S.M., Dancik, B.P. and

Allard, R.W. (1987). Chloroplast DNA polymorphisms in lodgepole and jack pines




and their hybrids. Proceedings of the National Academy of Science USA 84,

2097–2100.

Zimmermann, A., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). Quantitative and qualitative

evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean

food samples. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207,

81–90.


Bölüm 5

Agaroz Jel Elektroforezi

M. Somma, M. Querci






Agaroz Jel Elektroforezi 2

İçindekiler

Bölüm 5

Agaroz Jel Elektroforezi

Giriş 3

Agaroz jel elektroforezinin fiziksel özellikleri 3

Agaroz jel elektroforez bileşenleri 6

Deneysel 8

Kaynaklar 12



Giriş

Jel elektroforezi, makromolekülleri büyüklük, elektrik yükü ve diğer fiziksel özellikler

temelinde ayıran bir yöntemdir. Elektroforez (electrophoresis) terimi yüklü

partiküllerin elektrik akımı etkisi altında hareketini açıklamaktadır. Elektro (electro)

elektriğe karşılık gelir, forez (phoresis) anlamı karşıya geçirmek/taşımak olan

Yunanca bir kelimedir. Jel elektroforezi elektrik varlığında hareketlenen moleküllerin

jel boyunca karşıya hareket ettiği bir tekniği tanımlar. Elektroforez için gerekli güç,

jelin iki ucunda bulunan elektrotlara uygulanan voltajdır. Bir elektrik alanının bir

molekülü hangi hızla jel ortamında hareket ettirdiği, molekülün özelliklerine bağlıdır.

Birçok önemli biyolojik makromolekül (örn. amino asitler, peptitler, proteinler,

nükleotidler ve nükleik asitler) iyonlaşabilen gruplara sahiptir ve pH’ya bağlı olarak

çözeltide katyon (+) ya da anyon (-) biçiminde, elektrik yükü taşıyan türler olarak

bulunurlar. Net yükün özelliğine bağlı olarak, yüklü partiküller katota veya anoda

doğru hareket edecektir. Örneğin, elektrik alanının uygulandığı jel nötral pH’da ise,

DNA’nın negatif yüklü fosfat grupları anoda doğru hareket eder (Westermeier, 1997).

Agaroz jel elektroforezi DNA moleküllerinin ayrımı, tanımlanması ve saflaştırılması

için kullanılan standart bir yöntemdir. Teknik basit, hızlı ve diğer prosedürlerle

ayrıştırılamayan DNA fragmanlarını çözebilme yeteneğindedir.Ayrıca DNA’nın jeldeki

konumunu, düşük konsantrasyonlarda floresan veren etidiyum bromid ile boyayarak

belirlemek mümkündür. Takip eden bölüm, agaroz jel elektroforezinin hazırlanması

için fiziksel ilkeleri, bileşenleri (jel matriksi, tampon, yükleme tamponu ve markör) ve

prosedürü açıklayacaktır (Sambrook ve ark., 1989).

Agaroz jel elektroforezinin fiziksel özellikleri

Jel elektroforezi nükleik asitlerin ve proteinlerin ayrılması için kullanılan bir tekniktir.

Makromoleküllerin ayrılması iki değişkene bağlıdır: yük ve kütle. DNA gibi biyolojik bir

örnek bir tampon çözeltiye karıştırıldığı ve jele uygulandığı zaman bu iki değişken

birlikte rol oynar. Bir elektrottan gelen elektrik akımı, molekülleri iterken aynı anda

diğer elektrot molekülleri kendine doğru çeker. Jeldeki sürtünme kaynaklı ayrım gücü

molekülleri büyüklüklerine göre ayırarak “moleküler elek” görevi yapar. Elektroforez

sırasında makromoleküller, jelin porlarında hareket etmeye zorlanır. Elektrik alanı

altında hareket oranları şu faktörlere bağlıdır:

Alanın gücü



Moleküllerin büyüklüğü ve şekli

Örneklerin göreceli hidrofobisitesi

Moleküllerin içinde hareket ettiği tamponun iyonik kuvveti ve sıcaklığı

Elektroforezle ilgili basit denklemlerin incelenmesi, jel elektroforezinde yüklü

partiküllerin ayrılmasının tam olarak anlaşılması açısından önemlidir. Elektrotlara

voltaj uygulandığında, potensiyal gradient, E, oluşur ve şu eşitlikle açıklanabilir :

E = V / d (1)

V, uygulanan voltaj ve d elektrotların cm olarak birbirinden uzaklığıdır.

Potansiyel gradient, E, uygulandığı zaman, yüklü moleküller üzerinde bir güç, F,

oluşur ve şu eşitlikle açıklanır :

F = E q (2)

q molekül üzerindeki yüktür (Coulomb). Bu güç Newton cinsinden ölçülebilir ve yüklü

molekülün elektroda doğru hareket etmesini sağlar.

Aynı zamanda yüklü moleküllerin hareketini yavaşlatan, sürtünmeden doğan bir de

direnç vardır. Bu direnç fonksiyonları :

Molekülün hidrodinamik büyüklüğü

Molekülün şekli

Elektroforez için kullanılan ortamdaki por büyüklüğü

Tamponun yoğunluğudur.

Elektrik alanında yüklü moleküllerin hızı (v) potansiyel gradient, yük ve sürtünme

gücünün bir fonksiyonudur ve şu eşitlikle açıklanabilir:

v = E q / f (3)

f sürtünme katsayısıdır.

Bir iyonun elektroforetik hareketi, M,iyon hızının potansiyel gradiente bölünmesi

biçiminde gösterilir

M = v / E (4)

Buna ek olarak eşitlik 3’te görüldüğü gibi elektroforetik hareket M,molekül yükünün q

, sürütnme katsayısı f ‘e bölünmesi bçiminde de gösterilebilir



M = q / f (5)

Potansiyel gradient uygulandığında farklı yüklü moleküller farklı elektroforetik

hareketliliğe (M) bağlı olarak ayrılmaya başlayacaktır. Elektroforetik hareketlilik yüklü

grubun pK değerine ve molekül büyüklüğüne bağlı olarak, yüklü bir molekülün

önemli ve karakteristik bir parametresidir. Farklı sürtünme kuvvetlerine maruz

kalacaklarından, aynı yükü taşıan moleküüler dahi farklı molekül büyüklüklükleri

sebebi ile ayrılmaya başlayacaktır. Lineer çift zincirli DNA, jel matrislerinde baz

çiftlerin sayısının log10’una ters orantılı şekilde hareket eder. Daha büyük moleküller

daha fazla sürtünme engeli ile karşılaşırlar ve jelin porlarında daha etkisiz bir şekilde

hareket ettikleri için daha yavaştırlar.

Çözeltideki elektrotlar arasındaki akım, çoğunlukla tampon iyonlar tarafından

iletilirken, çok az bir bölümü de örnekteki iyonlar tarafından iletilir. Akım I, voltaj V ve

direnç R arasındaki ilişki Ohm Kanunu’nda şöyle gösterilir:

R = V / I (6)

Bu denklem, R dirençi için uygulanan V voltajını arttırarak elektroforetik ayrıştırmanın

hızlandırılabileceğini gösterir. Bu da I akımında bir artışla sonuçlanır. Kat edilen

uzaklık hem akım hem de zamanla orantılı olacaktır. Ancak, V voltajındaki artış ve

buna bağlı olarak I akımındaki artış, çoğu elektroforez türünun başlıca

problemlerinden biri olan ısı oluşumuna yol açar. Bu durum, elektroforez sırasında

oluşan Watt olarak ölçülen W gücünün, direnç ile akımın karesinin çarpılması

biçiminde hesaplandığı şu denklemle gösterilir:

W = I2 R ( 7)

Elektroforez işleminde üretilen gücün büyük bölümü ısı olarak dağılacağı için şu

zararlı etkiler ortaya çıkabilir:

Ayrıştırılan örneklerin yayılmasına neden olan tampon iyonlarının ve örneğin

difüzyon oranında bir artış,

Ayrıştırılmış örneklerin karışmasına neden olan konveksiyon (ısıyayım)

akımlarının oluşumu,

Isıya duyarlı olan örneklerde intabilizasyon (örn. DNA’nın denaturasyonu),

Tampon yoğunluğunda azalma ve buna bağlı olarak ortam direncinin düşmesi.



Agaroz jel elektroforez bileşenleri

Agaroz

Deniz yosunundan ekstrakte edilen doğal bir kolloit olan agaroz, galaktoz ve 3,6-

anhidrogalaktoz ünitelerinin ardışık olarak yer aldığı agarobioz ünitelerinin

tekrarlanmasından oluşan ve moleküler kütlesi yaklaşık 12.000 Da olan lineer bir

polisakkarittir. Agaroz çok hassastır ve elle dokunulduğunda kolayca bozulabilir.

Agaroz jel büyük por çapına sahiptir ve temelde 200 kDa’dan daha büyük

molekülerin ayrılmasında kullanılır.

Agaroz jel elektroforez işlemi hızlıdır, fakat agaroz jellerde oluşan bantlar bulnaıkça

ve dağılmaya meyilli oldukları için çözünürlüğü sınırlıdır. Bu por çapının bir

sonucudur ve kontrol edilemez. Agaroz jel kuru toz halindeki agarozun sıvı bir

tampon içine konması ve sonra karışımın, agaroz berrak bir çözeltiye dönüşene

kadar kaynatılmasıyla oluşturulur. Daha sonra bu çözelti jel tepsisine dökülür ve oda

sıcaklığında katılaşıncaya kadar soğutulur. Katılaştıktan sonra yoğunluğu agaroz

konsantrasyonuyla belirlenen bir matris oluşturur.

Elektroforez tamponu

DNA’nın elektroforetik hareketliliği elektroforez tamponunun kompozisyonuna ve

iyonik gücüne göre değişir. İyonların yokluğunda, eletrik iletimi en düşük düzeydedir

ve DNA çok yavaş hareket eder yahut hiç etmez. Yüksek iyonik güçlü bir tamponda

ise elektrik iletimi çok verimlidir fakat önemli miktarda ısı oluşur. En kötü durumda bu

ısı sebebi ile jel erir ve DNA denatüre olur.

Doğal çift zincirli DNA elektroforezinde kullanılan bir takım tamponlar mevcuttur.

Bunlar genellikle EDTA (pH 8,0) ve yaklaşık 50 mM (pH 7,5-7,8) konsantrasyonunda

Tris-asetat (TAE), Tris-borat (TBE), veya Tris-fosfat (TPE) içerir. Elektroforez

tamponları genellikle konsantre solüsyonlar olarak hazırlanır ve oda sıcaklığında

saklanır. TBE, agaroz jel elektroforezi için başlangıçta 1x çalışma gücünde

kullanılmıştır. Ancak, 0,5x çalışma solüsyonu yeterinden fazla tamponlama

kapasitesine sahiptir ve artık hemen hemen tüm agaroz jel elektroforezleri bu tampon

konsantrasyonu kullanılarak yapılmaktadır.

Agaroz konsantrasyonu

Belirli büyüklükteki bir DNA parçası agarozun konsantrasyonuna bağlı olarak jel

içinde farklı hızlarda hareket eder. Belirli konsantrasyondaki agaroz ve/veya tampon



için 20 ile 50.000 bp arasında büyüklüğe sahip bir DNA parçasını ayırmak

mümkündür. Yatay jellerde agaroz genellikle %0,7 ile %3 arasındaki

konsantrasyonlarda kullanılır (Tablo 1) .

Tablo 1. Lineer DNA moleküllerinin ayrımı için tavsiye edilen agaroz jel

konsantrasyonu

% agaroz DNA büyüklük aralığı (bp)

0,75 10.000-15.000

1,00 500-10.000

1,25 300-5000

1,5 200-4000

2,00 100-2500

2,5 50-1000

Markör DNA

Belirli bir voltaj, agaroz jel ve tampon konsantrasyonu için hareket aralığı, başlangıç

materyalinin molekül ağırlığına bağlıdır. Bu yüzden belirli bir büyüklükteki markör

DNA, jelin sağ ve sol yanlarındaki kuyucuklara yüklenmelidir. Genellikle bir markör

DNA belirli sayıda,ağırlığı bilinen DNA parçaları içerir. Bu da elektroforez sırasında

jel sistematik bir bozukluğa uğrarsa bilinmeyen DNA’ların büyüklüğünü saptamayı

kolaylaştırır.

Yürütme tamponu

Öncelikle agaroz jele yüklenecek DNA örnekleri, genellikle su, sakaroz ve bir

boyadan (örn ksilen siyanol, bromofenol mavi, bromokresol yeşil vb) oluşan yürütme

tamponuyla karıştırılır. Yüklenecek DNA’nın maksimum miktarı parçaların sayısına

bağlıdır. Etidiyum bromid ile boyanmış bir jelin fotoğrafıyla belirlenebilen minimum

DNA miktarı, 0,5 cm genişliğindeki bir bantta, 2 ng’dır. Bu genişlikteki bir bantta 500

ng’dan daha fazla DNA varsa kuyucuk aşırı yüklenecektir ve bu da bulanıklığa yol

açacaktır. Yürütme tamponunun üç görevi vardır:

Örneğin yoğunluğunu arttırarak DNA’nın kuyuya eşit bir şekilde yayılmasını

sağlamak

Örneğe renk katmak ve bu sayede yükleme işlemini basitleştirmek,

Elektrik alanında tahmin edilebilir bir hızda anoda doğru hareket eden örneğe

renk vermek



Deneysel

NOT

Etidiyum bromid güçlü bir mutajen/karsinojendir ve orta düzeyde toksiktir. Etidiyum bromid

içeren jellere ve solüsyonlara elle dokunurken mutlaka eldiven giyilmelidir.

Malzeme

Güç kaynağı olan yatay elektroforez ünitesi

Mikrodalga fırın yada ısıtıcılı karıştırıcı

Mikropipetler

1,5 ml reaksiyon tüpleri

Terazi (0.1 g tartabilen)

Spatulalar

Reaksiyon tüpleri için taşıma rafı

Cam malzeme

Transilluminatör (UV , 312 nm)

Belgeleme için gerekli cihazlar (örn polaroid fotoğraf makinesi veya kamera)

Çözeltiler

Agaroz, DNA elektroforezine uygun

Tris (hydroxymethyl) aminometan (Tris) (CAS 77-68-1)

Borik asit

Na2EDTA (CAS 6361-92-6)

Etidiyum bromid (CAS 1239-45-8)

Sukroz

Ksilen siyanol FF (CAS 2650-17-1)

DNA Markörleri :

Lambda DNA EcoRI / Hind III (ya da benzer ve aynı amaçlı kullanılabilecek

markörler)

100 bp DNA ladder



10x TBE Tamponu (1 litre)

Tris 54,0 g

Borik Asit 27,5 g

Na2EDTA 7,44 g

Tartılan kimyasallar deiyonize suda çözülür, pH 8,3’e ayarlanır ve 1 litreye

tamanlanır.

Oda sıcaklığında depolanır.

6x Yükleme tamponu (10 ml)

Ksilen siyanol FF 0,025 g

Sukroz 4 g

Sukroz ve Ksilen siyanol FF 10 ml çözelti hazırlamak üzere deioynize suya

eklenir.

Çözelti iyice karıştırılır ve otoklavlanır. Otoklavlandıktan sonra 4°C’de

saklanır.



Prosedür

Temiz ve kuru plastik bir jel tepsisinin kenarları bantla ya da başka bir şekilde

kapatılır.Agaroz solüsyonu eklendiğinde yükleme kuyuların oluşması için uygun

tarak yerleştirilir.

Elektroforez haznesini doldurmak ve jeli hazırlamak amacıyla 10x TBE tamponu,

uygun miktarda 0,5x TBE tamponu elde etmek için seyreltilir.

Analiz edilecek örneğe ait standart çalışma prosedürü tarafından önerilen

miktarda toz agaroz tartılır. Agaroz jel konsantrayonunu belirlemek için mutlaka

analizi yapılacak örneğe ait standart çalışma prosedürüne bakılmalıdır. Buna

göre agaroz jel elektroforezi uygulanacak örnek, izole edilen DNA ya da elde

edilen PCR ürünü olabilir.

Toz halindeki agaroz Tablo 2’ye göre tartılır ve bir Erlenmeyerde uygun miktarda

0,5x TBE tamponuna eklenir (genellikle 15x15 cm bir jel tepsisi için 150 ml jel

solüsyonu ve 15x10 cm bir jel tepsisi için 100 ml jel solüsyonu kullanılır).

Tablo 2. Kurs sırasında kullanılan agaroz jel konsantrasyonları.

GM

O3

GM

O4

ZE

IN3

ZE

IN4

p35

S-c

f3

p35

S-c

r4

HA

-no

s118

-f

HA

-no

s118

-r

CR

YIA

3

CR

YIA

4

GM

O7

GM

O8

mg

3

mg

4

gen

om

ik

DN

A

% 0,8 -1 X

% 1,5 X X

% 2 X X X X X

Karışım agaroz eriyene kadar, kaynayan bir su banyosunda ya da mikrodalga

fırında ısıtılır (ısıttıktan sonra solüsyonun hacmi kontrol edilir)

Karışım 50-60°C’ye kadar soğutulduktan sonra 10 mg/ml stok solüsyonundan

son konsantrasyon 0,2 µg/ml olacak şekilde etidiyum bromid ilave edilir ve iyice

karıştırılır ( jeli köpürtmemeye, kabarcık oluşturmamaya dikkat ediniz).

Solüsyon jel tepsisine dökülür ve jelin katılaşması beklenir. Oluşan jelin kalınlığı

yaklaşık 3-5 mm olmalıdır.

Jel tamamen katılaştıktan sonra tarak ve bant dikkatli bir şekilde çıkarılır ve jel

elektroforez haznesine yerleştirilir.

Jeli 2-5 mm derinliğinde kaplaması için yeterli miktarda 0,5x TBE tamponu

elektroforez ünitesine eklenir.



Genomik DNA için yükleme örnekleri ve markör hazırlanması aşağıdaki şekilde

gerçekleştirilir.

Örnek Markör

Su 3 µL Su 6 µL

Yükleme tampon 2 µL Yükleme tamponu 2 µL

Örnek 5 µL DNAEcoRI/HindIII 2 µL

10 µL 10 µL

PCR ürünleri için yükleme örnekleri ve markör hazırlanması aşağıdaki şekilde

gerçekleştirilir.

Örnek Markör

Yükleme tamponu 2 µL

Örnek 8 µL 100 bp DNA Ladder 15 µL

10 µL

Her örnegin 10 µl’si birbirini izleyen kuyulara, uygun DNA markörü ilk ve son

kuyucuğa yüklenir.

DNA’nın anoda doğru hareket edeceği biçimde jel haznesinin kapağı kapatılır (

anod jelin alt ucunda). 5-10 V/cm voltaj uygulanır.

Ksilen siyanol jelin içinde uygun uzaklığa hareket edene kadar elektroforez

yürütülür (yaklaşık 40-60 dakika).

Akım kapatılır, elektrodlar ve jel haznesinin kapağı çıkartılır. Dışarı alınan jel UV

ışık kutusunun üstüne yerleştirilir ve fotoğrafı çekilir.

Jel etidiyum bromid katı çöp kutusuna atılır.




Kaynaklar

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Gel electrophoresis of DNA. In:

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a

Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring

Harbor, NY, USA, chapter 6.

Westermeier, R. (1997). Electrophoresis in Practice: a Guide to Methods and

Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.


Bölüm 6

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

M. Somma, M. Querci






Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 2

İçindekiler

Bölüm 6

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

Giriş 3

DNA’nın içeriği, yapısı ve replikasyonu 3

PCR prensipleri 9

PCR cihazları ve içeriği 12

PCR için primer tasarımı 16

Özelleştirilmiş PCR 20

Pratikte PCR 21

Kaynaklar 28



Giriş

1985 yılında K. Mullis ve arkadaşları tarafından PCR (Polymerase Chain Reaction)’ın

bulunmasıyla moleküler biyoloji ve moleküler tıp yenilenmiştir (Jaiki ve ark. 1985).

PCR, bir DNA zincirinin bilinen iki parçası arasında uzanan özel bir DNA bölümünün

enzimatik olarak çoğaltıldığı in vitro bir tekniktir. Başlangıçta belirli bir genin sadece

küçük bir parçası elde edilebilirken, günümüzde PCR kullanılarak birkaç saat içinde

tek bir gen kopyasından milyonlarca kopya çoğaltılabilir.

PCR teknikleri diagnostik ve adli tıpta genlerin belirlenmesi ve özel DNA parçalarının

klonlanması ve gen ifade modellerinin tespit edilmesinde önem kazanmıştır.

Günümüzde PCR bakteri kontaminasyonu, genetiği değiştirilmiş DNAnın varlığı ve

gıda içeriklerinin özgünlüğünün kontrolü gibi yeni alanlarda da incelemeye olanak

sağlamaktadır. PCR ve uygulamalarını anlayabilmek içinöncelikle DNA molekülünün

doğal yapısı anlaşılmalıdır. Bu nedenle izleyen bölümlerde DNA’nın yapısı ve

replikasyonu açıklanmıştır.

DNA’nın içeriği, yapısı ve replikasyonu

DNA’nın içeriği:

DNA genetik bilgiyi taşıdığı nükleotidlerin sekansında şifrelenmiş olarak saklayan,

fosforik asit ve deoksiriboz ünitelerinin oluşturduğu iki paralel zincirin, pürin ve

pirimidin bazlarınca çapraz olarak bağlanması ile ortaya çıkan sağ yönlü sarmal

yapıya sahip bir moleküldür. Ökaryot hücrelerde DNA’nın çoğu çekirdek içinde

bulunur ve kromozomal DNA olarak adlandırılır. Çift katlı bir zar (çekirdek kılıfı) ile

hücrenin geri kalanından (sitoplazma) ayrılır.

Buna ek olarak, mitokondri ve kloroplastlarda ekstra kromozomal DNA bulunabilir.

DNA nın yapı taşı olan nükleotidler aşağıdaki gibidir

dATP (deoksiadenozin trifosfat)

dGTP (deoksiguanin trifosfat)

dCTP (deoksisitozin trifosfat)

dTTP (deoksitimin trifosfat)



İsimlendirme kolaylığı için bu dört nükleotid dNTP (deoksinükleosid trifosfat) olarak

adlandırılır. Bir nükleotid üç ana bölümden oluşur, pürin (adenin A veya guanin G)

veya pirimidin bazları (sitozin C veya timin T), pentoz şeker molekülü (deoksiriboz) ve

trifosfat grup. Şekil 1’de görüldüğü gibi pürin veya pirimidin bazları pentoz zincirine N-

glikosidik bağ ile ve fosfat grubu 5’ şekerin karbon atomuna diester bağ ile bağlanır.

Ribonükleik asitte (RNA), timinin yerini urasil, deoksiribozun yerini de riboz alır.

Şekil 1. Nükleotidlerin içeriği (Şekil: Andy Vierstraete, 1999)

DNA’nın yapısı:

Şekil 2 nükleotidlerin bir DNA zincirini nasıl oluşturduğunu göstermektedir. DNA

nükleotidleri, fosfat grubunun (şeker molekülünün beşinci karbon atomuna

bağlanmış) önceki nükleotidin şeker molekülünün 3. karbon atomundaki hidroksil

grup ile bağlanması ile oluşur. Bunu sağlamak için difosfat grubu ayrılır (ve enerji

açığa çıkar). Bu zincirin daima 3’ ucuna yeni nükleotidlerin eklenebildiği anlamına

gelir. Şekil 3’de görüldüğü gibi DNA çift ipliklidir (bazı virüsler dışında). İki iplik

birbiriyle tam bir şekilde eşleşir. İplikteki her baz diğer iplikte yalnız bir tip bazla

eşleşerek baz çiftini (bp) oluşturur. A daima T ile iki hidrojen bağı, C daima G ile üç

hidrojen bağı oluşturur. Bu yolla, iki zincir birbirine tamamlayıcı (komplement) olur. Bir

zincir diğerinin üretimi için atasal olarak görev yapar.



Şekil 2. Tek nükleotidlerden DNA zincir oluşumu (Şekil: Andy Vierstraete, 1999)

Bazlar çift sarmal yapının içinde hidrofobik bir çekirdek oluşturur. Şekerler ve fosfat

grupları (anyonik formlarında) molekülün dış hidrofilik katmanını oluşturur. Fizyolojik

durumlarda çift iplikli DNA sarmalı tek iplikli DNA sarmalından daha dayanıklıdır.

DNA’nın replikasyonu:

DNA bir organizmanın yapısını ve fonksiyonunu bütünüyle tanımlayan tüm genetik

bilgiyi içerir. Genetik bilginin aktarımından üç farklı işlem sorumludur:

Replikasyon

Transkripsiyon

Translasyon

Replikasyon esnasında çift iplikli bir nükleik asit molekülü , eş kopyalar verebilmek

için birebir çoğaltılır. Bu işlem genetik bilginin değişmeden korunarak sürekliliğini

sağlar. Transkripsiyon sırasında, bir gene karşılık gelen DNA parçası okunurak tek

iplikli bir RNA sekansı ile ifade edilir. Bu RNA molekülü çekirdekten sitoplazmaya

hareket eder. Translasyon sırasında RNA sekansı sitoplazmada, protein oluşturan

aminoasit zincirine çevrilir (Alberts ve ark. 1983).



Şekil 3. Hücrede DNA’nın yapısı (Şekil: Andy Vierstraete, 1999)



DNA replikasyonu PCR amplifikasyonunun dayandığı işlemdir. Replikasyon

sırasında, DNA molekülünün çift sarmal yapısı çözülerek açılır ve her iplik, yeni bir

tamamlayıcı ipliğin sentezi için ata olur. Her yavru molekül bir eski bir de yeni DNA

ipliğinden oluşur ve ana molekülün birebir kopyasıdır.

Şekil 4. Replikasyon çatalı

Çift sarmalın açılması ve yeni DNA ipliğinin sentezlenmesi için bir çok enzim

gereklidir. Topoizomeraz ve helikazlar DNA’nın sarmal yapısını kırarak çözmek ve

DNA’nın tek ipliğinin çentiklenerek açılmasından sorumludur.

Böylece primaz (primezom olarak tanımlanan bir protein grubunun bir parçası) enzimi

DNA polimerazın senteze başlayacağı 3’ OH bölgesinde görev yapmak için küçük bir

RNA primerini tek iplikli DNA’ya bağlar. Bu RNA primeri daha sonra RNAaz H

tarafından uzaklaştırılır ve kalan boşluk DNA polimeraz I tarafından doldurulur. Bu

safhada, DNA polimeraz DNA’nın tek ipliğinde ilerler. DNA polimerazın farklı tipleri

vardır, fakat yeni DNA ipliklerinin ilerleyen sentezinden prokaryotlarda DNA

polimeraz III sorumludur. DNA polimeraz ata iplikteki bazları uygun komplementer

serbest dNTP ile hidrojen bağları ile bağlar (A, T ile; G, C ile). Aynı zamanda oluşan

ipliğin bir önceki nükleotidi ile bu yeni nükleotid arasında kovalent fosfodiester bağ

oluşturur. Trifosfatta saklanan enerji her yeni nükleotidin büyüyen ikinci ipliğe

kovalent bağla bağlanması için kullanılır.DNA polimeraz yalnızca 5’ uçtan 3’ uca

doğru çalışır. Çift sarmalın bir ipliği 5’ uçtan 3’ uca doğru olduğu için, diğeri de 3’



uçtan 5’ uca doğrudur. DNA polimeraz 5’ uçtan 3’ uca doğru olan ipliğin (lagging

strand) ikinci kopyasını parçalar halinde (Okazaki fragmanları) oluşturur (Ogawa ve

Okazaki 1980). 5’ uçtan 3’ uca olan ipliğin gen kopyasının sentezlenmesi şekil 4’de

görülmektedir. Diğer iplik (leading strand) sarmal açıldıkça 5’ uçtan 3’ uca direkt

olarak sentezlenir. DNA polimeraz boş bir tek iplikte, ex novo olarak sentezlemeye

başlayamaz, mutlaka dNTP’yi bağlayacağı serbest bir OH grubuna sahip bir primere

ihtiyaç duyar.

Ligaz enzimi serbest ama komşu olan 3’ OH ve 5’ fosfat grupları arasında

fosfodiester bağın oluşumunu katalize eder. Bu aktivite, RNA primerinin ayrılmasını

takiben arada kalan küçük bölümlerin,molekülün geri kalanına bağlanmasını sağlar.

SSB (single strand binding, tek iplik bağlanıcısı) proteinleri replikasyon çatalının

dayanıklılığını korumak için çok önemlidir. Tek iplikli DNA oldukça kırılgan ve

dayanıksızdır bu nedenle bu proteinler tek iplikli kaldığında DNA’ya bağlanarak onu

parçalanmaktan korur.



PCR prensipleri

PCR hücre içinde (in vivo) DNA’nın kendini eşlemesi mekanizmasına dayanır. Çift

zincirli DNA (dsDNA), tek zincirli DNA (ssDNA) biçimine çözülür, kopyalanarak

çoğaltılır ve tekrar bağlanır. Bu teknik;

çift sarmal DNA’nın yüksek sıcaklıkta çözülerek tek sarmal haline gelmesi:

denatürasyon

primer olarak kullanılan iki oligonükleotidin hedef DNA’ya bağlanması: primer

eşleşmesi

Mg+2 iyonlarının varlığında, katalizör olan DNA polimeraz ile primerlere

nükleotid eklenmesi ve DNA zincirinin uzaması: primer uzaması

İşlem döngülerinin bir çok tekrarından oluşur.

Genellikle kısa zincirlerden oluşan oligonükleotidler, birbirlerinden dizin olarak

farklıdır. Primerlerin sekansı, çoğaltacak hedef DNA’ya komşu tanımlama bölgelerine

eştir. Denatürasyon, primer birleşmesi ve primer uzaması PCR metodunda bir

döngüyü oluşturur. Şekil 5’de PCR işlemindeki üç ana basamak gösterilmektedir.

Şekil 5. PCR çoğalmasının basamakları (resim Andy Vierstraete,1999)



Her döngünün sonunda yeni sentezlenen DNA zincirleri, bir sonraki döngü için hedef

(ata) zincir olabilir. Şekil 6’da görüldüğü gibi, bu reaksiyonun ana ürünü, sonu

oligonükleotid primerlerin 5’ ucu olan ve uzunluğu primerler arası uzaklıkla

tanımlanan bir dsDNA parçasıdır. Başarılı bir amplifikasyonun ilk döngüsünün

ürünleri, iki primerin bağlanma bölgeleri arasındaki uzaklıktan daha fazla uzunluğa

sahip, farklı boyutlarda DNA moleküllerdir. İkinci döngüde, istenen uzunluktaki DNA

zincirleri oluşur. Bu ürünün miktarı diğer amplifikasyon döngülerinde lineer olarak

çoğalır ve reaksiyonun temel çıktısını oluşturur. Amplifikasyon, başlangıçtaki ana

zincirin reaksiyon sonundaki kopya sayısı biçiminde aşağıdaki formülle açıklanır:

(2n-2n)x

Burada n döngü sayısı, 2n ilk ve ikinci döngüden sonra elde edilen uzunluğu

bilinmeyen ürünler, x ana zincirin kopya sayısıdır. Potansiyel olarak 20 döngüden

sonra her döngüde %100 başarı ile, 220 kez amplifikasyon olacaktır. PCR’ın başarısı,

uygulanan optimizasyon düzeyine göre ve atadan ataya değişir. PCR

amplifikasyonunun üç aşamsının detaylı tanımları (ata denatürasyonu, primer

bağlanması ve uzaması) aşağıdaki paragraflarda verilmiştir (Sambrook ve ark 1989).

Şekil 6. DNA’nın PCR ile üstel çoğaltılması

Template Denatürasyonu:

Denatürasyon esnasında, çift sarmal çözüler, bütün enzimatik reaksiyonlar durur

(örn. bir önceki döngüdeki uzama). İki eş zincir artan sıcaklık ile birbirinden ayrılır. Bu

işlem denatürasyon (bozulma) olarak adlandırılır. DNA denatürasyonunu sağlamak



için sıcaklık yaklaşık 93-96°C ‘ye çıkarılır. Bu sayede kuvvetli hidrojen bağları kırılır

ve eşleşmemiş bazların sayısı artar. Ortamdaki tüm çift sarmal (ds) DNA, tek sarmal

(ss) DNA formuna dönüştüğünde reaksiyon tamamlanır. Mevcut dsDNA’nın yarısının

tek sarmal haline dönüştüğü sıcaklık Tm, erime sıcaklığı olarak bilinir. Kullanılan

çözücü, tuz derişimleri ve ortam pHsı denatürasyon işlemini etkiler. Örneğin, düşük

tuz derişimlerinde, yüksek pH ve formaldehit gibi organik çözücülerin varlığında Tm

düşer. DNA’nın içerdiği nükleotid çiftlerinin oranı yani G/C ve T/A miktarları da Tm

değerini etkiler. G/C miktarı yüksek olan DNA’nın Tm’i, T/A miktarı yüksek olan

DNA’ya göre daha yüksektir. Örneğin Serratia marecescens %60 G/C ile yaklaşık

94°C Tm’e sahipken, Pneumococcus %40 G/C ile 85°C Tm’e sahiptir.

Primer Eşleşmesi:

DNA zincirlerinin eşleşmesi veya yeniden bağlanması daha düşük sıcaklıklarda

gerçekleşir (genellikle 55-65°C). Sıcaklık düşünce, birbirine eş iki ssDNA zinciri

yeniden bağlanarak dsDNA oluşturur. Bu fazda, tek zincir primerler ile tek zincir

hedef DNA arasında hidrojen bağlar oluşur ve kırılır. Hedef DNA’ya tam olarak

eşleşen primer ile ana zincir arasındaki bağlar daha sağlam ve uzun süreli olur.

Ortaya çıkan bu küçük dsDNA parçası (primer-template) üzerine DNA polimeraz

bağlanarak ana zinciri kopyalamaya başlar. Birkaç baz eklendikten sonra primer ve

template arasındaki iyonik bağ kuvvetlenir ve kırılmaz.

Primer Uzaması:

Sıcaklığa dayanıklı DNA polimeraz (genellikle Taq DNA Polimeraz) ile dNTP’lerin

varlığında primerler hedef zincir boyunca uzatılır. Bu reaksiyon başlangıçtaki hedef

DNA materyalinin iki katına çıkması ile sonuçlanır (birebir kopyalama). Taq

Polimerazın optimum çalışma sıcakllığı 72°C’dir. Primerler bir kaç baz uzadıktan

sonra, hedef DNA’ya karşı daha yüksek iyonik çekime sahip olurlar. Bu da yapılan

işlemin geri dönüşünü engeller. Tam olarak eşleşmeyen (uyuşmayan) primerler

yüksek sıcaklıktan dolayı gevşer ve böylelikle reaksiyon DNA parçasının uzaması ile

sonuçlanmaz. Ana DNA’ya eş olan bazlar primere 3’ kısmından bağlanır. Polimeraz

ana zinciri 3’-5’ yönünde okurken, 5’-3’ yönünde dNTP ekler. Primer uzama

basamağının süresi, çoğaltılacak DNA uzun ise arttırılabilir. Ancak genellikle PCR

deneylerinde 1 dakikalık uzama zamanı tam sentez için yeterlidir.



PCR aletleri ve içeriği

Aletler

PCR işleminin otomatik hale gelmesini iki temel gelişme izin sağlamıştır

a. Sıcağa dayanıklı, yüksek sıcaklıkta aktivitesini koruyan DNA polimerazların

kullanımı. Böylece reaksiyonun başlangıcında eklenen polimeraz sayısız işlem

döngüsü boyunca aynı aktiviteyi gösterir.

b. Sıcaklığın programlı olarak hızlı bir şekilde düşürüp yükseltilebildiği ısı

banyolarının gelişmesi. Bunlar PCR cihazları ya da termal cycler olarak bilinir.

Kullanılan PCR cihazlarının farklı tasarımları mevcuttur. Örneğin: sıvılarla ısıtma ve

soğutma, elektriksel rezistansla ısıtma ve sıvılarla soğutma ve elektrik rezistansla ısıtma

yarı iletkenlerle soğutma. Üç aşamalı işlemin tipik sıcaklık döngü profili Şekil 7’de

görülmektedir.

Aşağıda bahsedilecek olan reaksiyon girdileri ve döngü sayısının yanısıra,

denatürasyon, primer bağlanması, primer uzaması gibi daha önce bahsedilen termal

döngü parametreleri de başarılı bir PCR için kritiktir.

Şekil 7. PCR sıcaklığı değişim profili

Hedef DNA

PCR amplifikasyonu prensip olarak, hedef genin en azından bir tam kopyası

bulunduğunda yapılabilir. Çok sayıda hedef gen kopya sayısı başarılı DNA

amplifikasyon olasılığını arttırır. Hedef DNA yapısında herhangi bir hasar (örneğin

kırılma) PCR amplifikasyonunu durdurur. Hedef zincirin uzunluğu <0,1’den birkaç

kilobaza kadar olabilir. PCR’de kullanılan toplam DNA miktarı hedef DNA’nın tek



kopyasının belirlenmesine olanak sağladığı için 0,05 ile 1 µg arasında olur. Kullanılan

numunenin çok saf olması gerekmemekle beraber heparin, heme, formalin, Mg+2

şelatlayıcı ve deterjan gibi maddeler amplifikasyon işlemini engelleyebilir.

Primerler (Öncüler)

Genellikle yüksek bağlanma sıcaklıklarında kullanılabilmesi açısından 16-30

nükleotid uzunlukta primerler kullanılır. Primerlerde hedef ile uygun olmayan

bağlanmalar yapabilecek polibaz zincir uzamalarından (örneğin poli dG), veya tekrar

eden motiflerden kaçınılmalıdır. Hedef DNA’ya hibridizasyonu engelleyeceği için

primerde ikincil yapı oluşmasına yol açan tekrar eden ters zincirlerden kaçınılmalıdır.

PCR’da kullanılan primerlerin birbirlerine tamamlayıcı olmaması primerler arasında

hibridizasyon veya primer–dimer oluşumlarını engellemek için önemlidir (özellikler

primerin 3’ ucu için). Eğer mümkünse uzayacak olan kısmın bağlanmasını arttırmak

için primerin 3’ ucunda çok sayıda G ve C bazları bulunmalıdır. Primerler arasındaki

mesafe 10kb’den az olmalıdır. Genellikle primerler arasındaki uzaklık 3kb’den fazla

olunca PCR ürününde önemli ölçüde azalma görülür. Genelde PCR’da

oligonükleotidler 1 µM derişimde kullanılırlar. Bu miktar 30 döngülük bir PCR için

yeterlidir. Yüksek miktarlarda oligonükleotid istenmeyen bölgelerin amplifikasyonuna

sebep olabilir. Buna karşılık düşük primer konsantrasyonları PCR verimini azaltır.

DNA Polimeraz

Orijinal PCR metodunda E. coli DNA polimeraz I’in Klenow parçası kullanılmıştır

(Saiki ve ark. 1985). Ancak bu enzim hedef dsDNA’yı denatüre etmek için gerekli

olan sıcaklıktan daha düşük sıcaklıklarda bozulmaktadır. Bu nedenle ilk çalışmalarda

her döngüden sonra reaksiyonayeni enzim eklenmesi gerekiyordu. Buna ek olarak

farklı sıcaklıklarda gerçekleşen denatürasyon, bağlanma ve uzama basamakları için

örneklerin bir sıcaklık banyosundan diğerine aktarılması gerekiyordu. Sıcağa

dayanıklı DNA polimerazın kullanımı, her denatürasyon basamağından sonra enzim

eklenmesi gereğini ortadan kaldırdığı için PCR işlemini kolaylaştırmıştır. DNA

polimerazlar polinükleotidin sadece 3’ ucuna yeni nükleotid ekleyebilmektedir.

Kullanılan ilk sıcağa dayanıklı DNA polimeraz Thermus aquaticus’dan izole edilen

Taq DNA polimerazdır (Saiki ve ark. 1988). Bu enzim PCR uygulamalarında en

yaygın kullanılan enzim olmasına karşın başka DNA polimerazlar da bulunmaktadır.

Tablo 1 PCR için kullanılan ısıya dayanıklı DNA polimerazların özelliklerini

göstermektedir.



Tablo 1. PCR’da kullanılan bazı DNA polimerazların özellikleri

Taq/ AmpliTaq®

Vent TM Deep- Vent TM

Pfu Tth UITma TM

Kaynak Thermus aquaticus

Thermococcus litoralis

Pyrococcus GB-D

Pyrococcus furiosus

Thermus thermophilus

Thermotoga maritima

Uygulama Taq: doğal AmpliTaq:genetik müh. Için

Genetik müh. için

Genetik müh. için

Doğal Genetik müh. için

Genetik müh. için

95°C’deT1/2

aktivitesi(dk) 40 1380 400 >120 20 >50a

5’ - 3’ Ekzonükleaz aktivitesi

Evet Hayır Hayır Hayır Evet Hayır

3’ - 5’ Ekzonükleaz aktivitesi

Hayır Evet Evet Evet Hayır Evet

İşlevsellik 50-60 ? 7 ? 30-40 ?

Uzama hızı (nt/sn)

75 ? >80 60 >33 ?

Son DNA ucu 3’A >%95 kör >%95 kör ? 3’A Kör

Moleküler Ağırlık (kDa)

94 ? ? 92 94 70

Taq/AmpliTaqDNA Polimeraz

Daha önce bahsedildiği gibi bu enzim Amerika Yellowstone Doğal Parkında yaklaşık

85°C sıcaklıktaki kaynak sularında yaşayan Thermus aquaticus bakterisinden izole

edilmiştir. Bu enzimin optimal çalışma sıcaklığı 70-80°C arasındadır. Bu sıcaklıkta

bakteri saniyede 35-100 nükleotid sentezleyebilme hızına sahiptir. Enzimin hedef

DNA’dan ayrılmadan önce DNA’ya bağlayabildiği nükleotidlerin ortalama sayısı

“işlem kapasitesi” olarak tanımlanır. AmpliTaq DNA polimeraz E.coli tarafından

ifade edilen ve genetiği değiştirilmiş bir enzimdir. AmpliTaq rekombinant olduğu için

bu enzimin saflığı ve verimliliği doğal enzimden daha fazladır. Ancak DNA

amplifikasyonu sırasında bazı homolog E.coli sekansları ile potansiyel bir

kontaminasyon meydana gelebilir, bu durumda konak organizma olarak E.coli’de

ifade edilmeyen bir DNA polimeraz tavsiye edilir. Hem Taq hemde AmpliTaq DNA

polimerazlar büyüyen zincirin başından nükleotidleri ayıran 5’ uçtan 3’ uca

ekzonükleaz aktivitisine sahiptirler.

Vent ™- ; Deep Vent ™- ; Pfu- ve UITma™- DNA Polimerazlar

Bu enzimler doğru eşleşmiş bir baz çiftine gelinceye dek yanlış eşleşmiş tüm

parçaları kesebilen 3’ uçtan 5’ uca ekzonükleaz aktivitesine sahiptir. Ancak 3’-5’

ekzonükleaz aktivite, aynı zamanda primerlerin parçalanmasın da neden olabilir. Bu



nedenle enzim yanlızca reaksiyon başladıktan sonra eklenmeli ya da alternatif olarak

kimyasal olarak değiştirilmiş primerler kullanılmalıdır.

AmpliTaqGold ™ - DNA Polimeraz

AmpliTaqGold DNA polimeraz oda sıcaklığında inaktif olan ve yanlızca 94°C’lik

inkübasyon aralığında aktive olabilen bir enzimdir. Bu durumda kullanılacak termal

cycler programı 92-95°C’de bir ön inkübasyon safhası içermelidir. Time-released

PCR için ön inkübasyon elimine edilebilir, ancak klasik PCR’den farklı olarak

reaksiyonlar en az 10 döngü fazla sürdürülmelidir.

PCR Reaksiyonlarında Reaksiyon Tampon Çözeltileri ve MgCl2

PCR için reaksiyonda direk olarak yer alan maddelerin yanısıra uygun bir tampon

çözeltisine ihtiyaç duyulur. Tampon içeriği kullanılan enzimin özellik ve tipine bağlıdır

ve bir çok üretici enzimle beraber 10X tamponunu da sağlar. Taq/AmpliTaq®DNA

polimeraz ile en yaygın olarak kullanılan tampon;

10mM Tris, pH 8.3

50mM KCl

1,5-2,5 mM MgCl2 içermektedir.

PCR’da divalent katyonların bulunması çok önemlidir. Reaksiyon karışımında MgCl2

konsantrasyonu 0,5 ile 5 mM arasındadır ve optimum konsantrasyon ampirik olarak

belirlenir (Innis ve Gelfland 1990). Mg+2 iyonları;

-dNTP bağlanması için gerekli olan dNTP’ler ile çözünebilen bir karışım

oluşturur.

-polimeraz aktivitesini artırır.

-primer/hedef DNA etkileşmininin Tm’ni artırır (böylece ikili etkileşimi daha

dengeli hale getirir).

Genellikle düşük Mg+2 konsantrasyonu düşük miktarda ürün (ya da hiç) oluşmasına

sebep olurken yüksek miktarlardaki Mg+2, özel olmayan ürünlerin (yanlış eşleşme)

artmasına sebep olur. Hedef DNA solüsyonunda yüksek miktarlarda fosfat gibi

negatif olarak yüklenmiş iyonik gruplardan ya da EDTA gibi şelatlayıcı maddelerden

kaçınılması gerekir. Güncel literatürde çeşitli PCR tamponları ve DMSO, PEG 6000,

formamid, gliserol, spermidin ve iyonik olmayan deterjanlar gibi reaksiyon hassasiyeti

ve etkisini arttırmak için kullanılan ek maddelerin kullanılması üzerine tartışmalar

bulunmaktadır (Roux, 1995).Belli DNA polimeraz türleri sadece bu tür ek maddelerin

varlığında optiumum aktivite göstermektedir ( Ralfs ve ark. , 1992)



Deoksiribonükleosit Trifosfatlar

Serbest deoksiribonükleosit trifosfatlar (dNTP’ler) DNA sentezi için gereklidir. PCR

için kullanılan her dNTP için konsantrasyon 20 ile 200 µM arasında olmalıdır ve

yanlış bağlanma hatalarını önlemek için 4 dNTP de eşit miktarlarda kullanılmalıdır

(Innis ve ark 1988). Yüksek saflıkta dNTP’ler üretici firmalar tarafından dört ayrı stok

ya da dört dNTP karışımı olarak sağlanmaktadır. dNTP stok solüsyonları (genellikle

100 mM) için pH, son reaksiyon pH’sı 7,1’in altına düşmeyecek biçimde, 1M NaOH

ile pH 7,0-7,5 arasında ayarlanmalıdır (Sambrook ve ark 1989). Şu anda üretilen

dNTP stok solüsyonlarının çoğu pH ayarlı olarak sağlanmaktadır.

Döngü Sayısı ve Plato Etkisi

Jelde görülebilecek bir DNA bantı elde edebilmek için gerekli olan amplifikasyon

döngülerinin sayısı hedef DNA’nın başlangıç derişimine bağlıdır. 50 hedef molekülü

çoğaltmak için 40-45 döngü önerilir, ancak aynı derişimde 3x105 molekülü çoğaltmak

için 25-30 döngü de yeterlidir (Innıs ve Gelfald 1990). Bu oransızlık “Plato etkisi”

olarak adlandırılır. Sebebi ürün konsantrasyonu 0,3-1 nM’e ulaştığı PCR’ın son

safhalarında reaksiyonun lineer hızındaki azalmadır. Reaksiyon girdilerinin (dNTP,

enzim) parçalanması kısa hedefler için, azalması ise (primerler, dNTP)uzun hedefler

için bir problem olabilir.Son ürün inhibisyonu (pirofosfat oluşumu), özel olmayan

ürünlerin reaksiyon girdileri için yarışması, konsantre ürünün (10 nM) yeniden

bağlanma ile primer bağlanması için yarışması bu duruma yol açabilir (Innıs ve

Gelfald 1990). Eğer istenilen ürün 30 döngüde elde edilmiyorsa, döngü sayısını

arttırmak yerine çoğaltılan üründen çok az bir örnek (1 μl) alınarak yeni bir reaksiyon

karışımı ile 20-30 döngü çoğaltılmalıdır. Ana molekül derişiminin sınırlı olduğu

durumlarda bu yeni amplifikasyon iyi sonuç verirken döngü sayısının 40 ya da daha

fazla yapılması iyi sonuç vermez.

PCR için primer tasarımı (dizaynı)

Başarılı bir PCR için en kritik parametre primerlerin tasarımıdır. Tüm koşulların uygun

olduğu bir durumda, sadece zayıf tasarlanmış bir primer PCR reaksiyonun

çalışmamasına neden olabilir. Primer sekansı ürünün gen üzerindeki pozisyonu ve

uzunluğu, erime sıcaklığı, ve nihayetınde PCR verimi dahil pek çok parametreyi

etkiler (Innıs ve Gelfald 1994). Zayıf tasarlanmış bir primer, ürün oluşumunu

bastıracak biçimde rakip olabilen primer-dimer oluşumu ve/veya özel olmayan



amplifikasyon sonucu çok az veya hiç ürün üretilmemesine neden olabilir. Bu

uygulama notu PCR için primer tasarlanırken dikkat edilmesi gereken kuralları

içermektedir. Bu konuda daha detaylı bilgi başka kaynaklardan bulunabilir

(Dieffenbach ve ark. 1995).

Primer Seçimi

PCR primerleri tasarlanırken çeşitli parametrelere dikkat edilmelidir. En kritikleri;

-Primer uzunluğu

-Erime sıcaklığı Tm

-Hassasiyet (specificity)

-Tamamlayıcı primer sekansları

-G/C miktarı ve polipirimidin (T, C) ve polipurin (A, G) uzamaları

-3’ uc sekansıdır.

İzleyen bölümlerde bu kritik maddeler tartışılacaktır.

Primer uzunluğu

PCR hassasiyeti, bağlanma sıcaklığı ve bağlanma süresi primer uzunluğuna bağlı

olduğundan bu parametre başarılı bir PCR için çok önemlidir. Genel olarak,

bağlanma sıcaklığı uygun olduğunda 18 ile 24 bazlık oligonükleotidler belli bir

sekansa özel olarak bağlanırlar. Primer uzunluğu aynı zamanda bağlanma verimi ile

de doğru orantılıdır. Genel olarak primer uzadıkça , bağlanma verimi azalır. Her

basamakta daha az ana molekül primerle bağlandığından çoğaltılan üründe önemli

derecede azalmaya neden olur.

Uygulama özellikle gerektirmedikçe, primerler çok kısa olmamalıdır. Aşağıda

bahsedildiği gibi hedef en az 50°C’lik bağlanma sıcaklığına sahip bir primer

tasarlamaktır. Bağlanma sıcaklığı ile erime sıcaklığı arasındaki bağlantı PCR’ın kara

kutularından biridir. Genel kural bağlanma sıcaklığını erime sıcaklığından 5°C daha

düşük olarak kullanmaktır.Genellikle sadece bu şekilde hesaplanan bağlanma

sıcaklığ, enı uygun sıcaklık olmayıp belirlemek için ampirik deneyler yapılmak

zorunda kalınabilir. Bu optimizasyon kademeli termal döngü kullanılarak kolaylıkla

yapılabilir.



Erime sıcaklığı (Tm)

Hedef/bölge yönlü PCR reaksiyonu için iki primer kullanıldığı unutulmamalıdır. Her iki

oligonükleotid primer de benzer erime sıcaklıklarına sahip olacak şekilde

tasarlanmalıdır. Eğer primerler Tm nedeni ile yanlış bağlanırsa, amplifikasyon daha

az verimli olacaktır. Düşük sıcaklıkta Tm’ye sahip primer yüksek sıcaklıkta, yüksek

sıcaklıkta Tm’ye sahip primer düşük sıcaklıkta çalışmayacaktır. Oligoların erime

sıcaklığı en yakın komşu termodinamik hesaplamaları kullanılarak kesin olarak

hesaplanabilir.

Tm primer=ΔH [ΔS+R ln(c/4)]-273,15°C+16,6 log10 [K+]

Burada sarmal oluşum için H; entalpi, S; entropi, R molar gaz sabiti ve c de

primerlerin derişimidir. Primer tasarımı yazılım paketleri kullanılarak yapılabilir

(Sharrocks 94). Bu değerin iyi çalışan yaklaşık hesabı (genellikle 18-24 baz

aralığında oligolar için) aşağıdaki formül kullanılarak yapılabilir;

Tm=2(A+T)+4(G+C)

A,T,C,G purin ve pirimidin bazlarıdır. Tablo 2, bu eşitlik (Wallace formülü) kullanılarak

ve %50 G/C içeriği tahmini ile çeşitli uzunluklardaki primerlerin hesaplanmış

değerlerini göstermektedir.

Tablo 2. Wallace eşitliği ile primerlerin Tm değerlerinin hesaplanması (G/C içeriği

%50 kabul edilmiştir)

Primer uzunluğu Tm=2(A+T)+4(G+C) Primer uzunluğu Tm=2(A+T)+4(G+C)

4 12°C 22 66°C

6 18°C 24 72°C

8 24°C 26 78°C

10 30°C 28 84°C

12 36°C 30 90°C

14 42°C 32 96°C

16 48°C 34 102°C

18 54°C 36 108°C

20 66°C 38 114°C



Wallace kuralı kullanılarak hesaplananerime sıcaklıkları bu tablonun uç değerlerinde

kesin değildir. Primerlerin erime sıcaklığı hesaplanırken ürünün erime sıcaklığının

92°C’de %100 erime elde edilebilecek kadar düşük olmasına dikkat edilmelidir. Bu

parametre, daha etkili PCR elde edebilmek için önemli fakat her zaman gerekli

değildir.

Genel olarak, 100-600 bp arasındaki ürünler PCR reaksiyonlarında etkili olarak

çoğaltılabilir. Eğer kuşku varsa ürünün Tm’i aşağıdaki formul ile hesaplanmalıdır.

Tm=81,5+16,6(log 10 [K+]+0,41(%G/C)-675/uzunluk

Primer hassasiyeti

Yukarıda bahsedildiği gibi, primerin hassasiyeti (specificity), primer uzunluğuna

bağlıdır. 24 bazlık özgün oligo sekansları 15 bazlık oligo sekanslarından daha

hassastır. Primerler kısmi olarak çoğaltılıcak hedef DNA içinde özgün bir sekans

taşıyacak biçimde tasarlanmalıdır. Tekrarlanan sekanslar içeren primer ile genomik

DNA çoğaltılması bulanıklık ile sonuçlanacaktır ( birden fazla ürün türü). Ancak aynı

primer, genomik kütüphaneden tek bir klon çoğaltıldığında net, tek bir bant verebilir.

Taq polimeraz geniş bir sıcaklık aralığında aktif olduğu için primer uzaması düşük

bağlanma sıcaklıklarında meydana gelebilir. Sıcaklık çok düşük olduğunda primer ile

özgün olmayan bağlanma gerçekleşebilir. Eğer 3’ ucunda kısa da olsa homoloji varsa

polimeraz bu noktadan çalışmaya devam eder. Genel olarak 55-72°C arasındaki

erime sıcaklığı en iyi sonucu verir (bu sıcaklık aralığı Wallace kuralına göre 18-24

bazlık primer uzunluğu düşünülerek verilmiştir)

Tamamlayıcı primer sekansları

Primerler 3 bazdan daha fazla iç primer homolojisine sahip olmayacak şekilde dizayn

edilmelidir. Primerler kendi içinde homolojiye sahip olursa, “snap back” veya “hairpin”

( saç tokası) tabir edilen, primerin homolog sekansları sebebiyle kendi üzerine

katlanarak çift zincir oluştrması görülebilir. Bu da primerin hedef DNA’ya

bağlanmasını etkileyecektir. Diğer bir tehlike primerler arası homolojidir. İki primerin

orta bölümündeki kısmi homoloji hibridizasyonu engelleyebilir. Eğer homoloji

primerlerden birinin 3’ ucuna karşılık geliyorsa primer-dimerleri ( birbirine bağlanmış



iki primer molekülü) oluşur. Bu da elde etmek istenen ürünle yarışacağı için istenilen

ürünün oluşmasını engelleyecektir.

G/C miktarı ve poliprimidin (T,C) ve polipurin (A,G) uzamaları

Primerlerin baz kompozisyonu %45 ile %55 arası GC taşıyacak şekilde olmalıdır.

Primer sekansı özel olmayan bağlantıları arttıracak poli G ve poli C uzamaları

olmayacak şekilde seçilmelidir. Primer-hedef kompleksinde gevşemeye yol açacak

Poli A ve poli T uzantılarından da kaçınılmalıdır. Bu amplifikasyonun verimini

düşürebilir. Polipirimidin (T,C) ve polipurin (A,G) uzantılarından da kaçınılmalıdır.

İdeal olarak bir primer %50 GC içerik taşıyan ve yaklaşık 20 bp uzunluğunda

nükleotidlerin rastgele karışımına sahiptir. Bu yapı erime sıcaklıpı Tm’yi 56-62°C’lik

aralıkta tutar (Dieffeanbach ve ark. 1995).

3’- uc sekansı (zinciri)

3’ terminal pozisyonu yanlış bağlanmayı kontrol için çok önemlidir. Bu bölgede yer

alan primer homolojilerinin yaratacağı sorunlardan bahsedilmişti. Diğer bir değişken

primerlerin 3’ ucuna G ve C bazlarının eklenmesidir. Bu GC kıskacı G/C

nükleotidlerinin daha kuvvetli hidrojen bağlarla bağlanması nedeni ile 3’ ucun sonuna

doğru bağlanmayı garanti eder. Bu aynı zamanda primer-hedef kompleksinde

gevşemelere bağlı olaraak reaksiyon hızının yavaşlamsının önüne geçerek süre

kaybını azaltır ve reaksiyon verimini arttırır.

Özelleştirilmiş PCR

Yukarıda bahsedilen tipik PCR prosedürleri yoluyla hedef DNA’nın amplifikasyonun

yanısıra özel uygulamalar için geliştirilmiş özel PCR’lar vardır.

Nested PCR

Hedef DNA’nın PCR verimini arttırmak için nested yanı bırbırı için gömülmüş primer

setleri kullanılabilir (Newton ve Graham 1994). Nested PCR’da birinci primer seti ile

15-30 döngü arası amplifikasyonun ardından bu ilk PCR’ın ürünü kullanılarak bu

bölgede bir sekansa karşılık gelen ikinci bir primer seti ile 15 ile 30 döngü arasında

ikinci bir PCR yapılır. Böyle ilk PCR’dan elde edilen uzun parça ikinci PCR’ın hedef



DNA’sı olur. Nested PCR metodu kullanılarak, DNA amplifikasyon hassasiyeti ve

özgünlüğü önemli ölçüde arttırılabilir. Özgünlüğün artmasının nedeni bu tekniğin

benzer lakin özgün olmayan olmayan çoğalma ürünlerini ortadan kaldırmasıdır. İlk

PCR döngüsünden sonra ortaya çıkan özel olmayan ürünler, ikinci PCR primerleri

için de tamamlayıcı olma ihtimalleri çok düşük olduğundan çoğaltılmayacak ve

dolayısıyla sadece istenilen hedef sekans çoğaltılacaktır. Lakin bu yüksek

hassasiyetin dezavantajı yüksek kontaminasyon riskidir. Bu nedenle bu tip PCR’lar

yapılırken özellikle diagnostik laboratuvarlarda çok dikkatli olunmalıdır.

Multiplex PCR

Standart bir PCR reaksiyonunda özel bir sekansı çoğaltmak için tek primer çifti

kullanılırken, multiplex (çoğul) PCR’da bir çok sekansı eş zamanlı çoğaltmak

amacıyla birden fazla primer çifti kullanılır. Bir tüp içinde bir çok primerin bulunması

yanlış eşleşmiş PCR ürünleri, “primer-dimer” oluşumu ya da daha kısa DNA

parçalarının çoğaltılmasının yeğlenmesi gibi problemler yaratabilir(Atlas ve Bey

1994). Bu tip PCR çoğaltımı için benzer bağlanma sıcaklığına sahip primerler seçilir.

Çoğaltılan ürünlerin uzunluğu da benzer olmalıdır; hedef DNA’ların uzunluğundaki

büyük farklılıklar, kısa parçaların uzun parçaların üzerinde çoğalmasına sebep olur.

Bu da ürün verimlerinde farklılık yaratır. Multiplex PCR tampon çözeltileri amplikonlar

arasındaki yarışı ve kısa DNA parçalarının multiplex PCR esnasında yeğlenmesini

azaltan Taq polimeraz katkısı içerir. Multiplex PCR ürünleri, kontrol amaçlı olarak,

söz konusu gene özel prob ile hibridize edilebilir.

Pratikte PCR

Daha önceki bölümlerde gösterildiği gibi, PCR yaygın olarak kullanılan hızlı bir

analitik ve hazırlık tekniğidir. Yanlız bu işlemin doğası gereği, eser miktarlarda DNA

kontaminasyonu dahi hedef DNA olarak davranabilir ve bu da yalnış nükleik asidin

çoğaltılmasına neden olur (false pozitif). Bu nedenle PCR amplifikasyonunu DNA’dan

arındırılmış ortamda yapmak çok önemlidir. Fiziksel olarak ayrılmış alanlarda

çalışmak kontaminasyon riskini azaltır. Dekontaminasyon kurallarına tamamen

uymak (nükleik asitlerin dekontaminasyonu, aerosollerin önlenmesi gibi) yanlış pozitif

sonuçları minimuma indirmek için en önemli zorunluluktur. PCR kontaminasyonu

çeşitli sebeplerle oluşabilir;



Laboratuvar masaları, pipetleme aletleri ve diğer cihazlar (daha önceki DNA

deneyleri sırasında kontamine olmuş olabilir.)

Örnekler arası çapraz kontaminasyon

Daha önceki amplifikasyonlardan bulaşmış PCR ürünleri

Bu bölüm, çalışılacak örnek sayısına bakılmaksızın PCR için gerekli olan temiz bir

ortamın kurulması ve korunması için gerekli olan rutin ihtiyaçları belirtmektedir (Roth

ve ark. 1997).

Fiziksel önleme metodları

Laboratuvar Ortamı: Kontaminasyonu önlemek için fiziksel olarak ayrılmış çalışma

alanları aşağıdaki gibi düzenlenmelidir.

1. Numune hazırlama bölgesi: Bu oda hedef DNA amplifikasyonu öncesi bütün

diğer işlemlerinin yapıldığı alandan oluşur (DNA’nın izolasyonu ve saflaştırılması

gibi).

2. PCR odası: Bu “temiz oda” PCR reaksiyonu için gerekli olan işlemlerin yapıldığı

yerdir (mastermiks, primer seyreltilmesi gibi).

3. PCR sonrası alan: Bu alan hedef DNA zincirinin çoğaltılması ve PCR ürünlerinin

tayini ve analizi için ayrılmıştır.

Ek olarak aşağıdaki genel kurallar uygulanmalıdır.

Bütün odalarda PCR için ayrılan ve yeri değiştirilmeyen aletler ve malzemeler

bulunmalıdır (eldiven, kimyasal, önlük gibi).

Sıvılar ve diğer malzemeler içerik ve hazırlama tarihi ile etiketlenmelidir.

Tek yönlü akış sistemi kullanılmalıdır. Örneğin hiçbir zaman PCR sonrası

alandan, PCR öncesi alana, numune ya da örnek getirilmemelidir.

DNAaz ve RNAaz ari, tek kullanımlık PCR reaksiyon tüpleri kullanılmalıdır.

Aerosol dayanıklı pipet uçları ve PCR için özel olarak ayrılmış pipetler kullanılır

(tercihen pozitif yer değiştirmeli pipet).

Eğer mümkünse PCR reaksiyonları UV lambalı laminarda yapılmalıdır. Laminar

içinde mikrosantrifüj ve yanlızca PCR için kullanılan eldivenler bulundurulmalıdır.

Periyodik olarak çalışma alanları ve raflar %10 çamaşır suyu ve ardından %70

etanol ile yıkanmalıdır.



Örneğin çalışılması

Daha önce bahsedilen alanlarda steril teknikleri kullanın ve daima eldiven giyin.

Eldivenleri sık sık değiştirin. Özellikle hedef DNA içeren sıvılarla kontamine

olduğunu düşündüğünüzde hemen yeni eldivenler kullanılmalıdır.

PCR solusyonları ve hedef DNA hazırlarken daima yeni ve steril cam ve plastik

malzeme, pipet, vs. kullanılmalıdır.

Otoklavda bozulmayacak bütün solüsyon ve sıvıları otoklavlayın. Primerler,

dNTPler ve Taq polimeraz otoklavlanmaz.

Küçük miktarlarda saklanan, sadece sizin tarafınızdan kullanılan PCR kimyasal

seti ve solüsyonlarını kulanın.

DNA’yı pipetlerken kontaminasyon taşıyacak aerosoller oluşturmaktan kaçının

Daima kontrol reaksiyonları yapın. Örneğin DNA içermeyen negatif kontrol ve

daha önceki PCR’lerde başarı ile kullanılan pozitif kontrol.

Biyokimyasal önleme metodları

Urasil DNA Glikosilaz

PCR tek kopya molekülü milyarlarca kopya olarak çoğaltabilir. Bu yüzden çok küçük

miktarlardaki kontamine DNA dahi çoğaltılarak yanlış pozitif sonuç verebilir. Bu tip

kontaminasyonun kaynağı genellikle daha önceki PCR ürünleridir (taşıma

kontamisyon). Bu nedenle bu tip kontaminasyonları engelleyecek yöntemler

geliştirilmiştir.Yaygın yöntemlerden biri PCR sırasında dTTP yerine dUTP kullanarak

urasil içeren DNA (U-DNA)’lar üretmektir (Longo ve ark. 1990). Bu reaksiyonu izleyen

PCR öncesi tüm PCR reaksiyon karışımlarını urasil-DNA glikosilaz (UNG) ile

muamele edip, alkalin koşullarda ilk denatürasyon basamağında yüksek sıcaklığa

(95°C’de) maruz bırakmak primidin polinükleotidlerin kırılması ve kontamine eden U-

DNA’nın örnekten ayrılmasını sağlayacaktır (şekil 8).



Şekil 8. Urasil-DNA glikosilaz reaksiyonu

Bu yöntem laboratuvardaki bütün PCR reaksiyonlarını dTTP yerine dUTP ile

yapılmasını gerektirmektedir. dU içeren PCR ürünlerini kullanırken aşağıdakilere

dikkat edilmesi gerekmektedir.

dU içeren PCR ürünleri dideoksi sekansı için ana molekül olarak ya da hibridizasyon

hedefleri olarak kullanıldığında dT içerenler kadar iyi sonuç verir.

dU içeren PCR ürünleri UNG bakteri hostlarına transfer edilirse direkt olarak

klonlanabilir

dU içeren substrat bazı reaksiyon enzimleri ile (EcoRI, BamHI gibi) kolayca kesilirken

diğerleri bu substratlar üzerinde daha düşük aktiviteler gösterebilirler (HpaI, Hind II ve

Hind III gibi).

dU içeren DNA’ların kullanımı protein bağlanması veya DNA-protein etkileşim

çalışmalarında tavsiye edilmemektedir.

DNaz I, Ekzonükleaz III

Diğer biyokimyasal yöntemler kontamine olmuş DNA’nın DNAz, ekzonükleaz III veya

uzaklaştırılmak istenen DNA yapısı içinde hedef bölgesi bulunan bir restriksiyon

enzimine tabi tutulmasına dayanır. Çok kuvvetli reaksiyon koşulları gerektiği için bu

enzimler PCR amplifikasyonunun hassasiyetini düşürebilirler.



PCR reaksiyonu için karışım hazırlama

PCR için gerekli kimyasallar nükleaz ari su, reaksiyon tamponu, ısıya dayanıklı DNA

polimeraz, oligonükleotid primerler, deoksinükleotidler (dNTP), hedef DNA ve Mg

iyonlarıdır. Genel olarak bütün maddeler (hedef DNA dışında) reaksiyon sayısına göre

yeterli olacak miktarda tek bir tüpte karıştırılır (master karışım). Bu karışım tek tek tüplere

dağıtılır ve hedef DNA eklenir. Master karışım solüsyonunun kullanımı kontaminasyon

riskini azaltır ve aşağıdaki sebeplerden ötürü PCR reaksyion performansını arttırır :

Bir seri analiz için aynı kalitede karışım garantisi vardır.

Orijinal ve yeni hazırlanan karışımların kontaminasyon riski düşer.

Daha yüksek hacimler pipetlenebilir.

Pipetleme safhaları azalır, böylece zamandan kazanılır.

İlgilenilen bölgenin başarı ile çoğaltılması hedef DNA’nın miktarı ve kalitesine bağlıdır.

Gereken hedef DNA’nın miktarı DNA örneğinin ne kadar karmaşık olduğuna bağlıdır.

Organizmalar arasında nüklear genomun uzunluğunun farklı olduğu göz önünde

bulundurularak reaksiyondaki DNA derişimi sabit tutulmalıdır (genellikle 10 ng/µl).

Transformasyonda sıkça kullanılan bitki türlerinin genom boyutu ile belirli miktardaki

DNA’nın içerdiği genom kopya sayılarının karşılaştırılması Tablo 3’de verilmektedir.

Tablo 3: Bazı bitki türlerinin genom boyutunun, belirlenmiş miktardaki DNA’nın

içerdiği genom kopyaları ile karşılaştırılması

Örnek Genom boyutu 1 µg DNA’daki genom kopya

sayısı

1 ng DNA’daki genom

kopya sayısı

Mısır 5x109 bp 1,85x105 185

Soya 1,55x109 bp 5,98x105 598

Tütün 3,8x109 bp 2,43x105 245

Pirinç 4x108 bp 2,31x106 2310

Örneğin 1 kb’lik bir DNA parçası eklenmiş 4kb’lik bir plazmid için reaksiyona dahil

edilen DNA’nın %25’i istenilen bölgedir.Halbuki mısır genomunda (5x109 bp) yer alan

1 kb’lik bir gen, reaksiyona dahil DNA’nın yaklaşık olarak %0,00002’sini

oluşturmaktadır. Yani her reaksiyonda hedef kopya sayısını sabit tutabilmek için

yaklaşık olarak bir milyon kez daha fazla mısır genomik DNA’sı gerekmektedir.



Optimize edilmiş sonuç için hedef sekansın en az 104 , tercihen daha fazla kopyası

25-30 döngüde sinyal alabilmek için başlangıç atası olarak kullanılmaldır. Pratikte

hedef sekansın 10’dan az kopyasını dahi çoğaltmak mümkün olsa bile bu durumda

da elektroforezde sinyal alabilmek için daha fazla PCR döngüsü gerekecektir. Genel

protokolerde 30 ile 40 döngü arası rutin olarak uygulanır. Özel olmayan çoğaltmayı

da arttırabileceği için döngü sayısını arttırırken dikkatli olunmalıdır.

Kontroller

Daha önceki bölümlerde belirtildiği gibi laboratuvarda birçok kontaminasyon kaynağı

bulunabilir. Örnekler, lab personeli, havalandırma, aletler ve kimyasallar

kontaminasyon kaynağı olabilir. Kontamine ajanları arasında aşağıdakiler sayılabilir:

1. Daha önceki PCR’larda çoğaltılan DNA’ların taşınması yoluyla kontaminasyon

2. Örnekler arası kontaminasyon; hedef DNA’nın bir örnekten diğerine aktarılmaınsa

neden olur

3. Daha önceki DNA’ların hazırlanmasından kalan genomik DNA

4. Dekontaminasyon reaksiyonlarından parçalanmış ürünler.

İlk üç kontaminasyon biçimi yanlış pozitif sonuçlar verirken, sonuncusu yanlış negatif

sonuç verir. PCR reaksiyonlarının engellenmesine neden olan bu tip kontaminasyon

ilk olarak Neiderhauser ve ark. tarafından 1994 yılında gösterilmiştir. UNG yöntemi

kullanılarak yapılmış dekontaminasyon, primerlerle kompleks oluşumu ihtimalini

arttırır. Güvenilir sonuçlar elde edebilmek için PCR reaksiyonu sırasında hem pozitif

hem de negatif kontroller kullanılmalıdır. Tablo 4 nüklek asit amplifikasyonu

prosedürlerinden emin olmak için yaygın olarak kullanılan bazı kontrolleri

göstermektedir.

Tablo 4. PCR dayalı testlerde kullanılabilecek kontroller

Kontrol Yöntem

Ayraçların hedef DNA ile kontaminasyonu DNA template olmadan yapılan PCR (yanlızca

master karışım) – kontrol

Reaksiyonun özgünlüğü İkincil ve özel olmayan ürünleri bulmak için

yapılan kontroller

Reaksiyonun geliştirlmesi ve hassasiyeti +/- kontroller (istenilen koşulları ve ürünleri

sağlayabilmesi için)

PCR karışımının bütünlüğü DNA ile + kontrol PCR’ı



Pozitif (+) kontroller

DNA ekstraksyonu ve amplifikasyon verimliliği pozitif (+) kontrollerle sınanmalıdır. İdeal

olarak elde etme limitleri genomik karşılık olarak verilmelidir. Bu düşük kopya sayısında

bile tanımlanan hassas bir şekilde üretilmesine izin verecek şekilde olmalıdır. Kural olarak

incelenen hedef DNA’nın bilinen miktarlarını içeren referans hazırlanabilmelidir.

Negatif (-) kontroller

Hedef DNA’nın izolasyonu ve saflaştırılması veya amplifikasyon reaksiyon karışımlarının

hazırlanması esnasında kontaminasyon olabileceğinden (çoğaltılan ürün veya nükleik

asitleri taşıyan) her PCR reaksiyonu için DNA içermeyen bir örnekle negatif (-) kontrol

yapmak gereklidir.



Kaynaklar

Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., and Watson, J.D. (1983).

Molecular biology of the cell. Garland Publishing, Inc., NewYork.

Atlas, R.M., and Bej, A.K. (1994). Polymerase Chain Reaction. In: Gerhardt, P.,

Murrey, R.G.E., Wood, W.A. and Krieg, N.R., (Eds) Methods for general and

molecular bacteriology. Washington, D.C., American Society for Microbiology, pp.

418-435.

Dieffenbach, C.W., Lowe, T.M.J. and Dveksler, G.S. (1995). General Concepts for

PCR Primer Design. In: Dieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S. (Eds.) PCR

Primer: a Laboratory Manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

Cold Spring Harbor, NY, USA, pp. 33-155.

Innis, M.A. and Gelfand, D.H. (1990). Optimization of PCRs. In: Innis, M.A., Gelfand,

D.H., Sninsky, J.J. and White, T.J. (Eds.) PCR Protocols: a Guide to Methods

and Applications. New York, Academic Press, pp. 3-12.

Innis, M.A. and Gelfand, D.H. (1994). Optimization of PCRs. In: Innis, M.A., Gelfand,

D.H., Sninsky, J.J. and White, T.J. (Eds.) PCR Protocols: a Guide to Methods

and Applications. London, CRC Press, pp. 5-11.

Innis, M.A, Myambo, K.B., Gelfand, D.H., and Brow, M.A. (1988). DNA sequencing

with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase

chain reaction-amplified DNA. Proceedings of the National Academy of Science

USA 85, 9436-9440.

Longo, M.C., Berninger, M.S., and Hartley, J.L. (1990). Use of uracil DNA

glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reaction.

Gene 93, 125-128.

Newton, C.R. and Graham, A. (1994). PCR. BIOS Scientific Publishers, Limited,

Oxford.



Niederhauser, C., Höfelein, C., Wegmüller, B., Lüthy, J., and Candrian, U. (1994).

Reliability PCR Decontamination Systems. PCR Methods and Applications 4,

117-123.

Ogawa, T., and Okazaki, T. (1980). Discontinuous DNA replication. Annual Review of

Biochemistry, 49, 421-457.

Roux, K.H. (1995). Optimization and troubleshooting in PCR. PCR methods and

Applications 4, 185-194.

Rolfs, A., Schuller, I., Finckh, U., and Weber-Rolfs, I. (1992). Substances affecting

PCR: Inhibition and enhancement, 51-58. In: PCR: Clinical diagnostics and

research, Springer.

Roth, A., Mauch, H., and Göbel, U. (1997). Nucleic acid Amplification Techniques-

Recommendations for Employing Molecular Methods in Diagnostic Routine

Microbiology Laboratories and Measures for Internal Quality Assurance. Gustav

Fischer Verlag, Stuttgart.

Saiki, R.K., Scharf, S.J., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. and

Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of ß-globin genomic sequences and

restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350.

Saiki, R.K. et al. (1988) Primer directed enzymatic amplification of DNA with a

thermostable DNA polymerase. Science 239, 487.

Sambrook, J. and Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). In vitro Amplification of DNA

by the Polymerase Chain Reaction. In: Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis,

T. (Eds.) Molecular Cloning : A Laboratory Manual. New York, Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cols Spring Harbor, NY, USA, chapter 14.

Sharrocks, A.D. (1994). The design of primers for PCR. In: Griffin, H.G. and Griffin,

A.M. (Eds.) PCR Tehnology:Current Innovations. London, CRC Press pp.5-11.

Suggs, S.V. Hirose, T., Miyake, E.H., Kawashima, M.J., Johnson K.I., and Wallace,

R. B. (1981) Using Purified Genes. IN ICN-UCLA Symp. Developmental Biology,

Vol.23, Brown, D.D. Ed., Academic Press, New York, 1981, 683.




Ek Kaynaklar

Gayer-Herkert, G., (1992). Molekularbiologische Methoden für den Nachweis von

Mikroorganismen in Mischpopulationen-eine Literaturstudie. Bioengineering 5+6,

55-64.

Horton, H., Moran, L., Ochs, R., Rawn, J. and Scrimgeour, K., (1994). Principes de

Biochimie. De Boeck-Wesmael, S.A. Bruxelles.

Knippers, R. (1995). Molekulare Genetik. Geaorg Thieme Verlag, Stuttgart.

Kwok, S., Kellog, D.E., McKinney, N., Spasic, D., Goda, L., Levenson, C. and

Sninsky, J.J. (1990). Effects of primer-template mismatches on the polymerase

chain reaction: Human Immunodeficienecy Virus 1 model studies. Nucleic Acids

Research 18, 999-1005.

Larzul, D. (1993). Le PCR: un procede de replication in vitro. Tec&Doc Lavoisier,

Paris.

Stryer, L. (1991). Biochemie. Spectrum Akademischer Verlag, GmbH, Heidelberg.

Watson, D.J., Hopkins, N., Roberts, J., Steitz, J., and Weiner, A. (1988) Molecular

Biology of the Gene. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., New

York.


Bölüm 7

MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri

M.Querci, M.Mazzara






MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri 2

İçindekiler

Bölüm 7

MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri

Roundup Ready ® Soyanın Özellikleri 3

MON810 Mısırın Özellikleri 7

Bt-176 Mısırın Özellikleri 11

Kaynaklar 16




Roundup Ready ® Soyanın Özellikleri 1

Kısa Tanımlama

İsim GTS 40-3-2

Başvuran Monsanto Canada Şirketi

Bitki Türü Glycine max L. (Soya Fasülyesi)

Yeni Özellikler Roundup ready® herbisitinin aktif içeriği Glufosat

toleransı

Genetik Modifikasyon Metodu Partikül bombardımanı (biyolistik)

Önerilen Kullanım Hayvan besini (çoğunlukla yağdan arındırılmış olarak

sıkıştırılmış gevrek ve yemek) ve insan tüketimi

(çoğunlukla yağ, protein ve diyet liflerinde) için soya

üretimi

Temel Bilgi

Soya hattı GTS 40-3-2 Monsanto Canada Şti. tarafından soya üretiminde zararlı

bitkilerle mücadelede alternatif bir sistem olarak glufosatın kullanımına olanak

sağlamak için geliştirilmiştir. GTS 40-3-2 nin geliştirilmesi, Agrobacterium

tumefaciens suşu CP4’den izole edilen glufosat dirençli 5-enolpurivil-şikimat-3-fosfat

sentaz (EPSPS) enzimini kodlayan genin, ticari soya çeşidi (Asgrow Tohum Şirketi)

A5403’e aktarılması yolu ile olmuştur.

Yeni Karakterin Tanımı

Glufosat toleransı

Roundup®’ın aktif molekülü olan Glufosat, sistemik, seçici olmayan zararlı ot kontrol

maddesi olarak dünya çapında kullanılan bir herbisittir. Glufosat 5-enolpurivil-şikimat-

3-fosfat sentaz (EPSPS) enziminin kompetitif inhibitörü olarak görev yapar. EPSPS

fenilalanin, tirosin ve triptofan aromatik aminoasitlerinin üretiminde yer alan şikimat

biyokimyasal yolunda zorunlu bir enzimdir (Şekil 1). EPSPS’in engellenmesi

büyümenin durdurulması ve bitki ölümüne yol açar.

Aktarılan Glufosat tolerans geni bu enzimin bakteri kökenli (Agrobacterium

tumefaciens CP4 suşundan) versiyonudur. Bitki, mantar ve mikroorganizmalarda

1 Kanada Besin Teftiş Ajansı, Karar DD95-05’den alınmıştır.


bulunan bu enzim glufosata yüksek derecede dirençlidir. Bu nedenle inhibisyona

uğramaz ve bitkinin aromatik amino asit metabolik ihtiyaçlarını karşılayabilir.

5-enolpiruvil-şikimat-3-fosfat (EPSP)

Glifosat (Roundup®) N-(fosfonometil) glisin

Şikimat-3-fosfat

Fosfoenolpiruvat (PEP)

Eritroz-4-fosfat +Fosfoenolpiruvat

Fenilalanin Tirosin Triptofan

Şekil 1. EPSPS enzimi şikimat-3-fosfat ve fosfoenolpiruvat (PEP) arasındaki

reaksiyonu katalize eder. 5-enolpiruvil-şikimat-3-fosfat (EPSP) ile fosfat bu

reaksiyonun ürünleridir. EPSP, aromatik aminoasit sentezinde gerekli bir ara

moleküldür. Bu biyokimyasal yolun glufosat tarafından engellenmesi, protein

sentezini engelleyerek bitki ölümüne yol açar. EPSPS, glufosatın bitkideki tek hedef

enzimidir ve PEP kullanan diğer enzimler glufosattan etkilenmezler

EPSPS geni kuvvetli bir konstitütif promotör olan karnıbahar mozaik virüsü (P-

CaMVE35S) ve A. tumefaciens kaynaklı nopalin sentaz terminatörü (T-nos) ile

kontrol edilmektedir (Şekil 2). Bitki kökenli, kloroplast transit peptidi (Petunia

hibrida’dan CTP4) kodlayan DNA sekansı glufosat tolerans geninin 5’ ucuna

klonlanmıştır. EPSPS genine birleştirilen sinyal peptidi yeni sentezlenen enzimin

şikimat yolunun bulunduğu ve glufosatın etkisini gösterdiği kloroplastlara geçişini




sağlar. Geçiş gerçekleştikten sonra, transit peptidi özel bir proteaz ile enzimden

ayrılır ve hızlı bir şekilde parçalanır.

EPSPS sentaz doğada yaygın olarak bulunur ve toksik ve allerjik olması beklenmez.

Toksik ve allerjik polipeptidlerin sekans databazlarında karşılaştırma analizleri

yapıldığında bilinen herhangi bir toksin yada allerjenin aminoasit sekansı ile önemli

bir homoloji göstermemiştir.

Şekil 2. Roundup Ready® soya gen kasetinin şematik gösterimi (Padgette ve ark.

1995’ten uyarlamam).

Geliştirme Metodu

Ticari soya çeşidi A5403 (Asgrow Tohum Şirketi) altın partikül bombardıman yoluyla,

E.coli’ den elde edilen plasmid vektörü PV-GMGT04 ile transforme edilmiştir (bakınız

Şekil 3). PV-GMGT04, glufosat toleransı kodlayan CP4 EPSPS genini, seçici markör

olarak β-glukoronidaz üretimi için gus genini, ve antibiyotik direnci için nptII genini

(kanamisin direnci) içermektedir. Seçilen ilk transformantta biri gus seçici markörü,

diğeri glufosat tolerans geni ile olmak üzere iki integrasyon bölgesi görülmüştür. Bu

iki bölge, izleyen eşeyli üreme jenerasyonlarında bağımsız olarak ayrışmış ve

analizler sonucu, hat GTS 40-3-2’de sadece glufosat tolerans geninı içeren tekil bir

bir integrasyon bölgesi bulunduğu görülmüştür.

Bitki Genomuna Sabit İntegrasyon

İlk verilere göre (Padgette ve ark. 1995, 1996) GTS 40-3-2, nos poliadenilasyon

sinyali, CP4 EPSPS sekansı, kloroplast sinyal peptidi ve CaMV 35S promötörü

içeren CP4 EPSPS gen kasetinin tek bir fonksiyonel kopyasını içermektedir. Orjinal

plasmid vektörden bitkiye bu füsyon gen dışında başka bir kodlama bölgesinden

geçiş bulunmamıştır. İzleyen nesillerde bu birleşik genin ayrışması

gözlenmediğinden, GTS 40-3-2 hattının birleşik gen için homozigot olduğu kabul

CTP4 5S P-E3 CP4 EPSPS T-nos


edilmiştir.6 nesil boyunca yapılan DNA analizleri, gen entegrasyonunun sabit

kaldığını göstermiştir.

Güncel karakterizasyon çalışmaları, DNA entegrasyonu sırasında farklı düzenlemeler

meydana geldiğini göstermiştir. Roundup Ready® soya 40-3-2, işlevsel olan birincil

gen entegrasyonu bölgesi haricinde 250 bp ve 72 bp’lik iki küçük, fonksiyonel

olmayan DNA dizisi daha içermektedir (Mansanto 2000, Windels ve ark. 2001).

Şekil 3. Roundup Ready® soya vaka 40-3-2 geliştirmek için kullanılan PV-GMGT04

plazmid (Monsanto, 2000)

Düzenleme Kararı

Roundup Ready® (RR) soya şu anda Avrupa Birliğinde pazara sunum için onaylanan

tek transgenik soya hattıdır. 1994’de ABD’de onay almasından sonra Avrupa Birliğine

ithaline 96/281/EC Komisyon kararı ile 3 Nisan 1996’da onay verilmiştir. Bu karar

yanlızca tohumun Avrupa Birliğine ithaline, kısmi olarak soya içeren besin, hayvan

gıdası gibi canlı olmayan ürünlerin endüstriyel işlenmesi amacı ile üretimi için izin

verir.




MON810 Mısırın Özellikleri2

Kısa Tanımlama

İsim Vaka MON810 mısır (ticari ismi Yieldgard®)

Başvuran Monsanto Canada Şirketi

Bitki Türü Zea mays L. (mısır)

Yeni Özellikler Avrupa Mısır kurduna direnç (Ostrinia nubilalis)

Genetik Modifikasyon Metodu Partikül bombardımanı (biyolistik)

Önerilen Kullanım İnsan tüketimi için Z. mays üretimi (tohum yağı ve yaş

veya kuru öğütme) ve çiftlik hayvanları besini olarak

Temel Bilgi

Mısır MON810 (YieldGard®) Avrupa Mısır kurduna (ECB, Ostrinia nubilalis) dirençli

olarak Monsanto Canada Şirketi tarafından geliştirilmiştir. Geleneksel pestisitler

kullanılmadan ECB’nin larval dönemlerinde sebep olduğu ürün kayıplarını önlemek

için bir yöntem sağlamıştır.

MON810 bitki hücrelerine mikroprojektil bombardıman ve rekombinant DNA

teknolojisi yolu ile, doğada bulunan insektisidal (böcek öldürücü) proteini (Bacillus

thuringiensis ssp. Kurstaki’den) kodlayan genin aktarılması ile geliştirilmiştir. Bu

protein ECB’nin de dahil olduğu kelebek ve güveleri içeren bazı Lepidoptera türlerine

karşı aktiftir. MON810’da ifade edilen insektisidal protein CRYIA(b) δ-endotoksinin

kısaltılmış bir gen versiyonu ile ifade edilir ve mısır bitkilerini ECB larvaları tarafından

verilen yaprak ve bitki sapı zararından korur.

Yeni Karakterin Tanımı

Avrupa Mısır kurduna direnç

Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki endospor oluşturan, gram pozitif, toprakta

yaşayan bir bakteridir. Sporogenik döneminde endospora ek olarak Avrupa mısır

kurdu (ECB), Ladin tomurcuk kurdu, Çingene güvesi, Diamondback güvesi, Tütün

tomurcuk kurdu, Lahana kurdu gibi bazı lepidoptera böceklere karşı, aralarında aktif

2 Kanada Besin Teftiş Ajansı, Karar 97-19’dan alınmıştır.



CRYIA(b) δ-endotoksin aktif proteini de olmak üzere bir çok insektisidal protein

kristali üretmektedir.

Bu proteinin insanlara, diğer omurgalılara ve yararlı böceklere toksik olmadığı

defalarca gösterilmiştir (Lee ve ark. 1995). MON810, konstitütif CaMV 35S promotörü

ve HSP70 intron lider sekansının kontrolünde olan tek kopya cryIA(b) geninin

aktarılması yoluyla geliştirilmiştir (Şekil 4).

Bacillus thuringiensis ssp.HD-1’den alınan cryIA(b) genini kodlayan sekans,

CRYIA(b) δ-endotoksin proteinin bitkilerde ifadesini en iyi şekilde arttırmak için

modifiye edilmiştir. Protein kırılma sonrası tripsin dirençli bio-aktif bir moleküle

dönüşür ve lepidopteran larvalarına toksik hale gelir. İnsektisidal aktivitenin, bu aktif

proteinin hassas böceklerin orta bağırsak epitel hücrelerindeki özel alıcılara

tutunmasına bağlı olduğu düşünülmektedir. Bunu izleyen gözenek oluşumu ozmotik

dengeyi bozarak hücrenin patlamasına yol açar. Bu proteine hassas olan mısırın

lepidoptera zararlıları ECB ve mısır kulakkurdu’dur.

Değiştirilmiş mısırda ifade edilen toksinin aminoasit sekansının doğada bulunan

proteinle aynı ve organik besin endüstrisi tarafından biopestisit olarak yaygın biçimde

kullanılan protein ile eşdeğer olduğu tespit edilmiştir.

Şekil 4. MON810 mısırda kullanılan PV-ZMBK07 plasmidinde yer alan cryIA(b) gen

kasetinin ve hsp70 intron 1’in şematik gösterimi (BATS, 2003).

P-E35S: geliştirilmiş CaMV 35S promotör

hsp70: mısır hsp70 intron 1 sekansı

sentetik cry1A(b)geni

T-nos terminasyon sekansı

P-E35S hsp70 cryIA(b) T-nos


Geliştirme Metodu

MON810 PV-ZMBK07 ve PV-ZMGT10 plazmidlerinin biyolistik yöntemi ile birlikte

mısır genotipi Hi-II’ye aktarılması ile elde edilmiştir. PV-ZMBK07 plazmidi cryIA(b)

genini (Şekil 5) PV-ZMGT10 plazmidi ise CP4 EPSPS ve gox genlerini taşımaktadır.

Her iki plazmid de E. coli’de replikasyon için gerekli olan pUC plasmidi replikasyon

orijin sekansını(ori-pUC) ve bakteri promotör kontrolu altında nptII genini (bakteri

seçimi için) taşımaktadır. Her iki vektör de bitki kültürü hücrelerine mikroprojektil

bombardımanı ile aktarılmıştır. Aktarılan hücrelerden Glufosat dirençli olanlar

seçilmiş ve bitki rejenerasyonu için gerekli doku kültürü ortamlarına alınmıştır

(Amstrong ve ark. 1991)

Yazarlar tarafından sağlanan moleküler analizlerde, sadece PV-ZMBK07

plazmidindeki genetik elementlerin MON810 genomuna tek bir kopya olarak yerleştiği

görülmüştür. Geliştirilmiş CaMV 35S promotörü, hsp70 ön sekansı ve kısaltılmış

cryIA(b) gen sekansları tam iken, gen kasedinin 3’ ucunun kopması sebebi ile PV-

ZMBK07’de bulunan nos 3’ terminasyon sinyalinin kaybolduğu, bu nedenle alıcı

genomuna yerleşmediği tespit edilmiştir (BATS 2003).

Şekil 5. MON810 mısırda kullanılan PV-ZMBK07 plasmidinin şematik gösterimi

(Agbios Database, Essential Biosafety)



Bitki Genomuna Sabit İntegrasyon

Yazarlar tarafından sağlanan veriler, segregasyon ve stabilitenin, cryIA(b) geninin

MON810 genomuna tek bir bölgeden entegre olmuş olması ile uyum gösterdiğini

ortaya koymaktadır. Entegrasyon stabilitesi birçok nesil boyunca çaprazlama ile

gösterilmiştir. Bu mısır hattı farklı mısır genotipleri ile 4 nesil boyunca

çaprazlandığında ECB’ye karşı direnç devam etmiştir. MON810 hattı üçüncü

nesilden geri çaprazlama yolu ile elde edilmiştir. Üç nesil boyunca bu tekli

yerleşmenin sabit integrasyonu Southern Blot analizleri ile gösterilmiştir.

Düzenleme Kararı

Mısır hattı MON810’un Birleşik Devletlerde ekilmesi Temmuz 1996’da Çevre Koruma

Ajansı tarafından onaylanmıştır. Bu mısır hattının Avrupa Birliğinde ticarileşmesi 22

Nisan 1998 tarih 98/294/EC nolu Komisyon kararı ile teyit edilmiştir (Komisyon

Kararı 98/294/EC).

Kanada Besin Teftiş Ajansı, bu mısır hattının besin ve yem olarak onayını Karar

Dokümanı 97-101 ile yayınlamıştır. MON810 hattı Arjantin, Avustralya, Japonya,

Güney Afrika ve İsviçre’de onaylanmıştır. Bu mısır hattı insan tüketimi için (yaş ve

kuru öğütme ve tohum yağı) ve çiftlik hayvanlarının yemi olarak tasarlanmıştır.




Bt-176 Mısırın Özellikleri3

Kısa Tanımlama

İsim Vaka 176 Bt mısır

Başvuran Ciba-Geigy Ciba Tohumculuk ve Mycogen Şirketi

Bitki Türü Zea mays L. (mısır)

Yeni Özellikler Avrupa mısır kurduna direnç (Ostrinia nubilalis),

glufosinat amonyum herbisitine tolerans

Genetik Modifikasyon Metodu Olgunlaşmamış embryolarda partikül bombardımanı

(biyolistik)

Önerilen Kullanım Hibrid tane mısır olarak tarım (yetiştirme)

Temel Bilgi

Ciba Tohumculuk ve Mycogen Anonim Şirketi Avrupa Mısır kurduna (ECB) dirençli

bir mısır hattı geliştirmişlerdir. Vaka Bt-176 olarak tanımlanan bu mısır hattı,

embriyolara mikroprojektil bombardıman ve rekombinant DNA teknolojisi yolu ile

doğada bulunan, insektisidal bir proteini (Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki’den)

kodlayan genin aktarılması ile geliştirilmiştir. Bu protein Lepidoptera takımına ait,

ECB’nin de dahil olduğu bazı kelebek ve güve türlerine karşı aktiftir. Bu protein

doğadaki CRYIA(b) δ-endotoksinin en sekansı kısaltılmış bir versiyonudur şeklidir ve

mısır bitkilerini ECB larvaları tarafından verilen zararlardan korur. Buna ek olarak bu

hat mısıra, genetik olarak değişikliğe uğratılmış bitkileri çok erken gelişme

dönemlerinde seçip ayrıştırabilmek için herbisit glufosinat amonyum herbisitine

direnç sağlayan bir başka gen de aktarılmıştır.

Yeni Karakterlerin Tanımlanması

Avrupa mısır kurduna (ECB) direnç

Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki endospor oluşturan, gram pozitif, toprakta

yaşayan bir bakteridir. Sporogenik döneminde endospora ek olarak Avrupa mısır

kurdu (ECB), Ladin tomurcuk kurdu, Çingene güvesi, Diamondback güvesi, Tütün

tomurcuk kurdu, Lahana kurdu gibi bazı lepidoptera böceklere karşı, aralarında aktif

3 Kanada Besin Teftiş Ajansı, Karar 96-09’dan alınmıştır.



CRYIA(b) δ-endotoksin aktif proteini de olmak üzere bir çok insektisidal protein

kristali üretmektedir.

Bu proteinin insanlara, diğer omurgalılara ve yararlı böceklere toksik olmadığı

defalarca gösterilmiştir (Lee ve ark. 1995).

Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki HD-1 suşundan alınan sentetıik cryIA(b) geni,

CRYIA(b) δ-endotoksin proteinin daha kısa bir versiyonunu kodlar. Bu gen mısırdaki

ifadesini arttırmak için sentetik olarak geliştirilmiştir ve nükleotid dizini düzeyinde

doğal genle %65’lik bir homoloji göstermektedir (Koziel ve ark. 1993). Kısaltılmış

cryIA(b) geni doğal CRYIA(b) proteinin insektisidal aktivite gösteren bölgesini

içermektedir. İnsektisidal aktivitenin, bu aktif proteinin hassas böceklerin orta

bağırsak epitel hücrelerindeki özel alıcılara tutunmasına bağlı olduğu

düşünülmektedir. Bunu izleyen gözenek oluşumu ozmotik dengeyi bozarak hücrenin

patlamasına ve böceğin ölümüne yol açar

Vaka Bt-176 iki ayrı sentetik cryIA(b) gen konstrüksiyonu taşıyan bir vektörün

transformasyonu ile elde edilmiştir. Konstrüksiyonların birinde cryIA(b) geni mısır

fosfoenolpiruvat-karboksilaz (P-PEPC) promotörünün transkripsiyonel kontrolü

altındadır ve sadece yeşil dokularda ifade edilir. İkinci konstrüksiyonda aynı gen mısır

kalsiyuma bağlı protein kinaz promotörü (P-CDPK) kontrolü altındadır ve özellikle

polende ifade edilir. Her iki konstrüksiyonda da gen kaseti Karnıbahar Mozaik Virüs

kökenli terminatör ile durdurulur. Gen kasetleri ayrıca mısır fosfoenolpiruvat-

karboksilaz geninin intron 9 parçasını içermektedir (bakınız Şekil 6 ve Şekil 7).

CRYIA(b) proteinin yeşil dokularda ifadesi ilk nesil yapraklar üzerinde beslenen ECB

larvalarına karşı direnç kazandırmak için tasarlanmıştır. Polendeki ifade ise polen

üzerinde beslenen ikinci nesil ECB larvalarını hedef alarak tasarlanmıştır. Bt-176

yapraklarından elde edilen CRYIA(b) proteini, memeli mide koşulları taklit edilerek in

vitro sindirim denemelerine maruz bırakılmış ve geleneksel besin proteinleri gibi

parçalandığı gösterilmiştir.

Şekil 6. CDPK promotör kontrolü altında sentetik cryIA(b) gen kaseti şematik

gösterimi (Matsuoka ve ark., 2000).

P-CDPK cryIA(b)

PEPC Intr # 9

T-35S



Şekil 7. PEPC promotör kontrolü altında sentetik cryIA(b) gen kaseti şematik

gösterimi (Matsuoka ve ark., 2000).

Glufosinat amonyum herbist toleransı

Glufosinat amonyum tolerans geni (bar geni) toprak bakterisi Streptomyces

hygroscopicus’dan elde edilmiştir. Bu gen CaMV35S konstitütif promotörünün

transkripsiyonel kontrolü altında fosfinotrisin asetiltransferaz (PAT) enzimini kodlar

ve polen dışında bütün bitki dokularında aktiftir. Fosfinotrisin, glutamin sentetaz

inhibitörüdür ve glufosinat amonyum’un aktif içeriğidir. Fosfinotrisinin herbisidal

aktivitesi glutamin sentetaz enziöiminin inhibe edilmesi ile bitkide öldürücü

miktarlarda amonyum akümülasyonu ile sonuçlanır. PAT fosfinotrisin asetilasyonunu

katalize eder ve herbisidal aktivitesini ortadan kaldırır.

Fosfinotrisin’in L-izomeri (L-PPT) yaygın olarak yabani ot kontrolünde kullanılır. L-

PPT glufosinat amonyumun herbisitinin aktif maddesidir. Hoechst tarafından

geliştirilmiştir ve BASTA ticari ismi ile anılır. Bu izomer glutamin sentetazın substratı

olan glutamatın yapısal analoğudur (L-PPT ve glutamatın karşılaştırılması için

bakınız Şekil 8).

Şekil 8. L-PPT (sol) ve glutamatın (sağ) karşılaştırılması

T-35S cryIA(b)

PEPC Intr # 9

P-PEPC



L-PPT ilk olarak Streptomyces viridochromogenes’den izole edilmiştir. Bu organzima

yanlızca fosfinotrisin L-izomerini sentezler. Sentetik glufosinat amonyum PPT’nin D-

ve L- izomerlerinin eşit mollarda rasemik bir karışımıdır (D-PPT herbisidal aktivite

göstermez). PAT enzimi fosfinotrisin üzerinde etki gösterir,piruvat, kolin ve serin

içeren diğer yaygın asetiltransferaz substratları üzerinde etkisi gözlenmemiştir.

Memeli mide koşullarının taklit edildiği, E.coli tarafından ifade edilen PAT enzimi

varlığında gerçekleştirilen in vitro sindirim çalışmalarında bu proteinin geleneksel

besin proteini gibi sindirildiği görülmüştür.

Glufosinat amonyum tolerans geni, bitki ıslahı sırasında transfer edilen genlerin

izlenebilmesi ve transforme olan embryoların seçici ortamda tanımlanabilmesi için

markör olarak bitkiye aktarılmıştır. Rapor edilen (FSANZ 2000), moleküler veriler, BT-

176 vakasının karnıbahar mozaik virüsü 35S promotörü ve 35S terminatörü (sırasıyla

P-CaMV-35S ve T-35S) kontrolünde tek kopya bar geni taşıdığını işaret

etmektedir(bakınız şekil 9).

Şekil 9. bar genine ait şematik gösterim (Matsuoka ve ark., 2000)

Geliştirilme Metodu

Bt-176 vakası iki plazmidin biyolistik transformasyon yolu ile kendilenmiş mısır hattı

CG00526 (Zea mays L.) ‘ya aktarılması sonucu elde edilmiştir. İki sentetik cryIA(b)

geni tek bir plazmide (pCIB4431) birlikte klonlanmıştır. Aktarılan ikinci plazmid

vektörü (pCIB3064), toprak bakterisi Streptomyces hygroscopicus’dan izole edilen

herbisit tolerans geni (bar) taşımaktadır. İki vektör, mısır hattı CG00526’ın

olgunlaşmamış embriyolarına partikül bombardıman yoluyla aktarılmıştır. Gen

aktarılan bitkilerde yapılan moleküler analizler bu mısır vakasının genomuna her

plazmid vektörün iki ya da daha fazla kopyasının yerleştiğini göstermiştir. Testler ve

Northern Blot analizleri, bakteri geriplanında vektörleri seçmek amavı ile aktarılmış

olan bakteri promotörü tarafından kontrol edilen ampisilin direnç geninin (bla geni)

5P-3 S

bar T-35S


yaprak dokusu ya da polende ifade edilmediğini göstermektedir. İki bağımsız

transgenik mısır bitkisi daha sonraki çaprazlama ve karakterizasyon için seçilmiştir:

Vaka 171 ve Vaka 176 (Koziel ve ark. 1993).

Buna ek olarak yapılan karakterizasyon çalışmaları Bt-176 mısırda cry1A(b) (Koziel

ve ark 1993), bar ve bla genleri (Privalle 1994) bulunduğunu ispatlamıştır. Yeni

Zelanda gıda standartları (FSANZ 2000) tarafından rapor edilen verilere göre Bt-176

mısır DNA Southern Blot analizleri ile görüldüğü üzere, bu vakada 6 kopyaya kadar

cry1A(b) ve bla geni ve en az iki kopya bar geni (35S promotörü ile birlikte)

bulunabilir (Privalle 1994).

Karakterlerin Yerleşmesindeki Sabitlik

Rapor edildiği üzere (FSANZ 2000), serada büyüyen bitkilerin polen ve yeşil

yapraklarında CRY1A(b) ve PAT protein üretimi 4 başarılı geri çaprazlama nesli

boyunca sabit kalmıştır. Segregasyon analizleri ECB’ye direnç ve herbisit toleransı

özelliklerinin Mendel karakterleri gibi ko-segrege olduğunu göstermiştir. 3240 bitki

üzerinde yapılan bir çalışmada yalnızca 5 bitki (%0,15) glufosinat amonyuma dirençli

fakat ECB larvalarının zararlarına karşın hassas bulunmuştur.

Düzenleme Kararları

Ağustos 1995’de, ABD Çevre Koruma Birimi 2000 yılına kadar Vaka 176’dan gelen

tarla mısırının ticarileştirilmesini koşullu olarak onaylamıştır.

Bu mısır hattının Avrupa Birliğinde ticarileşmesi için gerekli komisyon kararı

(97/98/EC) 23 Ocak 1997’de yasallaşmıştır. Bu mısır hattı ziraai, endüstriyel

işlemlerde tohum olarak ve hayvan besini olarak üretimi ve tohum üretimi amacıyla

ekilmek üzere tasarlanmıştır (Komisyon Kararı 97/98/EC).



Kaynaklar

Agbios database on Essential Biosafety. Molecular Characterization of MON810

inserted DNA. http://www.agbios.com/main.php (accessed January 2010)

Armstrong, C.L., Green, C.E. and Phillips, R.L. (1991). Development and avaibility of

germplasm with high type II culture formation response. Maize Genetics

Cooperation Newsletter 65, 92-95.

BATS (2003). Genetically Modified (GM) Crops: molecular and regulatory details.

http://www.bats.ch/gmo-watch/index.php (accessed January 2010)

Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate. Plant Biosafety

Office. Decision Document DD96-09: Determination of Environmental Safety of

Event 176 Bt Corn (Zea mays L.) Developed by Ciba Seeds and Mycogen

Corporation. http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9609e.shtml

(accessed January 2010)

Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate. Plant Biosafety

Office. Decision Document DD95-05: Determination of Environmental Safety of

Monsanto Canada Inc.s Glyphosate Tolerant Soybean (Glycine max. L.) Line

GTS 40-3-2. http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9505e.shtml


Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate. Plant Biosafety.

Decision Document 97-19: Determination of the safety of Monsanto Canada

Inc.’s Yieldgard TM Insect Resistant Corn (Zea mays L.) MON810.

http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9719e.shtml (accessed

January 2010)

Commision Decision 97/98/EC of 23 January 1997 concerning the placing on the

market of genetically modified maize (Zea mays L.) with the combined

modification for insecticidal properties conferred by the t-endotoxin gene and

increased tolerance to the herbicide glufosinate ammonium, pursuant to Council

Directive 90/220/EEC.(OJ L 31,1.2.1997, p.69)


http://www.agbios.com/main.php

http://www.bats.ch/gmo-watch/index.php

http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9609e.shtml




Commision Decision 96/281/EC of 3 April 1996 concerning the placing on the market

of genetically modified soyabeans (Glycine max L.) with increased tolerance to

the herbicide glyphosate, pursuant to Council Directive 90/220/EEC. (OJ L 107,

30.4.1996), p. 10)

Commision Decision 96/294/EC of 22 April 1998 concerning the placing on the

market of genetically modified maize (Zea ays L. line MON810) pursuant to

Council Directive 90/220/EEC. (OJ L 131, 5.5.1998, p. 33).

Foods Standarts Australia New Zealand-FSANZ (formerly Australia New Zeland

Food Authority-ANZFA) (2000). Draft risk analysis report. Food produced from

insect-protected Bt-176 corn. Application 385,

http://www.foodstandards.gov.au/_srcfiles/A385%20FA.pdf (accessed January

2010)

Koziel, M. G.et al. (1993). Field performance of elite transgenic maize plants

expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thrungiensis

BIO/Technology 11, 194-200.

Lee, T.C., Zeng, J., Bailey, M., Sims, S.R., Sanders, P.R. and Fuchs, R.L. (1995).

Assessment of equivalence of insect protected corn- and E-coli –produced B.t.k.

HD-1 protein. Plant Physiol. Suppl. 108, 151.

Matsuoka, T., Kawashima, Y., Akiyama, H., Miura, H., Goda, Y., Kusakabe, Y.,

Isshiki, K., Toyota, M. and Hino. A. (2000). A method of detecting Recombinant

DNAs from four lines of genetically modified maize. Journal of Food Hygienic

Society of Japan 41, 137-143

Monsanto Company (2000). Updated Molecular Characterization and safety

Assessment of Roundup Ready Soybean Event 40-3-2. Monsanto Report,

Product Safety Centre.

Padgette, S.R., Kolacz, K.H., Delannay, X., Re, D.B., LaVallee, B.J., Tinius, C.N.,

Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Barry, G.F., Eicholtz, D.A., Perchke, V.M., Nida,D.L.,

Taylor, N.B. and Kishore, G.M. (1995). Development, identification and

characterization of a glyphosate-tolerant soyabean line. Crop Science 35, 1451-

1461


http://www.foodstandards.gov.au/_srcfiles/A385%20FA.pdf



Padgette, S.R., Re, D.B., Barry, G.F., Eicholtz, D.A., Delannay, X., Fuchs, R.L.,

Kishore, G.M and Fraley, R.T. (1996). New weed control opportunities:

Development of soybeans with Roundup Ready gene. In Duke, S.O. (ed.).

Herbicide-Resistant Crops. Agricultural, Economic, Regulatory and Technical

Aspects. CRC Lewis Publishers., pp 53-84.

Privalle L. (1994). Quantification of Cry1A(b) and PAT proteins in Bt corn (corn)

tissues, whole plants and silage. Performing laboratory: Ciba Seeds Agricultural

Biotechnology Research Unit, Ciba-Geigy Corporation, research Triangle Park.

NC, USA. Study No CAB-009-94.

Windels, P., Taverniers, I., Depicker, A., Van Bockstaele, E. and De Loose, M.

(200!). Characterization of the Roundup Ready soybean insert. European Food

Research Technology 213, 107-112.


Bölüm 8

El Kitabında tanımlanan Nitel PCR’ın Özellikleri







Nitel PCR’ın Özellikleri 2

İçindekiler

Bölüm 8

El Kitabında tanımlanan Nitel PCR’ın Özellikleri

El kitabında tanımlanan Nitel PCR sistemlerinin özellikleri 3

Bitki spesifik PCR 3

Lektin geninin saptanması 3

Zein geninin saptanması 3

Tarama yöntemi : CaMV 35S promotör ve nos terminatörün saptanması 4

CaMV 35S promotörün saptanması 4

nos terminatörün saptanması 5

GDO spesifik PCR 7

Roundup Ready® soya CTP/EPSPS gen kasetinin spesifik saptanması 7

Bt-176 mısır cryIA(b) sentetik geninin saptanması 7

MON810 mısır E35S promotör/hsp70 ekson-intron bölgesininin spesifik saptanması 9

Kaynaklar 11



El Kitabında tanımlanan Nitel PCR sistemlerinin özellikleri

Kurs süresince birden fazla saptama sistemi kullanılacaktır: 1) Bitki spesifik

primerler ile örneklerden ekstrakte edilen DNA’nın varlığını ve kalitesini (amplifiye

olabilirliğini) doğrulamak amacı ile kullanılan yöntem; 2) En yaygın kullanılan

düzenleyici sekanslardan 35S promotör ve nos terminatör’ ün spesifik olarak

saptanmasına dayanan, “tarama yöntemi” olarak adlandırılan yöntem. Bu iki yöntem

için basit bir PCR protokolü izlenecektir. Son olarak, GDO-spesifik primerler

kullanılarak farklı transgenik hatların selektif saptanması ve tanımlanması için

“nested PCR” gerçekleştirilecektir. Bu bölüm Roundup Ready® soya, MON810 mısır

ve CryIA(b) geni içeren Bt-176 mısırın saptanması ve tanımlanması için kullanılan

farklı sistemlere genel bir giriş niteliğindedir. Primer dizilimi ve kompozisyonu üzerine

daha fazla bilgi için Bölüm 9’a bakınız.

Bitki spesifik PCR

Lektin geninin saptanması

Soya DNA’sının tanımlanabilmesi için soyaya özgü lektin geninin (Le1) bir parçasını

tanımlayan GMO3 ve GMO4 primerleri (Meyer ve ark., 1996) kullanılacaktır.

Yukarıda açıklandığı gibi, bu yöntemin amacı, soya içeren örneklerden ekstrakte

edilmiş DNA’nın varlığını ve kalitesini doğrulamaktır. Burada DNA kalitesi olarak

aranan vasıf, istenen PCR ile amplifiye olabilme (çoğaltılabilme) özelliğidir. GMO3 ve

GMO4 primerleri, işlenmiş gıdalardan DNA ekstraksiyonu üzerine Meyer ve Jaccaud

(1997) tarafından rapor edilmiş bir çalışmada tanımlanmış olup, nested PCR için

kullanılmaktadır. Beklenen ürün, 118 bp büyüklüğünde bir amplikondur. Bu

amplikonun varlığı, analiz edilen örnekte soya bulunduğunu doğrular.

Zein geninin saptanması

Mısır zein (10 kb’lik bir protein kodlayan Ze1,) genine spesifik ZEIN3 ve ZEIN4

primerleri, (Studer ve ark., 1997) mısır içeren örneklerden ekstrakte edilmiş DNA’nın

varlığı ve kalitesini doğrulamak için kullanılacaktır. ZEIN3 ve ZEIN4 primerleri

işlenmiş gıdalardan ekstrakte edilen mısır DNA’sının saptanması için bir nested PCR

sisteminde internal primerler olarak tasarlanmıştır. Eğer ekstrakte edilen hedef DNA

zarar görmemişse ve amplifiye olabiliyorsa, beklenen ürün 277 bp büyüklüğünde bir




amplikondur. Bu amplikonun varlığı, analiz edilen örnekte mısır bulunduğunu

doğrular.

Tarama yöntemi : CaMV 35S promotör ve nos terminatörün

saptanması

Bitki kaynaklı gıda maddelerinde, herhangi bir genetik modifiye girdinin

tanımlanması, tarama yöntemi olarak adlandırılan bir yaklaşımla analiz edilen

örnekte 35S promotör ve/veya nos terminatörün varlığının PCR ile saptanması

yoluyla olur . Bugüne dek AB onayı almış genetik modifiye gıdaların hemen hepsinde

bulunduğu için 35S promotör ve nos terminatörün hedef dizilimler olarak kullanımı,

birçok genetik modifiye gıdanın saptanmasını sağlamaktadır (Hemmer, 1997). AB

pazarında kabul görmüş bazı mısır hatlarının karakteristik özellikleri Tablo 1’de örnek

olarak listelenmiştir. Kurs sırasında kullanılan 35S promotör ve nos terminatör

spesifik primerleri, işlenmiş gıdada Roundup Ready® soya ve Maximizer mısır (Bt-

176)’ın saptanması için geliştirilen bir PCR yönteminin geçerliliğini denetlemek için de

kullanılmıştır (Lipp ve ark., 2001).

Tablo 1. AB pazarına resmi olarak giriş yapan transgenik mısırlar

Ad Şirket Karakter Promotör Genler Terminatör

Vaka 176 Ciba-Geigy Bt, bar 35 S PEPC CDPK

bar cryIA(b)/int.9 PEPC cryIA(b)/int. 9 PEPC

35S 35S 35S

Hat Bt-11 Novartis Bt, pat 35S cryIA(b)/int.IVS6 nos

Hat T25 AgrEvo pat 35S pat 35S

Hat MON810 Monsanto Bt E35S E35S

cryIA(b)/int. hsp70 cryIA(b)/int. hsp 70

- -

CaMV 35S promotör saptanması

Bu promotör Roundup Ready® soya ve Bt-176 mısır gibi birçok transgenik bitkinin

gen ekspresyonunu düzenler. Spesifik saptama için p35S-cf3 ve p35S-cr4 primerleri

kullanılacaktır. Bu primerlerin CaMV 35S promotör diziliminin ilgili bölgesine


yerleştirildiği Şekil 1’de açıklandığı üzere, beklenen amplifikasyon ürünü 123 bp’lik bir

sekanstır.

ID A18053_3; parent: A18053 AC A18053; FT promoter 396..1779 FT /note="35S3 promoter sequence derived from cauliflower FT mosaic virus isolate CabbB-JI" SQ Sequence 1384 BP; nnnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn nnnnnnnnn 1140 ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 1200 acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga catctccact gacgtaaggg 1260 p35S-cf3 atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc 1320 p35S-cr4 atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctat aaatctatct ctctctctat 1380 aacc 1384 //

Şekil 1. Cauliflower Mosaic virüsü (CaMV) 35S promotör dizi parçası ve p35S-cf3 ve

p35S-cr4 primerlerinin hibridizasyon bölgesi.

nos terminatör saptanması

HA-nos118-f ve HA-nos118-r primerleri (Lipp ve ark., 2001) nos terminatörünün

saptanması için kullanılmaktadır. Nos terminatörü Roundup Ready® soya ve diğer

transgenik bitkilerde (örn. Bt-11) bulunur. Nos terminatörün amplifikasyonu

sonucunda 118 bp’lik bir DNA sekansı ortaya çıkar. Şekil 2’de Ha-nos118-f ve HA-

nos118-r primerleri Roundup Ready® soya transgenik bölgesinin dizilimi üzerinde

gösterilmiştir.



HA-nos118-r > 151 nnnnnnnnnn nnnnnnnnga tccccgatct agtaacatag atgacaccgc

201 gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt tctatcgcgt

251

< HA-nos118-f attaaatgta taattgcggg actctaatca taaaaaccca tctcataaat

301 aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt aattcaacag

351 aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga

/ / 1601 gatccaggtg tcgccttcct tacggatcct ggcgcccatg gcctgcatgg

1651 ccttgcccgt attgatgacg tcctcgcctt ccagaaggcc ggtgatgcgc

GM09 > 1701 gtttcaccgc tcgcgagacc gccgaacatg aaggaccggt gggagatcga

1751 cttgtcgccg ggaatgcgga cggttccgga aaggccagag gatttgcggg

1801 cggttgcggg ccggctgctt gcaccgtgaa gcatgcaggc tgtagccact

1851 gatgctgaaa tcctaaagga acaaaacttt tgcataaaaa ttgaatcttt

1901 tttcaaaacc aacatagaat ttgctgaatt tttcagtttt ttagatccaa

GM08 > 1951 aaacaagaaa acttgaagat ttaggaactt ggggtttatg gaaattggaa

2001 ttgggattaa gggtttgtat cccttgagcc atgttgttaa tttgtgccat

p35S-cr4 > 2051 tcttgaaaga tctgctagag tcagcttgtc agcgtgtcct ctccaaatga

< GM07 2101 aatgaacttc cttatataga ggaagggtct tgcgaaggat agtgggattg

< GM05 < p35S-cf3 2151 tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg

2201 aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg

2251 ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt

2301 tcctttatcg caatgatggc atttgtagga gccaccttcc ttttccacta

2351 tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt

2401 ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca catcg

Şekil 2. Patent WO 92/04449’a göre Monsanto’dan alınan Roundup Ready® soya

transgenik bölgesinin dizilimi



GDO spesifik PCR

Roundup Ready® soya, Bt-176 mısır ve MON810 mısır tanımlanması için kullanılan

amplifikasyon primerleri, sırasıyla Roundup Ready® soya, Bt-176 ve MON810 mısır

genomlarına eklenen genetik yapıyı özgün bir biçimde tespit edebilme

potansiyellerinden dolayı özellikle seçilmiştir.

Roundup Ready® soyanın CTP/EPSPS gen bölgesinin spesifik saptanması

GMO9/GMO5 ve GMO8/GMO7 primerleri Roundup Ready® soya transgenik

bölgesinin nested PCR yöntemiyle spesifik olarak saptanması için düzenlenmiştir

(Meyer ve Jaccaud, 1997). GMO9 ve GMO5 eksternal primerleri, CP4 EPSPS geni

ve CaMV 35S promotörü DNA dizilimlerinin tamamlayıcısıdırlar. DNA’nin bu iki

primer ile amplifiye olması, 447 bp büyüklüğünde bir amplikon ortaya çıkmasına

neden olur. İnternal primerler olan GMO8 ve GMO7, EPSPS petunya geni ve CaMV

35S promotörünün tamamlayıcısıdır. Bu internal primerler ile amplifiye olan DNA

Şekil 2’de görüldüğü gibi 169 bp büyüklüğünde bir dizi parçası verir.

Bt-176 mısırın cryIA(b) sentetik geninin saptanması

CRYIA1/CRYIA2 ve CRYIA3/CRYIA4 primer çiftleri sentetik cryIA(b) geninin nested

PCR yöntemiyle spesifik olarak saptanması için düzenlenmiştir (Studer ve ark.,1997).

CRYIA1 ve CRYIA2 eksternal primerleri ve CRYIA3 ve CRYIA4 internal primerleri

cryIA(b) geninin DNA dizilimine tamamlayıcıdır. Şekil 3’te gösterildiği gibi, internal

primerler CRYIA3/CRYIA4 189 bp’lik bir amplikon ortaya çıkarırken iki eksternal

primer (CRYIA1/CRYIA2) 420 bp’lik bir dizi parçasını kapsar.



ID I41419 standard; DNA; UNC; 1947 BP. AC I41419; ……… DE Sequence 3 from patent US 5625136. ……… RA Koziel M.G., Desai N.M., Lewis K.S., Kramer V.C., Warren G.W., Evola S.V., RA Crossland L.D., Wright M.S., Merlin E.J., Launis K.L., Rothstein S.J., RA Bowman C.G., Dawson J.L., Dunder E.M., Pace G.M., Suttie J.L.; RT "Synthetic DNA sequence having enhanced insecticidal activity in maize"; RL Patent number US5625136-A/3, 29-APR-1997. ……… FT source 1..1947 FT /db_xref="taxon:12908" FT /organism="unclassified" SQ Sequence 1947 BP; 412 A; 729 C; 528 G; 278 T; 0 other; atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60 gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120 agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180 gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240 gagcagctga tcaaccagcg catcgaggag ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300 gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360 cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420 ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480 tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540 cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600 ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660 cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720 ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780 agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840 cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900 aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960 atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020 CRYIA1 forward primer outer PCR atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080 accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140 CRYIA3 forward primer inner (nested) PCR agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200 taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260 CRYIA4 reverse primer inner (nested) PCR


http://dips-2.dips.org/dips/viewer?PN=US5625136&CY=ep&LG=en&DB=EPD

http://srs6.ebi.ac.uk/srs6bin/cgi-bin/wgetz?-e+%5bEMBL_features-id:I41419_1%5d

http://srs6.ebi.ac.uk/srs6bin/cgi-bin/wgetz?%5btaxonomy-ID:12908%5d+-e


ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320 agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380 gagttcaaca acatcatccc cagcagccaa atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440 CRYIA2 reverse primer outer PCR aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500 cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560 cagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620 atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680 ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740 agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800 cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct 1860 cagaaggccg tgaacgagct gttcaccagc agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg 1920 accgactacc acatcgatca ggtgtag

Şekil 3. Bt-176 mısıra eklenen optimize crylA(b) geni: US Patent no 5625136 ve

Genbankası Erişim no 141419’a göre (SEQ ID no.3) crylA(b) geninin dizilimi

MON810 mısırın E35S promotör/hsp70exon-intron bölgesininin spesifik saptanması

mg1/mg2 ve mg3/mg4 primer çiftleri E35S/hsp70exon-intron bölgesininin nested

PCR ile spesifik olarak saptanması için geliştirilmiştir (Zimmermann ve ark., 1998).

Bu gen bölgesi MON810 mısıra spesifiktir. Internal primerler mg3 ve mg4 sırasıyla

E35S promotör ve hsp70 exon 1 bölgesinin DNA diziliminin tamamlayıcısıyken, mg1

ve mg2 external primerleri sırasıyla E35S promotör diziliminin ve hsp70 intron 1

bölgesinin tamamlayıcılarıdır. Şekil 4’de gösterildiği gibi iki eksternal primer

(mg1/mg2) 401 bp büyüklüğünde bir amplikon üretirken mg3 ve mg4, 149 bp

büyüklüğünde bir amplikon üretir.




Şekil 4. Geliştirilmiş CaMV 35S promotörü, mısır hsp70 intronu ve sırasıyla mg1,

mg2, mg3 ve mg4 primerlerinin göreceli konumlarını da içerecek biçimde MON810

mısır gen kasetinden bir bölgenin şematik gösterilmesi (Zimmermann ve ark., 1998)

Plant DNA

401 bp

149 bp mg1 mg2

mg3 mg4

P-E35S

hsp70 exon 1

hsp70 exon 2

hsp70 intron 1

hsp70 intron



Kaynaklar

Hemmer, W. (1997). Foods Derived from Genetically Modified Organisms and

Detection Methods. Biosafety Research and Assessment of Technology

Impacts of the Swiss Priority Program Biotechnology – Report 2/97, 61

pages. http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php


Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and

Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain

reaction for the detection of genetically modified organisms in various

processed foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.

Meyer, R., Chardonnens, F., Hubner, P. and Luthy, J. (1996). Polymerase chain

reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food: detection of soya

in processed meat products. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -

Forschung A 203, 339-344.

Meyer, R. and Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in

processed food products: development and validation of a PCR assay for the

specific detection of Glyphosate-Tolerant Soybeans. Proceedings of the

EURO FOOD CHEM IX Conference, Interlaken, Switzerland, Event No. 220

1, 23–28.

Studer, E., Dahinden, I., Lüthy, J. and Hübner, P. (1997). Nachweis des

gentechnisch veränderten “Maximizer"-Mais mittels der Polymerase-

Kettenreaktion (PCR). Mitteilungen aus dem Gebiet der Lebensmittel und

Hygiene 88, 515–524.

Zimmermann, A., Liniger, M., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). A sensitive detection

method for genetically modified MaisGardTM corn using a nested-PCR

system. Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 31, 664-667.

http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php


Bölüm 9

MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya’nın PCR ile Nitel Saptanması

M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara






MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya’nın PCR ile Nitel Saptanması 2

İçindekiler

Bölüm 9

MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya’nın PCR ile

Nitel Saptanması

Deneysel 3

Giriş 3

Bitki spesifik PCR : Soya - Lektin 6

Bitki spesifik PCR : Mısır - Zein 9

Genetik yapısı değiştirilmiş bitkilerin saptanması için Tarama metodu 12

35S Promotörün Saptanması 12

nos Terminatörün Saptanması 14

MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready® soyanın nested PCR ile spesifik

saptanması 17

MON810 mısırın saptanması 17

Bt-176 Mısırın Saptanması 21

Roundup Ready Soyanın Saptanması 25



Deneysel

Giriş

Aşağıdaki protokoller, işlenmiş ve işlenmemiş materyalde genetiği değiştirilmiş (GDO)

organizmaları, GDO olmayan örneklerle (soya ve mısır) karşılaştırarak, PCR’a dayalı tarama

(35S promotör ve nos terminatör kullanılarak) ve spesifik tanımlama (Roundup Ready

soya, MON810 mısır ve Bt-176 mısır) yöntemlerini açıklamaktadır.

Bu yöntemlerde sonuçlar, örnekte hedef dizinin varlığı/yokluğu şeklinde araştırılmakta ve

yalnızca nitel sonuç vermektedir.

Ekipmanlar

Mikro pipetler

Termal cycler

Setüstü Santrifüj (Mikrosantrifüj)


Reaksiyon tüpleri için taşıyıcı raf

0,2 ml’lik PCR reaksiyon tüpleri

1,5 ml’lik mikrosantrifüj tüpleri

UV lambalı çeker ocak bulunan ayrı bir steril oda

DİKKAT

Bütün ekipmanlar DNA bulaşıksız olmalı ve kullanımdan önce sterilize edilmiş olmalıdır.

Kontaminasyonu önlemek için, filtreli pipet uçları kullanılmalıdır.

Çözeltiler

dATP CAS 1923-31-7

dCTP CAS 102783-51-7

dGTP CAS 93919-41-6

dTTP CAS 18423-43-3

10x PCR tampon solusyonu (genellikle Taq Polimerazın satın alındığı firma

tarafından sağlanır)



25 mM MgCl2

Taq DNA Polimeraz

5’ ve 3’ primer solusyonları

Mineral yağ (kapak ısıtmasız PCR kullanıldığında gereklidir)

Nükleaz ari su

4mM dNTP Stok çözeltisi

dNTPler eşit konsantrasyonlarda dATP, dCTP, dGTP, dTTP içeren önceden

karıştırılmış stok çözelti olarak veya her biri ayrı konsantre stoklarından sağlanabilir.

Herbiri ayrı ayrı olan stoklar kullanıldığında, her dNTP, son konsantrasyonda 4 mM

dNTP stok çözeltisi olacak şekilde steril deiyonize suda çözülür.

Tüplere dağıtılır ve –20°C’ de saklanır. dNTP’ler bir kaç ay stabildir.

20 µM primer çözeltisi

Primer olarak kullanacak oligonükleotidler genelde liyofilize şekilde elde edilir ve son

konsantrasyonu 20 µM olacak şekilde seyreltilir.

20 µM primer çözelti, sağlandığı firmanın açıklamaları doğrultusunda hazırlanır

- 1 µM=1 pmol/µl ise 20 µM=20 pmol/µl

- X nmol primer + 10X µl steril su = 100 pmol/µl = 100 µM

- 65C’de 5 dakika inkübe edilir, karıştırılır ve 65C’de 3 dakika daha inkübe edilir.

- Dilüsyon 1:5 Bir ependorf tübe 400 µl steril su hazırlanır ve primer

çözeltisinden 100 µl eklenir (100 µM) Son konsantrasyon: 20 µM

Küçük miktarlara bölünerek tüplere dağıtılır ve –20C’de saklanır. Bu saklama

koşulunda primerler en az 6 ay stabildir. Liyofilize primerler –20C’da 3 yıl boyunca

stabil olarak sakalnabilir.

10X PCR tamponu

500 mM KCl, 100 mM Tris HCl (25C’de pH 9,0) ve %1 Triton X-100 içeren 10X PCR

tampon solusyonu genelikle Taq DNA polimeraz ile birlikte temin edilir ve kullanıma

hazırdır. Tampon her kullanımdan önce karıştırılmalı ve kısa süreli santrifüj

edilmelidir.

Tüplere dağıtılan tampon solusyonu –20C’da saklanır ve bir kaç ay stabildir.



25 mM MgCl2 Çözeltisi

“PCR düzeyi” MgCl2 çözeltisi genellikle Taq DNA polimeraz ile temin edilir ve kullanıma

hazırdır. Çözelti her kullanımdan önce vorteks ile karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir ( uzu

süreli saklama sonucu oluşabiliecek konsantrasyon değişimini önlemek için). –20C’de

saklanır.

Nükleaz içermeyen su

Master reaksiyon karışımı ve DNA’nın seyreltilmesi için kullanılacak olan steril, nükleaz

içermeyen, deiyonize su, küçük miktarlarda tüplere dağıtılarak kullanılır. Her analiz serisi

için, yeni tüpler hazırlanmalıdır.



Bitki spesifik PCR : Soya - Lektin

Soya DNA’sının belirlenmesi lektin geni kullanılarak gerçekleştirilir. Eğer örnekte çoğaltılabilir

soya DNA’sı bulunuyorsa GMO3/GMO4 primerleri kullanılarak PCR ile belirlenir.

GMO3 VE GMO4 Primerlerin Özellikleri

GMO3 Primer GCCCTCTACTCCACCCCCATCC Uzunluk 22 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6471,6 Erime Noktası* (G/C) 65,1

GMO4 Primer GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG Uzunluk 23 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6981,1 Erime Noktası* (G/C) 59,6

*50 mM’lık [Na+] varlığında

Kontroller

Her PCR analizi icin kontrol deneylerinin yapılması önemlidir. Negatif kontroller, PCR

çözeltilerinde DNA ile kontaminasyonun varlığını kontrol etmek üzere düzenlenir. Karakterize

edilecek örneklere ait pozitif kontroller PCR analizinin verimliliğini/etkinliğini ve spesifikliğini

belirlemek için önemlidir. Aşağıdaki kontroller her PCR analiz performansı için tanımlanmak

zorundadır.

Pozitif kontrol: Geleneksel/genetik modifikasyona uğratılmamış soyadan izole edilmiş

saf DNA

Negatif kontrol : Lektin geni içermeyen diğer türlerden izole edilmiş saf DNA

Hedef içermeyen kontrol: DNA yerine suyun kullanıldığı, master karışımın negatif

kontrolü

Master Karışım Hazırlama

10 örneklik bir seri için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler

Tablo 1’de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.



Takip eden prosedür, 48 µl GMO3/GMO4 master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi içeren bir

reaksiyon için uygundur. Çözeltilerin tümü master karışımın hazırlanması sırasında buz

içinde muhafaza edilir.

Tablo 1. GMO3-GMO4 master karışım

Son Konsantrasyon

Tek örnek için master karışım

10 örnek için master karışım

Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4mM dNTPs 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM oligonükleotid GMO3 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM oligonükleotid GMO4 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOPLAM 48 µl 480 µl

Bir adet 1,5 ml’lik ependorf tüp hazırlanır

Tablo 1’deki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir

GMO3-GMO4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir

0,2 ml’lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 48’er µl dağıtılır

Üzerlerine 2 µl DNA solüsyonu eklenir

Yavaşça çalkalanır ve kısa süreli santrifüj edilir

Reaksiyon tüpleri PCR cihazına yerleştirilir

PCR Programı* (GMO3-GMO4)

Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 95C 30 sn Primer Bağlanması (Annealing) 63C 30 sn Primer Uzaması (Extension) 72C 30 sn Döngü Sayısı 40 Son Primer Uzaması (Extension) 72C 3 dk Soğutma 4C

Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içine konur.




* NOT: Kurs sırasında, Perkin Elmer Gene Amp PCR System 9600, ABI 9700 thermocycler

(PCR cihazı) kullanılacaktır. Farklı model ya da marka bir cihaz kullanıldığında PCR

programlarının gerekli şekilde uyumlanması ve test edilmesi koşuluyla aynı sonuçlar elde

edilecektir1.

PCR Ürünlerinin Analizi

Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra, PCR ürünleri etidiyum bromidle boyanmış agarsz jel

elektroferezi kullanılarak analiz edilir. 8 µl PCR ürünü, 2 µl yükleme tamponu ile

karıştırıldıktan sonra örnekler agaroz jele (%1,5) yüklenir. Elektroforez yürütmesi 100 Volt’da

1 saattir.

Boyut markörleri (100 bp ladder, 15 µl) jelde amplikon bantların büyüklüğünü tam olarak

ölçmek için kenardaki kuyucuklara yüklenerek yürütülür. Yürütmeden sonra UV

transillüminatör ışığında jeldeki DNA’lar görüntülenir. Deney sonuçlarını kalıcı olarak

kaydetmek amacıyla jelin fotoğrafı çekilebilir.

Sonuçların Yorumlanması

GMO3 ve GMO4 primer dizisi doğal lektin geninin saptanmasında soyanın internal kontrolü

olarak kullanılır. Amplifiye edilen DNAnın soyaya ait olduğu, 118 bp büyüklüğünde lektin

spesifik bandı ile doğrulanır.

Pozitif kontrol 118 bp büyüklüğünde bir bant verecektir.Negatif kontrol ve hedef içermeyen

kontrol görünür bir bant vermeyecektir.

Eğer pozitif/negatif kontroller beklenen sonuçları vermiyorsa seçilen örneklerin PCR analizi

doğru ve geçerli değildir. Kontroller beklenen sonuçları veriyor ve örnekler 118 bp

büyüklüğünde bir bant vermiyorsa bu örnekte çoğaltılabilir soya DNA’sı bulunmuyor

demektir. Bu bölümün konusu olan protokoller nitel yöntemlerdir. Bu nedenle de sonuçlar

var/yok şeklinde alınır.

1 JRC ve WHO bu el kitabında adı geçen yahut kurs esnasında kullanılan hiç bir cihazın kullanımını özel olarak telkin etmemektedir. Laboratuarlarımızda gerçekleştirilen analizler, alternatif ekipmanın s’stem gereklilikleri göz önünde tutularak kolayca yinelenebilmelidir


Bitki spesifik PCR : Mısır - Zein

Mısır DNA’sını tanımlamak için zein geni kullanılır.

Eğer örnekte çoğaltılabilir mısır DNA’sı bulunuyorsa ZEIN3/ZEIN4 primerleri kullanılarak

PCR ile belirlenir.

ZEIN3 ve ZEIN4 Primerlerinin Özellikleri

ZEIN 3 Primer AGTGCGACCCATATTCCAG Uzunluk 19 Molekül Ağırlığı (g/mol) 5772,3 Erime Noktası* (G/C) 55,2

ZEIN 4 Primer GACATTGTGGCATCATCATTT Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6410,9 Erime Noktası* (G/C) 51,7


Kontroller

Pozitif Kontrol : Geleneksel mısırdan izole edilmiş saf DNA

Negatif Kontrol : Zein geni içermeyen diğer türlerden izole edilmiş saf DNA

Hedef içermeyen kontrol: DNA yerine suyun kullanıldığı Master karışımın negatif

kontrolü


10 örnek için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 2’de

verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.

Takip eden prosedür, 48 µl ZEIN3/ZEIN4 master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi içeren bir

reaksiyon için uygundur. Çözeltilerin tümü master karışımın hazırlanması sırasında buz

içinde muhafaza edilir.



Tablo 2. ZEIN3/ZEIN4 master karışımı

Son Konsantrasyon Tek örnek için master karışım


Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4mM dNTPs 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM oligonükleotid ZEIN3 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM oligonükleotid ZEIN4 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOPLAM 48 µl 480 µl



ZEIN3/ZEIN4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüj edilir





PCR Programı (ZEIN3/ZEIN4)

Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 96C 1 dk Primer Bağlanması / Uzaması (Annealing / Extensıon)

60C 1 dk

Döngü Sayısı 40 Son Primer Uzaması (Final Extension) 72C 3 dk Soğutma 4C





Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra, PCR ürünleri etidiyum bromid ile boyanmış agaroz

jel elektroferezi kullanılarak analiz edilir. 8 µl PCR ürünü, 2 µl yükleme tamponu ile


1 saattir.





Sonuçların Yorumlanması

ZEIN3 ve ZEIN4 primer dizisi doğal zein geninin saptanması suretiyle mısır için internal

kontrol olarak kullanılır. Amplifiye edilen DNAnın mısıra ait olduğu, 227 bp büyüklüğünde

zein spesifik bandı ile doğrulanır.

Pozitif kontrol 227 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir.Negatif kontrol ve hedef olmayan

kontrol görünür bir bant vermemelidir.

Eğer pozitif/negatif kontroller beklenen sonuçları vermiyorsa bu deney için seçilen örneklerin

PCR analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller beklenen sonuçları veriyor ve örnekler 227

bp büyüklüğünde bir bant vermiyorsa bu örnekte çoğaltılabilir mısır DNA’sı bulunmuyor

demektir. Bu bölümün konusu olan protokoller nitel yöntemlerdir. Bu nedenle de sonuçlar

var/yok şeklinde alınır.



Genetik yapısı değiştirilmiş bitkilerin saptanması için Tarama

metodu

Genler promotör ve terminatörlerin düzenleyici etkileri ile kontrol edilir. 35S promotör

(CaMV’den elde edilen) ve nos terminatör (A. tumefaciens bakterisinden elde edilen) gen

aktarımında en çok kullanılan düzenleyicilerdir. Araştırılan örneğin içeriğindeki soya ve/veya

mısırda bu düzenleyivi dizinlerinden birinin tespit edilmesi GDO varlığını gösterir.

Roundup Ready soyada 35S promotör ve nos terminatör dizinlerinin her ikisinin de

tanımlanması mümkünken, Mon810 ve Bt-176 mısırda yalnızca 35S promotör bulunur.

35S Promotörün Saptanması

p35S-cf3 ve p35S-cr4 Primerlerin Özellikleri

p 35S-cf3 Primer CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6414,5 Erime Noktası* (G/C) 57,4

p 35S-cr4 Primer TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC Uzunluk 25 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7544,2 Erime Noktası* (G/C) 56,3


Kontroller

Pozitif kontrol : Referans materyal DNA’sı (% 0,5 GD mısır)

Negatif kontrol : %0 oranında GDO mısır içeren referans materyalden elde edilen

DNA

Hedef içermeyen kontrol : Master karışım negatif kontrolü, DNA yerine yalnızca su

içerir.


10 örnek için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 3’de




Takip eden prosedür, 48 µl p35S-cf3/p35S-cf4 master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi içeren

bir örnek reaksiyon için geçerlidir. Çözeltilerin tümü master karışımın hazırlanması sırasında

buz içinde muhafaza edilir.

Tablo 3. p35S-cf3/p35S-cf4 master karışım

Son Konsantrasyon



Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4mM dNTPs 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM oligonükleotid p35S-cf3 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM oligonükleotid p35S-cr4 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOPLAM 48 µl 480 µl



p355-cf3/p355-cf4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli

santrifüjlenir





PCR Programı (p35S-cf3/p35S-cf4)






Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra PCR ürünleri etidiyum bromidle boyanmış agaroz jel



1 saattir.





Sonuçların Değerlendirilmesi

p355-cf3/p355-cr4 primer çifti CaMV 355 promotörü saptanmasında kullanılır, elde edilen

ürün 123 bp büyüklüğünde bir bant verir. Bu promotör Roundup Ready® soya ve Bt-176

mısır gibi bir çok transgenik bitkinin gen ekspresyonunu düzenler.

Pozitif kontrol 123 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir. Negatif kontrol ve hedef içermeyen

kontrol görünen bir bant vermemelidir. Pozitif ve negatif kontroller beklenen sonuçları

vermiyorsa seçilen örneklerin PCR analizi doğru ve geçerli değildir.

Eğer kontroller beklenen sonuçları veriyor ve örnekte 123 bp büyüklüğünde bir bant

gözlemleniyorsa örnekte modifiye DNA bulunuyor demektir.

nos Terminatörün Saptanması

HA-nos 118-f ve HA-nos 118-r Primerlerinin Özellikleri

HA-nos 118-f Primer GCATGACGTTATTTATGAGATGGG Uzunluk 24 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7462,8 Erime Noktası* (G/C) 56,2

HA-nos 118-r Primer GACACCGCGCGCGATAATTTATCC Uzunluk 24 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7296,9 Erime Noktası* (G/C) 61,2

*50 mM’lık [Na] varlığında



Kontroller

Pozitif Kontrol : Referans materyalden elde edilen DNA (%0,5 GD RR Soya)

Negatif Kontrol: Referans materyalden elde edilen DNA (%0 GD soya)

Hedef içermeyen kontrol: Master karışımın negatif kontrolü, DNA yerine yalnızca su

içerir.


10 örneklik bir seri için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontrolleri içerir) gerekli çözeltiler


Takip eden prosedür, 48 µl HA-nos 118-f ve HA-nos 118-r master karışımı ve 2 µl DNA

çözeltisi içeren reaksiyon için geçerlidir. Çözeltilerin tümü master karışımın hazırlanması

sırasında buz içinde muhafaza edilir.

Tablo 4. HA-nos 118-f ve HA-nos 118-r master karışım

Son Konsantrasyon



Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4mM dNTPs 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM oligonükleotid HA-nos 118-f 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM oligonükleotid HA-nos 118-r 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOPLAM 48 µl 480 µl



HA-nos 118-f ve HA-nos 118-r master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa

süreli santrifüjlenir





PCR Programı (HA-nos 118-f/HA-nos 118-r)



Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 95C 25 s Primer Bağlanması (Annealing) 62C 30 s Primer Uzaması (Extension) 72C 45 s Döngü Sayısı 50 Son Primer Uzaması (Extension) 72C 7 dk Soğutma 4C






1 saattir.





.


HA-nos 118-f/HA-nos 118-r primer çifti nos terminatörün saptanmasında kullanılır, elde

edilen ürünler 118 bp büyüklüğünde bir bant verir. Bu terminatör, Roundup Ready soya,

Bt-11 mısır gibi gibi birçok transgenik bitkide bulunur .

Pozitif kontrol 118 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir.

Negatif kontrol ve hedef içermeyen kontrol görünen bir bant vermemelidir.

Pozitif ve negatif kontroller beklenen sonuçları vermiyorsa seçilen örneklerin PCR analizi

doğru ve geçerli değildir. Eğer kontroller beklenen sonuçları veriyor ve herhangi bir örnekte

118 bp büyüklüğünde bir amplifikasyon bandı gözlemleniyorsa bunun anlamı örneğin genetik

modifiye DNA içerdiğidir.



MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready® soyanın nested

PCR ile spesifik saptanması

MON810 mısırın saptanması

Bu saptama sistemi MON810 mısır için özeldir. Hedef elementler, yüksek veya arttırılmış

transkripsiyon düzeyi için yapısal birer düzenleyici olan CaMV 35S promotör ve ısı şok

protein geni hsp70 exon/intron1 bölgesi dizilimleridir.

mg1, mg2, mg3, mg4 Primerlerin Özellikleri

mg1 Primer TATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC Uzunluk 25 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7665,1 Erime Noktası* (G/C) 59,6

mg2 Primer TGCCCTATAACACCAACATGTGCTT Uzunluk 25 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7560,2 Erime Noktası* (G/C) 57,9

mg3 Primer ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC Uzunluk 25 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7472,2 Erime Noktası* (G/C) 61,2

mg4 Primer GCATTCAGAGAAACGTGGCAGTAAC Uzunluk 25 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7722,9 Erime Noktası* (G/C) 59,6




Kontroller

Pozitif kontrol: Referans materyal DNA’sı (%0,1 MON810 Mısır)

Negatif kontrol : Referans materyalden elde edilen DNA (%0 GD mısır)

Hedef içermeyen kontrol: DNA yerine suyun kullanıldığı master karışımın negatif

kontrolü

Master Karışım Hazırlama I


Tablo 5’de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır. Bir örnek için mg1/mg2 içeren

master karışım 48 µl ve DNA çözeltisi 2 µl olmak üzere toplam hacim 50 µl’dir. Master

karışım hazırlandığı sürede bütün çözeltiler buzda tutulmalıdır.

Tablo 5. Master karışım I (mg1/mg2)



Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4mM dNTPs 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM oligonükleotid mg1 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM oligonükleotid mg2 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl Toplam 48 µl 480 µl



mg1/mg2 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir







PCR Programı (mg1/mg2)


Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içine konur

Master Karışım Hazırlama II


Tablo 6’da verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.

Bir örnek için 49 µl mg3/mg4 içeren master karışım ve 1 µl ön amplifiye edilmiş DNA

çözeltisi olmak üzere toplam hacim 50 µl’dir.

Master karışım hazırlandığı sürede bütün çözeltiler buzda tutulmalıdır.

Tablo 6. Master karışım I (mg3/mg4)



Steril deiyonize su 33,75 µl 337,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4mM dNTPs 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM oligonükleotid mg3 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM oligonükleotid mg4 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl Toplam 49 µl 490 µl


Tablo 6’daki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir

mg3/mg4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir

0,2 ml’lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 49’ar µl dağıtılır






PCR Programı (mg3/mg4)







1 saattir.





Sonuçların değerlendirilmesi

mg1/mg2 ve mg3/mg4 primerleri MON810 içeren ürünlerin nested PCR ile spesifik

saptanması amacıyla tasarlanmıştır. Amplifikasyon ürünü olarak gözlemlenecek son nested

PCR bandı 149 bp büyüklüğündedir.

Pozitif kontrol 149 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir. Negatif kontrol ve hedef içermeyen

kontrol görünür bir bant vermemelidir. Pozitif kontrol ve negatif kontrolde beklenen sonuçlar

alınamıyorsa seçilen örneklerin PCR analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller ve örnekler

149 bp büyüklüğünde bir bant veriyorsa örnekler genetik modifiye DNA içermektedir.



Bt-176 Mısırın Saptanması

Hedef gen bölgesi, bitkiyi European Corn Borer gibi zararlı böceklerden koruyan cryIA(b)’dir.

CRYIA1, CRYIA2, CRYIA3, CRYIA4 Primerlerin Özellikleri

CRYIA 1 Primer CGGCCCCGAGTTCACCTT Uzunluk 18 Molekül Ağırlığı (g/mol) 5394,6 Erime Noktası* (G/C) 59,5

CRYIA 2 Primer CTGCTGGGGATGATGTTGTTG Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6519,2 Erime Noktası* (G/C) 57,6

CRYIA 3 Primer CCGCACCCTGAGCAGCAC Uzunluk 18 Molekül Ağırlığı (g/mol) 5397,6 Erime Noktası* (G/C) 61,7

CRYIA 4 Primer GGTGGCACGTTGTTGTTCTGA Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6479,2 Erime Noktası* (G/C) 57,6


Kontroller

Pozitif kontrol : Referans materyal DNA’sı (%0,1 GD Mısır)

Negatif kontrol : Referans materyal DNA’sı (%0 GD mısır)


kontrolü

Master Karışım Hazırlama I

10 örneklik bir seri için için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler




Bir örnek 48 µl CRYIA1/CRYIA2 içeren master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi olmak üzere

toplam hacim 50 µl’dir.


Tablo 7. CRYIA1/CRYIA2 master karışımı

Son Konsantrasyon



Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4mM dNTPs 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM oligonükleotid CRYIA1 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM oligonükleotid CRYIA2 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl Toplam 48 µl 480 µl



CRYIA1/CRYIA2 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli

santrifüjlenir





PCR Programı (CRYIA1/CRYIA2)





Master Karışım Hazırlama II

10 örnek için gerekli çözeltiler Tablo 8’de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.

İkinci PCR’da bir örnek için 49 µl CRYIA3/CRYIA4 içeren master karışım ve 1 µl ön amplifiye

edilmiş DNA çözeltisi olmak üzere toplam hacim 50 µl’dir.


Tablo 8. CRYIA3/CRYIA4 Master karışımı



Steril deiyonize su 33,75 µl 337,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4mM dNTPs 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM oligonükleotid CRYIA3 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM oligonükleotid CRYIA4 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl Toplam 49 µl 490 µl



CRYIA3/CRYIA4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli

santrifüjlenir







PCR Programı (CRYIA3/CRYIA4)


Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içerisine konur.





1 saattir.






CRYIA1/CRYIA2 ve CRYIA3/CRYIA4 primer çiftleri nested PCR ile sentetik cryIA(b) geninin

spesifik saptanması için tasarlanmıştır. Bu primer çifti kullanılarak elde edilen amplifiye ürün

189 bp büyüklüğünde bir bant verir. Bu gen Bt-176 mısır , Bt-11 ve benzerleri gibi diğer GD

organizmalarda bulunur.


Negatif kontrol ve hedef içermeyen kontrol görünür bir bant vermemelidir.

Pozitif kontrol ve negatif kontrolde beklenen sonuçlar alınamıyorsa seçilen örneklerin PCR

analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller ve örnekler 189 bp büyüklüğünde bir bant

veriyorsa örnekler genetik modifiye DNA içeriyordur.



Roundup Ready Soyanın Saptanması

Hedef gen, Roundup herbisidine direnç sağlayan CP4 EPSPS’dir.

GMO9, GMO5, GMO8 ve GMO7 Primerlerin Özellikleri

GMO5 Primer CCACTGACGTAAGGGATGACG Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6479,4 Erime Noktası* (G/C) 59,5

GMO9 Primer CATGAAGGACCGGTGGGAGAT Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6559,4 Erime Noktası* (G/C) 59,5

GMO7 Primer ATCCCACTATCCTTCGCAAGA Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6309,6 Erime Noktası* (G/C) 55,8

GMO8 Primer TGGGGTTTATGGAAATTGGAA Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6579,8 Erime Noktası* (G/C) 51,7

*50 mM’lık [Na] varlığında

Kontroller

Pozitif kontrol : Referans materyal DNA’sı (%0,1 GD soya)

Negatif kontrol : Referans materyal DNA’sı (%0 GD soya)


kontrolü



Master Karışım Hazırlama I GMO5/GMO9


Tablo 9’da verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.

İlk PCR’da bir örnek için 48 µl GMO5/GMO9 içeren master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi

olmak üzere toplam hacim 50 µl’dir.


Tablo 9. Master karışım I (GMO5/GMO9)



Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4mM dNTPs 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM oligonükleotid GMO5 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM oligonükleotid GMO9 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl Toplam 48 µl 480 µl



GMO5/GMO9 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir







PCR Programı (GMO5/GMO9)



Master Karışım Hazırlama II GMO7/GMO8

10 örnek için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 10’da


İkinci PCR’da bir örnek için 49 µl GMO7/GMO8 içeren master karışım ve 1 µl ön amplifiye

edilmiş DNA çözeltisi olmak üzere toplam hacim 50 µl’dir.


Tablo 10. Master karışım II GMO7/GMO8

Son Konsantrasyon



Steril deiyonize su 33,75 µl 337,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4mM dNTPs 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM oligonükleotid GMO7

0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl

20 µM oligonükleotid GMO8

0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl

Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl Toplam 49 µl 490 µl



GMO7/GMO8 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir







PCR Programı (GMO7/GMO8)







1 saattir.






GMO5/GMO9 ve GMO7/GMO8 primer çiftleri nested PCR ile Roundup Ready® soyada

bulunan modoıfıye gen kasetinin spesifik saptaması için kullanılır. Bu primer çifti kullanılarak

elde edilen amplifiye ürün 169 bp büyüklüğünde bir bant verir. GMO5 ve GMO7 primerleri

CaMV 35S promotör bölgesine komplementerdir. GMO9 primeri Agrobacterium sp CP4

suşuna ait CP4 EPSPS geni ile ve GMO8 primeri de CTP EPSPS geni ile komplementerdir.


Negatif kontrol ve hedef içermeyen kontrol görünür bir bant vermemelidir.




Pozitif kontrol ve negatif kontrolde beklenen sonuçlar alınamıyorsa seçilen örneklerin PCR

analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller ve örnekler 169 bp büyüklüğünde bir bant

veriyorsa örnekler genetik modifiye DNA içeriyordur.


Bölüm 10

GDO’ların Saptanması İçin Nicel PCR

F. Weighardt






GDO’ların Saptanması İçin Nicel PCR 2

İçindekiler

Bölüm 10

GDO’ların Saptanması İçin Nicel PCR

Giriş 3

Nicel ölçüm için kullanılan PCR yöntemleri 4

Eş zamanlı PCR (RT-PCR) tarihçesi 6

Eş zamanlı PCR (RT-PCR) ilkeleri 7

Eş zamanlı PCR kullanılarak yapılan nicel ölçüm prensipleri 13

Kaynaklar 18



Giriş

Bir gıda ürününde bır ya da daha fazla GM vakasının varlığı tespit edildiğinde

(Roundup Ready® soya, Bt 176 mısır, Bt 11 mısır, t25 mısır) bir sonraki analitik

adım, EC 1829/2003 ve 1830/2003 yasal düzenlemelerinin gereği olarak içerikte

bulunan her bir GD ürünün kesin miktarının belirlenmesidir (Şekil 1).

Yukarıda belirtilen düzenlemeler GDO’dan oluşan veya GDO içeren veya GDO’dan

üretilen tüm ürünlerin bu şekilde etiketlenmesini gerektirir. Etiketleme, gıdanın içerdiği

maddelerin herbirinin %0,9’dan fazla olmayan bir oranda GDO’dan oluşan, GDO

içeren ya da GDO’dan üretilen ürünler ve bu GDO varlığıın tesadüfi yahut teknik

olarak önlenemez olması durumunda gerekli değildir.

Tek bir tür bitkiden (mısır, soya vb.) elde edilmiş gıda içeriklerinin (un, yağ) tümü tek

bir gıda içeriği olarak düşünülür.

Şekil 1. Etiketleme gerekli değildir. GD mısır ve GD soya miktarları yasal seviyenin

altındadır.

Örneğin, yalnızca mısırdan elde edilmiş bir gıda maddesi eğer %0,9 dan daha az

oranda GD mısır içeriyorsa, bundan elde edilen gıda ürünleri için etiketleme

zorunluluğu yoktur. Diğer yandan, eğer %0,9 dan daha fazla oranda GD mısır içeriyor

ise, gıda ürünleri etiketlenmelidir. Etiketleme son üründe, farklı türlerden elde edilen

içeriklerin toplamı düşünüldüğünde (örnek: soya ve mısır) GD mısırın göreceli oranı

%0,9’un altına düşse bile geçerlidir. Eğer iki ya da daha fazla farklı GD mısır

varyetesi kullanılmış ise derişimleri hesaplanıp toplanmalı ve etikletme için toplam

yüzde oranı kullanılmalıdır (Şekil 2). Eğer sonuç %0,9 eşik değerinin altında ise

etiketlemeye gerek yoktur.



Şekil 2. Mısır içeriği için etiketleme gereklidir. Bt-11 (%0,6) ve Bt-176 (%0,6) toplamı

yasal seviye olan %0,9’u geçmektedir.

GDO içeriğinin göreceli oranı (yüzdesi), bir bitki türüne özel, tek kopya olarak

bulunan bir referans genin miktarına karşı (örneğin soya için lektin, mısır için zein

veya invertaz) GDO spesifik sekansın miktarı normalize ederek belirlenir. GDO

yüzdesi bu yüzden şu şekilde ifade edilir :

GDO (%) = GD-DNA / referans-DNA x100

Nicel ölçüm için kullanılan PCR yöntemleri

Geleneksel PCR’ın biri dezavantajı, amplifikasyon verimindeki değişkenlik sebebiyle

kesin nicel bilginin eksikliğidir. Her bir amplifikasyon döngüsü için reaksiyon verimi

sabit kalır ise, PCR sonrasındaki DNA konsantrasyonu, başlangıçtaki hedef DNA’nın

miktarı ile direkt orantılı olurdur. Lakin amplifikasyon verimi, değişik reaksiyonlar

arasında farklılık gösterdiği gibi, tek bir reaksiyonun ardışık döngülerinde de farklılık

gösterir. Özellikle PCR’ın son döngülerinde, amplifikasyon ürünleri, bilinmeyen

reaksiyon oranlarında, yani logaritmik olmayan bir şekilde oluşurlar.

Geleneksel PCR’a dayalı DNA miktar tayini, en yüksek duyarlılığı sağlayabilmek için,

son nokta ölçümlerine, yani amplifikasyon maksimum ürüne ulaştığında yapılan

ölçümlere dayanır. Kullanılan polimerazın aşamalı olarak termal inaktivasyonu ve

kullanılan maddelerin tükenmesi sonucunda reaksiyon, logaritmik olarak artış

gösteren fazdan çıkar. En sondaki ürünün derişimi ve başlangıçtaki hedef

moleküllerin miktarı arasındaki ilişki bu nedenle zayıftır.



Bu problemin üstesinden gelebilmek için, nicel karşılaştırmalı PCR ve real time (eş

zamanlı) PCR gibi teknikler geliştirilmiştir. Bunlar hedef DNA’nın derişimi ile

amplifikasyon boyunca üretilmiş olan PCR ürününün miktarı arasındaki ilişkiyi

kurmada karşılaşılan problemleri çözebilir.

Nicel karşılaştırmalı PCR (qc-PCR)

Geliştirilen ilk nicel PCR yöntemlerinden biri nicel karşılaştırmalı PCR’dır (Giacca ve

ark., 1994; Studer ve ark., 1998; Hardegger ve ark., 1999). Bu yöntem, hedef DNA

aynı primer bağlanma bölgelerini taşıyan belirli miktardaki internal DNA standardının

amplifikasyonuna dayanır. Başlangıçtaki standart DNA’nın miktarı bilindiği için,hedef

ile standart DNA’nın amplifikasyon veriminin aynı olduğu düşünüldüğünde jel

elektroforezi ile belirlenen iki PCR ürününün miktarlarının oranı, amplifikasyondan

önceki reaksiyon karışımı içerisinde bulunan hedef ve standart DNA’nın oranı ile

temsil edilir.

Genellikle standart DNA, jel elektroforezi ile belirlenebilecek iki farklı boyutta (

standart ve hedef DNAyı ayrıştırabilmek için) bant elde edebilmek üzere eklenmiş ya

da çıkarılmış bölgeler dışında hedef DNA ile aynı nükleotid sekansına sahip, lineer

bir plazmittir.

Karşılaştırmalı PCR, gerek DNA gerekse RNA miktarlarını ölçmek için başarı ile

kullanılmaktadır. Fakat dinamik aralık hedef ve standart DNA oranının yaklaşık 1:10

ile 10:1 arasında olduğu alanda sınırlınır (Şekil 3). Aslında en doğru sonuç hedef ve

standart DNA’nın 1:1 olduğu yani eşit olduğu noktada elde edilir. Bunu başarabilmek

için çeşitli dilüsyonlar test edilmeli ve hedef ile standart DNA arasındaki en uygun

oran bulunmalıdır.

Hedef DNA

Standart DNA

Şekil 3. Sabit miktarda hedef DNA ve değişik miktarlarda standart DNA’nın birlikte

amplifikasyonu sonrası jel elektroforez görüntüsü.



Bu yöntemin diğer bir dezavantajı ise ölçülecek her bir hedef DNA için farklı bir

standart DNA kullanma ihtiyacıdır. Amplifikasyon verimindeki küçük bir farklılık bile,

nicel karşılaştırmalı PCR vasıtası ile gerçekleştirilen nicel ölçümün doğruluğunu

tehlikeye atar. Ayrıca her karşılaştırmalı PCR reaksiyonunu takiben, genellikle

zahmetli PCR sonrası işlemler gerektiren, hedef ve standart amplikonların doğru bir

şekilde miktar tayininini gerektirir.

Karşılaştırmalı PCR sistemi yarı-nicel bir yöntemdir ve örnek ile karşılaştırılabilecek

bir standart (rakip) gerektirir. Sonuçlar yalnızca, numunenin tanımlanan standart

konsantrasyonunun altında, üzerinde ya da ona eşit olduğunu gösterir.

Karşılaştırmalı PCR yöntemi genellikle standart PCR ve moleküler biyoloji laboratuar

donanımı ile gerçekleştirildiği için, fazladan özel bir cihaz, vs. gerektirmez ve bu

yüzden avantajlı bir sistemdir.

Eş zamanlı (Real Time) PCR (RT-PCR)

Günümüzde en yaygın olarak kullanılan ve kesin sonuçlar veren nicel PCR metodu,

eş zamanlı PCR’dır (RT-PCR). Son ürün analizlerinden farklı olarak bu PCR

sistemleri, reaksiyonun gerçekleştiği zamanla eş zamanda reaksiyonu görüntüler. Bu

sistemlerdeki PCR reaksiyonunda, ardı ardına gerçekleşen döngülerde üretilen PCR

ürününün miktarı orantılı biçimde yayılan bir florasan sinyali ile ilişkilendirilmiştir. Her

bir reaksiyon döngüsünde, üretilen PCR ürününün miktarı ile orantılı olarak bu sinyal

artar. Her bir döngüde florasan sinyal miktarı kayıt edilir ve logaritmik faz boyunca

PCR reaksiyonu görüntülenir. Florasan sinyalinin ilk önemli artışı, hedef DNA’nın

başlangıçtaki miktarı ile ilişkilidir (Ahmed, 2002).

Eş zamanlı PCR (RT-PCR)’ın tarihçesi

Higuchi ve ark. (1992, 1993), PCR ürünlerinin biriktikçe tespit edilebildiği bir sistem

kurarak, PCR kinetiğinin analizine öncülük etmişlerdir. Bu eş zamanlı PCR sistemi,

her reaksiyon karışımına, DNA’ya bağlanma özelliği olan etidiyum bromid eklenmesi

presnsibi ile işlemekteydi. Numunelerin üzerine UV ışınları yayacak ve bilgisayar

kontrollü soğutulmuş CCD kamera ile ortaya çıkan florasanı tespit edebilecek şekilde

modifiye edilmiş PCR aleti kullanılıyordu. Amplifikasyon olduğunda üretilen dsDNA

miktarı artıyor ve etidiyum bromid ile bağlanıyo, bu da floresan sinyalinde bir artışa

neden oluyordu. Floresan ışığının yayılma miktarına karşı döngü sayısı bir grafiğe

dökülerek sistem amplifikasyon grafikleri oluşturuluyordu. Belirli sayıdaki döngüden



sonra ürün birikimini ölçümlemektense PCR sürecinin bütünü böyelikle izlenmiş

oluyordu.

Eş zamanlı PCR (RT-PCR) ilkeleri

RT-PCR yönteminin hassasiyeti, amplifikasyon reaksiyonunu oluşturmak ve izlemek

için kullanılan kimyasal yöntemlere ve oluşan sinyali gözlemlemek için kullanılan

cihaza bağlıdır. Bu amaç için geliştirilmiş pek çok kimyasal vardır: İnter kalatör

boyalar (etidiyum bromid, SYBR Green I), hibridizasyon probları (TaqMan probları,

FRET probları, moleküler fenerler, scorpions vb.).

SYBR Green I boyasına dayalı RT-PCR sistemleri

Higuchi ve ark. (1992, 1993), etidiyum bromid yerine, daha az toksik, daha spesifik,

ve daha duyarlı (10’dan ve 25 kata kadar) florasan bir dsDNA inter kalatör ajanı olan

SYBR Green I boyasını kullanarak ilk RT-PCR amplifikasyonunu gerçekleştirdiler

(Haugland, 2002).

SYBR Green I boyası, dsDNA’nın ikincil oluğuna bağlanırken ssDNA’ya bağlanamaz.

Bu bağlanmanın sonucu olarak florasan yayımı (eksitasyon 254 ve 488 nm, emisyon

560 nm) ortalama 800 ile 1000 kat artar. PCR başladığında yeni sentezlenen DNA

miktarının artması, florasan sinyalinin de artmasına neden olur (Şekil 4). SYBR

Green I tabanlı sekans tespit sistemlerinin en önemli zorluğu, bu molekülün spesifik

olmayan DNA’yı da tanıma ihtimalidir. Bu sebeple aslında PCR reaksiyonlarında

bulunan bütün dsDNA moleküllerinin, ki buna spesifik olmayan PCR ürünleri ve

primer-dimerler de dahildir, miktarı ölçülür. Bu problemin üstesinden gelmek ve

spesifik olmayan PCR ürünlerinden dolayı oluşan bu miktar tayin bileşeneni

hesaplamadan çıkartmak için erime eğrisi (melting curve) analizi yapmak

mümkündür. PCR’ın en son aşamasından sonra ürünler düşük hızda eritilir ve açığ

açıkan florasan verileri toplanır. Her farklı dsDNA spesifik bir erime sıcaklığına sahip

olduğu için tek bir reaksiyon karışımındaki farklı erime sıcaklığına sahip olan

bileşenler ölçülebilir. Böylelikle spesifik olmayan girdilerin toplam ölçümden

çıkarılması mümkün olur.

Sekans özel prob tabanlı RT PCR yöntemleri

Bir PCR reaksiyonunda çoğaltılmnak istenen amplikonun floresan yöntemlerle

tespitini özelleştirmek için PCR primer çiftlerinin içinde bulunan, floresan



işaretleyiciler taşıyan, sekansa özel problar kullanılır. Prob hibridizasyon işlemi (ve

takip eden degradasyon) genellikle PCR ürününün logaritmik birikimini etkilemez.

Spesifik RT-PCR tabanlı ölçüm reaksiyonları için birkaç farklı prensip

kullanılmaktadır.

Floresan rezonans Enerji Transferi (FRET) probları

FRET probları verici florofordan, alıcı fluorofora enerji transferine dayalıdır (Şekil 4)

(Haugland, 2002). FRET için temel prensipler:

Verici ve alıcı moleküller yakın olmalıdır.

Alıcı absorbsiyon spekturumu, vericinin yayılım spekturumu ile örtüşmelidir.

Verici ve alıcı dipol geçişleri hemen hemen paralel olmalıdır.

Verici ve alıcı floroforlar birbirlerine yakın iseler, vericinin mavi ışıkla uyarılması enerji

transferi ile sonuçlanır. Alıcı böylelikle daha uzun dalga boylarında ışık yayacaktır.

PCR ürünlerinin oluşumu, PCR primerlerinin yanısıra, hibridizasyon probu olarak

adlandırılan, floresanla işaretlenmiş iki adet sekans spesifik olgonükleotid prob

kullanarak görüntülenir. Hibridizasyon probları çift olarak dizayn edilir ve çiftlerden biri

verici boya (3’-Floresein), diğeri ise alıcı boya (5’-Red-640 veya 5’-Red-705) ile

işaretlenir.

FRET, uzaklığın 6. kuvveti ile orantılı azaldığı için hibridizasyon probları, hedef

DNA’nın birbirine yakın bölgelerine hibridize olacak şekilde tasarlanır (genellikle iki

bağlanma bölgesinin arasında 1-5 nükleotidlik boşluk olur). Eğer iki prob da hibridize

olur ise, iki boya da birbirine yakınlaşır ve FRET alıcı boyası flourometre ile

ölçülebilen sinyale neden olur.

Degredasyon probları (TaqMan prensibi)

TaqMan ölçümü, PCR esnasında Taq polimerazın 5’-3’ ekzonükleaz aktivitesini

degredasyon probunu kesmek için kullanır (Lie ve Petropoulos, 1998). Degredasyon

probu (ya da TaqMan probu) genellikle 20-30 baz uzunluğunda bir oligonükleotidtir.

Tm’leri genellikle primerlerin Tm’lerinden 10°C yüksektir. 5’ ucunda reporter( haberci)

floresan boya 3’ ucunda quencher (söndürücü) boya bulundurur (Şekil 4). 3’ ucu

bloke olduğu için prob primer gibi uzamaz. Hedef DNA’nın varlığında prob, PCR

reaksiyonu boyunca spesifik olarak sağ ve sol primer bölgeleri arasına bağlanır.



Prob sağlam durumda iken reporter boyanın quencher boyaya yakınlığı, özellikle

Forster tipi enerji transferi sebebiyle, haberci floresanın baskılanmasına neden olur

(Forster, 1948; Lakowicz, 1983). Reaksiyon esnasında Taq DNA polimerazın 5’-3’

ekzonükleaz aktivitesi, eğer hedef DNA ile hibridize olmuş durumda ise, haberci ve

söndürücü boyalar arasındaki probu degrede eder. Bu, amplifikasyon ilerledikçe

floresanın artmasına neden olur. PCR ürününün birikimi haberci boya florasanında

artış görüntülenmesine yol açar. Bu işlem, her döngüde tekrarlanır ve ürünün

eksponansiyel birikimini etkilemez. FRET problarından farklı olarak degredasyon

probları her bir döngüde, bir önceki yayıma yeni boya ekleyrek floresan salar. Sonuç

olarak florasan sinyali her bir döngüde artar. TaqMan ölçümü, evrensel termal döngü

parametreleri ve PCR reaksiyon şartları kullanır. Florejenik problar için özel

gereksinim 5’ ucunda G bazının olmamasıdır. Haberci boyaya bitişik G bazı

kesimden sonra bile haberci florasanı söndürür.

Şekil 4. Eş zamanlı PCR ilkeleri.



Moleküler Beacon ( ikaz ışığı, bıkın)

Moleküler Beacon molekülleri stem-loop yapısı içerecek şekilde taarlanmış DNA

problarıdır. Loop (halka) sekansı probun spesifik hedefine, stem (gövde) sekansı ise

kendi içinde tamamlayıcıdır (Şekil 5) (Tyagi ve Kramer, 1996). Probun 5’ ve 3’ uçları

fluorofor ( haberci) ve quencher (söndürücü) boyalara kovalent olarak bağlanmıştır.

Stem-loop yapısı kapandığında flourofor ve quencher yakınlaşır. Bu durumda

fluorofor tarafından yayılan bütün fotonlar, quencher tarafından emilir. Komplementer

sekansların varlığında prob açılır ve hedefe hibridize olur. Floruofor quencherdan

uzaklaşır ve prob florasan sinyali vermeye başlar.

Şekil 5. Molecular beacon ilkesi



Scorpions

Diğer bir gelişme, “Scorpions” olarak adlandırılan prob ailesidir. Bir Scorpion stem-

loop yapısı taşıyan spesifik prob sekanslarından oluşurlar (Şekil 6) (Thelwell ve ark.,

2000).

Probun 5’ ucuna bağlı sinyal üreten florofor, stem-loop konfigürasyonunda 3’ ucuna

bağlı bir molekül tarafından söndürülür. Bu stem-loop yapı, primerin 5’ ucuna

bağlanmıştır. Scorpion primerinin uzamasını takiben amplifikasyon sırasında spesifik

prob aynı DNA ipliği üzerinde kendi tamamlayıcı sekansına bağlanır. Bu bağlanma

sonucu saç tokası ilmeği (hairpin loop) çözülür. Böylelikle floresan söndürülemez ve

gözlenen sinyal değeri artar. Primer ile stem sekansı arasına yerleştirilien bir PCR

susturucu, saç tokası ilmeğinin baştan sona okunmasını ve bu da özel hedef sekans

yokluğunda saç tokası ilmeğinin açılmasını engeller. Tek molekül üzerinden

bağlanma özelliği, homojen prob sistemlerine kıyasla bazı avantajlar sağlar.

Moleküler Beacon, TaqMan ce FRET analizlerinin aksine, Scorpion ölçümleri

primerlerden başka ayrı bir prob gerektirmez.

Şekil 6. Scorpion probları ilkesi



TaqMan MGB ( Minor groove binder, ikincil oluk bağlayıcı) probları

MGB çift sarmal DNA’nın minor oluğuna tam olarak oturan, küçük, hilal biçimli bir

moleküldür (Kutyavin ve ark., 2000). TaqMan problarında MGB grubu quencher boya

ile birlikte 3’ uca bağlıdır (Şekil 7). TaqMan probu hibridize olduğunda, MGB, prob ve

hedef sekans arasında oluşan çift sarmal DNA’nın minor oluğunu kuşatarak

bağlanmayı dengeler. Çift sarmalda nükleotidler mükemmel bir şekilde eşlendiğinde

bu dengeleme çok daha etkilidir (örneğin, sekans hiç yanlış eşlenmediğinde).

Ayırıştırıcı gücünün yanında, arttırılmış stabilizasyon, genel prob tasarımı kurallarına

hala uyulurken, TaqMan MGB problarının TaqMan standart problarıyla (genellikle 18-

40 mer) karşılaştırıldığında çok kısa olması demektir (genellikle 13-20 mer). TaqMan

MGB probları özellikle multipleks ölçümler olmak üzere nicel PCR için çok

avantajlıdır. Geliştirilmiş spektral performans, farklı ölçümler için duyarlılığı ve

tutarlılığı mümkün kılarken, arttırılmış hibridizasyon özelliği hedef ayrıştırmayı

kolaylaştırır. Ayrıca, daha küçük problar, sekansa özel koruma veya sapma aralıkları

gibi daha kısa hedef bölgelere uygun problar geliştirilmesine alan sağlayarak ölçüm

yapılmasını kolaylaştırabilir. Amplikon boyutu iç-ölçüm tutarlılığını geliştirebilecek

daha da kısa MGB probları kullanılarak minimuma indirilebilir.

Şekil 7. MGB probları ilkesi



Eş zamanlı PCR kullanılarak yapılan nicel ölçüm kuralları

Göreceli (relatif) miktar ölçümü

Bir örneğin GDO içeriği, ürünün toplam miktarında genetik değişikliğe uğramış

materyalin miktarı ile ifade edilebilir. Bu değeri gerçek zamanlı PCR’ye dayalı bir

sistemde saptamak için endojen (iç) referans genin DNA sekans kopya sayısının ve

GDO spesifik hedef DNA sekans kopya sayısının ölçülmesi gerekir ( normalleştirme

için). Referans olarak seçilen gen bitki türüne özel, haploid genom başına tek bir

kopya, aynı türün farklı hatlarında değişmeden kalan ve analiz edilen GDO gibi

amplifiye olabilecek özellikte (bu da çok iyi bir primer-prob dizaynına bağlıdır) şekilde

seçilmiş olması gerekmektedir .Göreceli ölçümde karşılaşılabilecek problemlerden

biri kurallarda belirtilmeyen bir GDO içeriğinin yüzde olarak ortaya çıkmasıdır. Bu

yüzden GDO içeriği (yüzde olarak) saf içeriğin toplam ağırlığı üzerinden modifiye

edilmiş içeriğin ağırlığı olarak düşünülebilir (örneğin, bir örnekte bulunan mısırın

toplam ağırlığı üzerinden GDO mısırın ağırlığı). Analitik bakış açısından

düşünüldüğünde GDO yüzdesini hedef sınıfa özel sekans başına hedef DNA sekansı

olarak ölçmek uygundur. Bu tanım GDO hatlarının bazı önemli özelliklerini dikkate

almaz ve bu yüzden sonuçların yorumlanmasında şu parametreler gözönünde

tutulmalıdır:

a. Vakanın ploitliği . GDO vakası doğal çeşitten farklı bir ploitliğe sahip olabilir

(örneğin, diploid yerine tetraploid)

b. Vakanın zigositesi. GD özelliği homozigot veya heterozigot olabilir.

c. Tek bir gen kasetinin haploid genom başına düşen insersiyon sayısı. Bir gen

kaseti haploid genom başına tek bir kopya veya daha fazla kopya olarak ilave

edilebilir.

Madde c, primer-prob sistemini, gen kasetinin genoma eklenme sınırlarının

kapsayacak biçimde tasarlayarak aşılabilir. Sınır sekansları özgün olduğu için sistem

hem vaka –spesifik olacak, hem de aynı gen kasetinin birden fazla kopyasının

genoma eklenmiş olduğu durumlarda bunun miktar tayininde fazladan ölçülmesinin

önüne geçilecektir. a ve b maddeleri örnek ile homejen olan referans materyallerin

kullanımıyla deneysel olarak aşılabilir (örneğin mısır unu referans materyalinin mısır

ununu ölçmek için kullanılması). Sertifikalı referans materyallerinden farklı olan

miktar ölçümü standartları (örneğin klonlanmış DNA sekansları veya genomik DNA

karışımları), ölçümdeki moleküler farklılıkları düzeltmek için sertifikalı referans

materyallere karşı kontrol edilebilir. a ve b maddeleriyle ilgili problemleri çözmede



yaygın olarak kullanılan yöntem GDO yüzdesini haploid genomlar olarak ifade

etmektir.

Tespit limiti (LOD) ve ölçüm limiti (LOQ) parametreleri ölçülen kopyaların gerçek

sayısından etkilendiği için ölçümün bu özelliği her durumda bir metot geliştirilirken

dikkate alınmalıdır.

Bir eş zamanlı GDO Ölçüm Deneyinin Planı

Bir eş zamanlı PCR analizinin planı şunları içermelidir:

GDO-spesifik hedef DNA sekansını belirlemek için tasarlanan bir PCR

sistemi,

Türe özgü GD göreceli derişimlerinin hesaplanmasında “normalleştirici” olarak

da kullanılan endojen referans gen sekansını belirlemek için tasarlanmış ikinci

bir PCR sistemi,

Hem hedef hem de endojen referans sekansları için standart eğriler. Her

deney örneği için hedef ve endojen referansın miktarı uygun standart eğriler

ile belirlenir. Hedefin miktarı, endojen referansın miktarı ile normalleştirilerek

göreceli derişim elde edilir. İstatistiksel gereklilikleri karşılamak için standart

eğriler en az 4 farklı derişim noktası içermelidir. Standart eğrinin her noktası

ve örnek en az üç farklı kez yüklenmelidir.

Buna ek olarak her analiz hem referans gen, hem de GDO ölçümleri için negatif bir

kontrol (NTC-hedef içermeyen kontrol) içermelidir. Negatif DNA hedef kontrolü,

pozitif DNA hedef kontrolü de ayrıca yapılabilir.

Farklı deneyler arasındaki olası istatistiksel sapmaları önlemek için referans gen

ölçümü ve GDO spesifik sekans ölçümü farklı değil aynı PCR çalışmasında

(koamplifikasyon) gerçekleştirilmelidir.

Multipleks (Çok hedefli) eş zamanlı PCR reaksiyonları

Nicel ölçüm için kullanılan cihazlara ve kimyasal ayraçlara bağlı olarak referans gen

ve GDO sekanslarının nicel ölçümlerini ayrı ayrı farklı tüpler içinde ya da aynı tüpün

içinde çoklu reaksiyon olarak uygulamak olasıdır.

Her iki durumun da avantajları ve dezavantajları vardır. Çoklu reaksiyonlar zaman ve

ayıraç açısından tasarrufludur (iki kat fazla örneği tek bir deneyde analiz etmek

mümkündür). Bu reaksiyonlar aynı tüpte meydana geldikleri için referans gen ve



GDO hedef gen ölçümleri arasında deneysel kurulumdan kaynaklanabilecek (set-

up) hataları ortadan kaldırır.Diğer yandan çoklu reaksiyonlar, iki reaksiyonun birbirini

etkilemesi ve iki reaksiyonun ayıraç tüketim hızlarının farklı olması sebebyile LOQ

açısından daha duyarsızdır. Referans gen ve GDO hedef genini ölçmek için yapılan

ayrı reaksiyonlar LOQ açısından daha duyarlıdır; fakat iki kat daha fazla ayıraca ve

gerçek zamanlı PCR aparatı üzerinde iki kat daha fazla kuyuya gereksinim duyulur.

Ayrıca bu reaksiyonlarda bir örneği ölçerken pipetleme farklılığı gibi hatalara maruz

kalma riski daha fazladır.

TaqMan problar için farklı reporter boyaların elverişliliği aynı tüpte birden daha fazla

hedefin amplifikasyonunu olası kılar.Bir Reporter boya (FAM) farklı maksimum emilim

dalga boyuna sahip olduğu için bir diğerinden (VIC) ayırt edilebilir. Farklı emisyon

dalga boylarında değişik boyaların var olması (FAM, TET, VIC ve JOE), çoklu

TaqMan ölçümlerinin yapılmasını mümkün kılar. TAMRA boyası prob üzerinde

quencher olarak, ROX reaksiyon karışımında pasif referans olarak kullanılır. En iyi

sonuçlara ulaşmak için, maksimum emilimde en fazla farka sahip olduklarından

dolayı FAM (hedef) ve VIC (endojen kontrol) karışımı önerilir. Diğer yandan, JOE ve

VIC karıştırılmamalıdır. Çoklu TaqMan ölçümleri, farklı emilim dalga boylarını tespit

etme kapasitesine sahip oldukları için, ABI PRISM 7700, 7900, 7500, 7300 ve 7000

Sekans Tespit Sistemleri’nde uygulanabilir.

Eş zamanlı PCR verinin grafik analizi

Eş zamanlı PCR uygulanırken florasan veri (Rn biriminde), döngü sayısına (veya

zamana) karşı sinyal miktarını bulmak için bir grafikle toplanır. Genellikle bu grafik,

yarı-logaritmik bir ölçekte oluşturulur. Gerçek zamanlı PCR’da üç farklı aşama

görmek mümkündür: arka plandaki sinyalle ilgili hafif dalgalanmalarının olduğu ilk “

lag” aşaması; artan paralel verilerin bulunduğu ikinci logaritmik aşama (üstel faz) ve

verilerin platoya ulaştığı üçüncü aşama (Şekil 8).



Şekil 8. Bir gerçek zamanlı PCR grafiği. Gerçek zamanlı bir PCR’in tipik aşamaları

işaretlenmiştir.

Gerçek zamanlı PCR’in gücü, nicel ölçümün PCR reaksiyonunun son aşamasında

(plato) değil de amplifiye olmuş DNA miktarının (Rn degerinde) giderek artan (üstel

faz) gelişiminin arka plandaki sinyalden çok daha yüksek olduğu bir noktada miktar

ölçümünün gerçekleşmesidir. Bu ölçme yöntemi, örneğin başlangıçtaki miktarı ile

amplifikasyonun ilerlediği aşama arasında direkt bir ilişki olduğu için miktar

ölçümünün doğruluğunu arttırır. Gerçek zamanlı PCR’da eşik döngüsü (CT) deneysel

olarak florasan sinyalinin üçüncü ve onbeşinci döngüsü ile on standart sapma

arasında ölçülen florasan sinyallerinin ortalamasına ulaştığı döngü olarak tanımlanır.

Başlangıçtaki Genomik DNA miktarı ne kadar yüksek olursa PCR sürecinde biriken

ürün o kadar hızlı tespit edilir ve CT değeri o kadar düşük olur. Uygulamada CT

değerini belirleyen eşik çizgisinin seçimi genellikle teknisyene kalmış bir seçimdir ve

bu da gerçek zamanlı PCR’in kişisel öğelerinden biridir. Eşik çizgisi herhangi bir arka

plan aktivitesinin ilerisinde, üstel artış aşamasına dek gelen, logaritmik gösterimde

lineer görülen bir bölgede seçilmelidir. Her durumda eşik çizgisi tekrarlanan (3lü)

analizleri temsil eden paralel grafiklerinin çakışmaya başladığı seviyelere

yerleştirilmelidir. Kimi zaman logaritmik aşamanın en başında kopyalar hafif sapma

gösterebilir, bu zamanla azalır veya reaksiyon devam ederken tamamen yok olur.



GDO içeriğinin hesaplanması

Eş zamanlı PCR çıktısı, Rn+ (tüm parçaları içeren florasan sinyali) ve Rn-

(reaksiyonun arka plandaki sinyali, başlangıç ya da bir NTC örneğinin sinyali)

arasındaki fark olarak hesaplanabilen ΔRn’dir.

Bir örneğin GDO içeriği iki farklı yolla belirlenebilir:

Farklı miktarlardaki DNA’ya dayalı iki standart eğri çizilir:

Referans genine özgü bir ölçüm sistemi içeren ilk eğri

GD hedefe özgü bir ölçüm sistemi içeren ikinci eğri

Her örnek için hedef ve referans gen miktarı, standart eğriyle ara değer bulunarak

(interpolasyon) belirlenir. Daha sonra GDO DNA içeriği (yüzde olarak), GD hedef

sekans miktarı ve referans gen sekans miktarının oranı olarak hesaplanır

(GD/referans x 100).

Analizdeki örneklerin iki standart eğrinin ara değerlerinin içine düşmesi gerektiğine

dikkat edilmelidir. Bunların dışına çıkan değerler, ölçüm hataları ihtimaline karşı hariç

tutulmalıdır.

2. Karşılaştırmalı CT yöntemi (ΔΔCT): Bu yöntemde bilinen miktarda standartlar

kullanılmaz; GDO hedef sekansının göreceli miktarı ile referans gen sekansı

karşılaştırılır. Standart eğri, bilinen farklı konsantrasyonlardaki GDO (örneğin

IRMM’den sertifikalı referans materyalleri) içeriğine sahip bir dizi örnek yüklenerek

elde edilir.

Sonuç ΔΔCT (ΔCT=CT referans gen - CT GDO gen) standart eğrisidir. GDO içeriğinin

değeri bir örnek için ΔCT değeri hesaplanıp sonucu standartlardan alınan değerlerle

karsılaştırarak elde edilir.

Bu yöntemin başarılı olabilmesi için hem hedefin, hem de referans PCR sistemlerinin

amplifikasyon verimleri benzer olmalıdır. Bunu kontrol edebilmek için kullanılan

hassas bir yöntem ΔCT’nin (aynı başlangıç miktarı için iki ayrı PCR’in CT değerleri

arasındaki fark) örnekler seyreltildiğinde nasıl değiştiğine bakmaktır. İki amplikonun

verimlilikleri eşit ise log girdi miktarının CT’ye karşı çizilen grafiği yatay bir çizgi

olacaktır (<0,10 eğimli). Bunun anlamı iki PCR’in da ilk örnek miktarı kadar bir alanda

eşit şekilde verimli olduklarıdır. Eğer eşit olmayan bir verim görülürse standart eğri

yöntemi GDO ölçümü için kullanılmalıdır. Dinamik alan, sonuçların doğru olduğu,

hedeflerin minimum ve maksimum konsantrasyonları için belirlenmelidir.

Konvansiyonel karşılaştırmalı RT-PCR’da dinamik alan hedef-rakip oranı yaklaşık

10:1-1:10 olarak sınırlandırılır (en doğru sonuç 1:1 oranında sağlanır). Eş zamanlı

PCR çok daha geniş bir dinamik alana ulaşabilmektedir.



Kaynaklar

Regulation (EC) 1829/2003 of the European Parliament and of the Council of 22

September 2003 on genetically modified food and feed. OJ L 268, 18.10.2003,

pp. 1-23.

Regulation (EC) 1830/2003 of the European Parliament and of the Council of 22

September 2003 concerning the traceability and labelling of genetically modified

organisms and the traceability of food and feed products produced from

genetically modified organisms and amending Directive 2001/18/EC. OJ L 268,

18.10.2003, pp 24-28.

Ahmed, F.E. (2002). Detection of genetically modified organisms in foods.

Trends in Biotechnology 5, 215-23.

Forster, T. (1948). Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann

Phys (Leipzig) 2, 55-75.

Giacca, M., Zentilin, L., Norio, P., Diviacco, S., Dimitrova, D., Contreas, G., Biamonti,

G., Perini, G., Weighardt, F., Riva, S. and Falaschi, A. (1994). Fine mapping of a

replication origin of human DNA. Proceedings of the National Academy of

Science USA 91, 7119-23.

Hardegger, M., Brodmann, P. and Hermann, A. (1999). Quantitative detection of the

35S promoter and the nos terminator using quantitative competitive PCR.

European Food Research Technology 209, 83–87.

Haugland, R.P. (2002). The Handbook of Fluorescent Probes and Research

Products, Ninth Edition. Molecular Probes, Inc.

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-

Handbook.html (accessed January 2010)

Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S. and Griffith, R. (1992). Simultaneous

amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10, 413–

417.


http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook.html

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook.html



Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. and Watson, R. (1993). Kinetic PCR: Real-time

monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11, 1026–1030.

Kutyavin, I.V., Afonina, I.A., Mills, A., Gorn, V.V., Lukhtanov, E.A., Belousov, E.S.,

Singer, M.J., Walburger, D.K., Lokhov, S.G., Gall, A.A., Dempcy, R., Reed, M.W.,

Meyer, R.B. and Hedgpeth, J. (2000). 3'-minor groove binder-DNA probes

increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids

Research 28, 655-61.

Lakowicz, J.R. (1983). Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New

York, chapter 2.

Lie, Y. S. and Petropoulos, C. J. (1998). Advances in quantitative PCR technology: 5'

nuclease assays. Current Opinion Biotechnol 9, 43-48.

Studer, E., Rhyner, C., Lüthy, J. and Hübner, P. (1998). Quantitative competitive

PCR for the detection of genetically modified soybean and maize. Zeitschrift für

Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207, 207–213.

Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. and Brown, T. (2000). Mode of

action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids

Research 28, 3752-3761.

Tyagi, S. and Kramer, F.R. (1996). Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon

hybridisation. Nature Biotechnology 14, 303-308.

Vaïtilingom, M., Pijnenburg, H., Gendre, F. and Brignon, P. (1999). Real-time

quantitative PCR detection of genetically modified Maximizer maize and Roundup

Ready soybean in some representative foods. Journal of Agricultural Food

Chemistry 47, 5261–5266.

WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA





Bölüm 11

Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real-Time) PCR ile Nicel Saptanması

N. Foti

Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real‐Time) PCR ile Nicel Saptanması 2


İçindekiler

Bölüm 11

Roundup Ready Soya’nın Eş Zamanlı (Real-Time) PCR ile Nicel

Saptanması

Deneysel 3

Giriş 3

ABI PRISM® 7700 kullanarak Eş Zamanlı (Real-Time) PCR 3

LightCycler (Roche) kullanılarak RT-PCR 8

Kaynaklar 14



Deneysel

Giriş

Aşağıdaki protokoller, özel bir GD soya (Roundup Ready® soya) vakası için ham ve

işlenmiş materyallerde miktar tayini için kullanılan eş zamanlı PCR yöntemleridir. Bu

eş zamanlı PCR ölçümleri amplikon üretimini florasan kullanarak eş zamanda tespit

eden iki farklı PCR termal döngü cihazı ile gerçekleştirilmiştir: ABI PRISM® 7700

SDS (Applied Biosystems) ve LightCycler® (Roche).

Eş zamanlı PCR, genetik değişikliğe uğramış soya varlığını gösteren bir DNA hedef

sekansına ek olarak bir de endojen referans DNA (soyaya özgü) sekansının amplifiye

edilmesinde kullanılır. Her iki ölçüm de her biri özel DNA primerleri ve boya-işaretli

problar içeren iki farklı PCR sisteminden oluşur. Bir PCR sistemi GDO’ya spesifik

DNA sekansını tespit ederken, diğeri GD ve GD olmayan soya tespit edilmesinde

miktarsal referans olarak görev yapmak üzere tasarlanmış bir endojen referans

sistemidir.

Not: Bu kitapçığın içerdiği protokoller eğitici amaçlarla seçilmişlerdir ve eş zamanlı

(real-time) PCR yöntemi kullanarak yapılan GDO miktar tayini çalışmalarının temel

örnekleri olarak düşünülmelidirler. En son geliştirilen ve onaylanan protokoller

hakkında bilgi edinmek için uygun kaynakların ve literatürün periyodik olarak gözden

geçirilmesini tavsiye ederiz. Bu protokollerin bizim laboratuvarımızda bulunan aletlere

göre seçilmiş olduğuna lütfen dikkat ediniz. JRC ve WHO, hiç bir şirketin ya da

markanın kullanılmasını özel olarak desteklememektedir.

ABI PRISM® 7700 kullanarak Eş Zamanlı (Real-Time) PCR

RR soyaya spesifik RT- PCR için protokol: çok hedefli (multiplex) PCR metodu

Bu metod, lektin referans geni ve RR soyaya eklenmiş olan gen kasetinin bir

bölümünün Multipleks PCR analizi ile amplifikasyonu ve nicel saptanmasından oluşur

(Foti ve ark., 2006). TaqMan lektin ve RR probları sırasıyla VIC ve FAM boyalarıyla

işaretlenmiştir, bu da aynı tüpte birden fazla hedefin amplifikasyonunu tespit etmeyi

mümkün kılar. Reporter boya FAM emisyonu, farklı maksimal yayılım dalga boyu



özelliği ile VIC’den ayrılabilir. ABI PRISM 7700 SDS emisyonu farklı dalga

boylarında olan birden fazla boyayı tespit etme özelliğine sahiptir.

RR soyaya karşılık gelen boya miktarı (FAM), her örnekte tespit edilen bitki

materyaline karşılık gelen boya (VIC) miktarı ile normalize edilir. Böylelikle tekrar

örnekleri için ortalaması alınan CT değerleri ortaya çıkar. Bu değerler bilinen RR

soya konsantrasyon standartlarından elde edilen kalibrasyon eğrisi ile hesaplanmış

olan CT değerleri ile karşılaştırılır ( karşılaştırmalı CT metodu veya CT ).

Bu prosedür çeşitli ham madde, katkı maddesi ve soya içeren gıdalarda (yoğurt, un,

lesitin, soya içeceği) başarıyla uygulanmıştır. Bu metodun analitik performansı birçok

yeterlilik testi sırasında başarıyla gözlemlenmiştir (FAPAS, GIPSA).

Alet ve malzemeler

ABI PRISM 7700 Sekans Tespit Sistemi (Applied Biosystems)

MicroAmp Optik 96-Kuyucuk Reaksiyon Plateleri (Cat No. N801-0560)

MicroAmp Optik kapaklar (Cat No. N801-0935)

TaqMan Universal PCR Master karışım (Cat No. 4304437) 2X içeriği: TaqMan

Tamponu 2X AmpliTaq Gold DNA Polimeraz (5U/µl), AmpErase UNG (1U/ml),

dNTP’ler 200 µM dUTP ile, Pasif Referans 1

Mikrosantrifüj

15 ml konik tüpler için soğutmalı santrifüj

Mikropipetler



1,5ml mikrosantrifüj tüpleri

15 ml polypropylene konik santrifüj tüpleri

Nükleaz ari su

Referans genine(lektin) özel primerler (Le-F ve Le-R) ve prob (Le-Probe)

Transgene özel primerler (RR-F ve RR-R) ve prob (RR-Probe)



Referans geni primerleri ve probunun özellikleri

Transgen primerleri ve probunun özellikleri

RR-F

Sekans GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT Uzunluk (bp) 23 Mol. Ağırlık 7014

RR-R Sekans GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C Uzunluk (bp) 25 Mol. Ağırlık 7712

RR-Probe Sekans 5’-(FAM)-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC

AGC TTG TCA GCG-(TAMRA)-3' Uzunluk (bp) 33 Mol. Ağırlık 10137

Master karışım hazırlanması

İşlem için gerekli ayraçları ihtiyaç duyulan miktarlarda çözüp, yavaşça karıştırın ve

santrifuj edin. Çözülmüş bileşenleri buz içinde tutun.

Le-F Sekans TCC ACC CCC ATC CAC ATT T Uzunluk (bp) 19 Mol. Ağırlık 5586.0

Le-R Sekans GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA Uzunluk (bp) 24 Mol. Ağırlık 7532

Le-Probe Sekans 5’-(VIC)-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT

CG-(TAMRA)-3' Uzunluk (bp) 23 Mol. Ağırlık 7019.0



Buz içindeki tüpün içine, master karışım hazırlamak için gerekli bileşenleri aşağıda

belirtilen sırayla (DNA dışında) ekleyin. Ekstrakte edilen her DNA üç kere analiz

edilir. Solüsyonun akıcılığına bağlı pipetleme hatalarına karşı dört fazla reaksiyon

karışımı hazırlandığına dikkat edin.

Tablo 1. Çok hedefli (multiplex) PCR ölçümünün bir plate için master karışım hazırlanması

Son Konsantrasyon

Bir örnek için µl

Bir örnek için master karışım (3 tekrar)

Bir plate için master karışım (32+4 örnek)

Steril, deiyonize su 18,3 54,9 1976,4 TaqMan Universal Master karışım 2X

1X 25 75 2700

Primer Le-F(20µM) 40 nM 0,1 0,3 10,8 Primer Le-R(20µM) 40 nM 0,1 0,3 10,8 Primer RR-F(20µM) 100 nM 0,25 0,75 27 Primer RR-R(20µM) 100 nM 0,25 0,75 27 Le-Prob(10µM) 100 nM 0,5 1,5 54 RR-Prob (10µM) 100 nM 0,5 1,5 54 DNA 50-250 ng 5 15 Toplam 50 150

Yavaşça karıştırın ve kısaca santrifüjleyin.

Test edilecek her DNA örneği için bir tane 1,5 ml mikrosantrifüj tüpü hazırlayın:

standart eğri örnekleri (CRM-RR soya % 0,1; 0,5; 1; 2; 5), bilinmeyen örnekler ve

kontrol örnekleri (%0 RR soya , RR soya DNA’sı ve hedef içermeyen kontrol).

Her mikrosantrifüj tüpüne 3 tekrar için gerekli master karışım miktarını ekleyin (135 µl

master karışım). Her tüpe 3 tekrar için uygun miktarda DNA ekleyin (15 µl DNA). Her

tüpü en az üç kere yaklaşık 10 sn vorteksleyin. Bu adım her örneğin 3 tekrarı

(replikalar) arasındaki farkı en aza indirmek için önemlidir.

Çok kısa santrifüjleyin. 96-well reaksiyon tepsisini yerleştirin ve yatay olarak soldan

sağa her kuyucuğa 50 µl ekleyin. Master karışımı dikey kuyu sütunlarından her birine

eklendikten sonra optik kapaklarla kapatın.

Not: optik kapağın üzerine yazmayınız ve kapağa dokunmayınız.

Yüklenen master karışım sıvısının kuyuların tabanında olduğuna, kapakta ve kuyu

kenarında damla ve baloncuk olmadığına emin olun.

Reaksiyon tepsisini ABI PRISM 7700 cihazına yerleştirin; her kuyu için örnek türünü

düzenlemek için erkandan yeni bir tepsi ayar penceresi açın: VIC boya için IPC, FAM

boya için UNKN örnek türü seçilir.

Tablo 2’de belirtildiği gibi cihazı başlatın.



Tablo 2. RR soya için ABI PRISM 7700 SDS’de çok hedefli (multiplex) program

Set: Eş zamanlı (real time) PCR modu

50µl reaksiyon hacmi

Aşama Kademe TC Zaman(sn) Okuma Döngüler 1 UNG 50C 120” Yok 1X 2 İlk denatürasyon 95C 600” Yok 1X 3 Amplifikasyon Denatürasyon 95C 15” Yok 45X 4 Bağlanma ve 60C 60” Ölçüm Uzama

Veri analizleri ve sonuçların değerlendirilmesi

Çalışılan her örneğin reporter boyasının CT değerini hesaplamak için çalışmadan

sonra veriler ABI PRISM 7700 SDS bilgisayar programı ile analiz edilir.

Örneklerin SDS bilgisayar programının “Plate Setup” (tepsi ayarları) penceresinde

doğru bir şekilde numaralandırılması önemlidir. Her kuyu “Replicatea” (tekrarlar)

alanında özgün bir sayı ile numaralandırılmalıdır. Tekrarlarda örneklere aynı numara

verilmelidir. Amplifikasyon çizim penceresine otomatik olarak ulaşabilmek için analiz

menüsünden “Analyse” (analiz et) seçeneği işaretlenerek çalışılır. Eşik değer FAM

ve VIC seviyeleri için ayarlanır.

Çalışmayı analiz ettikten sonra elde edilen sonuçları excel dosyasına aktarılır.

Aktarılan dosyalar Microsoft Excel programına açılı. Her kuyucuk için CT değeriyle

birlikte FAM ve VIC boya seviyelerine ilişkin veri iki bloklu bir tabloda toplanır.

CT (CT FAM - CT VIC) değerini hesaplamak için her tekrar grubunun CT (FAM) ve

CT (VIC) ortalamaları hesaplanır.

Her örnek için, derişim standart ayarlarından elde edilen CT ve log (%GDO)

değerleri karşılaştırılıp, numunenin CT analizi sonucunda % GDO hesaplanır.



LightCycler (Roche) kullanılarak RT-PCR

RR-soya spesifik RT-PCR için protokol

Bu yöntem, iki bağımsız PCR reaksiyonunda, lektin referans geni ve RR soyaya

aktarılmış transgenik gen kasetinin bir bölümü için miktar ölçümünden oluşur (BgVV,

EU Tender Report, 2000). Bu iki PCR sistemi FAM’la işaretlenmiş problar kullanır.

Her örnek için GD soya ve referans gen (lektin geni) miktarı, transgen ve referans

gen için gereğine uygun olarak hazırlanmış standart eğrilerden saptanır. GD soya

içeriği, normalize edilmiş GD soya değerini belirlemek için referans gen miktarına

bölünür.

Cihaz ve Ayraçlar

Roche LightCycler sistemi

LightCycler örnek kapillerleri. Roche, Kat No 1909339

LightCycler kapiller adaptörü. Roche, Kat No 1909312

LightCycler FastStart DNA Master Hibridizasyon Probları. Roche, Kat No 3003248

İçeriği: FastStart Taq DNA Polimeraz, dNTP karışımı (dTTP yerine dUTP ile) ve

reaksiyon tampon solusyonu buffer, 10X kons.; PCR için uygun steril su

Bovine serum albumin (BSA), nükleaz içermeyen (DNAaz & RNAaz içermeyen) örn.

Promega Kat No. R9461 (1µg/µl)

Platinum Taq DNA Polimeraz 5U/µl (10X buffer ve 50 mM MgCl2 ile beraber).

Invitrogen- life technologies Kat No. 10966026

Mikrosantrifuj

Miropipetler



1,5 ml mirosantrifuj tüpleri

Nükleaz ari su

Referans gene sözel primerler (GM1-F ve GM1-R) ve prob (GM1-Probe)

Transgene özel primerler (GM2-F,GM2-R) ve prob (GM2-Probe)



Referans geni için primer ve prob özellikleri

GM1-F Sekans 5'-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3'

GM1-R Sekans 5'-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3'

GM1-Probe Sekans 5'-(FAM)-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC -(TAMRA)-3'

Transgen için primer ve prob özellikleri

GM2-R Sekans 5'-GAG CCA TGT TGT TAA TTT GTG CC-3'

GM2-Probe Sekans 5'-(FAM)-CAA GCT GAC TCT AGC AGA TCT TTC (TAMRA)-3'

Standart eğriler

Her işlemde 5 farklı standart DNA seyreltmesi kullanıalrak iki standart eğri

oluşturulur. Her standart kalibrasyon DNA’sı için ın, her iki master karışımla birer

reaksiyon gerçekleştirilir.

Toplam soya ve GD materyali ölçümü için standart eğriler, %2 RR soya ile başlayıp,

0,1M, pH 8,0 TE tampon ile seyreltmek suretiyle azalan standart DNA solüsyonları ile

oluşturulur. Standart eğrilerin ilk noktası için yaklaşık 100 ng DNA kullanılır. Tüm

seyreltmeler ve derişimler Tablo 3’te özetlenmiştir.

GM2-F Sekans 5'-CAT TTG GAG AGG ACA CGC TGA-3'



Tablo 3. DNA miktarları ve standart eğri seyreltmeleri

DNA miktarı (ng)/reaksiyon

Soya DNA % GD DNA % Seyreltme Faktörü

STD1 100 100 2 STD2 50 50 1 1:2 STD3 25 25 0,5 1:4 STD4 12,5 12,5 0,25 1:8 STD5 6,25 6,25 0,125 1:16

Master karışım hazırlanması

İşlem için gerekli ayraçları ihtiyaç duyulan miktarlarda çözüp, yavaşça karıştırın

ve santrifuj edin. Çözünmüş bileşenleri buz içinde tutun.

Her sistem için master karışım hazırlamak üzere buz içindeki 1,5 ml mikrosantrifuj

tüpünün içine, master karışım hazırlamak için bileşenleri aşağıda belirtilen sırayla

(DNA dışında) ekleyin. Solüsyonun akıcılığına bağlı pipetleme hatalarına karşı iki

fazla reaksiyon karışımı eklendiğine dikkat edin.

Tablo 4. GM1 sistemi için master karışım hazırlanması

Bileşenler Son konsantrasyon

µl/reaksiyon Toplam µl (18 reaksiyon için)

Platinum Taq pol.buffer 10X 1X 2 36 MgCl2 (50mM) 4mM 1,6 28,8 dATP,dGTP,dCTP,dTTP(4mM) 0,8mM 4 72 GM1-F primer (20µM) 500mM 0,5 9 GM1-R primer (20µM) 500mM 0,5 9 GM1-prob (10µM) 200mM 0,4 7,2 BSA nükleaz free(1µg/µl) 0,1 mg/ml 2 36 Platinum Taq pol.(5U/µl) 0,8 U 0,16 2,9 Nükleaz ari su # 6,85 123,5 DNA 2 Toplam hacim: 18µl+2µl

DNA 324,2µl (DNA

hariç)



Tablo 5. GM2 sistemi için master karışım hazırlanması

Bileşenler Son konsantrasyon

µl/reaksiyon Toplam µl (18 reaksiyon için)

Platinum Taq pol.buffer 10X 1X 2 36 MgCl2 (50mM) 4mM 1,6 28,8 dATP,dGTP,dCTP,dTTP(4mM) 0,8mM 4 72 GM2-F primer (20µM) 500mM 0,5 9 GM2-R primer (20µM) 500mM 0,5 9 GM2-probe (10µM) 200mM 0,4 7,2 BSA nükleaz ari (1µg/µl) 0,1 mg/ml 2 36 Platinum Taq pol.(5U/µl) 0,8 U 0,16 2,9 Nükleaz ari su # 6,85 123,5 DNA 2 Toplam hacim: 18µl+2µl

DNA 324,2µl (DNA hariç)

Yavaşça karıştırın ve çok kısa santrifüjleyin.

Test edilecek her DNA (standart eğri örnekleri ve bilinmeyen örnekler) örneği için iki

(bir tane GM1 sistemi için ve bir tane GM2 sistemi için) 0,5 ml reaksiyon tüpü

hazırlayın.

Her reaksiyon tüpüne 2 tekrar için gerekli master karışım miktarını ekleyin (36 µl

masterkarışım). Her tüpe 2 tekrar için uygun miktarda DNA ekleyin (4 µl DNA). Her

tüpü en az üç kere yaklaşık 10 sn vorteksleyin. Bu adım bir örnek için tekrarlar

arasındaki farkı en aza indirmek için önemlidir.

Kapillerleri önceden soğutulmuş santrifuj adaptörüne yerleştirin.

Şemada belirtilene göre her kapillere 20µl master karışım pipetleyin (Tablo 6 Tepsi

kurulumu- yükleme sırası).

Düşük hızda mikrosantrifujde çevirin (700 rpm). Bu adım reaksiyon karışım hacminin

tamamının kapillerlerin ucunda konsantre olmasını sağlar.

Kapillerleri LightCycler® (Roche) carousel içine transfer edin.

Tablo 7’de belirtildiği gibi cihazı başlatın.



Tablo 6. LightCycler® carousel yükleme sırası: 1’den 16’ya GM1 sistemi, 17’den 32’ye GM2 sistemi. Rferans gen ve transgen (GDO) sistemi için her örnek çift çalışılmış.

Pozisyon Örnek(%) Pozisyon Örnek(%) Pozisyon Örnek(%)

1 STD (100) 13 U2 25 STD (0.125)

2 STD (100) 14 U2 26 STD (0.125)

3 STD (50) 15 NTC 27 U1

4 STD (50) 16 NTC 28 U1

5 STD (25) 17 STD (2) 29 U2

6 STD (25) 18 STD (2) 30 U2

7 STD (12.5) 19 STD (1) 31 NTC

8 STD (12.5) 20 STD (1) 32 NTC

9 STD (6.25) 21 STD (0.5)

10 STD (6.25) 22 STD (0.5)

11 U1 23 STD (0.25)

12 U1 24 STD (0.25)

Tablo 7. LightCycler® programı

Her adım için eğimi 20C/s oalarak ayarlayın

Fluoresen gösterim modu F1/1

Denatürasyon:

Cycles: 1

Type: None Fluorescence Display Mode: F1/1

Segment Number

Temp. Time Slope 2° Target Temp.

Step Size

Step Delay (Cycles)

Acquisition Mode

1 96 °C 120 sec 20 °C/sec 0 °C 0 °C 0 None

Döngü:

Cycles: 45

Type: Quantification Fluorescence Display Mode: F1/1

Segment Number


Step Size

Step Delay (Cycles)

Acquisition Mode

1 95 °C 5 sec 20 °C/sec 0 °C 0 °C 0 None

2 60 °C 15 sec 20 °C/sec 0 °C 0 °C 0 Single

3 72 °C 15 sec 20 °C/sec 0 °C 0 °C 0 None

Soğutma:

Cycles: 1

Type: None Fluorescence Display Mode: F1/1

Segment Number


Step Size

Step Delay (Cycles)

Acquisition Mode

1 40 °C 30 sec 20 °C/sec 0 °C 0 °C 0 None



Çalışma sırasında EDIT SAMPLE düğmesini tıklayarak, yükleme ekranında örnek adlarını

girin. Tüm pozisyonları (kalibrator DNA da dahil) “ Unknown” (Bilinmeyen)olarak belirtin.

Data analizleri ve sonuçların değerlendirilmesi

Data analizi için data analizi ön penceresinde Fluorescence F1/F2’yi seçin.

Ölçüm için “quantification” düğmesine tıklayın.

LightCycler® bilgisayar programı ölçüm için iki farklı metod önerir: “Second derivative

Maximum” metodu ve “Fit Points” metodu. RR soya DNA tespit kiti ile miktar tayini

için tercihen “Fit Points” metodu kullanılır. Belirtilen ayarları kullanınız: baseline

adjustment = “Proportional”; number of points = 2.

Standart eğriyi diğer tüm ilgili bilinmeyen reaksiyonlarla beraber gösterin.

“Step 2: Noise Band” dosyasını açın.

Noise band pozisyonunu 0,1’e getirin (aşağıdaki nota bakınız). Noise band elle veya

“Chance Graph Settings” düğmesinin altındaki tuşa basarak hareket ettirilebilir. Bu

tuş ile “Manual Cursor Adjustment” penceresi açılır ve cursor değeri 0,1 olarak

ayarlanır.

“Step 3: Analysis” dosyasını açın.

Step 3: Analysis’de çakışma noktaları, kalibrasyon standartlarının ve bilinmeyen DNA

hedeflerinin ilgili konsantrasyonları hesaplanır.

Standart eğrinin r-değerini kontrol edin. r–0,98 değeleri kabul edilebilir; r= –1 değeri

optimaldir.



Kaynaklar

EU Tender Report. (2000). Development of qualitative as well as quantitative

detection methods to identify a genetic modification in soybean and maize

products. Report of the EU Tender n. XXIV/98/A3/001.

LightCycler Operator’s Manual, version 3.0 (Roche Molecular Biochemicals).

User Bulletin #2. Relative quantitation of gene expression. ABI PRISM 7700

Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, 1997.

User Bulletin #5. Multiplex PCR with TaqM VIC probes. ABI PRISM 7700

Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, 1998.

Foti, N., Onori, R., Donnarumma, E., De Sanctis, B., and Miraglia, M. (2006). Real-

Time PCR multiplex method for the quantification of Roundup Ready soybean in

raw material and processed food. European Food Research and Technology

Journal 222, 209-216.


Bölüm 12


F. Eyquem






Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 2

İçindekiler

Bölüm 12


Giriş 3

ELISA Tekniği 7

Deneysel 11

Kaynaklar 21



Giriş

Transformasyon sonrasında aktarılan gen tarafından sentezlenen yeni proteinin özel

immunolojik tayini, genetik olarak değiştirilmiş bitkilerin belirlenmesi için alternatif bir

yaklaşımdır. Ancak genetik modifikasyonun her zaman yeni bir proteinin

sentezlenmesini yönlendirmediği ve protein ifade seviyelerinin analiz metodları için

her zaman yeterli olmayacağı bilinmelidir. Buna ek olarak bazı proteinler bitkinin

sadece özel bölgelerinde (özel amaçlar için genellikle dokuya özel (doku hedefli)

promotörler kullanılır) ya da fizyolojik gelişimin farklı fazlarında veya belli bölgelerde

farklı seviyelerde ifade edilebilir.

En kuvvetli konstitütif promotörler kullanıldığında bile, transgenik ürünlerin ifade

seviyelerinin bitkilerde toplam çözünen proteinin yüzde 0 ile 2 arasında olduğu

belirtilmiştir (Longstaff, 1995). Birçok durumda, ifade seviyeleri (örneğin onaylanmış

GD tahıllar) üst sınır yüzde ikiden daha azdır (Hemmer 1997).

İmmunoanalizler, antikorları test maddesi olarak kullanan analitik ölçüm sistemleridir.

Antikorlar hayvanların serumundan izole edilen ve spesifik üretimlerine yol açan

(antijen) maddeye fiziksel olarak tutunan özel proteinlerdir. Antikorlar, tespiti gereken

maddeyi (örneğin CP4 EPSPS, herbisit Roundup®’a direnç sağlayan protein) fare,

tavşan gibi deney hayvanlarına enjekte ederek vücut hücrelerinin yabancı olarak

tanımladıkları bu proteine karşı antikor üretmesi ile elde edilir. Antikorlar saflaştırılır,

tespit edilebilir bir şaretleyici ile imlenir ve ilgi duyulan maddenin tayininde kullanılır.

İmmunolojik yöntemlerin geliştirilmesi için ilk koşul, tanımlanacak yeni protein için

yüksek hassasiyette antikorların bulunmasıdır. Buna ek olarak, numune ya da ilgi

duyulan proteinlerin önemli derecede parçalanmamış olması tayin için önemlidir.

Antikorlar bileşik karışımlardaki antijenlerin belirlenmesi ve nicel tespitinde biyologlar

için yüksek hassasiyetli araçlardır. Bütün immunoanalizler antikorun antijene özel

olarak bağlanması esasına dayanır.

Antikor-Antijen Etkileşimi

İmmunologlar antikorları çoklukla solüsyondaki antijenleri çöktürme özelliğine sahip

olan proteinler olarak tanımlasalar da bazı otoimmun hastalıklar hariç in vivo



koşullarda antikorlar antijenleri nadiren çöktürür. Antijenlerin belirlenmesi ve

izolasyonunda da ”çöktürme” artık nadiren kullanılmaktadır.

Antikor çöktürme reaksiyonlarının bilgilendirici değeri, Şekil 1’de gösterildiği gibi, bu

reaksiyonun antikor moleküllerinin temel ve evrensel özelliklerinin bir çoğunu

muntazam bir şekilde, bir bütün halinde ortaya koymasıdır.

Bu teknikle gösterilen bazı özellikler;

-serum IgG antikorları antijenle reaksiyonlarında bivalenttir ve farklı antijenlerle

çapraz bağlanma yapabilirler,

-antijenler antikorlarla olan reaksiyonlarında çok değerliklidir ( multivalent)

-serum antikorları doğada poliklonaldir

-antikorlar antijenleri moleküler düzeyde tanıyabilmek için çok özelleşmişlerdir.

Şekil 1. Bir antijen ve ona ait antikorun çökme grafiği

Çöken antikorun miktarının antijen derişimine karşı grafiği çizildiğinde üç bölge

görülür.

Yüksek antikor (Fazla antikor) bölgesi: çökelme önlenir ve fazla antikor

supernatantda tespit edilebilir.



Denge (Eşitlik) bölgesi: en fazla çökelmenin görüldüğü, antijen ve antikorun büyük

erimez yapılar (mavi ile gölgelendirilmiş) oluşturduğu ve ne antijen ne de antikorun

supernatantda tespit edilemediği bölgedir.

Yüksek Antijen bölgesi: çökelti engellenir ve fazla antijen supernatant içinde tespit

edilebilir.

Çökelme reaksiyonu poliklonal antikorlar ile çok değerlikli antijenler arasındaki

etkileşim karakterize etmek için uygundur.Antijenler aynı epitopu çoğul biçimde

taşımadıkları sürece (örneğin polisakkaritlerde bulunan tekrarlayan karbonhidrat

yapıları), monoklonal antikorlar ve antijenler arasındaki etkileşimi tanımlamak için

çökelme reaksiyonu pek yararlı değildir.Sadece bu koşullarda tek özellikli monoklonal

antikorlar bağlanarak antijeni çökertebilir. Monoklonal antikorlar, antikor-antijen

etkileşimi hakkında daha detaylı bilgi sağlayabilmek için denge sabiti, kinetik hız gibi

daha hassas ölçüm yöntemleri ile tanımlanırlar.

Yıllar boyunca geliştirilen çok hassas antikor uygulamaları göz önünde tutulduğunda,

antikorların antijenlerin izolasyonu ve belirlenmesi için ne denli yararlı bir yöntem

olduğu daha kolay analaşılır. Antikorların kullanımları antijenlere bağlanma

kapasitelerini etkilemeden, çeşitli kimyasal modifikasyon reaksiyonlarında

dayanıklılıkları ve yapısal dengelerini koruyabilme özellikle ile de yaygınlaşmıştır.

Çeşitli deneysel koşullar altında antikorlar, antijen tanımlaması ve izolasyonunu

artırmak amacı ile, kimyasal modifikasyon yöntemleri ile floresan, magnetik,

radyoaktif vb. işaretliyiciler ile antjiene bağlanma hassasiyetleri hiç etkilenmeden

imlenmiş ve kullanılmıştır.

Monoklonal antikorlar nasıl hazırlanır?

Vücuda yabancı olan maddeler örneğin hastalık yapan bakteriler, virüsler, ve diğer

enfeksiyon ajanları vücut bağışıklık sistemi tarafında istilacı olarak tanımlanır. Bu

yabancı ajanlara karşı doğal savunmamız, antijenleri tanımaya ve yok etmeye

yarayan antikorlardır.

Antikorlar iki yararlı özelliğe sahiptirler. Birinci olarak çok özelleşmişlerdir. Her antikor

özel olarak bir antijene bağlanır ve ona saldırır. İkinci olarak bazı antikorlar bir

hastalık sonucu aktive olduktan sonra bu hastalığa karşı direncin devamını sağlar.

Antikorların ikinci özelliği aşıların geliştirilmesine olanak sağlar. Aşı zayıflatılmış ya

da öldürülmüş bakteri ya da virüslerdir, vücuda verildiği zaman aşının içerdiği

antijenlere karşı antikorların üretilmesini tetikler.



Antikorların özelliği olan kendine özgülük monoklonal antikor teknolojisini değerli

yapar. Antikorlar yanlızca tedavi amaçlı hastalıktan korunmak için değil çeşitli

hastalıkların tanısına, viral ve bakteri ürünlerinin ve kandaki anormal maddelerin

teşhisine de yardımcı olur.

Hastalıklara karşı savaşan maddeler olarak çeşitli kullanımları, antikorların saf

miktarlarda üretimini bilimsel incelemelerin odağı yapmıştır. Geleneksel yöntem, bir

laboratuvar hayvanına antijen enjekte edilmesi ve antikorların oluşmasını takiben bu

antikorları kan serumundan toplamak şeklindedir (antikor içeren seruma anti-serum

adı verilir). Bu yöntem ile ilgili iki problem vardır: antiserum istenmeyen maddeleri de

içerir ve elde edilen kullanılabilir antikor miktarı çok azdır.

Monoklonal antikor teknolojisi, hücrelerden doğal olarak antikor eldesi yolu ile yüksek

miktarlarda saf antikor ve hücre kültüründe sürekli büyüyebilen hücrelerin üretimine

olanak verir. Hücre ölümsüzlüğü ve istenilen maddenin üretimini birleştiren bir hibrid

oluşturulduğunda zamana karşı antikor üreten bir fabrika sahibi olunur.

Monoklonal antikor teknolojisinde, sonsuz çoğalabilen tümor hücreleri, antikor

üretebilen memeli hücreleri birleştirilir. Bu hücre füzyonunun sonucu ”hibridoma”

oluşur ve sürekli olarak antikor üretebilir. Bu antikorlar monoklonal olarak adlandırılır

çünkü tek tip bir hibridoma hücresinden gelir. Diğer yandan geleneksel yöntemlerle

üretilen antikorlar birçok hücre tipinin bulunduğu ortamlardan üretildiği için poliklonal

olarak adlandırılır. Monoklonal antikorların nasıl oluştuğu aşağıda örneklenmiştir.

Monoklonal antikor üretimi

Myeloma, hücre kültüründe sürekli olarak büyümeye adapte edilebilen bir kemik iliği

tümörüdür. Myeloma hücreleri antikor-üreten memeli dalak hücreleri ile

birleştirildiğinde, oluşan hibrid hücrelerin veya hibridomaların, çok sayıda monoklonal

antikor ürettiği gözlenmiştir. Bu hücre füzyon ürünü iki farklı hücre tipinin istenilen tüm

özelliklerini birleştirir; sürekli olarak büyüme ve yüksek miktarlarda saf antikor üretimi.

Seçilen hibrid hücreler tek bir antikor ürettikleri için, geleneksel yöntemlerle üretilen

poliklonal antikorlardan daha saftır. Hastalıklarla savaşta geleneksel ilaçlardan daha

etkilidir. Çünkü ilaçlar yalnızca yabancı maddeye değil vücut hücrelerine de saldırırlar

ve bazen alerji gibi istenmeyen yan etkilere de neden olur. Monoklonal antikorlar ise

çok az ya da hiç bir yan etki olmadan sadece hedef moleküle saldırır.



ELISA Tekniği

Enzim Bağlı İmmunosorbent Analizi: Bir immunosorbent (katı bir desteğe bağlı

antijen veya antikor) ve enzim bağlı bir immunoreaktant (tepki veren) kullanılan bir

enzim immuno analizidir. Çeşitli yöntemler (örn işaretlenmemiş bilinmeyen ile işaretli

reaktant arasındaki yarışçı bağlanma) bilinmeyen derişimleri ölçmek için kullanılır.

ELISA (Clark ve Adams 1977) yönteminde antijen ve antikorlar arasındaki özel

etkileşim esastır. ELISA’daki anahtar ayraç moleküller, antijen adı verilen yabancı

maddelere karşı vücut bağışıklık sistemi tarafından üretilen anitkor adı verilen

çözünür proteinlerdir. GDO’ların belirlenmesi durumunda bu antijen, genetik

modifikasyon sonucu sentezlenen yeni protein olabilir.



ELISA deneysel safhada yeni aktarılan gen tarafından sentezlenen protein ifade

seviyesinin belirlenmesinde kullanılır. Bu nedenle, özel antikorların üretimi ve

kullanımı ile ilgili bilgiler transgenik bitkilerin geliştirilmesi ile ilgili pek çok makale de

bulunabilir (Mohapatra ve ark. 1999).

Onaylanan genetiği değiştirilmiş tahıllarda kullanılan transgenlerin ürünleri olan

proteinlere karşı kullanılabilecek özgün antikorlardan sadece bir kaçı ticari olarak

mevcuttur. Buna örnek olarak nptII gen ürününe (npt II ve APH(3’)II) ve gus gen

ürününe karşı olan antikorlar örnek verilebilir.

ELISA testi 3 farklı yöntemle gerçekleştirilebilir:

Roundup Ready® soya için özel bir belirleme yöntemi olarak ELISA’ya bağlı yeni bir

teknik geliştirilmiş, test edilmiş ve onaylanmıştır (Lipp ve ark. 2000).

Yöntem, Roundup Ready® soyada herbisite karşı direnci sağlayan protein CP4

EPSPS enzimine (5-enolşikimat-3-fosfat sentaz) (Agrobacterium sp. Suş CP4) karşı

özel antikorların kullanımına dayanır (Padgette ve ark. 1995). İlk sonuçlarda bu

yöntem (ticari ELISA kiti ile) kullanılarak ham soyada (işlenmemiş) GDO varlığı %0,3

ve %0,5 arasındaki derişimlerde belirlenebilmiştir.



Prensip

CP4 EPSPS proteinin belirlenmesi için direkt sandviç enzime-bağlı immunosorbent

analizi (ELISA) aşağıda gösterilen şekilde kullanılmıştır.

Bir mikrotitre plağının yüzeyi özel monoklonal antikor ile kaplanmıştır.

İlgilenilen numune uygulandığında, yüzeye tutunmuş olan antikor özel antijenine

bağlanır. Bağlanmayan moleküller yıkama ile ortamdan uzaklaştırılır.

Yıkamadan sonra, CP4 EPSPS proteinin ikinci bir antijenik bölgesine özelleşmiş olan

ve yaban turbu peroksidaz enzimini (HRP) kovalent bağlanmış olarak taşıyan

poliklonal antikor eklenir.



İkinci yıkamadan sonra, peroksidaz enzim aktivitesi için tetrametilbenzidin (TM)

kromojeni eklenir. Yaban turpu peroksidaz, antijen derişimiyle doğru orantılı olan bir

renk sinyali üretir. Renk sinyalini durdurmak için durdurma sıvısı eklenir. Elde edilen

renk 450 nm dalga boyunda ölçülür.




Deneysel

(GDO Gıda içeriği testi, soya kit kullanıcı rehberi (1999) Strategic Diagnostics Inc.,

Rev. 052099, vers, 1.8)11

Giriş

Aşağıdaki protokol soya unu veya soya protein izolatları ve ham (işlenmemiş)

tarımsal ürünlerde bulunan Roundup Ready® soyada ifade edilen CP4 EPSPS

proteinin belirlenmesi için kullanılan ELISA yöntemini açıklamaktadır.

Yöntem hiç işlenmemiş ya da çok az işlemden geçmiş CP4 EPSPS proteinin

bozulmadığı örneklerde çalışılabilir. Örneğin gıdaların işlendiği çok yüksek sıcaklıklar

yöntemin protein tayini becersini etkileyebilir. Elde edilen veriler, güvenilir protein

tespiti için işlem sıcaklıklarının 65°C’den yüksek ve sürelerinin 60 dakikadan fazla

olmaması gerektiğini belirtmektedir.

Bu yöntem, CP4 EPSPS proteinin tayini için onaylanmıştır ve özel referans materyali

kullanılarak numune içinde %0,3 – 0,5 aralığı içinde bulunan proteinlerin miktarının

(derişimlerinin) belirlenmesinde kullanılabilir. Değiştirilmiş bir protokol kullanılarak

%0,05’den %0,3’e kadar olan daha düşük seviyelerde de kullanılabilir.

Malzemeler

15ml polipropilen konikal santrfüj tüpleri

12x75 mm cam test tüpleri

Sera film veya aliminyum folyo

Plastik band (manuel yıkama için) ya da otomatik plak yıkayıcı

Yıkama şişeleri, örn. 500 ml

20µl- 500 µl aralığında hassas pipetler


Ağırlık dengeleri

Spatulalar

0,01 g hassasiyette terazi

5000- 10000 rpm aralığına sahip santrifuj 1 Bu bölümde bahsi geçen kit, kurs düzenlediğinde ve bu kitap hazırlandığında ticari olarak erişilebilen bir kittir. JRC ve WHO herhangi bir ticari marka kiti tavsiye etmemektedir.


450 nm dalga boyunda absorbans okuma kapasitesine sahip mikrotitre plak

okuyucu

37°C de sabitlenebilen inkubatör

450µm aralıklı filtre veya eşdeğeri

150µm aralıklı(100 meş) filtre veya eşdeğeri

Çok kanallı pipet, örneğin 50µl ile 300µl aralığında (opsiyonel)

Çok kanallı dağıtım için sıvı reservuarları (opsiyonel)

Otomatik plak yıkayıcı (opsiyonel)

Tüp taşıyıcı raf (15 ml santrifüj tüpleri için) (opsiyonel)

Kimyasallar

Genel

Analiz esnasında aksi belirtilmedikçe, deiyonize veya saf su ve tanımlanmış analitik

derecedeki kimyasallar kullanılmalıdır.

Belirlenmiş performans ölçütlerinden sapmalar kimyasalların stabilitesindeki

eksiklikten kaynaklanabilir. Eğer substrat içeriği şeffaftan maviye dönüştüyse, bu

kimyasal atılmalıdır. Bulanık tampon solüsyonları kullanılmamalıdır.

Bütün kit maddeleri 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır. Kit içindeki maddelerin

kullanım süreleri “son kullanma tarihi” biçiminde belirtilmiştir. Hızlandırılmış stabilite

testleri 2°C ile 8°C arasında test kitinin kullanım süresi 9 ay olarak belirlemiştir.

Antikor konjugatı ”soya konjugat” stok solüsyonu ve antikor konjugat çalışma

solüsyonu kitin kullanım süresinin sonuna kadar 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır.

Seyreltilmiş çalışma yıkama tamponu yaklaşık 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır. Kit

son kullanım tarihinden sonra kullanılmamalıdır.

Test kitinde bulunan kimyasallar

Soya ekstrasyon tamponu, sodyum borat tamponu, pH 7.5

Soya Analiz Tamponu, PBS, Tween 20, Bovin Serum Albumin, pH:7.4

Kaplanmış şerit kuyucukları (12 şerit, her biri monoklonal antikorlarla kaplanmış 8

kuyucuğa sahip ve bir şerit tutucu)

Soya konjugatı, tavşan anti-CP4 EPSPS protein, liyofilize olmuş

Seyreltilmiş soya konjugat, %10 ısıyla inaktif olmuş fare serumu



Kromojenik madde, K-Blue TM, tetrametilbenzidin (TMB), hidrojen peroksit, temel

çözücü olarak %5 dimetilformamid

Durdurma solüsyonu, %0.5 sulfirik asit

10 kez konsantre yıkama tamponu, PBS, Tween 20, pH: 7.1

Negatif ve pozitif referans standartları

Deney

Prosedürün kısıtlamaları

Bu ELISA GDO testinin hassasiyeti CP4 EPSPS protein ifadesinin, kullanılan

referans standart içinde bulunan GDO materyalinin seviyesi ile ilişkili olduğu

numunelerle sınırlıdır.

ELISA test kiti 15°C ile 30°C arasındaki ortam sıcaklıklarında optimum performansı

vermek üzere tasarlanmıştır. En yüksek referans standartın absorbansı 0,8’den

büyük olmalı ve spektrofotometrenin lineer aralığı dışında olmamalıdır (üst sınır

spektrofotometre modeline göre değişebilir). OD değerlerinin 30°C den daha yüksek

sıcaklıklarda daha hızlı arttığını göz önünde bulundurmak gerekmektedir. Bu

nedenle, eğer sıcaklık yüksek ise substrat inkubasyon zamanını azaltmak

gerekmektedir. Düşük sıcaklıklarda (15°C’nin altında) substrat inkubasyon zamanı

arttırılmalıdır.

Numune hazırlama esnasında kontaminasyondan kaçınmak için alınması gereken

önlemler

Genel. ELISA GDO test sistemi çok düşük miktarlarda GDO kontaminasyonu

saptama kapasitesine sahip çok hassas bir tekniktir. Bu sebeple, numune serilerinin

değişimi sırasında soya numunelerini işlemek için kullanılan bütün ekipmanın

temizlenmesi zorunludur. Bu işlemlerde ilk basamak kalan materyal parçalarının

fiziksel temizlenmesidir. İkinci basamak ise alette kalabilecek GDO proteinin inaktif

hale getirmek için numuneyi alkol ile yıkamaktır.

Öğütücü temizliği. Yumuşak kıllı bir fırça ile fırçalayın. Periyodik olarak fırçayı

yıkayın ve alkol solüsyonuna batırın. Kullanmadan önce fırçayı kurulayın. Yumuşak

bir havlu ile silin. Alkolü üzerine püskürterek ya da alkol içinde bekleterek yıkayın. İki

yıkama ya da püskürtme yeterlidir. Ardından su ile yıkayın. Direk olarak kurumaya

bırakabilirsiniz ya da acil kullanmanız gerekiyorsa saç kurutucusu ile kurutun.



Filtre temizliği. Filtreler soya unu ile kalıplaşma eğilimi gösterirler. Kalıplaşan

materyali temizlemek için filtreyi hızlı bir şekilde sert bir yüzeye vurun. Temiz

yumuşak kıllı bir fırçayla fırçalayın. Düzenli olarak fırçayı yıkayın ve en az 1 dakika

alkol solüsyonunda bekletin. Kullanımdan önce fırçayı kurulayın. Yumuşak bir bez ile

silin.

5 dakika alkole batırın ve su ile yıkayın. Direk olarak kurumaya bırakabilirsiniz ya da

acil kullanmanız gerekiyorsa saç kurutucusu ile kurutun.

Alternatif bir yöntem olarak ultrasonik banyo ve takiben kurumaya bırakmak

kullanılabilir.

Çalışma alanının temizliği. Çalışma alanının temizliği çok önemlidir. Analiz çok

hassas olduğu için çok az miktarlarda bir GDO pozitif toz kontaminasyonu bile yanlış

pozitif sonuç verebilir. Çalışma alanında soya toz kontaminasyonundan

kaçınılmalıdır. Bir önceki işlemde kullanılan soya tozunun aleti kontamine ederek bir

sonraki işlemi etkilemesine izin vermeyiniz. Numunenin ezilip hazırlandığı odanın,

analizin yapıldığı oda ile aynı olmaması optimum performans için gereklidir.

Numune hazırlanması

Laboratuar örneğinden homojen artan bir alt örnek alınmalıdır. Eğer örnek

işlenmemiş soya ise en az 500 g uygun bir öğütücüde yaklaşık 3 dakika ya da

filtreden geçecek kadar ufak olana kadar ezin. Nicel analiz için 150 µm daha küçük

partikül boyutu, nitel analiz için 450 µm’den daha az partikül boyutu elde etmek

gerekir. Kontaminasyondan kaçınmak için filtreleme basamağına dikkat edilmelidir.

Buna ek olarak, fazla ısıtmaktan da kaçınılmalıdır. Blender (parçalayıcı), örneği hem

karıştıracak hem de parçalayacaktır. Ana materyalden yaklaşık 100 gr’lık bir örnek

alınıp 450 µm’lık filtreden geçirilmelidir. Bu örneğin en az %90’ı 450 µm’lik filtreden

geçirilmelidir. Nitel analiz için bu materyal direkt olarak kullanılabilir, nicel analiz için

filtrelenen materyal tekrar 150 µm’lik filtreden geçirilmelidir. 450 µm’lik filtreden geçen

materyalin homojen olduğu gözlenmiştir. Bu nedenle, 150 µm’lik filtreden yalnızca

son örneği sağlayacak kadar materyali geçirmek gereklidir. Son örnek için, prosedür

için gerekli olacak miktarda materyali filtrelemek yeterlidir.

Diğer tipteki örnekler daha küçük numune miktarları kullanılsa bile aynı biçimde işlem

görmelidir.



Analiz işlemi

Kullanımdan önce bütün sıvıları oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Kaplanmış şerit

ve şerit tutucuları folyo kutusundan çıkarın. Uygun sayıda şeriti çıkardıktan sonra

folyo kutusunu mutlaka kapatın. Referans standartları ve analiz körleri için 10

kuyucuk gereklidir. Her plak kendi standart ve kontrollerine sahip olmalıdır. Normal

yıkama kullanılıyorsa yıkama basamaklarında bütün şeritleri kenarlarından tutturmak

gereklidir.

Antikor konjugatın hazırlanması

Antikor konjugat stok solüsyonu: 1ml soya konjugat çözücü, soya konjugat

viyolünee alınır. Karıştırmak için 10 sn vortekslenir.

Antikor konjugat çalışma solüsyonu: Yeniden oluşturulmuş soya konjugatından

240 µl soya konjugat çözücü şişesine geri aktarılır ve tarih atılır. 20 kez çevirerek

karıştırılır.

Yıkama tamponunun hazırlanması

10x yıkama tamponunu oda sıcaklığına getiriniz.

Çalışma yıkama tamponu hazırlamak için bu tamponu deiyonize su ile seyreltin (örn

50 ml 10x yıkama tamponu 450 ml deiyonize su içine)

Yıkama şişesine koyun (ya da otomatik yıkayıcı)

Örnek ve referans standartlarının ekstrasyonu

Örnekler, pozitif ve negatif referans standartları, aynı koşullar altında, duplike olarak

aşağıda belirtildiği gibi esktrakte edilir.

Örnekleri tartarken, her referans standartı ve örnekler artan derişimlerde sıralanır.

Her referans standartı ve örnekden 0,5±0,01 g. tartarak polipropilen santrifuj tüplerine

koyun. Kontaminasyonu önlemek için her tartıda spatulayı temizleyin. 0,5 g numune

içeren her tüpe 4,5 ml soya ekstrasyon tamponu ekleyip 10 sn vorteksleyin.

Karışımları 5000 rpm de 15 dakika santrifüjleyin. Transfer pipeti kullanılarak çökeltiye

zarar vermeden supernatantı ayırınız. Supernatantı işaretlenmiş 15 ml lik temiz yeni

bir santrifuj tüpüne alınız. Analize başlamadan önce numuneler ve referans standart

ekstraktları soya tamponu ile Tablo 1’e göre seyreltilir. Protein ekstraktları bir çalışma

gününden uzun olmamak şartı ile 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır.

Tablo 1. Matrikse göre seyreltme oranları



Matriks Seyreltme

Soya fasülyesi

Soya unu

Yağı alınmış soya unu

Protein izolatı

1:300

1:300

1:300

1:10

Örnek ekstraktlarının seyreltilmesi

Ekstraksiyon yapılan negatif kontrol, ekstraksiyon yapılan pozitif referans ve her

örnek için seyreltme işlemi yapmak üzere iki adet 12x75 mm boyutlarında test tüpü

gereklidir.

280 µl soya analiz tamponunu bu tüplerden bir tanesine pipetleyin

380 µl soya analiz tamponunu diğer tüpe pipetleyin.

280 µl olan tüpü 1:15, 380 µl olan tüpü 1:300 olarak etiketleyin

Her örnekten 20 µl 1:15 olarak etiketlenmiş tüpe ekleyin ve vorteksleyin

Karıştırma sonrası 1:15 etiketli tüpten 20 µl alarak 1:300 etiketli tüpe ekleyerek

vorteksleyin

Bu basamakları her negatif kontrol, pozitif referans ve örnek ekstraktları için tekrar

edin

ELISA İmmunoanaliz prosedürü

Genel

ELISA analiz kiti 8 kuyucuklu şeritlerden herhangi biri kullanılarak çeşitli formatlarda

yürütülebilir. Rastgele yükleme şeması izlenmesi tavsiye edilmektedir.

Bütün reaksiyon kuyucukları eşli olarak yürütülmelidir. Her kuyucuk için ortalama

absorbans değerleri hesaplanmalıdır. Her yürütme tampon körü, negatif kontrol ve

pozitif referans standartlarının analizinden oluşur.

Analiz başlatıldığı zaman diğer basamaklar da ara vermeden tamamlanmalıdır.



Numune Eklenmesi

Seyreltilmiş ekstraktlar ve analiz tamponundan 100µl uygun kuyucuklara eklenir.

Kontaminasyonu önlemek için her pipetleme basamağında ayrı kullanılıp atılan pipet

uçları kullanılmalıdır.

Buharlaşma ve kontaminasyonu önlemek için kuyucukların üstü sera film veya

aliminyum folyo ile kapatılır.

Örnek inkubasyonu

Mikrotitre plağı 37°C de 1 saat bekletilir.

Yıkama

300 µl yıkama tamponu ile 3 kere yıkanır.

Elle yapılan yıkama: Kuyucuklar ters çevrilerek uygun bir atık kutusuna boşaltılır.

Yıkama solüsyonu ile dolu 500ml yıkama şişesi kullanılarak her kuyucuk tepesine

kadar doldurulur. 60 sn bekletilir, daha sonra ters çevrilerek boşaltılır. Yıkama adımı

3 kez tekrar edilir. Kalan sıvıyı ve hava kabarcıkları birkaç kağıt havlu üzerine ters

yüz ederek alınır. Uygun bir bant ile şeritlerin düşmesi engellenir.

Otomatik yıkama: İnkubasyon safhasının ardından bütün kuyucukların içi mikro

kuyucuk yıkayıcısı ile aspire edilerek boşaltılır. Ardından bütün kuyucuklar yıkama

tamponu ile doldurulur. Aspirasyon ve doldurma safhaları toplam 3 kez tekrar edilir.

Son olarak mikro kuyucuk yıkayıcı bütün kuyucuklardaki sıvının buharlaşması için

kullanılır. Kalan yıkama tamponu veya hava kabarcıkları birkaç kat kağıt havlu

üzerine ters yüze ederk alınır.

Kuyucukların tamamen kurumasına izin vermeyiniz. Bu analiz performansını

etkileyebilir.

Yetersiz yıkama hatalı sonuç verebilir. Her iki yıkama yönteminde de kuyucukların

eşit miktarlarda sıvı ile yıkanması gerekmektedir.

Antikor konjugatın eklenmesi

Her kuyucuğa 100µl antikor konjugat çalışma solüsyonundan eklenir.

Buharlaşma ve kontaminasyonu önlemek için plak örtülür.

İnkubasyon

Mikrotitre plak 37°C de 1 saat inkube edilir.



Yıkama

İnkubasyon safhasının sonunda tüm yıkama safhaları yukarıda belirtildiği gibi tekrar

edilir

Substrat eklenmesi

Her kuyucuğa 100 µl renk solüsyonu eklenir.

Plak yavaşca karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletilir.

Kromojenik substratın eklenmesi hemen yapılmalıdır.

Pipetleme safhasında aynı sıra ve zaman aralığı korunmalıdır.

Mikrotitre plak renk yoğunluğunun etkilenmemesi için güneş ışığından korunur.

Stop solusyonu eklenmesi

İnkubasyon safhasının sonunda her kuyucuğa 100 µl stop solüsyonu eklenir.

Plak yavaşca karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletilir. Pipetleme

safhasında Kromojenik substratın eklenmesi ile aynı sıra ve zaman aralığı korunmalı,

ara verilmeden tamanlanmalıdır. Mikrotitre plak renk yoğunluğunun etkilenmemesi

için güneş ışığından korunur.

Absorbans okunması

450 nm’de ölçüm yapabilmek için uygun filtre takılmış mikroplak okuyabilen

spektrofotometre ile her analiz kuyucuğunun absorbansını ölçünüz.

Bütün ölçümler durdurma solüsyonu ekledikten sonra 30 dakika içinde yapılmalıdır.

Elde edilen sonuçlar kaydedilir ve ortalama absorbans değerleri hesaplanır ya da

bilgisayar programı kullanılır.

Değerlendirme

Standart eğrinin çizilebilmesi için standart değerler kullanılır. Körün değeri bütün

numune ve referans standartlarından çıkarılmalıdır. Her çiftli referans noktasından

ortalama değerler standart eğri çizmek için kullanılır. Her çiftli numuneden elde edilen

ortalama veri bu grafikten derişim hesabı için kullanılır.

Kabul/Red Kriterleri

Geçerli olabilmesi için her yürütmenin prosedürdeki kabul/red kriterlerine uyması

gereklidir. Yürütme aşağıdakilerden oluşur; analiz körü, her GDO pozitif referans

standart ekstraktı, negatif kontrol ve her bilinmeyen numune. Bütün protein



ekstraktları ve analiz körü çiftli olarak yürütülür. Eğer yürütme analiz kabul ölçütlerine

uymazsa bütün yürütme tekrarlanır.

Yürütme Ölçüt

Analiz Tampon kör A450<0,30

%0 GDO standart A450<0,30

%2,5 Referans A450>0,8

Bütün pozitif standartlar Çiftlerin CVsi≤%15

Test edilen numuneler Çiftlerin CVsi≤%20



AKIŞ ŞEMASI

Örnek ve referans ekstrasyonu için akış şeması

İşlem Hacim/Ağırlık Tanım

Tartım 0,5 g Örnekler, analiz körü ve referans standartları tartılır.

Ekleme 4,5 ml Ekstrasyon tamponu eklenir.

Karıştırma Homojen olana kadar örnek ekstrasyon tamponu ile

karıştırılır.

Santrifüj 5000 rpm Örnek 5000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilir

Supernatant temiz bir tüpe alınır.

Seyreltme 1:300 veya 1:10

incelenen materyale göre

Örnek veya referans standartları seyreltilir.

ELISA Immunoanaliz için Akış Şeması

İşlem Hacim Tanım

Ekleme 100 µl Örnek, referans standart ve analiz tampon körü uygun analiz

kuyucuğuna pipetle konulur.

Inkubasyon 1 saat 37°C de inkubasyon yapılır.

Yıkama 3 kez yıkama tamponu ile yıkanır.

Ekleme 100 µl Antikor konjugatı her analiz kuyucuğuna dağıtılır.

Inkubasyon 1 saat 37 °C de inkubasyon yapılır.

Yıkama 3 kez yıkama tamponu ile yıkanır.

Ekleme 100 µl Her kuyucuğa renk solüsyonu eklenir.

İnkubasyon Ortam sıcaklığında 10 dakika bekletilir.

Ekleme 100 µl Her kuyucuğa durdurma reaksiyonu eklenir.

Absorbans Ölçümü Plak okuyucuda her kuyucuğun absorbansı 450 nm de

ölçülür.



Kaynaklar

Clark, M.F. and Adams, A.N. (1977). Characteristics of the microplate method of

enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of

General Virology 34, 475-483.

Hemmer, W. (1997). Foods Derived from Genetically Modified Organisms and

Detection Methods. Biosafety Research and Assesment of Tehnology Impacts of

the Swiss Priority Program Biotechnology- Report 2/97, 61 pages.

http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php (accessed January

2010).

Lipp, M., Anklam, E. and Stave, J.W. (2000). Validation of an immunoassay for

detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food

fractions usig reference materials. Journal of AOAC International 83, 919-927.

Longstaff, M., Edmonds, H.S. and Newell, C.A. (1995). An improved method for he

detection and quantification of recombinant protein in transgenic plants. Plant

Molecular Biology Reporter 13, 363-368.

Mohapatra, U., Mccabe, M.S., Power, J.B., Schepers, F Vanderrarend, A., and

Davey, M.R. (1999). Expression of the bar gene confers herbicide resistance in

transgenic lettuce. Transgenic Research 8, 33-44.

Padgette, S.R., Kolacz, K.H., Deannay, X., Re, D.B., LaVallee, B.J., Tinius, C.N.,

Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Barry, G.F., Eicholtz, D.A., Peschke, V.M., Nida, D.L.,

Taylor, N.B. and Kishore, G.M. (1995). Development, identification, and

characterzation of a glyphosate-tolerant soybean line. Crop Science 35, 1451-

1161.


http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php



Ek Kaynaklar

Brett, G.M., Chambers, S.J., Huang, L. and Morgan, M.R.A. (1999). Design and

development of immunoassays for detection of proteins. Food Control 10,

401-406.

Commision Directive 79/700/EEC of 24 July 1979 establishing Community methods

of sampling for the official control of pesticide residues in and on fruit and

vegetables. OJ L 239, 22.9.1979, p.24.

Rogan, G.J. Dudin, Y.A., Lee, T.C., Magin, K.M., Astwood, J.D., Bhakta, N.S., Leach,

J.N., Sanders, P.R. and Fuchs, R.L. (1999). Immunodiagnostic methods for

detection of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthetase in Roundup

Ready® soybeans. Food Control 10, 407-414.

Stave, J.W. (1999). Detection of new modified proteins in novel foods derived from

GMO-future needs. Food Control 10, 367-374.

Van der Hoeven, C., Dietz, A. and Landsmann, J. (1994). Variability of organ-specific

gene expression in transgenic tobacco plants. Transgenic Research 3, 159-

165.


Ek

Çalışma Programı Örneği (Bir Haftalık Kurs)

M. Querci






Çalışma Programı Örneği 2

1. GÜN – PAZARTESİ

9:00 Kurs, organizatörler ve katılımcıların tanıtımı

9:30 Teori: GDO saptamada kullanılan genel yöntemler ve kurs içeriğine giriş

ÖRNEKLERİN HAZIRLANMASI: DNA EKSTRAKSİYONU

10:00 Deney: CTAB metodu ile DNA ekstraksiyonu (1. kısım)

10:30 Kahve arası

11:00 Teori: Nükleik asit analizleri için jel elektroforezi

Deney: Agaroz jel hazırlama


13:00 Öğle arası


15:15 Deney: Agaroz jele örnek yükleme

16:00 Kahve arası

16:20 Teori: PCR lab düzeni, sorun giderme v.b. üzerine genel değerlendirmeler

17:20 Deney: Agaroz jel sonuçlarının değerlendirilmesi

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Ek


2. GÜN – SALI

NİTEL PCR

9:00 Teori: Polimeraz Zincir Reaksiyona (PCR) giriş ve transgenik mısır ve

soyanın saptanmasında PCR kullanımı

9:30 Deney: Transgenik MON810 mısır ve Roundup Ready® soya için PCR

Bitki özel: zein ve lectin genlerinin saptanması

10:15 Kahve arası

10:40 Agaroz jel hazırlama

11:00 Seminer: Örnekleme ve doğrulama: temel kavramlar

12:30 Öğle arası

14:00 Agaroz jele örnek yükleme

14:30 Teori: MON810 mısır ve Roundup Ready® soyanın özellikleri ve GDO için

nested PCR’ye giriş

15:15 Agaroz jel sonuçlarının değerlendirilmesi (zein ve lectin için PCR)

16:00 Kahve arası

16:15 Deney: Transgenik MON810 mısır ve Roundup Ready® soya için PCR

GDO özel: 35S promotör and nos terminatörünün saptanması.

17:00 Seminer: GDO’lar ile ilgili AB kanunlarına giriş



3. GÜN – ÇARŞAMBA

NİTEL PCR

9:00 Deney: MON810 mısır ve Roundup Ready® soyanın nested PCR ile spesifik

saptanması (1. PCR reaksiyonu)

10:00 Agaroz jel hazırlama

10:30 Kahve arası

11:00 Seminer: GDO taraması ve analitik kalite güvencesi

12:00 Agaroz jele örnek yükleme (35S promotör ve nos terminatör için PCR)

12:30 Öğle arası

13:30 Deney: MON810 mısır ve Roundup Ready® soyanın nested PCR ile spesifik

saptanması (2. PCR reaksiyonu)

14:00 Agaroz jel sonuçlarının değerlendirilmesi (35S promotör ve nos terminatör için

PCR)

15:00 Deney: Agaroz jel hazırlama

15:30 Kahve arası

15:45 Deney: Agaroz jele örnek yükleme (nested PCR)

16:00 Teori: GDO saptama ve miktar tayini için eş zamanlı (real-time) PCR (RT-

PCR)’ye giriş

17:30 Deney: Agaroz jel sonuçlarının değerlendirilmesi (MON810 mısır ve Roundup

Ready® soya için nested PCR)



4. GÜN – PERŞEMBE

NİCEL EŞ ZAMANLI (REAL-TIME) PCR (RT-PCR)

9:00 Deney: DNA miktar tayini ve eş zamanlı (real-time) PCR (RT-PCR) için örnek

hazırlama

9:30 Deney: Transgenik Roundup Ready® soyanın saptanması için eş zamanlı

PCR (RT-PCR)

LightCycler (Roche) kullanarak (Grup 1)

ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) kullanarak (Grup 2)

Kahve arası

13:00 Öğle arası


PCR (RT-PCR)

LightCycler (Roche) kullanarak (Grup 2)

ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) kullanarak (Grup 1)

15:30 Teori: Veri analizi: Bazı istatistiksel terimlere giriş

16:30 Kahve arası


PCR (RT-PCR)




5. GÜN – CUMA

ROUNDUP READY® SOYANIN ELISA İLE NİCEL SAPTANMASI

9:00 Teori: GDO saptama için serolojik yaklaşım

9:20 Deney: ELISA 1. kısım

10:00 Kahve arası

10:30 Seminer: GDO saptama için serolojik yaklaşım


12:00 Öğle arası


14:00 Sonuçların değerlendirilmesi

15:00 Seminer: Genetiği Değiştirilmiş Organizmaların güvenli kullanımı üzerine

uluslararası uzlaşmalar

16:00 Genel tartışma ve kapanış

JRC Misyonu JRC’nin misyonu AB politikalarının doğru kavranması, geliştirilmesi, uygulanması ve izlenebiliriliği için tüketici haklarını gözeten bir biçimde bilimsel ve teknik destek sağlamaktır. Avrupa Komisyounca sağlanan bir servis olarak JRC, AB için bir bilim ve teknoloji referans merkezi olarak hizmet vermektedir. Politika geliştirme süreçlerine aktif olarak katkıda bulunan JRC, birlik üye ülkelerinin ortak çıkarlarını gözetirken her türlü ulusal ya da özel amaç yahut menfaatten bağımsız hareket eder.

LB

-X1-06-051-T

R-C

Documents

KURS ELKİTABI · 2010-10-08 · Umuyoruz ki bu kitabın yap ve içeriı ği, kurs katılımcılarının (ve diğer tüm okur ve kullanıcıların) kazandıkları becerileri ve edindikleri