Kullanım Talimatları - GBO · diagnósti-ca in vitro Limitación de tempera-tura Contenido suficiente para ensayos irritante Código de lote Nota im-portante it Non riutilizza-bile

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti

Kullanım Talimatları

Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040)8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050)

Yalnızca profesyonel laboratuvar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir Revizyon 00 / Şubat 2011

Greiner Bio-One GmbH Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel No: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience

IVD

Alm

anya

'da

Üre

tilm

iştir

Xn

R 3

6/37

/38-

42,

S 2

2-24

-26-

37/3

9

18°

25°

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - Kullanım TalimatlarıRevizyon 00 / Şubat 2011

2

SEMBOLLER SÖZLÜĞÜ

en Do not reuse

Use by Consult Instruc-tions for Use

Catalog Number

Manufac-turer

In Vitro Diag-nostic Me-dical Device

Tempe-rature limitation

Contents sufficient for <n> tests

Irritant Batch code

Important Note

de Nicht wieder-verwen-den

Mindes-tens haltbar bis

Vor Gebrauch Anwei-sung lesen

Katalog-nummer

Hersteller In-vitro-Diagnosti-kum

Tempera-turbegren-zung

Inhalt ausrei-chend für <n> Tests

Reizend Chargen-bezeich-nung

Wichtiger Hinweis

fr Ne pas réutiliser

Date limite de conser-vation jusqu’au

Lire les in-structions avant utilisation

Numéro de réfé-rence

Fabricant Produit médi-cal de diagnostic in-vitro

Limite de tempéra-ture

Contenu suffisant pour <n> tests

irritant No de lot Note im-portante

es No utilizar más

A utilizar preferib-lemente antes de

Antes de usar, lea las instruccio-nes

Número de catálo-go

Fabri-cante

Producto medicinal de diagnósti-ca in vitro

Limitación de tempera-tura

Contenido suficiente para <n> ensayos

irritante Código de lote

Nota im-portante

it Non riutilizza-bile

Da utilizzare entro e non oltre

Leggere le istruzi-oni prima dell’uso

Numero catalogo

Produt-tore

Dispositivo medico- diagnosti-co in-vitro

Limiti di tempera-tura

Contenuto sufficiente per <n> test

Irritante Codice del lotto

Nota im-portante

pt Não utilz-ar mais

A utilizar preferí-velmente antes de

Antes de usar, leia as instru-ções

Número de catálo-go

Fabri-cante

Producto medicinal de diagnósti-ca in vitro

Limitação de tempera-tura

Conteúdo suficiente para <n> ensaios

irritante Código do lote

Aviso im-portante

nl Niet opnieuw gebruiken

Tenminste houdbaar tot

Gebruik-saanwij-zing lezen

Catalo-gusnum-mer

Fabrikant In vitro diag-nostisch medisch product

Tempera-tuurbeper-king

Voldoen-de inhoud voor <n> tests

Irriterend Lot nummer

Belangri-jke op-merking

da Må ikke genbru-ges

Anvendes senest

Læs brugsan-visningen

Katalog-nummer

Producent In vitro meskdicin doag-nose-apparat

Tempera-turbegra-ensær

Indehol-der nok til <n> test

Lokalirri-terende

Lotnum-mer

Vigtig henvis-ning

sv Får ej återan-vändas

Sista för-bruknings-dag

Läs bruk-sanvisnin-gen före använd-ning

Katalog-nummer

Tillverkare In vitro- medicinsk doag-nostisk apparatur

Tempe-ratur-be-gränsning

Innehållet räcker till <n> tester

irriterande Lot nummer

Viktigt medde-lande

pl Nie stosować ponownie

Termin zydatności

Przed użyciem przeczytać instrukcję

Numer katalo-gowy

Producent Diag-nostykain vitroProdukt yw

Ograni-czenie tempera-tury

Zawartość wystarcza na <n> testów

drażniący Kod partii Ważne

no Må ikke brukes flere ganger

holdbar til Les bruksan-visning før bruk

katalog-nummer

produsent in vitro-di-agnostisk medisinsk utstyr

tempe-raturbe-grensning

Innhold tilstrekke-lig for <n> tester

irriterende batch nr. Viktig merknad

el Προϊόν μίας χρήσης

Χρήση έως

Συμβου-λευτείτε τις Οδηγίες χρήσης

Αριθμός καταλόγου

Κατασκευ-αστής

In Vitro διαγνωστι-κή ιατρική συσκευή

Περιο-ρισμοί θερμοκρα-σίας

περιέχει επαρκές υλικό για < n > δοκι-μασίες

Ερεθιστικό Κωδικός παρτίδας

Σημαντική σημείωση

tr Yeniden ullanmayın

Son kullanma tarihi:

Kullanma-dan önce talimatı okuyun

Katalog numarası

Üretici firma

In vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü

Sıcaklık sınırlaması

İçeriği <n> test için yeter-lidir

Tahriş edici

Parti kodu Önemli Not

!


3

İÇİNDEKİLER

1. KİTİN İÇERİĞİ ............................................................................................................. 52. GEREKEN SARF MALZEMELERİ VE EKİPMANLAR ............................................... 6

2.1 Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040) ................................................................................62.2 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050) ....................................................................................7

3. NAKLİYE VE SAKLAMA ............................................................................................. 84. GÜVENLİK TALİMATLARI .......................................................................................... 85. ATIKLARIN YOK EDİLMESİ ....................................................................................... 96. GİRİŞ ......................................................................................................................... 10

6.1 Kullanım amacı .............................................................................................................................106.2 Yanlış kullanım .............................................................................................................................106.3 Numune materyali ........................................................................................................................ 116.4 DNA saflaştırma işleminin temel prensibi .................................................................................. 11

7. oCheck® İŞ AKIŞI TALİMATLARI ............................................................................. 127.1 Genel talimatlar ...........................................................................................................................127.2 Oda ayrımı .....................................................................................................................................127.3 Uyarılar ve önlemler .....................................................................................................................13

7.3.1 Kontaminasyonun önlenmesi ..............................................................................................137.3.2 Genel önlemler ....................................................................................................................137.3.3 Güvenli çalışma ..................................................................................................................14

8. TEK KOLON PREPARASYONU (Kat. No. 515 040) ................................................ 158.1 Çalışma solüsyonlarının preparasyonu ve saklama koşulları .................................................158.2 Numune preparasyonu ................................................................................................................16

8.2.1 PapilloCheck® ve PapilloCheck® high-risk için numune preparasyonu .............................168.2.2 PelvoCheck® CT/NG için numune preparasyonu ...............................................................16

8.3 Standart protokol .........................................................................................................................178.3.1 Preparasyon ........................................................................................................................178.3.2 Ön Lizis ...............................................................................................................................178.3.3 Lizis .....................................................................................................................................178.3.4 DNA bağlama şartlarını ayarlama .......................................................................................188.3.5 DNA Bağlama .....................................................................................................................188.3.6 Spin Kolonları Yıkama ........................................................................................................188.3.7 Spin Kolonları Kurutma .......................................................................................................198.3.8 DNA elüsyonu .....................................................................................................................19


4

9. KURULUM VE ÇALIŞTIRMA KILAVUZU oCheck® VAC SET VE oCheck® VAC PUMP ............................................................ 20

9.1 Ürün İçeriği ...................................................................................................................................209.1.1 oCheck® VacSet ..................................................................................................................209.1.2 oCheck® VacPump ..............................................................................................................21

9.2 oCheck® VacSet'in Montajı ..........................................................................................................229.2.1 DNA bağlama ve yıkama için kurulum ................................................................................229.2.2 DNA elüsyonu için kurulum .................................................................................................23

9.3 oCheck® VacPump'ın Montajı ......................................................................................................249.4 Vakumu kurma ..............................................................................................................................249.5 Vakum uygulama ..........................................................................................................................249.6 Manifoldu havalandırma ..............................................................................................................25

10. 8 KOLON PREPARASYONU (Kat. No. 515 050) ..................................................... 2510.1 Çalışma solüsyonlarının preparasyonu ve saklama koşulları ................................................2510.2 Numune preparasyonu ...............................................................................................................26

10.2.1 PapilloCheck® ve PapilloCheck® high-risk için numune preparasyonu ...........................26

10.3 Standart protokol ........................................................................................................................2710.3.1 Preparasyon ........................................................................................................................2710.3.2 Ön Lizis ...............................................................................................................................2710.3.3 Lizis .....................................................................................................................................2710.3.4 DNA bağlama şartlarını ayarlama .......................................................................................2810.3.5 DNA Bağlama .....................................................................................................................2810.3.6 Bağlama Şeritlerini Yıkama .................................................................................................3010.3.7 Bağlama Şeritlerini Kurutma ...............................................................................................3110.3.8 DNA Elüsyonu .....................................................................................................................31

11. SORUN GİDERME .................................................................................................... 3312. TEKNİK YARDIM ....................................................................................................... 3513. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ ................................................................................. 3514. KISA PROTOKOLLER .............................................................................................. 35

14.1 Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040) için kısa protokol ...............................................3514.2 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050) için kısa protokol...................................................37


5

1. KİTİN İÇERİĞİ

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti Adı

Tek Kolon Preparasyonu

(Kat. No. 515 040)

8 Kolon Preparasyonu

(Kat. No. 515 050)

Tampon L1 20 ml 20 ml

Tampon L2 12 ml 24 ml

Reaktif L3 3 ml 6 ml

Tampon W1 30 ml 75 ml

Tampon W2 (konsantre) 14 ml 50 ml

Tampon E 15 ml 50 ml

Proteinaz K (liyofilize) 30 mg 75 mg

Proteinaz Tampon PKB 1,8 ml 3,6 ml

Taşıyıcı RNA (liyofilize) 0,3 mg 0,3 mg

Spin Kolonlar 50 -

Toplama Tüpleri 250 -

Bağlama Şeritleri - 12

Kağıt Yaprağı - 10

Tampon L4 için Etiket 1 1

Kılavuz Talimatlarını Yükleme 1 1

BUF L1

BUF L2

REAG L3

BUF W1

BUF W2

BUF E

BUF L4

Proteinase K

Carrier RNA

Spin Columns

Collection Tubes

Binding Strips

Paper Sheet

Proteinase BUF PKB


6

2. GEREKEN SARF MALZEMELERİ VE EKİPMANLAR

2.1 Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040)

Sarf Malzemeleri Greiner Bio-One Kat. No. Miktar (parça)

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti – Tek Kolon Preparasyonu 515 040 50 preparasyon

Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu

0,5-10 µl filtre uçları 0,5-20 µl filtre uçları 10-100 µl filtre uçları10-200 µl filtre uçları100-1000 µl filtre uçları

765 288774 288772 288739 288750 288

9696969660

Gereken ek sarf malzemeleri

• Lizis adımları için emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpü• Etanol p.a. ≥ %99,8• Tek kullanımlık eldivenler

Gereken ek ekipmanlar

• 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpleri ve 11.000 g için uygun mikrosantrifüj• Vorteks mikser• 70 °C ve 56 °C inkübasyonda kullanılacak 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpleri için uygun termoblok, su banyosu veya

termomikser• 1-1000 μl arasında değişen mikropipetler• Atık kabı• Süreölçer


7

2.2 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050)

Sarf Malzemeleri Greiner Bio-One Kat. No. Miktar (parça)

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti – 8 Kolon Preparasyonu 515 050 12 x 8 preparasyon

Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu

0,5-10 µl filtre uçları 0,5-20 µl filtre uçları 10-100 µl filtre uçları10-200 µl filtre uçları100-1000 µl filtre uçları

765 288774 288772 288739 288750 288

9696969660

PCR tüpü 8'li strip8'li tüp strip için başlık stripiTekli PCR tüpleri

673 210373 270671 201

125125500

Ekipman Greiner Bio-One Cat. No. Miktar (parça)

oCheck® VacSet 863 080 1

oCheck® VacPump 863 070 1

Gereken ek sarf malzemeleri

• Lizis adımları için emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpü• Çok kanallı pipet rezervuarı (tek kullanımlık reaktif rezervuarları), hacimler: 25 ve 100 ml • 8 kanallı pipet için pipet uçları (1200 μl hacim için yeterli)• Etanol p.a. ≥ %99,8• Tek kullanımlık eldivenler

Gereken ek ekipmanlar

• 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpleri ve 11.000 g için uygun mikrosantrifüj• Vorteks mikser• 70 °C ve 56 °C inkübasyonda kullanılacak 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpleri için uygun termoblok, su banyosu veya

termomikser• 1-1000 μl arasında değişen mikropipetler• Büyük hacimler için (50 ila 1200 μl) 8 kanallı multipipet• Atık kabı• Süreölçer• PCR rafı


8

3. NAKLİYE VE SAKLAMA

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, oda sıcaklığında saklanır ve nakledilir. Hazırlanan çalışma solüsyonlarının saklama koşulları için bkz. bölüm 8.1 ve 10.1.

4. GÜVENLİK TALİMATLARI

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kitinin aşağıdaki bileşenleri tehlikeli maddeler içerir.

Eldiven ve koruyucu gözlük takın ve bu bölümde yer alan talimatlara uyun.

Bileşen TehlikeliMaddeler

TehlikeSembolü

Riskİfadeleri

Riskİfadeleri

Güvenlik İfadeleri

Tampon L2 Guanidin hidroklorür

Yutulması zararlıdır, Gözleri ve cildi tahriş

ederR 22-36/38

Tampon W1Guanidin

hidroklorür + izopropanol < %25

Yanıcıdır, Yutulması zararlıdır, Gözleri ve cildi tahriş

eder

R 10-22-36/38 S7-16-25

Proteinaz K Proteinaz K,liyofilize

Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder,

Solunduğunda hassaslaşmayaneden olabilir

R 36/37/38-42 S 22-24-26-36/37

* Her bir şişe miktarının 125 g veya ml'nin altında olduğu durumlarda tehlike etiketine gerek yoktur (67/548//EEC Md. 25, 1999/45/EC Md. 12 ve German GefStoffV § 20 (3) ve TRGS 200 7.1 uyarınca). Daha fazla bilgi için bkz. Güvenlik Veri Formu.

Risk İfadeleriR10 YanıcıdırR22 Yutulması zararlıdırR 36/37/38 Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş ederR 36/38 Gözleri ve cildi tahriş ederR 42 Solunduğunda hassaslaşmaya neden olabilir

Güvenlik İfadeleriS7 Kabı sıkıca kapalı tutunS16 Tutuşma kaynaklarından uzak tutun - Sigara içilmezS 22 Tozu solumayınS 24 Cilde temasından kaçınınS 25 Gözlere temasından kaçınınS 26 Gözlerle temas etmesi durumunda gözleri derhal bol suyla yıkayın ve tıbbi yardım alınS 36/37 Uygun koruyucu giysi ve eldiven kullanın

Bu ürüne ait güncel Güvenlik Veri Formu, Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir:www.gbo.com/bioscience/biochips_download

*

*

*


9

5. ATIKLARIN YOK EDİLMESİ

Tampon L2 ve W1 içindeki guanidin hidroklorür, ağartma maddesiyle birleştiğinde son derece reaktif bileşenler oluşturabilir. Numune preparasyon atığına ağartma maddesi veya asidik solüsyonlar doğrudan eklenmemelidir.

Sıvı atıkların bulaşıcı kalıntı maddelerle kirlenmesi çok düşük bir ihtimal olmakla birlikte tamamen imkansız değildir. Bu nedenle sıvı atık bulaşıcı olarak kabul edilmeli ve yerel güvenlik düzenlemelerine uygun şekilde alınıp imha edilmelidir. Lütfen federal ve yerel yönetimlerin yanı sıra eyaletlerin atık bertarafıyla ilgili kılavuz ilkelerine dikkatle uyun.


10

6. GİRİŞ

6.1 Kullanım amacı

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 515 040 veya Kat. No. 515 050) bir in vitro tıbbi tanı kitidir ve oCheck® ürün serisi ile yapılacak denemelerle analiz edilmek üzere insan kaynaklı numuneler ile yapılacak DNA preparasyonunda kullanım içindir.

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti değişkenleri tarafından kullanılan nükleik asit izolasyon metodolojisi, aşağıda yer alan kitlerle yapılacak doğrudan işlem sonrası analiz için uygun DNA üretir:

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040)• PapilloCheck® (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 060)• PapilloCheck® high-risk (Greiner Bio-One; Kat. No. 505 060)• PelvoCheck® CT/NG (Greiner Bio-One; Kat. No. 504 002)

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050)• PapilloCheck® (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 060)• PapilloCheck® high-risk (Greiner Bio-One; Kat. No. 505 060)

Validasyon tamamlanana kadar PelvoCheck® CT/NG (Greiner Bio-One; Kat. No. 504 002) deneyi ile yapılacak işlem sonrası analiz için DNA izole etmek amacıyla oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonunun kullanılması tavsiye edilmez.

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, yalnızca oCheck® ürün serisi (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya) ile yapılacak deneylerle birlikte kullanıma yöneliktir. Bu ürün serilerindeki kullanım talimatlarında oCheck® DNA Ekstraksiyon Kitini kullanma yöntemleri belirtilmektedir.

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, İn Vitro Tıbbi Tanı Cihazı Direktifinin (98/79/EC) koşullarına uyduğundan dolayı CE uyum işareti taşımaktadır.Ürün, YALNIZCA moleküler biyolojik teknikler konusunda uzmanlaşmış teknisyenler ve doktorlar gibi profesyonel kullanıcılar tarafından kullanma amaçlıdır.

6.2 Yanlış kullanım

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, KESİNLİKLE CarnoCheck® (Greiner Bio-One), ParoCheck® (Greiner-Bio-One) veya oCheck® ürün serisinden olmayan herhangi bir ürünle birlikte kullanılmamalıdır.


11

6.3 Numune materyali

PapilloCheck® (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 060) ve PapilloCheck® high-risk (Greiner Bio-One; Kat. No. 505 060) işlem sonrası uygulama için oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, aşağıdaki numune toplama sistemlerinden biriyle toplanmış insan servikal smear'lerinden viral ve insan genomik DNA'sı ekstrakte etmek için tasarlanmış ve test edilmiştir:

• PapilloCheck® Toplama Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 070)• PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, ABD)• SurepathTM (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD)• STMTM (Qiagen, Hilden, Almanya)

PelvoCheck® CT/NG (Greiner Bio-One; Kat. No. 504 002) deneyi işlem sonrası uygulama için oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, aşağıdaki toplama sistemlerinden biri kullanılarak insan idrar örneklerinden elde edilen bakteriyel ve insan genomik DNA'sını ekstrakte etmek için valide edilmiştir:

• PelvoCheck® Toplama Kiti SAFE (Greiner Bio-One; Kat. No. 453 100)• PelvoCheck® Toplama Kiti STRAW (Greiner Bio-One; Kat. No. 453 101)

Diğer numune toplama sistemleri valide edilmemiştir ve oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti ile kullanılmamalıdır.

6.4 DNA saflaştırma işleminin temel prensibi

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, insan kaynaklı numunelerden elde edilen viral, bakteriyel ve insan genomik DNA'sının saflaştırması için tasarlanmıştır. Numune materyali, Proteinaz K ve Tampon L1 eklenerek hızlı ve etkili bir şekilde lize edilir. Lizis tamponu ve etanol, nükleik asitlerin Bağlanma Kolonunun silika membranına bağlanması için uygun koşulları oluşturur. Taşıyıcı RNA, düşük konsantrasyonlu viral, bakteriyel ve genomik DNA'nın bağlanması ve geri kazanımını güçlendirir. Tuzlar, metabolitler ve çözünebilir makromoleküler hücresel komponentler gibi kontaminant unsurlar (potansiyel PCR inhibitörleri), etanolik yıkama tamponlarıyla yıkama adımları sırasında ortadan kaldırılır. Saf bakteriyel, viral ve insan genomik DNA'sı son olarak, düşük iyonik güçteki koşullarda, hafif alkalin elüsyon tamponuna elüe edilir. Saflaştırma işlemi sonrasında DNA, oCheck® ürün serisi ile elde edilen deneylerle yapılacak doğrudan analiz için uygun bir solüsyon haline gelir.


12

!

7. oCheck ® İŞ AKIŞI TALİMATLARI

7.1 Genel talimatlar

Aşağıdaki talimatlar, moleküler biyolojide şu an kullanılmakta olan en son tekniklerin uygulanmasıyla yapılan laboratuvar deneyimlerine dayanmaktadır ve PCR tabanlı yöntemler açısından maksimum güvenliği sağlamayı hedeflemektedir. oCheck® DNA Ekstraksiyon Kitini, oCheck® ürün serisi ile elde edilen deneylerle saflaştırılmış DNA'nın ileri işlem sonrası analiziyle birlikte kullanırken uygun önlemler alınmalıdır.

DNA esktraksiyonu, amplifikasyonu ve tespiti gibi moleküler biyoloji proseslerinde genel olarak uygun niteliklere sahip personel görev almalıdır. Ayrıca, numunelerdeki nükleik aside ait amplifikasyon ürünleri tarafından kontaminasyon veya degradasyon oluşumu nedeniyle elde edilebilecek hatalı sonuçlardan kaçınmak için, net ve iyi yapılandırılmış bir iş akışı gereklidir. Bunu sağlamak için, ekstraksiyon ve amplifikasyon alanları ayrı olmalıdır.

Bir amplifikasyon ürünü, yalnızca ekstraksiyon için ayrılmış olan alana kesinlikle sokulmamalıdır. Her iki alanda da ayrı ekipman, sarf malzemeleri, laboratuvar önlükleri ve eldivenler bulunmalıdır. Ekstraksiyon için ayrılmış olan alana ait laboratuvar önlükleri, eldivenler veya ekipmanlar, kesinlikle amplifikasyon için ayrılmış olan alana aktarılmamalıdır.

7.2 Oda ayrımı

Şekil 1 bir laboratuvarın nasıl 3 farklı bölüme ayrılabileceğine yönelik bir örnek göstermektedir. Bu odalardan biri yalnızca DNA ekstraksiyonu için, diğeri PCR reaksiyonlarının kurulması ve çalıştırılması için, sonuncusu ise hibridizasyon ve analiz için kullanılır. Her bir oda, numunelerin kontaminasyonunu önlemek amacıyla, yalnızca belirtilen uygulama veya teknik için kullanılmalıdır. Ekipmanların ve sarf malzemelerinin alanlar arasında yanlışlıkla yer değiştirmesini önlemek için renk kullanılması yararlı olabilir.

Ekipmanlar ve sarf malzemeleri, farklı laboratuvar odaları ve alanları arasında yer değiştirmemelidir. Bu nedenle, ekipmanların ve sarf malzemelerinin çift olarak temin edilmesine dikkat edilmelidir.

Şekil 1: oCheck® iş akışında oda ayrımıOda 1: DNA ekstraksiyonu, Oda 2: PCR reaksiyonunun kurulması ve reaksiyon karışımının temiz bir tezgahta ayrılması; DNA şablonunun eklenmesi için ayrı bir alan; Oda 3: Hibridizasyon ve analiz

Oda 1 Oda 2 Oda 3


13

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti ile yapılacak olan tüm DNA ekstraksiyon prosedürü, DNA ekstraksiyon odası olan oda 1'de uygulanmalıdır. Bu odadan çıktıktan sonra, laboratuvar önlükleri değiştirilmelidir. oCheck® iş akışında, DNA ekstraksiyonu, kontaminasyona en duyarlı olan prosestir, bu nedenle bu belgede yer alan talimatlara kesinlikle uyulması son derece önemlidir. Buna ek olarak, 7.3.1 bölümünde yer alan kontaminasyonu önleme kılavuzlarına da uyulmalıdır.

Oda 2'de PCR reaksiyon karışımı kurulur ve temiz bir tezgah üzerinde ayrılır. Oda 1'de ekstrakte edilen DNA, oda 2'de tahsis edilecek ayrı bir alanda eklenmelidir. Bu odadan çıktıktan sonra laboratuvar önlükleri değiştirilmelidir.

Hibridizasyon reaksiyonu ve yıkama adımları, üçüncü laboratuvar odasında yapılır. Ayrıca, CheckScannerTM ile CheckReportTMYazılımı da, oCheck® ürün serisi ile yapılacak deneylerin nihai analizi için oda 3'te kurulur.

7.3 Uyarılar ve önlemler

7.3.1 Kontaminasyonun önlenmesi

• Laboratuvar önlükleri: Prosedürlerin uygulanması sırasında laboratuvar önlükleri giyilmelidir ve her bir laboratuvar odası için farklı laboratuvar önlük setleri bulunmalıdır.

• Eldivenler: her bir analiz adımı sırasında eldiven takılmalı ve her farklı adımda eldivenler değiştirilmelidir.

• Laboratuvar temizliği: Çalışma yeri, çalışmadan önce ve sonra, uygun temizlik solüsyonlarıyla dekontamine edilmelidir.

• Reaksiyon tüpleri: Reaksiyon tüpü kapağının içine kesinlikle dokunulmamalıdır. Çapraz kontaminasyondan kaçınmak için, her seferde yalnızca bir tüp açılmalıdır. Kontaminasyonu önlemek için, lizis adımlarında emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı reaksiyon tüpleri kullanılmalıdır.

• Uygun mikropipet filtre uçları kullanılmalıdır (steril, DNase, RNase ve insan DNA'sı içermeyen). Sıvı transferleri arasında pipet uçları daima değiştirilmelidir.

7.3.2 Genel önlemler

• Teslim alındığında oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti bileşenlerini hasar bakımından kontrol edin. Bileşenlerden biri hasar görmüşse (örn. tampon şişeleri), yerel Greiner Bio-One distribütörünüze başvurun. Hasar görmüş kit bileşenlerini kullanmayın. Bu bileşenlerini kullanılması, kit performansını zayıflatabilir.

• Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın. • oCheck® DNA Ekstraksiyon Kitini, son kullanma tarihinden sonra kullanmayın.• Farklı serilere ait reaktifleri karıştırmayın.• Yalnızca kitle birlikte sağlanan ve üretici tarafından tavsiye edilen reaktifleri/ekipmanları kullanın.• Pipetler, su banyosu ve termoblok için düzenli olarak kalibrasyon ve kontrol yapılmalıdır.• Mikrolitre aralığına küçük miktarlarda sıvı pipetlemek zordur. Bu nedenle, mikropipetlerle

olabildiğince doğru bir şekilde pipetlemeye dikkat edin.• Tüm santrifüj adımları, oda sıcaklığında (18-25 °C) gerçekleştirilmelidir.• Kullanılmayan reaktifler ve atık materyal, federal yönetim ve eyalet düzeyindeki kılavuz ilkelere

uygun olarak bertaraf edilmelidir.


14

7.3.3 Güvenli çalışma

• Bu kit yalnızca in vitro tanılarda kullanıma yöneliktir ve yalnızca in vitro tanılarda laboratuvar uygulama deneyimine sahip eğitimli personel tarafından kullanılmalıdır.

• Solüsyonları kesinlikle ağzınızla pipetlemeyin.• Çalışma alanlarında yiyecek ve içecek bulundurmayın, sigara içmeyin veya kozmetik ürünler

kullanmayın.• İnsanlara bulaşma potansiyeli taşıyan maddeler içeren biyolojik numunelerle işlem yaparken

dikkatli olun. Bulaşma potansiyeline sahip maddelerden enfeksiyon alma riskini azaltmak için, numuneler lize edilene kadar, laminar hava akımı şartları altında çalışmanız tavsiye edilir. Tüm biyolojik numuneleri, enfekte edici ajanlar taşıma kapasiteleri bulunuyormuş gibi kabul ederek kullanın ve bertaraf edin. Biyolojik numunelere doğrudan temas etmekten kaçının, bu numuneleri sıçratmayın ve püskürtmeyin.

• Numuneleri ve reaktifleri kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın.• İnsan numuneleriyle çalışırken daima laboratuvar önlüğü giyin, eldiven takın ve koruyucu gözlük

kullanın. Bu ürüne ait Güvenlik Veri Formunun güncel sürümü Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir: www.gbo.com/bioscience/biochips_download


15

8. TEK KOLON PREPARASYONU (Kat. No. 515 040)

8.1 Çalışma solüsyonlarının preparasyonu ve saklama koşulları

Tüm kit komponentleri, oda sıcaklığında (18-25 °C) saklanmalıdır. Komponentler, üretildikten sonra iki yıl süreyle stabildir.

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti protokolüne başlamadan önce, aşağıdaki solüsyonları hazırlayın:

1. Proteinaz K solüsyonu: Kitin ilk kullanımından önce, liyofilize edilmiş Proteinaz K'nın çözünmesi için 1,35 ml Proteinaz Tamponu (PKB) ekleyin. Solüsyonu alikuotlara bölün ve 6 aya kadar -20°C'de saklayın. Tekrar dondurmayın.

2. Tampon W2: Tampon W2 konsantratına 56 ml etanol (p.a. ≥ %99,8) ekleyin. Şişenin etiketine güncel tarihi not edin. Tampon W2, oda sıcaklığında (18-25 °C) bir yıla kadar stabildir.

3. Tampon L4: Tampon L2'yi Reaktif L3'e tamamen aktarın ve iyice karıştırın. Şişeye kitle birlikte verilen L4 etiketini uygulayın. Şişenin etiketine güncel tarihi not edin. Elde edilen Tampon L4, oda sıcaklığında (18-25 °C), bir yıla kadar stabildir..

4. Taşıyıcı RNA solüsyonu: Liyofilize edilen Taşıyıcı RNA'nın çözünmesi için 900 μl Tampon L1 ekleyin. Çözünen Taşıyıcı RNA’yı alikuotlara ayırın (örn. 12 ekstraksiyon için 35 ml’lik alikuotlar). Çözünen Taşıyıcı RNA solüsyonunu, -20 °C'de saklayın. Tekrar dondurmayın! Kullanılmış flakonlar çözündüklerinde imha edilmelidir.

Özellikle düşük sıcaklıklarda saklama sırasında, Tampon L1, L2 veya L4'te beyaz bir çökelti oluşabilir. Bu çökeltiler, kullanımdan önce şişenin 50-70 °C'de inkübe edilmesiyle kolaylıkla çözünebilir.


16

!

8.2 Numune preparasyonu

8.2.1 PapilloCheck® ve PapilloCheck® high-risk için numune preparasyonu

• PapilloCheck® Toplama Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 070)• PreservCyt® toplama ortamı (Hologic, Bedford, MA, ABD)içinde toplanan insan servikal smear numuneleri, doğrudan işlenebilir. • SurepathTM toplama ortamı (BD, Franklin Lakes, NJ ABD) içinde toplanan servikal smear

numuneleri kullanılmadan önce yıkanmalıdır: 250 μl numuneyi, 5 dakika süreyle, 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun ve pelleti 250 μl seyreltilmiş suda yeniden süspansiyon haline getirin.

• STMTM toplama ortamı (Qiagen, Hilden, Almanya) içinde toplanan servikal smear numuneleri,

seyreltilmiş suyla seyreltilmelidir: 100 μl numune + 150 μl seyreltilmiş su.

Genel olarak servikal smear numunesi çok konsantre ise ve zaten agrege olmuşsa, ekstraksiyona başlamadan önce numunenin seyreltilmesi ve homojenize edilmesi gerekir!

Çok seyreltilmiş ve gözle görünür hücreleri göstermeyen servikal smear numuneleri, ekstraksiyon için daha fazla hücre verimi elde etmek amacıyla konsantre edilmelidir. En fazla 1000 μl numuneyi, 5 dakika süreyle, 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun ve pelleti 250 μl seyreltilmiş suda yeniden süspansiyon haline getirin.

Bu konsantrasyon adımı, yalnızca PapilloCheck® Toplama Kiti, PreservCyt® toplama ortamı veya SurepathTM toplama ortamı ile toplanan servikal smear numuneleri için uygulanır. Eğer STMTM toplama ortamı kullanılmışsa, santrifüj yoluyla konsantrasyon elde edilmesi mümkün değildir.

➠ 250 μl numune solüsyonunu, 1,5 ml veya 2 ml'lik reaksiyon tüpüne pipetleyin. Kontaminasyonu önlemek için, lizis adımlarında kullanılan emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı reaksiyon tüplerini kullanın. Her bir DNA ekstraksiyon döngüsündeki tüm DNA izolasyon prosedürünün, bir negatif numune kontrolü kullanılarak valide edilmesi tavsiye edilir.

8.2.2 PelvoCheck® CT/NG için numune preparasyonu • PelvoCheck® Toplama Kiti SAFE (Greiner Bio-One; Kat. No. 453 100)• PelvoCheck® Toplama Kiti STRAW (Greiner Bio-One; Kat. No. 453 101)içinde toplanan insan idrar numuneleri, doğrudan işlenebilir.

➠ 250 μl idrar numunesini, 1,5 ml veya 2 ml'lik reaksiyon tüpüne pipetleyin. Kontaminasyonu önlemek için, lizis adımlarında kullanılan emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı reaksiyon tüplerinin kullanılması tavsiye edilir. DNA ekstraksiyonunu valide etmek için, her bir ekstraksiyon döngüsünde bir negatif numune kontrolü kullanılmalıdır.

17oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - Kullanım TalimatlarıRevizyon 00 / Şubat 2011

!

!

8.3 Standart protokol

8.3.1 Preparasyon

➠ Santrifüjü oda sıcaklığına (18-25 °C) ayarlayın. ➠ Numuneleri bölüm 8.2'ye göre hazırlayın. ➠ Termoblokları veya su banyolarını, sırasıyla 56 °C ve 70 °C'ye ayarlayın. ➠ Elüsyondan önce, elüsyon Tampon E'yi, 70 °C'de inkübe edin. ➠ Çalışma solüsyonlarının bölüm 8.1'e göre hazırlanmasına dikkat edin.

8.3.2 Ön Lizis

➠ 80 μl Tampon L1 ekleyin. ➠ Hazırlanan Taşıyıcı RNA solüsyonundan 2,4 μl ekleyin. ➠ 20 μl Proteinaz K solüsyonu ekleyin. ➠ Kapağı kapatın ve puls vorteks uygulayarak kısa bir süre karıştırın. ➠ En az 30 dakika 56 ºC'de inkübe edin. Numuneleri, bir termo mikser yardımıyla 650 rpm'de

sallayın. Bir termoblok veya su banyosu kullanılıyorsa, numuneleri inkübasyon periyodu süresince arada bir vorteksleyin.

Birçok numune işleniyorsa, Proteinaz K, Tampon L1 ve Taşıyıcı RNA kullanılmadan önce karıştırılmalıdır. Tampon L1 ve Proteinaz K'yı, numunenin eklenmesinden önce 10–15 dakikadan daha fazla kesinlikle karıştırmayın. Proteinaz K, substrat olmadan Tampon L1 içinde kendi kendine parçalanabilir.

8.3.3 Lizis

➠ Kapağın içindeki damlacıkları yok etmek için, reaksiyon tüpünü kısa bir süre santrifüje tabi tutun. ➠ 250 μl Tampon L4 ekleyin. ➠ Kapağı kapatın ve puls vorteks uygulayarak 10 saniye karıştırın. ➠ 15 dakika süreyle 70 ºC'de inkübe edin.

Kapakların kazara açılmasını önlemek için, reaksiyon tüplerinin ağızlarını sıkıca kapatın.

8.3.4 DNA bağlama şartlarını ayarlama

➠ Kapağın içindeki damlacıkları yok etmek için, reaksiyon tüpünü kısa bir süre santrifüje tabi tutun. ➠ Numuneye 300 μl etanol (p.a. ≥ %99,8) ekleyin. ➠ Kapağı derhal kapatın ve puls vorteks uygulayarak 15 saniye karıştırın. ➠ Kapağın içindeki damlacıkları yok etmek için, reaksiyon tüpünü kısa bir süre santrifüje tabi tutun.


!

8.3.5 DNA Bağlama

Kontaminasyonu önlemek için bu adımdan önce yeni eldivenler takın!

➠ Her bir numune için, bir Toplama Tüpü içine bir Spin Kolon yerleştirin. ➠ 450 μl lizatı, Spin Kolon'un içine dikkatlice yerleştirerek 1 dakika süreyle oda sıcaklığında

11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun. Kalan lizatı atmayın! ➠ Tek kullanımlık Toplama Tüpünü atın.


➠ Yeni Toplama Tüpleri hazırlayın ve Spin Kolonları bu tüplere yerleştirin. ➠ Kalan 450 μl lizatı Spin Kolona pipetleyin. ➠ Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun.


➠ Tek kullanımlık Toplama Tüpünü atın Spin Kolonları yeni Toplama Tüplerine yerleştirin.

8.3.6 Spin Kolonları Yıkama

➠ Spin Kolonun içine 500 μl Tampon W1 uygulayın. ➠ Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun. ➠ Tek kullanımlık Toplama Tüpünü atın ve Spin Kolonu yeni Toplama Tüpüne geri koyun. ➠ Spin Kolonun içine 600 μl Tampon W2 uygulayın. ➠ Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun. ➠ Tek kullanımlık Toplama Tüpünü atın ve Spin Kolonu yeni Toplama Tüpüne yerleştirin.

8.3.7 Spin Kolonları Kurutma

➠ Membranı tamamen kurutmak için, oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun.

Etanol izlerini yok etmek için bu adımın uygulanması gereklidir. Tampon W2 içindeki etanol, enzimatik reaksiyonları inhibe eder, bu nedenle DNA elüsyonundan önce tamamen yok edilmelidir.


!

!

8.3.8 DNA elüsyonu

Önceden ısıtılmış (70 °C) Tampon E kullanın!

Pipetleme adımları sırasında sıcaklık kaybını önlemek için, 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüplerinin maksimum 1.300 μl Tampon E ile doldurulması tavsiye edilir (n = 12 numune için yeterlidir).


➠ Spin Kolonu, 1,5 ml'lik temiz bir reaksiyon tüpüne yerleştirin. ➠ Spin Kolonun içindeki membranın merkezine önceden ısıtılmış (70 °C) Tampon E uygulayın. ➠ Kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 1 dakika süreyle inkübe edin. ➠ 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun.

Downstream uygulamalarında izole edilmiş DNA'dan en iyi performansı almak için sağlanan Tampon E ile elüsyon tavsiye edilir. Ekstrakte edilen DNA'yı, -20 °C'de saklayın.oCheck® ürün serisiyle yapılacak deneylerden daha fazla analiz almak için ilgili Kullanım Talimatlarına başvurun (PapilloCheck®, PapilloCheck® high-risk ve PelvoCheck® CT/NG).


20

9. KURULUM VE ÇALIŞTIRMA KILAVUZU oCheck® VAC SET VE oCheck® VAC PUMP

oCheck® Vakum Manifoldu, nükleik asitlerin oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonu kullanılarak manüel olarak hızlı bir şekilde paralel saflaştırılması için tasarlanmıştır. Bu sistem, yüksek kaliteli nükleik asitlerin hızlı bir şekilde eş zamanlı olarak saflaştırılmasını sağlar. Vakum kullanılması sayesinde, zaman alan santrifüj ve aktarma işlemlerinin uygulanmasına gerek kalmaz. oCheck® DNA Ekstraksiyon Kitleri, ultra filtrasyon teknolojisi tabanlıdır ve nükleik asit saflaştırma işlemlerinde hızlı ve kullanışlı bir yol sağlar.

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonunu vakum altında kullanırken, oCheck® VacSet (Kat. No. 863 080) ve oCheck® VacPump (Kat. No. 863 070) ürünlerinden yararlanılması önerilir.

9.1 Ürün İçeriği

9.1.1 oCheck® VacSet

9.1.2

Şekil 2: oCheck® VacSet'in içeriği

Kolon Tutucu Mikrotüp Rafı Kör Şeritler (12 adet)

Manifold Kapağı

Manifold Tabanı Aralayıcılar

Atık Kapları

Vakum Regülatörü


21

9.1.3 oCheck® VacPump

Şekil 3: oCheck® VacPump'ın içeriği

oCheck® VacPump

Bağlantı Tüpleri

Susturucu


22

!

9.2 oCheck® VacSet'in Montajı

➠ Manifold Tabanını güvenli bir laboratuvar tezgahının üzerine yerleştirin. Vakum Manifoldu, şekil 4 a+b'de gösterildiği gibi hazırlanmalıdır.

Şekil 4: a) DNA bağlama ve yıkama için kurulum b) DNA elüsyonu için kurulum

9.2.1 DNA bağlama ve yıkama için kurulum

➠ DNA bağlama ve yıkama prosedürleri için (protokol adımları 10.3.5 - 10.3.7), Vakum Manifoldunu, şekil 4a'da gösterildiği gibi kurun.

➠ Manifold Tabanının içine bir veya iki Atık Kabı* yerleştirin. ➠ Manifold Tabanını Manifold Kapağıyla kapatın. ➠ Kolon Tutucuyu Manifold Kapağının kauçuk korumasının içine doğru yerleştirin. ➠ Kolon Tutucuya yeterli miktarda Bağlama Şeridi yerleştirin. ➠ Bağlama Şeritlerinin doğru bir şekilde takıldığından ve Kolon Tutucuyu sıkıca kapattığından

emin olun (net bir “klik” sesi duymalısınız). Bir seferde 48'den daha az numune işlem görüyorsa, tutucunun içine yalnızca gereken miktarda Bağlama Şeridi yerleştirin ve Kolon Tutucuda kalan yerleri, uygun miktarda Kör Şerit ile doldurun.

Vakum uygulamadan önce, Bağlama Şeritlerinin ve Kör Şeritlerin, Kolon Tutucuya düzgün bir şekilde oturduğundan emin olun.* Atık Kabını temizlemek amacıyla bulaşık makinesine koymayın!

Bağlama Şeritleri içeren Kolon Tutucu

Manifold Kapağı

Mikrotüp Rafı

„Microtube Rack“Aralayıcı

„Round-Well Block“Aralayıcı

Manifold Tabanı


Manifold Kapağı

Atık Kabı

Manifold Tabanı

Manifold Valfi


23

9.2.2 DNA elüsyonu için kurulum

DNA elüsyon adımları için (protokol adımı 10.3.8), Vakum Manifoldu, şekil 4 b'de gösterildiği gibi değiştirilmelidir.

➠ Kolon Tutucuyu Bağlama Şeritleriyle birlikte alın ve temiz bir Kağıt Yaprağının (kitle verilen) üzerine yerleştirin.

➠ Manifold Kapağını kaldırın ve kullanılmış Atık Kabını çıkartın. ➠ Manifold Tabanının kısa kenarlarına, “Yuvarlak Kuyucuklu Blok” Aralayıcılarını ve üzerine

Mikrotüp Rafını yerleştirin (şekil 4b). ➠ Mikrotüp Rafını Aralayıcıların üzerine yerleştirin. ➠ Mikrotüp Rafının 2 numaralı sırasından başlayarak, her 2. sıraya etiketlenmiş PCR tüplerinden

gereken miktarda yerleştirin. ➠ Vakum Manifoldunu kapatın ve üzerine Bağlama Şeritlerini yerleştirin. Her bir Bağlama

Şeridinin elüe edilen DNA'yı toplayacak PCR tüpünün tam üzerine yerleştiğinden emin olun (şekil 4c). Tüm Bağlama Şeritleri ve Kör Şeritlerin, Kolon Tutucuya hala düzgün bir şekilde oturup oturmadığını yeniden kontrol edin.

Şekil 4c: Her bir Bağlama Şeridi kolonunun, doğrudan PCR şeridindeki bir PCR tüpü üzerine yerleştirilmiş olması gereklidir.


24

9.3 oCheck® VacPump'ın Montajı

oCheck® VacPump'ı sabit bir laboratuvar tezgahının üzerine yerleştirin. oCheck® VacPump şekil 5a'da gösterilen şekilde monte edilmelidir. oCheck® VacPump'ı Vakum Manifolduna birleştirmek için, ekteki iki Bağlantı Tüpünden uzun olanını kullanın. Kısa olan Bağlantı Tüpünü iki parçaya kesin (yaklaşık 5 cm ve 4 cm). 5 cm'lik Bağlantı Tüpünü oCheck VacPump'ı Vakum Regülatörüne bağlamak için kullanın. Susturucuyu, 4 cm'lik Bağlantı Tüpünü kullanarak, oCheck® VacPump'ın çıkışının zıt yönünde sabitleyin.

Şekil 5: a) oCheck® VacPump'ın Montajı b) Vakum Regülatörü

9.4 Vakumu kurma

Manifold Kapağının, Kolon Tutucunun ve Bağlama Şeritlerinin doğru bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Manifold Valfini kapatın (şekil 5a). Vakum Pompasını çalıştırın. Vakumu, Vakum Regülatörünü kullanarak, kit protokolüne göre ayarlayın (şekil 5b). İstenen vakum seviyesine ulaşana kadar Ayar Vidasını açın.

9.5 Vakum Uygulama

Numuneleri, bağımsız Bağlama Şeritlerine yükleyin. Manifold Valfini açın ve gerekiyorsa, akış başlayana kadar Bağlama Şeritlerine hafifçe baskı uygulayın

9.6 Manifoldu havalandırın

Numuneler Bağlama Şeritlerinin filtresinden geçtiğinde Manifold Valfini kapatın ve Vakum Pompasını durdurun. Kolon Tutucu ile Bağlama Şeritleri kolaylıkla çıkarılabilecek düzeye gelene kadar yaklaşık 30 saniye bekleyin.

Susturucuyu buraya sabitleyin

Manifold Valfi Ayar Vidası


25

10. 8 KOLON PREPARASYONU (Kat. No. 515 050)

10.1 Çalışma solüsyonlarının preparasyonu ve saklama koşulları

Tüm kit komponentleri, oda sıcaklığında (18-25 °C) saklanmalıdır. Komponentler, üretildikten sonra iki yıl süreyle stabildir.

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti protokolüne başlamadan önce, aşağıdaki solüsyonları hazırlayın:

1. Proteinaz K, solüsyonu: Kitin ilk kullanımından önce, liyofilize Proteinaz K'nın çözünmesi için 3,35 ml Proteinaz Tamponu (PKB) ekleyin. Solüsyonu alikuotlara bölün ve 6 aya kadar -20 °C'de saklayın. Tekrar dondurmayın.

2. Tampon W2: 200 ml etanolü (p.a. ≥ %99,8), Tampon W2 konsantratına ekleyin. Şişenin etiketine güncel tarihi not edin. Tampon W2, oda sıcaklığında (18-25 °C) bir yıla kadar stabildir.

3. Tampon L4: Tampon L2'yi Reaktif L3'e tamamen aktarın ve iyice karıştırın. Şişeyi, kitle birlikte verilen L4 etiketiyle etiketleyin. Şişenin etiketine güncel tarihi not edin. Elde edilen Tampon L4, oda sıcaklığında (18-25 °C) bir yıl süreyle stabildir.

4. Taşıyıcı RNA solüsyonu: Liyofilize edilmiş Taşıyıcı RNA'nın çözünmesi için, 900μl Tampon L1 ekleyin. Çözünen Taşıyıcı RNA'yı alikuotlara ayırın, örneğin 16 ekstraksiyon için 50 μl'lik alikuotlar gibi. Taşıyıcı RNA solüsyonunu -20° C'de saklayın. Tekrar dondurmayın! Kullanılmış flakonlar çözündüklerinde imha edilmelidir.

Özellikle düşük sıcaklıklarda saklama sırasında, Tampon L1, L2 veya L4'te beyaz bir çökelti oluşabilir. Bu çökeltiler, kullanımdan önce şişenin 50-70 °C'de inkübe edilmesiyle kolaylıkla çözünebilir.


26

!

10.2 Numune preparasyonu

10.2.1 PapilloCheck® ve PapilloCheck® high-risk için numune preparasyonu

• PapilloCheck® Toplama Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 465.070)• PreservCyt® toplama ortamı (Hologic, Bedford, MA, ABD) içinde toplanan servikal smear numuneleri, doğrudan işlenebilir. • SurepathTM toplama ortamı (BD, Franklin Lakes, NJ ABD) içinde toplanan servikal smear

numuneleri kullanılmadan önce yıkanmalıdır: 250 μl numuneyi, 5 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun ve pelleti 250 μl seyreltilmiş suda yeniden süspansiyon haline getirin.

• STMTM toplama ortamı (Qiagen, Hilden, Almanya) içinde toplanan servikal smear numuneleri,

seyreltilmiş suyla seyreltilmelidir: 100 μl numune + 150 μl seyreltilmiş su.

Genel olarak servikal smear numunesi çok konsantre ise ve zaten agrege olmuşsa, ekstraksiyona başlamadan önce numunenin seyreltilmesi ve homojenize edilmesi gerekir!

Çok seyreltilmiş ve gözle görünür hücreleri göstermeyen servikal smear numuneleri, ekstraksiyon için daha fazla hücre verimi elde etmek amacıyla konsantre edilmelidir. En fazla 1000 μl numuneyi, 5 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun ve pelleti 250 μl seyreltilmiş suda yeniden süspansiyon haline getirin.

Bu konsantrasyon adımı, yalnızca PapilloCheck® Toplama Kiti, PreservCyt® toplama ortamı veya SurepathTM toplama ortamı ile toplanan servikal smear numuneleri için uygulanır. Eğer STMTM toplama ortamı kullanılmışsa, santrifüj yoluyla konsantrasyon elde edilmesi mümkün değildir.

➠ 250 μl numune solüsyonu, 1,5 ml veya 2 ml'lik reaksiyon tüpüne pipetleyin. Kontaminasyonu önlemek için, lizis adımlarında kullanılan emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı reaksiyon tüplerini kullanın.

Her bir DNA ekstraksiyon döngüsündeki tüm DNA izolasyon prosedürünün, negatif numune kontrolü kullanılarak valide edilmesi tavsiye edilir.


!

10.3 Standart protokol

Vakum altında oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonu kullanılırken uygun bir vakum sistemi gereklidir. Gereken ekipmanlar, kurulum ve çalışma talimatları, bölüm 9'da açıklanmaktadır.

10.3.1 Preparasyon

➠ Santrifüjü oda sıcaklığına (18-25 °C) ayarlayın. ➠ Numuneleri bölüm 10.2'ye göre hazırlayın ➠ Termoblokları veya su banyolarını, sırasıyla 56 °C ve 70 °C'ye ayarlayın. ➠ Elüsyondan önce, elüsyon Tamponu E'yi, 70 °C'de inkübe edin. ➠ Çalışma solüsyonlarının bölüm 10,1'e göre hazırlanmasına dikkat edin.

10.3.2 Ön Lizis

➠ Liyofilize edilmiş 80 μl Tampon L1 ekleyin. ➠ Hazırlanan Taşıyıcı RNA solüsyonundan 2,4 μl ekleyin. ➠ 20 μl Proteinaz K solüsyonu ekleyin. ➠ Kapağı kapatın ve puls vorteks uygulayarak kısa bir süre karıştırın.

Birçok numune işleniyorsa, Proteinaz K, Tampon L1 ve Taşıyıcı RNA kullanılmadan önce karıştırılmalıdır. Numuneye eklenmeden önce, Tampon L1 ve Proteinaz K'yı kesinlikle 10-15 dakikadan daha fazla karıştırmayın. Proteinaz K substrat olmadan Tampon L1 içinde kendi kendine parçalanabilir.

➠ En az 30 dakika süreyle 56 ºC'de inkübe edin. Numuneleri, bir termo mikser yardımıyla 650 rpm'de sallayın. Bir termoblok veya su banyosu kullanılıyorsa, numuneleri inkübasyon periyodu süresince arada bir vorteksleyin.

10.3.3 Lizis

➠ Kapağın içindeki damlacıkları yok etmek için, reaksiyon tüpünü kısa bir süre santrifüje tabi tutun. ➠ 250 μl Tampon L4 ekleyin. ➠ Kapağı kapatın ve puls vorteks uygulayarak 10 saniye karıştırın. ➠ 15 dakika süreyle 70 ºC'de inkübe edin. ➠ Kapakların kazara açılmasını önlemek için, reaksiyon tüplerinin ağızlarını sıkıca kapatın.

10.3.4 DNA bağlama şartlarını ayarlama

➠ Kapağın içindeki damlacıkları yok etmek için, reaksiyon tüpünü kısa bir süre santrifüje tabi tutun. ➠ Numuneye 300 μl etanol (p.a. ≥ %99.8) ekleyin. ➠ Kapağı derhal kapatın ve puls vorteks uygulayarak 15 saniye karıştırın. ➠ Kapağın içindeki damlacıkları yok etmek için, reaksiyon tüpünü kısa bir süre santrifüje tabi tutun.


28

!

10.3.5 DNA Bağlama

➠ oCheck® Vakum Manifoldunu şekil 6'ya göre hazırlayın (daha ayrıntılı açıklama için bkz. bölüm 9).

Şekil 6: DNA bağlama ve yıkama için kurulum

➠ Manifold Tabanının içine bir veya iki Atık Kabı* yerleştirin. ➠ Manifold Tabanını Manifold Kapağı ile kapatın. ➠ Kolon Tutucuyu Manifold Kapağının kauçuk korumasının içine doğru yerleştirin. ➠ Kolon Tutucuya gerekli miktarda Bağlama Şeridi takın. Bağlama Şeritlerinin düzgün bir

şekilde takıldığından ve Bağlama Şeritlerinin Kolon Tutucuyu sıkıca kapattığından emin olun (net bir “klik” sesi duymalısınız). Bir seferde 48'den daha az numune işlem görüyorsa, tutucunun içine yalnızca gereken miktarda Bağlama Şeridi yerleştirin ve Kolon Tutucuda kalan yerleri, yeterli miktarda Kör Şerit ile doldurun.

Vakum uygulamadan önce Bağlama Şeritlerinin ve Kör Şeritlerin Kolon Tutucuya doğru bir şekilde oturduğundan emin olun.* Atık Kabını temizlemek amacıyla bulaşık makinesine koymayın!


Manifold Kapağı

Atık Kabı

Manifold Tabanı

Manifold Valfi


➠ Bağlama Şeritlerinin kuyucuklarına 900 μl lizat pipetleyin ve kuyucuk alanlarının ıslanmamasına dikkat edin (şekil 7).

Şekil 7: Lizatı, Bağlama Şeritlerinin kuyucuklarına pipetleyin

➠ Vakumu, vakum regülatörü yardımıyla -200 mbar değerine ayarlayın (şekil 8a). ➠ Tüm lizatlar kolonlardan geçene kadar, Manifold Valfini açarak yavaş yavaş vakum uygulayın

(şekil 8b).

Şekil 8: a) Vakum Regülatörü b) Manifold Valfi

➠ Tüm sıvı kolonlardan geçtikten sonra, vakumu doğrudan durdurun (yaklaşık 30 saniye). Manifold Valfini kapatarak köpük oluşumunu önleyin.

➠ Vakum Pompasını kapatın ve vakumu bırakın.

Manifold ValfiAyar Vidası


10.3.6 Bağlama Şeritlerini Yıkama

Aşağıdaki adımlar için 8 kanallı pipet ve reaktif rezervuarlarının kullanılması tavsiye edilir (reaktif rezervuarları kullanılıyorsa, gereken tampon hacimleri için bkz. tablo 1).Tampon rezervuarları kullanılıyorsa, gerekli miktarda tampon solüsyonu hazırlayın

Ekstrakte edilecek numunelerin sayısı

8 16 24 32 40 48

Tampon W1 6,5 ml 12 ml 17,5 ml 23 ml 28,5 ml 34 ml

Tampon W2* 16 ml 32 ml 48 ml 64 ml 80 ml 96 ml

Tablo 1: n = x numuneler için gereken miktarda tampon solüsyonları

* İlk kullanımdan önce 200 ml etanol ekleyin (ayrıca bkz. bölüm 10.1).

➠ Bağlama Şeritlerinin her bir kuyucuğuna 600 μl Tampon W1 ekleyin (şekil 9 a+b).

Şekil 9: a) Tampon rezervuarından Tampon W1 pipetleme. b) Bağlama Şeritlerinin kuyucuklarına Tampon W1 ekleme.

➠ Vakumu, Vakum Regülatörü yardımıyla -200 mbar değerine ayarlayın. ➠ Tüm lizatlar kolonlardan geçene kadar, Manifold Valfini açarak yavaş yavaş vakum uygulayın

(şekil 8). ➠ Tüm sıvı kolonlardan geçtikten sonra (yaklaşık 30 saniye), köpük oluşumunu önlemek için

Manifold Valfini kapatarak vakumu doğrudan durdurun. ➠ Bağlama Şeritlerinin her bir kuyucuğuna 900 μl Tampon W2 ekleyin. ➠ Vakumu, Vakum Regülatörü yardımıyla -200 mbar değerine ayarlayın. ➠ Tampon kolonlardan geçene kadar (yaklaşık 30 saniye)). ➠ vakum uygulayın. Tüm sıvı kolonlardan geçtikten sonra (yaklaşık 30 saniye), köpük oluşumunu

önlemek için Manifold Valfini kapatarak vakumu doğrudan durdurun. ➠ Bağlama Şeritlerinin her bir kuyucuğuna 900 μl Tampon W2 ekleyin. ➠ Vakumu, Vakum Regülatörü yardımıyla -200 mbar değerine ayarlayın. ➠ Tüm tampon kolonlardan geçene kadar (yaklaşık 30 saniye). ➠ vakum uygulayın. Tüm sıvı kolonlardan geçtikten sonra (yaklaşık 30 saniye), köpük oluşumunu

önlemek için Manifold Valfini kapatarak vakumu doğrudan durdurun. ➠ Vakum Pompasını kapatın ve vakumu bırakın.


!

10.3.7 Bağlama Şeritlerini Kurutma

➠ Son yıkama adımından sonra vakumu durdurun ve Vakum Manifoldunu havalandırın (bölüm 9.6). Kolon Tutucuyu Bağlama Şeritleri ile birlikte çıkarın. Bu arada, Manifold Kapağını açın, kullanılmış Atık Kabını çıkarın ve yerine kullanılmamış (temiz) bir atık kabı yerleştirin.

➠ Manifold Kapağını Kolon Tutucu ve Bağlama Şeritleri ile birlikte Manifold Tabanına yerleştirin. Manifold Kapağının tekrar sıkıca kapandığından ve tüm Bağlama Şeritleri veya Kör Şeritlerin doğru bir şekilde oturduğundan emin olun.

➠ Membranın tamamen kuruması için maksimum (en az ~400 ila ~600 mbar basınç farkı) değerde 10 dakika süreyle vakum uygulayın.

➠ Vakum Pompasını kapatın ve vakumu bırakın.

Etanol izlerini yok etmek için bu adımın uygulanması gereklidir. Tampon W2 içindeki etanol, enzimatik reaksiyonları inhibe eder, bu nedenle DNA elüsyonundan önce tamamen yok edilmelidir.

10.3.8 DNA Elüsyonu

Sonraki elüsyon adımları için Vakum Manifoldunun şekil 10'a göre değiştirilmesi gereklidir.

Şekil 10: DNA elüsyonu için kurulum

➠ Kolon Tutucuyu Bağlama Şeritleri ile birlikte alın ve temiz bir Kağıt Yaprağının (kitle verilen) üzerine yerleştirin.

➠ Manifold Kapağını açın ve kullanılmış Atık Kabını çıkartın. ➠ Manifold Tabanının kısa kenarlarına, “Yuvarlak Kuyucuklu Blok” Aralayıcılarını ve üzerine

Mikrotüp Rafını yerleştirin (şekil 10). ➠ Mikrotüp Rafını Aralayıcıların üzerine yerleştirin. ➠ Mikrotüp Rafının 2 numaralı sırasından başlayarak, her 2. sıraya etiketlenmiş PCR tüplerinden

uygun miktarda yerleştirin. ➠ Vakum Manifoldunu kapatın ve üzerine Bağlama Şeritlerini yerleştirin. Her bir Bağlama

Şeridinin elüe edilen DNA'yı toplayacak PCR tüpünün tam üzerine yerleştiğinden emin olun (şekil 11). Tüm Bağlama Şeritleri ve Kör Şeritlerin Kolon Tutucuya hala düzgün bir şekilde oturup oturmadığını kontrol edin.


Manifold Kapağı

Mikrotüp Rafı

„Microtube Rack“Aralayıcı

„Round-Well Block“Aralayıcı

Manifold Tabanı


!

Şekil 11: Her bir Bağlama Şeridi kolonunun, doğrudan PCR şeridindeki bir PCR tüpü üzerine yerleştirilmiş olması gereklidir.

➠ Tek kanallı pipet kullanarak, doğrudan her bir Bağlama Şeridi üzerine,) önceden ısıtılmış 100 ml (70 °C) Tampon E pipetleyin. Her bir numune için yeni bir uç kullanılmalıdır.

➠ 5 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. ➠ Manifold Valfini açarak maksimum -400 mbar değerinde vakumu yavaşça uygulayın. ➠ Köpük oluşumunu önlemek için, tüm sıvı kolonlardan geçtikten sonra Manifold Valfini doğrudan

kapatarak vakumu hemen durdurun. ➠ Vakum Pompasını kapatın ve vakumu bırakın. ➠ Etiketlenmiş PCR tüplerini saklamak üzere kapatın.

Downstream uygulamalarında izole edilmiş DNA'dan en iyi performansı almak için sağlanan Tampon E ile elüsyon tavsiye edilir. Ekstrakte edilen DNA'yı, -20 °C'de saklayın.oCheck® ürün serisiyle yapılacak deneylerden daha fazla analiz almak için ilgili Kullanım Talimatlarına başvurun (PapilloCheck® ve PapilloCheck® high-risk)


33

!

11. SORUN GİDERME

Sorun ve sebebi Açıklamalar ve öneriler

DNA VERİMİ YOK VEYA ÇOK DÜŞÜK

Lizis işlemi tamamlanmadı

Reaktifler doğru bir şekilde uygulanmadı Kolondan alınan DNA elüsyonu yetersiz

• Numune iyice homojenize edilmemiş ve Tampon L1 / Proteinaz K ile karıştırılmamıştır. Karışımın, Tampon L1 eklendikten hemen sonra kuvvetlice vortekslenmesi gereklidir.

• Numunede yeterli hücre sayısı yoktur.• Düşük Proteinaz K etkinliği: Solüsyonu alikuotlara bölün ve 6 aya kadar -20 °C'de

saklayın. Tekrar dondurmayın.

• Bölüm 8.1 veya 10.1'e göre Tampon L4, W2, Taşıyıcı RNA ve Proteinaz K solüsyonu hazırlayın. Lizatları kolonlara yüklemeden önce etanol ekleyin.

• Elüsyondan önce Tampon E'yi 70 °C'ye kadar önceden ısıtın. Silika membranın merkezine doğrudan Tampon E uygulayın.

• Elüsyon, pH < 7,0 değerinde tamponlarla yapılmışsa, elüsyon önemli ölçüde verim kaybeder. Tampon E (pH 8,5) gibi hafif alkalin elüsyon tamponları kullanın.

KOLONLAR TIKALI

Lizis işlemi tamamlanmadı

Reaktifler doğru bir şekilde uygulanmadı

• Numune iyice homojenize edilmemiş ve Tampon L1 / Proteinaz K ile karıştırılmamıştır. Karışımın, Tampon L1 eklendikten hemen sonra kuvvetlice vortekslenmesi gereklidir.

• Düşük Proteinaz K etkinliği: Solüsyonu alikuotlara bölün ve 6 aya kadar -20 °C'de saklayın. Tekrar dondurmayın.

• Bölüm 8.1 veya 10.1'e göre Tampon L4, W2, Taşıyıcı RNA ve Proteinaz K solüsyonu hazırlayın. Lizatları kolonlara yüklemeden önce etanol ekleyin.

ENZİMATİK REAKSİYONLARDA DNA PERFORMANSI YETERSİZ

Etanol veya tuz taşınması

DNA'nın inhibe edici maddelerle kontaminasyonu

• DNA elüsyonundan önce tüm etanolik Tampon W2'nin temizlenmesi için en az 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutulduğundan emin olun. Herhangi bir sebeple, Tampon W2 kurutma sonrasında kolon çıkışına kadar ulaşmışsa, santrifüj işlemini tekrar edin.

• Kullanımdan önce Tampon W2'yi soğutmayın. Soğuk tampon tuzu etkili bir şekilde temizlemez. Tampon W2'yi kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin.

• DNA'yı TE tamponuyla elüe etmeyin. EDTA enzimatik reaksiyonları inhibe edebilir. DNA'yı yeniden saflaştırın ve Tampon E ile elüe edin.

• Elüatın A260/280 oranı 1,6 değerinin altındaysa, saflaştırma prosedürünü tekrar edin: Elüata 1 hacim Tampon L4 ve 1 hacim etanol (%96-100) ekleyin. Karışımı spin kolona yükleyin ve standart protokoldeki DNA bağlama adımına devam edin (bölüm 8.3.5 veya 10.3.5).


34

12. TEKNİK YARDIM

Greiner Bio-One, moleküler biyoloji ve oCheck® ürünlerinde kapsamlı uygulama ve teori deneyimi edinmiş uzman bilim adamlarından oluşan bir Teknik Servis Departmanına sahiptir.oCheck® ürünleriyle ilgili herhangi bir sorunuz veya sorununuz olduğunda, lütfen yerel Greiner Bio-One distribütörünüze başvurmaktan çekinmeyin.

13. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, oCheck® ürün serisi ile yapılacak deneylere yönelik bir IVD aksesuarıdır. oCheck® DNA Ekstraksiyon Kitinin analitik ve spesifik performansı, ilgili deneylerle test edilmiştir. Performans ile ilgili ayrıntılı açıklama için lütfen oCheck® ürünleri Kullanım Kılavuzuna başvurun [PapilloCheck® (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 060), PapilloCheck® high-risk (Greiner Bio-One; Kat. No. 505 060) ve PelvoCheck® CT/NG (Greiner Bio-One; Kat. No. 504 002)].


KISA PROTOKOL

DNA Ekstraksiyon

Oda 114. KISA PROTOKOLLER

14.1 Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040) için kısa protokol

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti Tek Kolon Preparasyonu (Greiner Bio-One; Kat. No. 515.040) kullanılarak DNA Ekstraksiyonu

1. PREPARASYON

➠ Santrifüjün oda sıcaklığına (18-25 °C) ayarlandığından emin olun ➠ Bölüm 8.1'e göre çalışma solüsyonlarını hazırlayın ➠ Termoblokları veya su banyolarını 56 °C ve 70 °C'ye ayarlayın ➠ Elüsyon Tamponu E'yi önceden 70 °C'ye kadar ısıtın ➠ Numuneleri bölüm 8.2'ye göre hazırlayın ➠ 1,5 veya 2.0 ml'lik reaksiyon tüpüne 250 μl numune pipetleyin

2. ÖN LİZİS

➠ 80 µl Tampon L1 ➠ 2.4 μl Taşıyıcı RNA solüsyonu ➠ 20 μl Proteinaz K solüsyonu ➠ Kısa bir süre vorteksleyin! ➠ En az 30 dakika 56 °C'de ➠ Santrifüje tabi tutun!

3. LİZİS

➠ 250 µl Tampon L4 ➠ Kısa bir süre vorteksleyin! ➠ 15 dakika süreyle 70 °C'de ➠ Santrifüje tabi tutun!

4. DNA BAĞLAMA ŞARTLARINI AYARLAMA

➠ 300 μl etanol ➠ Kısa bir süre vorteksleyin ➠ Santrifüje tabi tutun


KISA PROTOKOL

DNA Ekstraksiyon

Oda 1

5. DNA BAĞLAMA

➠ Spin Kolonları hazırlayın ➠ 450 μl lizat ➠ 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde ➠ 450 μl lizat ➠ 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde

6. SPIN KOLONLARI YIKAMA

➠ 500 μl Tampon W1 ➠ 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde ➠ 600 μl Tampon W2 ➠ 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde

7. SPIN KOLONLARI KURUTMA

➠ 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun

8. DNA ELÜSYONU

➠ 100 μl Tampon E (önceden 70 °C'ye ısıtılmış) ➠ 1 dakika süreyle oda sıcaklığında (18-25 °C) ➠ 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde


KISA PROTOKOL

DNA Ekstraksiyon

Oda 114.2 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515.050) için kısa protokol

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonu. (Greiner Bio-One; Kat. No. 515 050) kullanılarak DNA Ekstraksiyonu

1. PREPARASYON

➠ Santrifüjün oda sıcaklığına (18-25 °C) ayarlandığından emin olun ➠ Bölüm 10.1'e göre çalışma solüsyonlarını hazırlayın ➠ Termoblokları veya su banyolarını 56 °C ve 70 °C'ye ayarlayın ➠ Elüsyon Tamponu E'yi önceden 70 °C'ye kadar ısıtın ➠ Numuneleri bölüm 10.2'ye göre hazırlayın ➠ 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpüne 250 μl numune pipetleyin

2. ÖN LİZİS

➠ 80 µl Tampon L1 ➠ 2,4 μl Taşıyıcı RNA solüsyonu ➠ 20 μl Proteinaz K solüsyonu ➠ Kısa bir süre vorteksleyin! ➠ En az 30 dakika 56 °C'de ➠ Santrifüje tabi tutun!

3. LİZİS

➠ 250 µl Tampon L4 ➠ Kısa bir süre vorteksleyin! ➠ 15 dakika süreyle 70 °C'de ➠ Santrifüje tabi tutun!

4. DNA BAĞLAMA ŞARTLARINI AYARLAMA

➠ 300 μl etanol ➠ Kısa bir süre vorteksleyin ➠ Santrifüje tabi tutun


KISA PROTOKOL

DNA Ekstraksiyon

Oda 1

5. DNA BAĞLAMA

➠ Bağlama Şeritlerine 900 μl lizat pipetleyin ➠ Vakum uygulayın: -200 mbar* ➠ Köpük oluşumundan kaçının!

6. BAĞLAMA ŞERİTLERİNİ YIKAMA

➠ 1. yıkama 600 μl Tampon W1 ➠ 2. yıkama 900 µl Tampon W2 ➠ 3. yıkama 900 µl Tampon W2

Her bir yıkama adımı için: ➠ 30-60 saniye ➠ -200 mbar* ➠ Köpük oluşumundan kaçının!

7. BAĞLAMA ŞERİTLERİNİ KURUTMA

➠ 10 dakika süreyle -600 mbar'da*

8. DNA ELÜSYONU

➠ 100 μl Tampon E (önceden 70 °C'ye ısıtılmış) ➠ 5 dakika süreyle oda sıcaklığında (18-25 °C) ➠ Vakum uygulayın: -400 mbar* ➠ Köpük oluşumundan kaçının!

* Atmosferik basıncın düşürülmesi: Numune viskozitesine bağlı olarak, filtrasyon süresinin uzatılması veya vakumun arttırılması (örn. -200 ila – 400 mbar) gerekebilir.

Documents

Kullanım Talimatları - GBO · diagnósti-ca in vitro Limitación de tempera-tura Contenido suficiente para ensayos irritante Código de lote Nota im-portante it Non riutilizza-bile