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8. ARBEITEN IM8. ARBEITEN IMMIKROBIOLOGISCHENMIKROBIOLOGISCHENLABOR LABOR -- TEIL 1TEIL 1
Kultivierung von MikroorganismenKultivierung von Mikroorganismen
Nährmedium - Nährsubstrat
Einteilungsmöglichkeiten:
- nach ihrer Zusammensetzung- nach ihren physikalischen Eigenschaften- nach ihrem Verwendungszweck
Kultivierung von MikroorganismenKultivierung von Mikroorganismen
Nährmedium - Nährsubstrat
SynthetischeSynthetischeNNäährmedienhrmedien
KomplexeKomplexeNNäährmedienhrmedien
DefDef. chem. Zusammensetzung. chem. Zusammensetzung Mehr oder weniger exaktMehr oder weniger exaktdefinierte Bestandteiledefinierte Bestandteile
HefeextraktHefeextraktTomatenpresssaftTomatenpresssaft
PeptonPepton, ...., ....
ZusammensetzungZusammensetzung
Komplexe NKomplexe Näährbodenbestandteilehrbodenbestandteile
PeptonPepton
FleischextraktFleischextrakt
CaseinhydrolysatCaseinhydrolysat
MalzextraktMalzextrakt
HefeextraktHefeextrakt
EiweiEiweißßspaltprodukte, spaltprodukte, hergesthergest. durch . durch enyzmatischeenyzmatischeVerdauung tierischer u. pflanzlicher ProteineVerdauung tierischer u. pflanzlicher Proteine
WWäässriger Extrakt von ssriger Extrakt von enzymatischenzymatisch vorverdautemvorverdautemFleischFleisch
Salzsaures Salzsaures HydrolysatHydrolysat aus Milcheiweiaus Milcheiweißß ohne niederohne nieder--molekulare Spaltprodukte, liefert freie Aminosmolekulare Spaltprodukte, liefert freie Aminosääurenuren
WWäässriger Extrakt von Malz, spezieller Bestandteil ssriger Extrakt von Malz, spezieller Bestandteil von Pilzvon Pilz--NNäährmedienhrmedien
WWäässriger Extrakt aus ssriger Extrakt aus autolysierteautolysierte Hefe, liefert vielHefe, liefert vielC und NC und N
Lieferanten fLieferanten füür C, N, Aminosr C, N, Aminosääuren, Vitamine,uren, Vitamine,Mineralstoffe, SpurenelementeMineralstoffe, Spurenelemente
Nährmedium - NährsubstratPhysikalPhysikal. Eigenschaften. Eigenschaften
Kultivierung von MikroorganismenKultivierung von Mikroorganismen
FESTFEST FLFLÜÜSSIGSSIGWEICHWEICHVerfestigungsmittelVerfestigungsmittel
AgarAgar--AgarAgar
1,5 1,5 -- 2 % 0,2 2 % 0,2 -- 0,8%0,8%
GelatineGelatine10 10 -- 15 %15 %
(CMC, 1,5 %)(CMC, 1,5 %)
AgarAgar--AgarAgar
-- Verfestigungsmittel aus Verfestigungsmittel aus marinenmarinen RotalgenRotalgen-- hoher hoher PolysaccharidanteilPolysaccharidanteil (ca. 70%)(ca. 70%)-- AgaroseAgarose und und AgaropektinAgaropektin-- bedeutende Schmelzbedeutende Schmelz-- und Erstarrungsund Erstarrungs--eigenschafteneigenschaften::
Schmelzbereich: 80 Schmelzbereich: 80 -- 90 90 °°CCErstarrungsbereich: 32 Erstarrungsbereich: 32 -- 38 38 °°CC
Nährmedium - NährsubstratVerwendungszweckVerwendungszweck
Kultivierung von MikroorganismenKultivierung von Mikroorganismen
Universal/KollektivmediumUniversal/Kollektivmedium
SelektivmediumSelektivmedium
ElektivnElektivnäährmediumhrmedium
DifferentialmediumDifferentialmedium
AnreicherungsmediumAnreicherungsmedium
MangelmediumMangelmediumTransportmedium etc.Transportmedium etc.
NNäährmedienbereitunghrmedienbereitung
NNäährbodenkonzentrat (oder Komponenten) hrbodenkonzentrat (oder Komponenten) einweinwäägengen
AufschlAufschläämmung in (mmung in (destdest.) Wasser.) Wasser
Ggf. Zugabe von VerfestigungsmittelGgf. Zugabe von Verfestigungsmittel
NNäährsubstrat auflhrsubstrat auflöösen (Dampf, heizbarer sen (Dampf, heizbarer MagnetrMagnetrüührerhrer))
pHpH--Kontrolle/Kontrolle/--korrekturkorrektur
SterilisationSterilisation
SterilisationSterilisation
-- DekontaminationsmaDekontaminationsmaßßnahmenahme-- AbtAbtööten und Entfernen aller Lebewesenten und Entfernen aller Lebeweseneinschlieeinschließßlich ihrer Ruhestadienlich ihrer Ruhestadien................................vollst........vollstäändige Entkeimung (?)ndige Entkeimung (?)
-- verschiedene Mverschiedene Mööglichkeiten:glichkeiten:
HitzesterilisationHitzesterilisationFiltrationFiltrationBestrahlungBestrahlungBegasungBegasungAnwendung von ChemikalienAnwendung von Chemikalien
Feuchte HitzeFeuchte HitzeTyndallisationTyndallisationTrockene HitzeTrockene Hitze
UVUVIonisierende StrahlenIonisierende Strahlen
HitzesterilisationHitzesterilisation
-- DenaturierungseffektDenaturierungseffekt-- AbgetAbgetöötete Keime verbleiben im Sterilisierguttete Keime verbleiben im Sterilisiergut-- AutoklavierungAutoklavierung ((ÜÜberdruck)berdruck)
-- Diskontinuierliche/fraktionierte SterilisationDiskontinuierliche/fraktionierte Sterilisation((TyndallisationTyndallisation))
121 121 °°C / 20 min.C / 20 min.
100 100 °°C / 30 min.C / 30 min.30 30 °°C / 12 C / 12 -- 24 h24 h100 100 °°C / 30 min.C / 30 min.
Aufbau eines Aufbau eines AutoklavenAutoklaven
Autoklav um 1950Autoklav um 1950
DiverseDiverseAutoklavenAutoklaven--modellemodelle
TischautoklavTischautoklav
Zyklus einer Zyklus einer AutoklavierungsprozedurAutoklavierungsprozedur
Brock, 2001Brock, 2001
Temperatur und Dampfdruck Temperatur und Dampfdruck von gesvon gesäättigtem Wasserdampfttigtem Wasserdampf
100100105,3105,3109,7109,7115,2115,2120,6120,6133,9133,9
101101122122142142170170203203304304
1,011,011,221,221,421,421,701,702,032,033,043,04
1,001,001,201,201,401,401,681,682,002,003,003,00
TempTemp..°°CC
kPa.kPa. barbar atmatm
Sterilisierdauer richtet sich nach demSterilisierdauer richtet sich nach demSterilisiervolumen !Sterilisiervolumen !
bis 50 mlbis 50 ml20 20 -- 200 ml200 ml200 200 -- 1000 ml1000 ml1 1 -- 2 l2 l10 l10 l20 l20 l
EinzelvolumenEinzelvolumen
15 15 20202525353560 60 -- 9090120 120 -- 180180
Sterilisierzeit Sterilisierzeit bei 121 bei 121 °°CC
WWäärmermeüübergang !bergang !
Empfehlungen zur DurchfEmpfehlungen zur Durchfüührung hrung einer einer LaborLabor--AutoklavierungAutoklavierung
-- nur hitzesterilisierbares Gut sterilisierennur hitzesterilisierbares Gut sterilisieren-- GefGefäßäße nicht voll befe nicht voll befüüllen ( 1/2llen ( 1/2--voll)voll)-- DampfunduchlDampfunduchläässigessige VerschlVerschlüüsse nur losesse nur loseaufsetzenaufsetzen
-- Wattestopfen mit Pergament oder AlufolieWattestopfen mit Pergament oder Alufolieabdeckenabdecken
-- Beschriftung mit Beschriftung mit autoklavenfestemautoklavenfestem FilzstiftFilzstift-- Sterilisiergut mSterilisiergut mööglichst senkrecht platzierenglichst senkrecht platzieren-- separate Gefseparate Gefäßäße fe füür Vernichtungssterilisationr Vernichtungssterilisation
verwendenverwenden-- nach Autoklavieren langsamer Duckabfallnach Autoklavieren langsamer Duckabfall
Kontrolle der DampfsterilisationKontrolle der Dampfsterilisation
IndikatorenIndikatoren
ChemischeChemische BiologischeBiologische((„„BioindikatorenBioindikatoren““))-- Farbstreifen mit FeldernFarbstreifen mit Feldern
-- FarbumschlagsanzeigeFarbumschlagsanzeige-- einfach zu handhabeneinfach zu handhaben-- auf Sterilisiergut aufkleben auf Sterilisiergut aufkleben
-- aufwaufwäändiger als chem. Indikatorenndiger als chem. Indikatoren-- zuverlzuverläässiger als ssiger als -- ““ ---- meist Sporenprmeist Sporenprääparateparate((GeobacillusGeobacillus stearothermophilusstearothermophilus,,definierter definierter ATCCATCC--StammStamm))
-- Sporenstreifen oder TestampullenSporenstreifen oder Testampullen-- an an „„kkäältester Stelleltester Stelle““ platziertplatziert-- anschl. Bebranschl. Bebrüütungsphasetungsphase(...keine Tr(...keine Trüübung)bung)
Im EuropIm Europääischen Arzneibuch spezifizierteischen Arzneibuch spezifizierteBioindikatorBioindikator--MikroorganismenMikroorganismen
StaphStaph. . aureusaureus ATCC 6538ATCC 6538BacillusBacillus subtilissubtilis ATCC 6633ATCC 6633PseudomonasPseudomonas aeruginosaaeruginosa ATCC 9027ATCC 9027ClostridiumClostridium sporogenessporogenes ATCC 19404ATCC 19404CandidaCandida albicansalbicans ATCC 10231ATCC 10231AspergillusAspergillus nigerniger ATCC 16404ATCC 16404
Sterilisationseffekt Sterilisationseffekt AbtAbtöötung durch trockene Heitung durch trockene Heißßluft:luft:Erhitzungsdauer in min. bei 120 Erhitzungsdauer in min. bei 120 °°CC
SalmonellaSalmonella typhityphi 2020E. E. colicoli 3030StaphylococcusStaphylococcus aureusaureus 3030
EndosporenEndosporen vonvon::ClostridiumClostridium botulinumbotulinum 120120BacillusBacillus anthracisanthracis 120120
mod. n. mod. n. WallhWallhääusserusser, 1995, 1995
Kinetik der HitzeinaktivierungKinetik der Hitzeinaktivierung
Brock, 2001Brock, 2001
DD--WertWertDezimale ReduktionszeitDezimale Reduktionszeit
Zeit in Minuten, die bei vorgegebener Temperatur Zeit in Minuten, die bei vorgegebener Temperatur notwendig ist, um die Keimzahl um 90 % (= auf einnotwendig ist, um die Keimzahl um 90 % (= auf ein
Zehntel) zu reduzierenZehntel) zu reduzieren
EinflussgrEinflussgrößößen auf den Den auf den D--WertWert::-- „„NaturNatur““/Empfindlichkeit des Mikroorganismus/Empfindlichkeit des Mikroorganismus-- Bestimmung des DBestimmung des D--Werts aufwWerts aufwäändigndig(mehrere KZ(mehrere KZ--BestimmungsansBestimmungsansäätze)tze)
-- ........Abt........Abtöötungskurve nicht immer eine Geradetungskurve nicht immer eine Gerade
22
44
66
88
1010
--22 ZeitZeit
log KZlog KZ
DD--WertWert
1 Z / 100 ml1 Z / 100 ml
HitzeinaktivierungskinetikHitzeinaktivierungskinetik
Thermische AbtThermische Abtöötungszeittungszeit
Jene Jene ZeitdauerZeitdauer, die erforderlich ist, um bei, die erforderlich ist, um beivorgegebener Temperatur vorgegebener Temperatur alle (?) alle (?) Zellen abzutZellen abzutöötenten
-- wesentliche Einflussgrwesentliche Einflussgrößöße: Dichte/Keimzahl der e: Dichte/Keimzahl der betrachteten Keimsuspension bzw. Probe betrachteten Keimsuspension bzw. Probe
VorgangsweiseVorgangsweise::Proben (Proben (defdef. Zellsuspensionen) f. Zellsuspensionen) füür unterschiedlicher unterschiedlicheZeitspannen erhitzen, dann Zeitspannen erhitzen, dann inkubiereninkubieren und auf und auf Wachstum kontrollierenWachstum kontrollieren
Sterilisation von NSterilisation von Näährmedienhrmedien
HitzesterilisationHitzesterilisation
SterilfiltrationSterilfiltration
AutoklavierenAutoklavieren
tyndallisierentyndallisieren
schonend schonend „„aufkochenaufkochen““
1x Filter1x Filter1x1x--FilteraufsFilteraufsäätzetzeMembranfiltrationMembranfiltration
Andere thermische EntkeimungsverfahrenAndere thermische Entkeimungsverfahren
-- PasteurisierungPasteurisierung
-- UHTUHT--ErhitzungErhitzung
-- nur Teilentkeimungnur Teilentkeimung-- Pathogene abgetPathogene abgetöötettet-- Verderbskeime reduziertVerderbskeime reduziert-- vorwiegend bei Lebensmittelnvorwiegend bei Lebensmitteln-- HaltbarkeitsverlHaltbarkeitsverläängerungngerung-- Verderb verzVerderb verzöögertgert
-- Erhitzung auf 130 bis 150 Erhitzung auf 130 bis 150 °°CCffüür wenige Sekundenr wenige Sekunden
-- SterilisationseffektSterilisationseffekt-- vorwiegend bei Lebensmittelnvorwiegend bei Lebensmitteln(z.B. (z.B. HH--Milch....Milch....““UHTUHT““))
MembranfiltrationsMembranfiltrations--SterilisationSterilisation
-- „„mechanische Sterilisationmechanische Sterilisation““-- Mikrofilter mit definierter PorenweiteMikrofilter mit definierter Porenweite
0,22 0,22 µµmm0,45 0,45 µµmm
-- Celluloseacetat, CellulosenitratCelluloseacetat, Cellulosenitrat-- ggf. Vorfilter vor eigentlicher Sterilfiltrationggf. Vorfilter vor eigentlicher Sterilfiltration
Struktur einesStruktur einesCelluloseacetatCelluloseacetat--FiltersFilters
1x1x--FilterFilterMembranfiltrationsvorrichtungMembranfiltrationsvorrichtung
Brock, 2001Brock, 2001
Schema FiltrationsaufsatzSchema Filtrationsaufsatz
Brock, 2001Brock, 2001
Vorrichtung zur Membranfiltration unter DruckVorrichtung zur Membranfiltration unter Druck
Bast, 2001Bast, 2001
Filtrieranordnung des Filtrieranordnung des MicrofilMicrofil--SytemsSytems
MilliflexMilliflex--SystemSystem ((MilliporeMillipore))
Anwendung von Miniaturfiltern Anwendung von Miniaturfiltern ffüür Entkeimungszwecker Entkeimungszwecke
Block, 1991Block, 1991
Spezialisiertes Filtrationssystem Spezialisiertes Filtrationssystem ffüür kritische Anwendungenr kritische Anwendungen
Block, 1991Block, 1991
Beispiele fBeispiele füür die Anwendung der r die Anwendung der MikrofiltrationsMikrofiltrations--SterilisationSterilisation
-- AntibioticaAntibiotica-- VakzineVakzine-- IntravenIntravenööse Lse Löösungensungen-- AllergenextrakteAllergenextrakte-- SteroideSteroide-- OphthalmologOphthalmolog. Produkte. Produkte-- OrgankonservierungslOrgankonservierungslöösungensungen
Anwendung von trockener HitzeAnwendung von trockener Hitze
-- Hitzesterilisation von (trockenen) GlasgerHitzesterilisation von (trockenen) Glasgeräätenten(Pipetten, Kolben, R(Pipetten, Kolben, Rööhrchen, Petrihrchen, Petri--schalen etc.)schalen etc.)
-- HeiHeißßluftsterilisatorluftsterilisator, gute Luftzirkulation, gute Luftzirkulation-- Sterilisiergut nicht zu dicht packenSterilisiergut nicht zu dicht packen-- Check mittels IndikatorbCheck mittels Indikatorbäändern oderndern oderBioindikatorenBioindikatoren
-- Vorsicht bei GummiVorsicht bei Gummi-- u. Kunststoffstopfenu. Kunststoffstopfen-- nur trockenes Gut sterilisierennur trockenes Gut sterilisieren
Kenndaten der HeiKenndaten der Heißßluftsterilisationluftsterilisation
160 160 °°CC
170 170 °°CC
180 180 °°CC
180 min.180 min.
120 min.120 min.
30 min30 min
TempTemp. Zeit. Zeit
HeiHeißßluftsterilisatorenluftsterilisatoren
AusglAusglüühen von hen von ImpfImpföösensen und und --nadelnnadeln
Bast, 2001Bast, 2001
BunsenbrennerBunsenbrenner
Sterilisation durch BestrahlungSterilisation durch Bestrahlung
-- UVUV--StrahlungStrahlung
-- Ionisierende StrahlungIonisierende Strahlung
-- NucleinsNucleinsääureure--SchSchäädigungdigung-- Raumluft , OberflRaumluft , Oberfläächen, Trinkwasserchen, Trinkwasser-- geringe Eindringtiefegeringe Eindringtiefe-- UVUV--CC--Bereich am wirksamstenBereich am wirksamsten(200 (200 -- 280 nm)280 nm)
-- QuecksilberQuecksilber--NiederdruckstrahlerNiederdruckstrahler(253,7 nm)(253,7 nm)
-- Ozon !Ozon !-- in unbenutzten Rin unbenutzten Rääumenumen
-- Sterilisation von Einwegmaterialien, Sterilisation von Einwegmaterialien, Gewebsersatz u. Gewebsersatz u. AntibioticaAntibiotica
-- GammaGamma--StrahlenStrahlen-- produzieren Elektronen, Radikaleproduzieren Elektronen, Radikale-- SchSchäädigung der DNAdigung der DNA-- Bestrahlungsdosis in Bestrahlungsdosis in Gray (Gy)Gray (Gy)
Chemische SterilisationChemische Sterilisation
-- EthylenoxidbegasungEthylenoxidbegasung
-- FormalinbehandlungFormalinbehandlung
-- PeressigsPeressigsääureure
--Ethanol Ethanol
--((ßß--PropiolactonPropiolacton))
Achtung explosiv !Achtung explosiv !
Hohe ToxizitHohe Toxizitäät, sterile t, sterile NachbelNachbelüüftungftung
Raumluftdesinfektion,Raumluftdesinfektion,kanzerogen, kanzerogen, Anw.KonzAnw.Konz. 1. 1-- 3.5%3.5%
Nicht mehr gebrNicht mehr gebrääuchlich,uchlich,kanzerogenkanzerogen
ArbeitsflArbeitsfläächendesinfektion,chendesinfektion,70%iger ,verg70%iger ,vergäällter Alkohol,llter Alkohol,60%iger 60%iger IsopropanolIsopropanol
Schematische Darstellung einer Schematische Darstellung einer EthylenoxidEthylenoxid--SterilisationsSterilisations--AnlageAnlage
Block, 1991Block, 1991
LaborsicherheitLaborsicherheit
Eingeschleppte KeimeEingeschleppte Keime(Mensch, Luft, unsterile(Mensch, Luft, unsterile
GerGerääte)te)
RaumluftRaumluft(ca. 500 (ca. 500 -- 2000 K/m )2000 K/m )33
Wichtige Regeln fWichtige Regeln füür das mikrobiologische Arbeitenr das mikrobiologische Arbeiten
-- Alle GegenstAlle Gegenstäände sind so zu behandeln, als ob siende sind so zu behandeln, als ob siepathogenes Material (Mikroorganismen pathogenes Material (Mikroorganismen u.ou.o. deren. derenStoffwechselprodukte) enthielten Stoffwechselprodukte) enthielten
-- Tragen von SchutzkleidungTragen von Schutzkleidung-- SchmuckverbotSchmuckverbot-- Essen, Trinken, Rauchen im Labor Essen, Trinken, Rauchen im Labor vebotenveboten-- Beschriften von BehBeschriften von Behäältnissenltnissen-- Kontaminierte GegenstKontaminierte Gegenstäände dekontaminierennde dekontaminieren-- Achtung auf Luftkontamination / AerosolbildungAchtung auf Luftkontamination / Aerosolbildung
Historische Darstellung Historische Darstellung eines Pestweines Pestwäächterschtersum 1720um 1720
PersonenPersonen-- und Produktschutz im Laborund Produktschutz im Labor
Umgang mit MikroorganismenUmgang mit Mikroorganismen
-- Schutz von Personal und UmweltSchutz von Personal und Umwelt
-- Genehmigung der BehGenehmigung der Behöörde frde füür Arbeiten mitr Arbeiten mithumanhuman-- u. u. tierpathogenentierpathogenen ErregernErregern
-- Einstufung der Einstufung der „„biologbiolog. Arbeitsstoffe. Arbeitsstoffe““in Risikoklassen (1 in Risikoklassen (1 -- 4)4)
Gruppierung nach RisikoklassenGruppierung nach Risikoklassen
Gruppe 1Gruppe 1: kein oder sehr geringes Risiko f: kein oder sehr geringes Risiko füürrMensch und Wirbeltiere, als KrankheitsMensch und Wirbeltiere, als Krankheits--erregererreger ffüür Gesunde ohne Bedeutungr Gesunde ohne Bedeutung
Gruppe 2Gruppe 2: Geringes bis m: Geringes bis mäßäßiges Risiko figes Risiko füür Mensch r Mensch und Wirbeltiere, potenzielle Krankheitserregerund Wirbeltiere, potenzielle Krankheitserregerbeim Menschen, wirksame Vorbeugung und beim Menschen, wirksame Vorbeugung und Behandlung normalerweise mBehandlung normalerweise mööglichglich
Gruppe 3Gruppe 3: M: Mäßäßiges bis hohes Risiko figes bis hohes Risiko füür Mensch undr Mensch undWirbeltiere, Erreger schwerer Erkrankungen,Wirbeltiere, Erreger schwerer Erkrankungen,wirksame Vorbeugung oder Behandlung wirksame Vorbeugung oder Behandlung normalerweise mnormalerweise mööglichglich
Gruppe 4Gruppe 4: Hohes Risiko f: Hohes Risiko füür Mensch und Wirbeltierer Mensch und Wirbeltiere(best. Viren)(best. Viren)
Beispiele fBeispiele füür die einzelnen Risikoklassenr die einzelnen Risikoklassen
Gruppe 1:Gruppe 1:
Gruppe 2:Gruppe 2:
Gruppe 3:Gruppe 3:
Gruppe 4:Gruppe 4:
AcetobacterAcetobacter, die meisten , die meisten LactobacillenLactobacillen,,die meisten die meisten E.coliE.coli, , SaccharomycesSaccharomyces
Pathogene Pathogene E.coliE.coli, , ShigellaShigella dysenteriaedysenteriae,,ClostridiumClostridium tetanitetani, , KlebsiellaKlebsiella pneumoniaepneumoniae
ChlamydiaChlamydia psittacipsittaci, , SalmonellaSalmonella typhityphi,,YersiniaYersinia pestispestis, , FrancisellaFrancisella tularensistularensis
nur bestimmte Viren (nur bestimmte Viren (EbolaEbola,....),....)
RRääumliche Voraussetzungenumliche Voraussetzungen
-- Lage des Labors (....nicht ErdgeschoLage des Labors (....nicht Erdgeschoßß))-- VorrVorrääume ume -- ArbeitsflArbeitsfläächen und Fuchen und Fußßbböödenden-- wenig Mobiliarwenig Mobiliar-- Fenster und TFenster und Tüüren geschlossenren geschlossen-- DesinfektionsmDesinfektionsmööglichkeit fglichkeit füür Raumluftr Raumluft-- RegelmRegelmäßäßige Kontrolle auf Ungezieferige Kontrolle auf Ungeziefer-- Keine Verwechslungen von GerKeine Verwechslungen von Geräätschaftentschaften-- Vermeidung von Verletzungen (Nadeln etc.)Vermeidung von Verletzungen (Nadeln etc.)
Allgemein:Allgemein:
Arbeiten unter Arbeiten unter Schutzstufe 2Schutzstufe 2
-- Arbeitsraum mit Arbeitsraum mit LabelLabel kennzeichnenkennzeichnen-- ttäägliche Desinfektion der Flgliche Desinfektion der Fläächenchen-- Schutzkleidung nie auSchutzkleidung nie außßerhalb tragenerhalb tragen-- Verwendung von starken LatexhandschuhenVerwendung von starken Latexhandschuhen-- Arbeiten in SicherheitswerkbArbeiten in Sicherheitswerkbäänkennken-- Bunsenbrenner mit SpritzschutzglockeBunsenbrenner mit Spritzschutzglocke-- Verwenden von EinwegartikelnVerwenden von Einwegartikeln-- Kontaminierte GerKontaminierte Gerääte in Desinfektionsbad einlegente in Desinfektionsbad einlegen-- Sofern Kontamination eintritt, Bereich sperren u. desinfizierenSofern Kontamination eintritt, Bereich sperren u. desinfizieren-- Abfallsammlung und Abfallsammlung und --entsorgung (Dekontamination)entsorgung (Dekontamination)
Arbeiten mit einer ReinraumwerkbankArbeiten mit einer Reinraumwerkbank
-- DurchfDurchfüührung aller aseptischen Arbeitsschrittehrung aller aseptischen Arbeitsschritte-- Schutz der Schutz der UmgebungUmgebung, Schutz des , Schutz des ExperimentatorExperimentatorss-- UVUV--Bestrahlung im Inneren der WerkbankBestrahlung im Inneren der Werkbank-- Umluftsystem mit Umluftsystem mit HOSCHHOSCH--FilternFiltern (engl.: HEPA (engl.: HEPA filtersfilters))
-- 3 Arten von Werkb3 Arten von Werkbäänkennken::1. Schutz des Arbeitenden und der Umgebung (Kl. 1)1. Schutz des Arbeitenden und der Umgebung (Kl. 1)
2. Schutz der Arbeitsobjekte und 2. Schutz der Arbeitsobjekte und --prozesseprozesse
3. Schutz des Arbeitenden und der Prozesse (Kl. 2 u. 3)3. Schutz des Arbeitenden und der Prozesse (Kl. 2 u. 3)
„„LaminarLaminar FlowFlow““
High High EfficiencyEfficiency ParticulateParticulate Air FilterAir Filtermit definierten mit definierten AbscheidegradenAbscheidegraden
Schematische Darstellung einer ReinraumwerkbankSchematische Darstellung einer ReinraumwerkbankBast, 2001Bast, 2001
SterilwerkbSterilwerkbäänkenke
GerGerääte und Utensilien te und Utensilien ffüür das mikrobiologische Arbeitenr das mikrobiologische Arbeiten
Bast, 2001Bast, 2001
LaborausstattungLaborausstattung
-- BunsenbrennerBunsenbrenner-- WasserbWasserbääderder-- InkubationsschrInkubationsschräänkenke-- ThermometerThermometer-- AutoklavAutoklav-- HeiHeißßluftsterilisatorluftsterilisator-- DampfschrankDampfschrank-- MarkierungsstiftMarkierungsstift-- SchSchüüttelinkubatorttelinkubator-- AnaerobiertopfAnaerobiertopf-- Div. EinmalgerDiv. Einmalgeräätete
aerobaerob
anaerobanaerob
LaborausstattungLaborausstattung
-- PetrischalenPetrischalen-- PipettenPipetten-- PipettierhilfePipettierhilfe-- RRööhrchen/Eprouvettenhrchen/Eprouvetten-- EprouvettenverschlEprouvettenverschlüüssesse-- ImpfImpföösensen-- ImpfnadelImpfnadel-- DrigalskispatelnDrigalskispateln-- Schere, StanleymesserSchere, Stanleymesser----
ImpfImpföösese n. Bast, 2001n. Bast, 2001
Das MikroskopDas Mikroskop
Bast, 2001Bast, 2001
Strahlengang Strahlengang eineseines
LichtmikroskopsLichtmikroskops
Brock, 2001Brock, 2001
Aufbau des MikroskopsAufbau des Mikroskops
Optischer TeilOptischer Teil
Mechanischer TeilMechanischer Teil
BeleuchtungBeleuchtung
OkulareOkulareObjektiveObjektiveKondensorKondensorIrisblendeIrisblende(Filter)(Filter)
ObjekttischObjekttischTubusTubusGrobGrob--/Feintrieb/FeintriebStativStativ
LampeLampe(Spiegel)(Spiegel)BeleuchtungsstBeleuchtungsstäärkerke--reglerregler
Erstes serienreifesErstes serienreifesZeissZeiss--MikroskopMikroskop
QualitQualitäätskriterien ftskriterien füür Mikroskoper Mikroskope
VergrVergrößößerungsvermerungsvermöögengen
AuflAuflöösungsvermsungsvermöögengen
ZeichnungsvermZeichnungsvermöögengen
GesamtvergrGesamtvergrößößerung:erung:OkularvergrOkularvergrößößerung x Objektivvergrerung x Objektivvergrößößerungerung
Numerische Numerische AperturApertur
Korrektur von LinsenfehlernKorrektur von Linsenfehlern
Numerische Numerische AperturApertur
-- MaMaßß ffüür die Qualitr die Qualitäät eines Objektivst eines Objektivs-- je hje hööher desto besser/empfindlicherher desto besser/empfindlicher
A = n x A = n x sinsin uu
n....Brechungsexponentn....Brechungsexponentu....halberu....halber ÖÖffnungswinkel derffnungswinkel der
ObjektivfrontlinseObjektivfrontlinse
100 / 1,25100 / 1,25ÖÖLL
uu
Wo liegt die Grenze der AuflWo liegt die Grenze der Auflöösung ?sung ?
Bei welchem Minimalabstand zwischen zweiBei welchem Minimalabstand zwischen zweiObjekten kann ich diese beiden noch als Objekten kann ich diese beiden noch als
getrennt erkennen ?getrennt erkennen ?
AuflAuflöösungsformel nach Abbsungsformel nach Abbéé::
e = e = λλ / 2A/ 2A
.....Wellenl.....Wellenläänge der Lichtquellenge der Lichtquelle
.....Numerische .....Numerische AperturAperturλλAA
100 / 1,25100 / 1,25ÖÖLL Verwendung von Verwendung von ImmersionsImmersionsööll::
-- LichtbrechungLichtbrechung-- SchSchäärfere Abbildungrfere Abbildung-- n = 1.515n = 1.515
Trockene Objektive Trockene Objektive ÖÖlimmersionsobjektivelimmersionsobjektive
MikroskopartenMikroskoparten
LichtmikroskopLichtmikroskop
UVUV--MikroskopMikroskop
FluoreszenzmikroskopFluoreszenzmikroskop
NormalkondensorNormalkondensorDunkelfeldkondensorDunkelfeldkondensorPhasenkontrastkondensorPhasenkontrastkondensor
abhabhäängig von der gewngig von der gewäähltenhltenLichtquelleLichtquelle
UV: UV: kein direktes Betrachtenkein direktes Betrachtendes Bildes !des Bildes !
Fotografische EinrichtungenFotografische Einrichtungen
Normales HellfeldNormales Hellfeld--mikroskopmikroskop
PhasenkontrastPhasenkontrast--mikroskopmikroskop
DunkelfeldDunkelfeld--mikroskopmikroskop
Brock, 2001Brock, 2001
SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae
InterferenzphasenkontrastInterferenzphasenkontrast--MikroskopieMikroskopie
LactobacillusLactobacillus acidophilusacidophilusFluoreszenzmikroskopische AufnahmenFluoreszenzmikroskopische Aufnahmen
BacillusBacillus cereuscereus MicrococcusMicrococcus luteusluteusund und BacillusBacillus cereuscereus
BacLightBacLight Inc.Inc.
ElektronenmikroskopieElektronenmikroskopie
-- Sehr hohe AuflSehr hohe Auflöösung (bis ca. 0,1 nm)sung (bis ca. 0,1 nm)-- Untersuchung von ZellstrukturenUntersuchung von Zellstrukturenund Molekund Moleküülenlen
-- Elektronen anstelle von LichtstrahlenElektronen anstelle von Lichtstrahlen-- Magnete anstelle von LinsenMagnete anstelle von Linsen-- Arbeitet unter VakuumArbeitet unter Vakuum-- Spezielle Techniken zur VorbereitungSpezielle Techniken zur Vorbereitungder Proben (der Proben („„DDüünnschnittennschnitte““))
-- ErhErhööhung des Kontrasts durch speziellehung des Kontrasts durch spezielleFFäärbungen (rbungen (OsmiumtetroxidOsmiumtetroxid etc.)etc.)
Bauarten von ElektronenmikroskopenBauarten von Elektronenmikroskopen
TransmissionsTransmissions ––EMEM((TEMTEM))
RasterRaster-- EMEM((REMREM, auch , auch ScanningScanningElectronElectron MicrocopyMicrocopy))
Keine DKeine Düünnschnitte erforderlich,nnschnitte erforderlich,NegativfNegativfäärbung, wenigerrbung, wenigeraufwaufwäändigndig
PrPrääparat mit dparat mit düünnem Schwernnem Schwer--metallfilmmetallfilm (z.B. Gold) (z.B. Gold) üüberzogen,berzogen,Elektronenstrahl tastet OberflElektronenstrahl tastet Oberfläächecheab, reflektierte, gestreute Elektronen ab, reflektierte, gestreute Elektronen gesammelt, Bildgesammelt, Bild
System eines ElektronenmikroskopsSystem eines Elektronenmikroskops
ElektronenElektronen--mikroskopmikroskop
ElektronenmikroskopischeElektronenmikroskopischeAufnahme von FliegenkAufnahme von Fliegenkööpfenpfen
BakteriophagenBakteriophagen
Herstellung mikroskopischer PrHerstellung mikroskopischer Prääparateparate
LebendprLebendprääparateparate
FFäärbeprrbeprääparateparate
FeuchtkammerprFeuchtkammerprääparateparate
-- DeckglasprDeckglasprääparatparat-- HHäängender Tropfenngender Tropfen-- ZZäählkammerprhlkammerprääparatparat
-- Direkte FDirekte Fäärbungrbung-- Indirekte FIndirekte Fäärbungrbung-- GramfGramfäärbungrbung-- EndosporenfEndosporenfäärbungrbung-- KapselfKapselfäärbungrbung-- GeiGeißßelfelfäärbungrbung-- SSääurefestigkeitsfurefestigkeitsfäärbungrbung
-- Darstellung von Darstellung von SchimmelpilzenSchimmelpilzen
MikroskopierutensilienMikroskopierutensilien
-- MikroskopMikroskop-- ObjekttrObjektträägerger-- DeckglDeckglääserser-- PinzettenPinzetten-- ImpfImpfööse/se/--nadelnadel-- ImmersionsImmersionsööll-- WundbenzinWundbenzin-- WatteWatte-- FilterpaierFilterpaier-- bestbestäändiger Filzstiftndiger Filzstift-- VaselineVaseline-- BunsenbrennerBunsenbrenner
FFäärbelrbelöösungensungen::z.B.: z.B.: GramfGramfäärberbe--KitKit
MethylenblauMethylenblau--LLöösungsungetc.etc.
LebendprLebendprääparatparat
-- Orientierende SchnelltestOrientierende Schnelltest-- natnatüürliche Zellform, rliche Zellform, --verbverbäändende-- Beweglichkeit erkennbarBeweglichkeit erkennbar-- spezielle spezielle mikroskopmikroskop. Techniken anwendbar. Techniken anwendbar(z.B. Phasenkontrastmikroskopie)(z.B. Phasenkontrastmikroskopie)
Normales DeckglasprNormales Deckglasprääparat Hparat Häängender Tropfenngender Tropfen
HohlschliffobjekttrHohlschliffobjektträägerger
Vorbereitung: HVorbereitung: Häängender Tropfenngender Tropfen
BakteriensuspensionBakteriensuspensionauf Deckglauf Deckglääschenschen
100
Öl
Objektiv
Immersionsöl
DeckglasHÄNGENDER TROPFEN
Vaseline
Kreuztisch
Kondensor / Licht
Auge
Mikroskopieren des HMikroskopieren des Häängenden Tropfensngenden Tropfens
WK 2002WK 2002s.as.a. 3. Einheit. 3. Einheit
Skizze eines ZSkizze eines Zäählkammerprhlkammerprääparatsparats
MethylenblauMethylenblau--FFäärbeprrbeprääparatparat
-- Rasche und einfache DurchfRasche und einfache Durchfüührunghrung-- Erkennen morphologischer KriterienErkennen morphologischer Kriterien(Zellform, Zellverband)(Zellform, Zellverband)
--
---- ++
++++
++ ++ ++ ++
++
++
++
Ladung der Ladung der BakterienzelleBakterienzelleFarbstoffmolekFarbstoffmoleküülele
GramfGramfäärbungrbung
Gramfärbung
Bacillus subtilis
Pseudomonas fluorescens
Staphylococcus xylosus
Details Details s.as.a. 2. Einheit. 2. Einheit
EndosporenfEndosporenfäärbungrbung
-- Nachweis bakterieller SporenNachweis bakterieller Sporen-- Erkennen der Lage der Erkennen der Lage der EndosporeEndospore-- Beschaffenheit des Beschaffenheit des SporangiumsSporangiums-- verschiedene Rezepturenverschiedene Rezepturen
Bacillus licheniformis
EndosporenEndosporen
SSääurefestigkeitsfurefestigkeitsfäärbungrbung
-- CarbolfuchsinfCarbolfuchsinfäärbungrbung-- ZiehlZiehl--NeelsenNeelsen--FFäärbungrbung-- TBC/MycobakterienTBC/Mycobakterien--DiagnostikDiagnostik
M. M. tuberculosistuberculosis
FeuchtkammerprFeuchtkammerprääparatparat
-- Kultivierung von SchimmelpilzenKultivierung von Schimmelpilzenin feuchtem Milieuin feuchtem Milieu
PetrischalePetrischale
Befeuchtetes FilterpapierBefeuchtetes Filterpapier
ObjekttrObjektträägerger
ParaffinParaffin
Festes NFestes Näährmediumhrmedium
Wachsender SchimmelWachsender Schimmel
PenicilliumPenicillium sp.sp.