Kristijan Peras.pdf

8/18/2019 Kristijan Peras.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/kristijan-peraspdf 1/52

SVEUČILIŠTE JOSIPA JURJA STROSSMAYERA U OSIJEKU

POLJOPRIVREDNI FAKULTET U OSIJEKU

Kristijan Peras, apsolvent

Sveučilišni dodiplomski studij Smjer: Ratarstvo

NAČIN DOBIVANJA I PRIMJENA PČELINJEG OTROVA

Diplomski rad

Osijek, 2015.



SVEUČILIŠTE JOSIPA JURJA STROSSMAYERA U OSIJEKU

POLJOPRIVREDNI FAKULTET U OSIJEKU

Kristijan Peras, apsolvent

Sveučilišni dodiplomski studij Smjer: Ratarstvo


Diplomski rad

Povjerenstvo za ocjenu i obranu diplomskog rada:

prof. dr. sc. Zlatko Puškadija, predsjednik

izv. prof. dr. sc. Drago Bešlo, mentor

prof. dr. sc. Marcela Šperanda, član

Osijek, 2015.



Sadržaj

1. UVOD.............................................................................................................. 1

2. SISTEMATIKA PČELA..................................................................................4

3. PČELINJI OTROV...........................................................................................7

3.1. Morfologija žalčanog aparata............................................................ 8

3.2. Istraživanje pčelinjeg otrova.............................................................11

3.3. Sastav pčelinjeg otrova.....................................................................12

3.3.1. Hlapljiva komponenta pčelinjeg otrova.............................14

3.3.2. Fiziološki aktivni spojevi otrova........................................15

3.3.2.1. Fosfolipaza A2....................................................16

3.3.2.2. Fosfolipaza B......................................................17

3.3.2.3. Hijaluronidaza.....................................................17

3.3.3. Peptidi................................................................................18

3.3.3.1. Apamin................................................................18

3.3.3.2. Treciapin..............................................................19

3.3.3.3. MCD peptid........................................................20

3.3.3.4. Adolapin..............................................................21

3.3.3.5. Sekapin................................................................21

3.3.3.6. Biogeni amini......................................................22

4. MELITIN........................................................................................................23

4.1. Biosinteza melitina...........................................................................26

5. LJEKOVITA SVOJSTVA I UPOTREBA PČELINJEG OTROVA..............28

6. UREĐAJ ZA PRIKUPLJANJE PČELINJEG OTROVA..............................32

6.1. Način rada elektrostimulatora...........................................................34

7. ZAKLJUČAK.................................................................................................37

8. POPIS LITERATURE....................................................................................38

9. SAŽETAK.......................................................................................................41

10. SUMMARY....................................................................................................42

11. POPIS SLIKA.................................................................................................43

12. POPIS TABLICA............................................................................................44



13. INTERNET STRANICE...............................................................................44

14. TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA



1

1. Uvod

Pčelarstvo je jedna od najstarijih grana poljoprivrede, a smatra se da je započelo sa

razvojem u kamenom dobu, usporedno sa razvojem sjedilačkog načina ţivota, preciznije

mezolitiku (10000- 6500 g. pr.n.e.) udomaćivanjem pčela, odnosno začetkom njihova uzgoja u

prvim košnicama, npr. panjevima, dupljama drveća, itd. Jedan od najstarijih arheoloških

nalaza datira iz desetog tusućljeća pr.n.e. iz Španjolske što je prikazano na slici 1. Iako su

pronaĎene puno starije slikarije koje pokazuju da se čovjek sakupljanjem meda bavio i puno

ranije, kao vrijeme začetka pčelarstva uzet je mezolitik.

Slika 1. Crteţ iz pećine, Bicorp, Španjolska: Sakupljanje meda

Izvor: http://www.google.si/bicorp/image

Čovjek se sluţio raznim metodama da bi došao do meda, a to je bila, najjednostavnijerečeno, pljačka pčelinjeg gnijezda, koja je često bila izuzetno opasna pošto se pčelinja

gnijezda u prirodi nalaze na teško dostupnim mjestima, te zbog ţestoke obrane pčelinjeg

gnijezda. Čovjek je kao lovac i sakupljač plodina primijetio dobrobiti koje mu pruţa mala, ali

opasna zajednica letećih kukaca, te se postepeno, u početku primitivnim, a kako je vrijeme

prolazilo sve suptilnijim metodama, pribliţio i umiješao u ţivot pčela kakve poznajemo danas.



2

Med se u početku skupljao tako da su se pčele tjerale iz svojih obitavališta, a pčelinja

društva su time često bivala i uništena. Na isti način su dobivani i ostali pčelinji proizvodi,

koje je drevni čovjek koristio u liječenju, prehrani, te kao tehnološka pomagala (npr. voštana

svijeća za rasvjetu) u najrazličitijim vidovima ondašnjih ljudskih potreba. Pčele su svoje

zajednice smještale u sigurna skloništa, poput duplji drveća, u udubinama u stijenama,

svakojakim mogućim šupljim prostorima, u tlu, itd. U prilog tome idu crteţi iz ranih doba

„novije“ ljudske povijesti koje su arheolozi pronašli diljem starog kontinenta. Prema

današnjim saznanjima, najstarije pčelarstvo bilo je organizirano na Bliskom istoku, u 4.

tisućljeću pr.n.e. u Egiptu, zatim u drevnoj Indiji, Rimu i Grčkoj. Postoje nalazi koji pokazuju

da su stari Egipćani pokušavali udomaćiti pčele oko 4500.g.pr.n.e. Posude s medom

pronaĎene su u faraonskim grobnicama kao npr. faraona Tunankhamuna. Pčelarstvo se

spominje i u vjerskim tekstovima; Bibliji, Qranu, Vedama te mnogim knjiţevnim djelimaantike.

Pčelarstvo kao jedna od najstarijih grana poljoprivrede tek u novije vrijeme postaje

profitabilno (aktualno), na temelju čega moţemo zaključiti da čovjeku treba puno vremena da

bi shvatio k oliko mu dobra priroda oduvijek daje, pa iz tog razloga još uvijek zaostaje prema

„main streamu“; stočarstvu, ratarstvu, voćarstvu, vinogradarstvu, itd. Ne smijemo zaboraviti i

onu neprofitabilnu sferu pčelarstva, a to je pčelinja prirodna funkcija kao oprašivača, odnosno

jednu od najbitnijih karika u odrţavanju biološke raznolikosti. Einstein je rekao da ukoliko

nestane pčela, čovjek će nestati za iduće 3-4 godine. Ekonomski aspekt, odnosno profit, ono

radi čega se čovjek u stvari bavi pčelarstvom, tek je jedno sićušno zrnce pijeska naspram

vaţnosti pčela u prirodi.

Porastom standarda i tempa ljudskog ţivota, postajemo sve podloţniji negativnim utjecajima

okoline i stanja u koje se dovodimo iscrpljujućim radom. Stoga imamo sve veću potrebu za

okretanjem prirodi (što se na ţalost uvijek prekasno dešava) jer smo učinili previše zla planetu

Zemlji i sebi samima pa smo krenuli u proces ponovnog vrednovanja blagodati kojima nas je

priroda okruţila, a koje smo dugo zanemarivali.

Tako smo počeli prepoznavati vrijednosti koje naša europska, kranjska pčela Apis

mellifera mellifera carnica ima i koje nam ih ona tako nesebično daje, a mi moramo pametno i

zahvalno iskoristiti te blagodati. Treba napomenuti u svijetu pčelari sa puno više vrsta i



3

pasmina pčela koje su prilagoĎene svaka u svojem klimatu, a kod nas u blagoj kontinentalnoj

klimi, pčelarimo sa kranjskom pčelom koja je najbolje adaptirana našoj klimi, što je rezultat

selekcije.

Svakim danom nam se pruţa sve više informacija o dobrobiti i blagotvornim učincima

pčelinjeg meda, propolisa, matične mliječi, peluda i u novije vrijeme pčelinjeg otrova.

Pčelinji otrov i njegove učinke čovjek poznaje od davnina, a napretkom tehnologije i

analitičkih metoda moţe učinkovitije odrediti njegovo djelovanje i valorizirati n jegovu

djelotvornost u prevenciji bolesti, simptoma, odnosno fizioloških poremećaja koje uzrokuju

odreĎene bolesti.

Uvid u kemijski sastav pčelinjeg otrova te njegova fizikalno-kemijska svojstva

omogućio je cijeli niz metoda, a to su plinska (GC) i tekuća kromatografija (LC), tankoslojna

kromatografija (TLC), metoda cirkularnog dikroizma, kapilarna elektroforeza, rendgenska

kristalografija (Kokot, Matysiak, Urbaniak, Dereziński 2011.).



4

2. Sistematika pčela

Da bi se pobliţe stekao dojam o velikom broju pčelinjih vrsta potrebno se ukratko

upoznati sa sistematikom pčela. Pošto meĎu pčelama postoje značajne morfološke razlike,

logično je zaljučiti da je kemijski sastav njihova otrova u korelaciji sa morfološko -fiziološkim

razlikama.

Tablica 1. Sistematika pčela (http://hr.wikipedia.org/wiki/Pčele)

Carstvo Animalia

Koljeno Arthropoda

Podkoljeno Hexapoda

Razred Insecta

Red Hymenoptera

Podred Apocrita

Natporodica Apoidea

Porodica Apidae

Potporodica Apinae

Rod Apis

Vrsta mellifera (medarica)

Podvrsta mellifera

Varijetet carnica (kranjs ka pčela)

Porodica Pčele Apidae se dijeli na tri podporodice:

Bumbari – Bombinae

Male tropske pčele – Maliponinae

Prave pčele/ Društvene pčele – Apinae

http://hr.wikipedia.org/wiki/%C5%BDivotinje

http://hr.wikipedia.org/wiki/Opnokrilci

http://hr.wikipedia.org/w/index.php?title=Apocrita&action=edit&redlink=1

http://hr.wikipedia.org/wiki/Apoidea

http://hr.wikipedia.org/w/index.php?title=Apidae&action=edit&redlink=1

http://hr.wikipedia.org/w/index.php?title=Apidae&action=edit&redlink=1

http://hr.wikipedia.org/wiki/Apoidea

http://hr.wikipedia.org/w/index.php?title=Apocrita&action=edit&redlink=1

http://hr.wikipedia.org/wiki/Opnokrilci

http://hr.wikipedia.org/wiki/%C5%BDivotinje



5

Na svijetu postoji oko 20000 vrsta pčela, a najčešće su medonosne pčele, koje su prisutne

na svim k ontinentima, osim Arktika i Antarktika (Laktić i Šekulja, 2008.).

Podporodica Društvene pčele, rod Apis ima četiri značajne vrste, od njih 7 utvrĎenih:

1. Apis dorsata F. – Velika indijska pčela, najraširenija u Indiji, Maleziji i Indoneziji.

Radilice ove pčele dvostruko su veće od europske, a razlike izmeĎu radilica i

matice ne postoje. Nema posebno diferenciranih stanica (radničke,

trutovske,matične). Karakterizira ih nomadski način ţivota.

2. Apis florea F. – Mala indijska pčela, podrijetlom iz Azije, najviše u Indiji. Saće

gradi na otvorenom i primjećuje se diferencijacija stanica. Ţive nomadski.

3. Apis indica F. – Indijska pčela. Ima diferencirano saće, a po načinu ţivota srodna

je europskoj pčeli. Ţivi u zatvorenom prostoru, ne skuplja zalihe hrane jer im je

hrana pristupačna cijele godine.

4. Apis mellifera F. – Europsko- afrička medonosna pčela. Jedina vrsta pčela koja se

uzgaja u košnicama. Podvrste: 1. Apis mellifera mellifera L. – crna ili tamna pčela

2. Apis mellifera Fasciata L. – ţuta pčela

Na temelju morfoloških karakteristika medonosnu pčelu, odnosno rod Apis dijelimo na:

1. Apis mellifera var. mellifera L. – Sjevernoeuropska pčela. Sjeverna, zapadna

Europa, Ukrajina. Karakterizira ih sklonost kraĎi, nemir i neotpornost na bolesti.

2. Apis mellifera var. Cavcasica – Kavkaska siva pčela. Karakterizira ih slabi rojevni

nagon i izlaţenje iz košnica za vrijeme niskih temperatura.

3. Apis mellifera var. Ligustica – Talijanska pčela. Karakteristična ţuto pigmentirana

kutikula, slab nagon za skupljanjem hrane i jaki rojevni nagon. Sklona je kraĎi

islabo podnosi zimu. U nas je prisutna u Istri.



6

4.

Apis mellifera var. Carnica – Kranjska pčela (Slika 2.). Tamna pčela, sivosrebrnih

dlačica. Ima izuzetan nagon za sakupljanjem hrane, izuzetnu plodnost te je otporna

prema bolestima.

Slika 2. Kranjska pčela, Apis mellifera mellifera carnica

Izvor: http://hr.wikipedia.org/wiki/Pčele/image



7

3. Pčelinji otrov

Pčelinji otrov je izlučevina ţalčanog sustava pčele, a osnovna mu je biološka namjena

štititi pčelu i pčelinju zajednicu od neprijatelja. Izlučuju ga pčele radilice i matica. Sintetizira

se u otrovnoj ţlijezdi, skladišti u otrovnome mjehuru, a tokom uboda izlučuje se kroz ţalčani

aparat. Masa sintetiziranog otrova iznosi 0.1 mg do 0.3 mg (Laktić i Šekulja, 2008.).

Otrovne ţlijezde kod pčela počinju funkcionirati nakon izlaska radilica iz stanica saća.

U trenutku izlaska pčele iz stanice, otrov je još u obliku prekursora (Treherne, 1978.), a nakon

24 sata ima ga oko 0,04 mg. Njegova količina postepeno raste pa ga 15. dana ima oko 0.3 mg

(Laktić i Šekulja, 2008.). Količina otrova ovisi o kvaliteti paše i godišnjem dobu. Pri

nadolasku jeseni, količina se smanjuje, pa su prema tome, ubodi u proljeće i kasnu jesen,

man je bolni. Za razliku od radilice, matica ima maksimalnu količinu otrova odmah nakonizlaska iz matičnjaka, a ţalac koristi u borbi sa suparnicama. Pčele samo kod ubadanja

sisavaca upotrijebe gotovu svu količinu otrova jer se zbog elastičnosti i mekoće koţe , zupci

ţalca zaglave u njoj te ga pčela ne moţe izvući pa ga gubi zajedno sa cijelim ţalčanim

aparatom (Slika 3.), otrovnim mjehurom, mišićima i središnjim ţivcima (Laktić i Šekulja,

2008.).

Slika 3. Pčela ostaje bez ţalčanog aparata

Izvor: http://hr.wikipedia.org/wiki/apiterapija/image



8

Smatra se da je srednja letalna doza za odraslog čovjeka iznosi LD50 » 2.8 mg otrova po

kilogramu tjelesne teţine. Prema tome smrt odrasle osobe mase 70kg moţe nastupiti ako tu

osobu ubode oko 600 pčela (Mahmoud Abdu Al-Samie, 2012.). Naravno sve ovisi o

pojedincu, njegovoj dobi, zdravstvenom stanju i stupnju rekcije, odnosno alergiji na otrov te

od toksičnosti otrova. TakoĎer je opasno oticanje npr. jezika ili grla, ukoliko do uboda doĎe u

usnoj šupljini, vratu i ţdrijelu ili izvana u blizini grla.

3.1. Morfologija žalčanog aparata

Pčela radilica ima sloţen ţalčani sustav (Slika 4.). Sastoji se od ţalčanih lukova, tri

para hitinskih pločica (duguljastih, trokutastih, kvadratnih), otrovne ili velike-kisele ţlijezde,

Koţevnikove ţlijezde, Dufourove ili male-alkalne ţlijezde i ţalca (Tucak, Bačić, Horvat,

Puškadija, 2005.).

Najinteresantnije su nam kisela i alkalna ţlijezde. Kisela ţlijezda je odgovorna za proizvodnju

otrova. Istraţivanja pokazuju da je veličina ţlijezde u pozitivnoj korelaciji sa količinom

proizvedenog otrova (Brizola-Bonacina, Alves, de Moraes, 2006.). Dufourova ili alkalna

ţlijezda izlučuje ugljikohidrate i estere. Esteri daju specifičan miris matici i pčelama i sluţe

meĎusobnom privlačen ju (http://honeybee.drawwing.org/book/dufour%E2%80%99s-gland)

2014.

Koţevnikova ţlijezda izlučuje sekret koji sluţi podmazivanju hitinskih dijelova ţalca.

http://honeybee.drawwing.org/book/dufour%E2%80%99s-gland






9

Slika 4. Shematski prikaz otrovne ţlijezde sa ţalčanim aparatom

Izvor: http://honeybee.drawwing.org/book/dufour%E2%80%99s-gland

Ţalac (aculeus) posjeduju pčele radilice i matica, dok ga trut nema, dakle samo ţenski članovi

zajednice te se smatra da je nastao transformacijom leglice (Pčelarstvo, 2008.). Smješten je na

kraju zatka u zadnjem segmentu pčele. Za vrijeme mirovanja prekriven je desetom leĎnom itrbušnom ljuskicom zatka. Sastoji se od ţalačnog ţlijeba i dviju ţalačnih iglica. Ţalačni ţlijeb

je dug 2.25mm, gornji dio proširen, a donji suţen i otvoren. U ţlijebu se nalaze dvije šuplje,

hitinske ţalačne iglice koje predstavljaju ţalac u uţem smislu. Svaka iglica ima na svom kraju

zupce koji su vrškom okrenuti u suprotnom smjeru od smjera izlaska ţalca iz ţalčanog

aparata. Ţalac radilice ima 10 zubaca (Slika 5.), a matice 3, ali je ţalac matice veći i jače

graĎen.

Svaka ţalačna iglica nosi u svom gornjem dijelu jednu izraslinu s malom elastičnom koţicom

koja prilikom pomicanja iglica ima zadatak usisati otrov iz otrovnog mjehura.



10

Slika 5. Ţalac radilice sa vidljivim zupcima

Izvor: http://en.wikipedia.org/wiki/venom/stillet/image

Sa ţalcem u neposrednoj vezi stoji otrovna ţlijezda koja je smještena u zadnjem dijelu

šupljine zatka, ispod probavnog trakta. Kod radilice je duţine oko 21mm, a kod matice 40-

50mm i završava sa otvorom na prednjem dijelu ţalačnog ţlijeba.

Biosinteza, dobivanje i primjena otrova medonosne pčele je najviše proučavana od

svih vrsta pčela pošto je ona najbolje adaptirana za naše podneblje i umjerenu kontinentalnu

klimu. Apis m.m.carnica je u našem podneblju, a i šire, najefikasnija vrsta/pasmina pčele, jer

posjeduje izuzetno jak nagon sakupljanja i spremanja viškova hrane (meda i peludi) prema

ostalim vrstama pčela, manje je agresivna te jako plodna (Belčić, Sulimanović, 1985.).

Treba naglasiti da otrov pčelama sluţi kao sredstvo za obranu koje sa ţalcem čini

veoma učinkovit obrambeni aparat. Hlapljiva komponenta otrova ima za funkciju, svojim

mirisom te brzinom širenja zrakom, upozoriti pčelinju zajednicu na opasnost. Naime, prilikom

uboda i ispuštanja otrova, dolazi do naglog širenja mirisa hlapljivih kemijskih spojeva otrova,

što vrlo učinkovito alarmira cijelu pčelinju zajednicu te pčele agresivno u velikom broju kreću

u obranu svojeg društva. Brzina odgovora pčelinje zajednice na napad je od izuzetne vaţnosti

za sigurnost cijele zajednice jer se pravovremenom obranom smanjuje moguća šteta i opasnost

po zajednicu. Npr. pravovremenom eliminacijom izvidničkih stršljenova sprječava se njihov

jači napad što bi u konačnici rezultiralo velikim gubicima pčela, odnosno propašću zajednice.



11

3. 2. Istraživanje pčelinjeg otrova

Istraţivanja pčelinjeg otrova započeo je pred više od stotinjak godina Langer 1897.

(Zalat, Nabil 1999.) koji je otkrio da se otrov sastoji od aktivne i hemolitičke komponente,

koje je okarakterizirao kao osnovne. Do danas su u otrovu otkrivena 63 različita kemijska

spoja (http://www.chm.bris.ac.uk/webprojects2001/loveridge/index-page8.html ) 2014, a

njihov broj bi mogao i porasti primjenom osjetljivijih metoda analize.

Pčelinji otrov je mješavina enzima, polipeptida, spojeva različitih svojstava i molekulskih

masa. Otkriveno su enzimi, fosfolipaza A2, hijaluronidaza (Habermann & Neumann, 1957),

kisela fosfomonoesteraza i esteraza, α-D-glukozidaza (Shkenderov, et al. 1979),

lizofosfolipaza (Ivanova & Shkenderov 1982), α-galaktozidaza i α-

acetilaminodeoksiglukozidaza (Habermann, 1957.). PronaĎeni su peptidi sekapin i terciapin,

apamin (Habermann, 1965.). Otkriven je inhibitor proteaze koji dejluje kao zaštita pojedinih

komponenti otrova od proteolitičkih enzima (Shkenderov, 1973.). Nelson & O'Connor su

otkrili 1968. tri peptida: Nelsonov peptid, prokamin A i prokamin B. Otkriven je histamin,

česti amin male molekulske mase u otrovu reda Himenoptera. Identificirani su i kateholamini

(dopamin i noradrenalin) (Banks & Shipolini 1986.). Otkriveni su ugljikohidrati,

aminokiseline i fosfolipidi, kojih u otrovu ima u sličnoj koncentraciji kao i u hemolimfi pčele

(Shipolini, 1984.).

http://www.chm.bris.ac.uk/webprojects2001/loveridge/index-page8.html%20)%202014






12

3.3. Sastav pčelinjeg otrova

Pčelinji otrov ili apitoksin je gusta, homogena, opalescirajuća tekućina (raspršuje

svjetlost), gorkog, kiselkastog okusa i specifičnog mirisa. Topljiv je u vodi i kiselinama, alinije u alkoholu (zbog koagulacije peptidnih elemenata). Kisele je reakcije pH 4.5-5.5 (Laktić,

Šekulja, 2008.).

Pčelinji otrov sastoji se od suhe tvari, hlapljivih spojeva te vode (Tablica 2.). Isparivi

dio otrova ishlapljuje odmah nakon pčelinjeg uboda (radi brzog alarmiranja pčelinje

zajednice na opasnost). Količina suhe tvari iznosi 30–45 %, a oko polovice količine suhe tvari

čini peptid melitin (Laktić, Šekulja, 2008.).

Do danas je u pčelinjem otrovu utvrĎeno više od 60 kemijskih spojeva, a prema

masenom udjelu glavninu otrova čine: enzimi, peptidi, biogeni amini, ugljikohidrati,

aminokiseline, fosfolipidi, volatilne tvari i minerali (http://en.wikipedia.org/wiki/bee/venom .).

Od enzima u otrovu, najbitniji su: fosfolipaza A2 i hijaluronidaza. Od peptida

najvaţniji je melitin (oko 50% suhe tvari), zatim apamin, MCD peptid, sekapin, adolapin,

prokamin i terciapin.

Najčešći biogeni amini u otrovu su: dopamin, histamin i noradrenalin.



13

Tablica 2. Sastav čvrstih tvari u pčelinjem otrovu, njihova koncentracija (%) i količina otrovau ubodu, nmol/ubod (O'Connor, Peck, Crane, 1990.)

Vrsta spoja Naziv spoja Koncentracija (%)Količina otrova/ubod

(nmol)

ENZIMI

Fosfolipaza A2

HijaluronidazaFosfolipaza BKisela

fosfomonoesteraza

Lizofosfolipaza

α-glukozidaza

10-12

1-31-

1

1

0.6

0.23

0.03--

0.03

-

-

PROTEINI I

PEPTIDI

Melitin

ApaminMCD peptid

Sekapin

Prokamin

AdolapinInhibitor proteaza

Terciapin

45-60

1-32

0.5-2

1-2

10.1-0.8

0.1

10-12

0.5-0.60.6

0.13

2

0.060.07

0.003

AMINI

Histamin

Dopamin Noradrenalin

0.5-2

0.13-10.1-0.7

5-10

2.7-5.50.9-4.5

UGLJIKOHIDRATIGlukozaFruktoza

2 -

AMINOKISELINE

-aminomaslačnakiselina

α-aminokiseline

0.4-0.5

1

-

-

FOSFOLIPIDI - 5 -HLAPLJIVI - 4-8 -



14

3.3.1. Hlapljiva komponenta pčelinjeg otrova

1. Izoamil acetat: to je ester izoamil odnosno izopentilnog alkohola i acetatne (octene)

kiseline. Bezbojan je spoj mirisa na banane.

Slika 6. Izoamil-acetat

Izvor: http://hr.wikipedia.org/wiki/izoamil-acetat

2. Propil-acetat: ester je propilnog alkohola i octene kiseline. Bezbojan spoj, mirisa na

kruške.

Slika 7. Propil-acetat

Izvor: http://hr.wikipedia.org/wiki/propil-acetat

3. Etil-acetat: ester etilnog alkohola i octene kiseline. Bezbojna tekućina slatkastog

voćnog mirisa.

Slika 8. Etil-acetat

Izvor: http://hr.wikipedia.org/wiki/etil-acetat



15

3.3.2. Fiziološki aktivni spojevi otrova

Nakon isparljive komponente dolazimo na puno kompleksniji i zanimljiviji dio u

sastavu pčelinjeg otrova. Kao što je već napomenuto, fiziološki aktivna frakcija pčelinjeg

otrova sadrţi velik broj aktivnih spojeva koji pripadaju u različite skupine kemijskih spojeva.

Tablica 3. Relativne molekulske mase vaţnijih spojeva u pčelinjem otrovu

Izvor: http://hr.wikipedia.org/wiki/

Melitin 2846,46

Fosfolipaza A2 30,000

Hijaluronidaza 53,870

Apamin 2027Adolapin 11500

MCD peptid 2593

Histamin 111,15

Noradrenalin 169,18

Dopamin 153,18

Sekapin 8763

Svaki od kemijskih spojeva u otrovu uzrokuje fiziološku reakciju karakterističnu za dotični

spoj, a svi zajedno djeluju nadopunjujuće, odnosno, na djelovanje jednog spoja nadovezuje sedrugi spoj itd. Da bismo prodrijeli u srţ djelovanja pčelin jeg otrova, nakon kemijskog sastava,

treba pobliţe objasniti svojstva svake pojedine komponente odnosno kemijskog spoja. Na taj

način moţemo donekle objasniti fiziološki mehanizam djelovanja otrova, odnosno shvatiti

kako koja pojedina komponenta djeluje na pojedini stanični dio.

Najvaţnije komponente su proteini, odnosno enzimi koji djeluju na ţivu stanicu i

aktivno mijenjaju konstelaciju staničnih komponenti počevši od stanične membrane.



16

3.3.2.1. Fosfolipaza A2

Fosfolipaze su enzimi koji hidroliziraju fosfolipide na masne kiseline, glicerol i

lipofilne komponente. Postoje 4 tipa fosfolipaza koje se razlikuju po tipu reakcije koje

kataliziraju, odnosno mjestu na kojem cijepaju lipide, a označavaju se: A, B, C, D(http://sr.wikipedia.org/wiki/Fosfolipaza_A2).

Enzim prepoznaje i cijepa PLA2 acilni lanac, dakle vezu izmeĎu drugog C atoma i

masne kiseline, oslobaĎajući arahidonsku kiselinu (Slika 9.). Arahidonska kiselina je po

kemijskoj strukturi karboksilna kiselina sa 20 C atoma i četiri cis -dvostruke veze. U

organizmu postaje esencijalna u slučaju deficita linolenske kiseline (Doery, Pearson, 1961.).

Slika 9. PLA2 - mjesto hidrolize fosfolipaze A2

Izvor: http://sr.wikipedia.org/wiki/fosfolipaza A2

Arahidonska kiselina se modificira pomoću enzima ciklooksigenaze i peroksidaze u aktivne

tvari zvane eikozanoidi u koje pripadaju prostaglandini, prostaciklini i tromboksani, vaţni

biološki medijatori u upalnim procesima, stoga inhibicija ciklooksigenaze moţe dovesti do

simptoma olakšavanja upale i bola. To je jedan od osnovnih principa djelovanja nesteroidnih

proutupalnih lijekova (ibuprofen, aspirin) (Lehninger, 2005.).

Fosfolipaze nalazimo u otrovu insekata kao i u zmijskom otrovu, koji se sastoji većinom od

melitina koji djeluje kao stimulator fosfolipaza. U konačnici, djelovanje fosfolipaza rezultira

bolom i upalom na mjestu reakcije (Doery, pearson, 1961.).



17

3.3.2.2. Fosfolipaza B

Fosfolipaza B ima kombinirano djelovanje fosfolipaze A1 i fosfolipaze A2, odnosno

moţe hidrolizirati acilne lance na sn1 i sn2 pozicijama (Slika 10.). Fosfolipaza B djeluje na

lizolecitin koji nastaje hidrolizom lecitina kojeg hidrolizira PLA2

(http://sr.wikipedia.org/wiki/Fosfolipaza_B.).

Slika 10. PLA1 i PLA2, mjesta djelovanja fosfolipaze B

Izvor: http://sr.wikipedia.org/wiki/fosfolipaza B

3.3.2.3. Hijaluronidaza

Hijaluronidaze su enzimi koji kataliziraju razgradnju hijaluronske kiseline,

konstituenta izvanstaničnog matriksa, čime se smanjuje njena viskoznost, odnosno povećava

se permeabilnost tkiva. Olabavljuje strukturu i potporu vezivnog tkiva te olakšava izmjenu

tekućina izmeĎu tkiva i krvnih ţila. U kombinaciji sa lijekovima pojačava njihovo usvajanje,

povećanjem propusnosti tkiva (Bruce, 2008.).

http://sr.wikipedia.org/wiki/Fosfolipaza_B






18

3.3.3. Peptidi: Apamin, terciapin, MCD-peptid, adolapin, sekapin

3.3.3.1. Apamin

Apamin je peptidni neurotoksin, sastavljen od 18 aminokiselinskih ostataka(Slika 11.).

Selektivno blokira SK kanal, vrstu kalcijem aktiviranog Ca2+

K + kanala, vaţnog u centralnom

ţivčanom sustavu. Blokiranjem SK kanala ometa se prijenos K + iona. Apamin je najmanji

peptidni toksin te prolazi krvno-moţdanu barijeru i stoga lako dolazi do ciljnog organa,

odnosno CNS-a (Faber, Sah, 2007.). Istraţivanja su pokazala da SK kanali imaju utjecaja na

sinaptičku plastičnost, vaţan mehanizam u procesu učenja i pamćenja, stoga se apamin moţe

koristiti kao terapija kod kognitivnih poremećaja i poremećaja u pamćenju (Haberman, 1984.).

Blokatori SK kanala imaju terapeutsko djelovanje na Parkinsonovu bolest na način da

blokiranjem SK kanala dolazi do otpuštanja dopamina iz dopaminergičkog neuronskog

sustava. SK kanali su ciljani kanali za liječenje epilepsije, shizofrenije i emocionalnih

poremećaja (Faber, Sah, 2007.).

Slika 11. Struktura apamina

Izvor: http://sr.wikipedia.org/wiki/apamin



19

3.3.3.2. Terciapin

Tertiapin je peptid sastavljen od 21 aminokiselinskih ostataka. Terciapin je opisan kao

snaţan blokator kalijevih kanala koji djeluje na dvije vrste K+ kanala: unutarnji ispravljač

kalijevog kanala, koji je vrsta selektivnog kalijevog kanala i kalcijem aktivirani veliki

provodnički kalijev kanal- BK (Kanjhan, Coulson, Adams, Bellingham, 2005.). Tertiapin se

moţe koristiti u tretmanima protiv boli i upala, npr. kod reumatoidnog artritisa i multiple

skleroze jer blokiranjem BK kanala produljuje fazu depolarizacije. To dovodi do inaktivacije

Na+ kanala osjetljivih na napon i time smanjuje senzorni prijenos prema centralnom ţivčanom

sustavu. Moguća ja i terapeutska primjena u liječenju infarkta miokarda (Drici, Lazdunski,

2000.).

Slika 12. Struktura terciapina

Izvor: http://sr.wikipedia.org/wiki/terciapin



20

3.3.3.3. MCD peptid – degranulator mastocita

Peptid degranulator mastocita ili MCD (mast cell degranulating) peptid, sastavljen je

od 22 aminokiselinska ostatka (Slika 14). Ovisno o aktivnom mjestu peptida te pri niţim

koncentracijama, MCD peptid dejluje imunotoksično, odnosno stimulira degranulaciju

mastocita i otpuštanje histamina u krv. Mastociti su slobodne stanice vezivnog tkiva koje

nastaju u koštanoj srţi, a krvlju dospijevaju u tkiva gdje dozrijevaju. Postoje vezivno -tkivni

mastociti koji u granulama sadrţavaju heparin, antikoagulantni faktor, te mukozni mastociti

(mastociti mukoze digestivnog i respiratornog trakta) koji u granulama sadrţe histamin). Pri

višim koncentracijama MCD peptid ima protuupalna svojstva i snaţan je blokator na napon

osjetljivih kalijevih kanala što uzrokuje neurotoksičnost te u pokusnih ţivotinja induciraepileptične napadaje.

Slika 13. Struktura MCD peptida

Izvor: http://sr.wikipedia.org/wiki/MCD



21

3.3.3.4. Adolapin

Adolapin je polipeptid molekulske mase 11500 koji pokazuje protuupalna i analgetska

svojstva te inhibira enzim ciklooksigenazu. TakoĎer je pronaĎeno da adolapin inhibira

djelovanje fosfolipaze A2 te lipooksigenaze. Inhibicijom ciklooksigenaze i fosfolipaze

umanjuje se stvaranje spojeva koji sudjeluju ili uvjetuju upalne i bolne procese (Koburova,

Mihailova, Skenderov 1985.).

3.3.3.5. Sekapin

Sekapin je peptid sastavljen od 25 aminokiselinskih ostataka. Opisan je već pred 39

godina, a tek je nedavno otkrivena njegova funkcija u pčelinjem otrovu. Otkriveno je da je

sekapin inducira upale i hiperalgezije (preosjetljivost na bol) kroz put lipooksigenaze te

uzrokuje nastanak edema (Moruelle, Palma, 2014.).

Tyr-Ile-Ile-Asp-Val-Pro-Pro-Arg-Cys-Pro-Pro-Gly-Ser-Lys-Phe-Ile-Lys-Asn-Arg-Cys-Arg-

Val-Ile-Val-Pro

Slika 14. Primarna struktura sekapina

Izvor: (http://www.rcsb.org/pdb/secapin/)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Koburova%20KL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2996298





22

3.3.4. Biogeni amini

Biogeni amini pčelinjeg otrova poznati su neurotransmiteri. Dopamin i noradrenalin

pripadaju ketokolaminima, a histamin indolaminima. Kod čovjeka neurotransmiteri se

sintetiziraju u ţivčanim završecima (sinaptičkim), u sinaptičkoj pukotini djeluju kao

prenosioci električnih signala izmeĎu neurona. Poremećaji u sintezi i razgradnji

neurotransmitera dovode do pojave psihofizičkih smetnji.

Noradrenalin je hormon stresa, nedostatak dopamina moţe uzrokovati Parkinsonovu bolest, a

histamin ima imunosnu ulogu (http://hr.wikipedia.org/wiki/Neurotransmiter).



23

4.MELITIN

Kao što znamo, melitin je glavna komponenta pčelinjeg otrova. Njegov sadrţaj kreće

se u rasponu od 50-70% (Szczesna&Rybak, Journal of Apicultural science, vol. 48, 2.2004.),a raspon u sadrţaju ovisi o sortimentu pčela, klimatskim uvjetima te ostalim faktorima

abiotske i biotske prirode.

Melitin je mali izrazito hemolitički peptid sastavljen od 26 aminokiselina (Slika 16.) od kojih

nijedna ne sadrţi sumpor. Primarna struktura odnosno slijed aminokiselinskih ostataka u

melitinu (Thomas, Eisenberg, 1981.), prethodno utvrĎena prema Habermann i Jentsch: Gly-

Ile – Gly – Ala – Val – Leu – Lys – Val – Leu – Thr – Thr – Gly – Leu – Pro – Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-

Arg-Lys-Arg-Gln-Gln.

Na staničnu membranu djeluje tako da formira pore, ulazeći u membranu u α-

helikalnoj konformaciji i ima višestruke efekte, vjerojatno kao rezultat interakcije sa negativno

nabijenim fosfolipidima. Inhibira Na-K pumpu, ATP-azu te H-K-ATP-azu. Povećava

permeabilnost membrane za ione, posebno prema Na(+) te indirektno prema Ca(2+), zbog

izmjene 2Na(+) za Ca(2+). Djeluje sinergistički sa fosfolipazom A2.

(http://www.rcsb.org/pdb/protein/P01501-UniProt ) 2014.

Isto je tako poznato da pojedine komponente otrova, ili otrov u cijelosti, mogu biti korištene

kao fungicidi, mikrobicidi, a najzanimljivija je činjenica da posjeduju anti-tumorska svojstva.

Melitin je najviše proučavani peptid pčelinjeg otrova najviše zbog izraţenih antitumorskih

svo jstava te predstavlja izuzetan potencijal u borbi protiv više vrsta tumora. O čemu će biti

opširnije kasnije u tekstu.

http://www.uniprot.org/uniprot/P01501






24

Ovaj peptid je amfipatski, što znači da sadrţi hidrofilne i hidrofobne komponente.

Molekula je pakirana u dva lanca koji su savijeni, hidrofilne aminokiseline se nalaze na

površini molekule, a hidrofobne su zaštićene u središtu lanca (Lubke et.al 1971.). Slijedaminokiselina od 1. pa do 20. čine većinom hidrofobni aminokiselinski ostaci, a od 21. pa do

26. ostatka, hidrofilni. Zbog toga se melitin smatra kationskim detergentom (Habermann i

Jentsch, 1967.)

Takav raspored aminokiselina čini melitin topljivim u vodi, a pri kontaktu sa lipidnim

dvoslojem (staničnom membranom) on spontano integrira u taj dvosloj i djeluje kao litički

agens (Habermann i Kowallek, 1970.). Melitin ima izrazita svojstva površinski aktivne tvari te

u vodi vrlo brzo stvara film, a po brzini penetracije u lecitin i miješane lipide premašuje sveznane biološke surfaktante.

Hemolitički efekt melitina na eritrocite temelji se na njegovoj sposobnosti penetracije u

trodimenzionalne strukture fosfolipida (Sessa, et al, 1970.). Melitin penetrira u lipidne

jednoslojeve bez obzira na naboj površine lipida, a u umjetno prireĎene liposome ulazi unatoč

pozitivnom ili negativnom neto naboju liposoma (Sessa 1969.). Habermann je 1972.

napomenuo da nema čvrste povezanosti izmeĎu površinske aktivnosti i hemolitičkih svojstava

melitina, te da na ta svojstva uvelike utječu drugi molekularni parametri.

Melitin ne oštećuje samo eritrocite, već i leukocite i njihove lizosome te trombocite

(otpuštajući serotonin), mastocite (otpuštajući histamin), zatim mišićno tkivo (otpuštajući

kalijeve ione te organske i anorganske fosfate).

Kao i ostali detergenti, melitin oštećuje membranske sustave, oslabljuje elektronski transport u

mitohondrijima te odvaja oksidaciju od fosforilacije (Habermann, 1972.).

Uvijanje molekule melitina te termodinamika tetramerizacije odreĎena je metodom

cirkularnog dikroizma (Eisenberg, 1992.).



25

Melitin se konvertira iz monomernog nasumičnog klupka u α-helikalni tetramer (Slika 16) kod

promjene pH od 4.0 prema 9.5, odnosno pri povećanju ionske jakosti ili kod dodatka fosfata

(Wilcox, Eisenberg, 1992.). Tetramer melitina ima dvije pKa vrijednosti: 7.5 i 8.5 što

odgovara protonaciji N-terminalnog dijela i lizina 23. Najstabilniji je pri temperaturi izmeĎu

35.5 i 43 stupnja C, ovisno o pH (Gilson & Honig, 1988.).

Slika 15. Prikaz kvaterne strukture tetramera melitina

Izvor: (http://www.rcsb.org/pdb/protein/P01501-UniProt)

Na staničnoj membrane melitin formira tetramerne pore koje olakšavaju difuziju iona

(Shipolini 1984). Melitin se takoĎer veţe na komponente koţe čineći čvrsti kompleks

(Shipman & Cole 1972). Formiranje tog kompleksa vrši se specifično, vezivanjem na

akceptore, a ne formira se sa albuminima seruma. Opaţeno je i da melitin pokazuje svojstva

površinski aktivne tvari te izrazito jaka hemolitička svojstva (Eisenberg, Terwiligert,

Interpretation of the melittin structure, 1981.).



26

4.1. Biosinteza melitina

Biosinteza melitina proučavana je in vivo na temelju ishrane pčela sa radioaktivnimaminokiselinama kojima je dio vodika zamijenjen radioaktivnim tricijem. Korištenjem ovog

pristupa proučavana je inkorporacija označenih aminokiselina, što je omogućilo istraţivanje

sinteze otrova tijekom sazrijevanja imaga. Ekstrakti iz otrovne ţlijezde su analizirani i

utvrĎeno je prisustvo označenih aminokiselina i drugih spojeva (Kreil, Bachmayer,

Biosynthesis of Melittin, 1970.)

Proizvodnja otrova započinje nakon izlaska imaga iz kukuljice i tokom dvotjednog perioda

otrovna ţlijezda ga proizvede oko 0.05 µmola i kao što je već navedeno oko 50% količine

otrova otpada na melitin.

Pri istraţivanju biosinteze melitina utvrĎeno je da melitin nastaje iz manje potentnog

prekursora, odnosno promelitina, što je utvrĎeno i pri biosintezi mnogih fiziološki aktivnih

peptida, odnosno utvrĎeno je prisustvo radioaktivnog peptida koji je imao karakteristike

predviĎene za prekursor melitina (Kreil, Bachmayer, Biosynthesis of Melittin, 1971.). Takav

mehanizam sinteze snaţnog hemolitičkog peptida nuţan je jer bi u protivnom došlo do

razaranja tkiva otrovne ţlijezde. Stoga Habermann (1972.) predlaţe stvaranje "sigurnog"

prekursora, koji se pretvara u aktivni toksin tek nakon što se odstranjuje sa ribosoma i sprema

u otrovnu vrećicu. Aktivacija promelitina u melitin odvija se pod utjecajem stroge enzimske

kontrole iako taj proces nije do kraja istraţen (Beament, 2011.).

UtvrĎeni su dodatni nizovi na N-terminalnom dijelu promelitina, bogati kiselim ostacima i

prolinom. To moţe dovesti do povećane topljivosti promelitinskog monomera i smanjiti

tendenciju za formiranje površinski aktivnog agregata (Kreil, 1973.).

Metodom komplementarne fluorescencije odreĎene su brzine vezivanja melitina i promelitina

sa lipidnim membranama. Otkriveno je da se n-terminalna regija melitina vrlo brzo veţe i

umeće u membranu sa konstantom od 367 s-1, zatim pozitivni naboj melitina dolazi do



27

proksimalne interakcije sa membranom sa konstantom oko 27 s-1. Nabijene regije se u

konačnici umeću u hidrofobnu jezgru membrane sa konstantom od 0.3 s-1.

PronaĎene su sekcije promelitina koje se veţu i umeću u fosfolipidnu membranu, ali oko 30

puta sporije od molekule melitina. Nabijene sekcije promelitina nisu se vezivale samembranom (Wolfe, Cladera, O'Shea, 1998.).



28

5. LJEKOVITA SVOJSTVA I UPOTREBA PČELINJEG OTROVA

Ministarstvo poljoprivrede i šumarstva. Pravilnik o kakvoći meda i drugih pčelinjih proizvoda.

Narodne novine (70/97 i 36/98).

PČELINJI OTROV:

Članak 19.

Pčelinji otrov jest proizvod otrovne ţlijezde pčela radilica.

Članak 20.

Pčelinji otrov stavlja se na trţište sušen u obliku bijelog kristaličnog praha.

Članak 21.

Rok trajanja pčelinjeg otrova je jedna godina.

Pčelinji proizvodi kao što je med, propolis, vosak, matična mliječ i otrov se koriste već

tisućama godina u liječenju različitih oboljenja i fizioloških stanja.

Liječenje i načini primjene apiterapije su se do sad odrţavali usmenom predajom i „domaćim“

receptima, a znanstvena istraţivanja ozbiljnijeg tipa su započela pred nekoliko desetaka

godina, ako izuzmemo kemijska/biokemijska istraţivanja sastava pčelinjih proizvoda.

Vrijeme početka primjene pčelinjeg otrova i drugih pčelinjih pripravaka za liječenje,odnosno apiterapije, ne moţemo točno odrediti, ali pouzdano znamo da su već stari Egipćani,

Grci, Rimljani i Kinezi upotrebljavali pčelinje pripravke za liječenje mnogih oboljenja.

Povijest primjene pčelinjih proizvoda moţe se pratiti iz starih vjerskih tekstova; Veda, Biblije,

Qrana i drugih.



29

Slika 16. Eros, Venera i pčele, A. Dürer, 1514

Izvor: : http://en.wikipedia.org/Eros_and_bees

Moderne studije apiterapije, osobito pčelinjeg otrova, započeo je austrijski liječnik

Philip Terc koji ih je objavio u publikaciji „Izvještaj o čudnoj vezi izmeĎu pčelinjeg uboda i

reumatizma“, 1888. godine. Recentna popularnost pridaje se Charlesu Mrazu (1905-1999)

pčelaru iz Vermonta u zadnjih 60 godina.

Apiterapija obuhvaća primjenu pčelinjih proizvoda, najviše pčelinjeg otrova, a ne

konzumaciju meda.

Za sada još uvijek nema standardizirane primjene pčelinjeg otrova pa se njegova upotreba

moţe podijeliti na:

direktnu primjenu ubodom jedne, nekoliko ili više stotina pčela

primjenu osušenog, liofiliziranog otrova sa svim komponentama i

primjenu pojedinih komponenti iz otrova, npr. melitina, fosfolipaze, apamina itd.

Ljekovita svojstva pčelinjeg otrova poznata su još iz davnih vremena čovjekove povijesti pa se tako još u starom Egiptu liječilo mnoge bolesti pčelinjim pripravcima i

naravno, otrovom.

U pučkoj medicini se primjenjuje kao antireumatik, a novija istraţivanja primjene pčelinjeg

otrova u liječenju pokazuju da pčelinji otrov utječe na umanjivanje boli, sniţen je krvnog tlaka,

http://en.wikipedia.org/Eros_and_bees






30

smanjenje kolesterola u krvi, povećanje radne sposobnosti. Orijentalna medicina razvila je

metodu liječenja upalnih bolesti i kroničnih bolnih stanja ubodima pčela u akupunkturne točke

(apipunktura). Nakon što je razvijen postupak dobivanja pčelinjeg otrova, ova terapija raširila

se svijetom. Terapijski postupak se provodi potkoţnim ubrizgavanjem otrova injekcijom u

oboljela mjesta ili u akupunkturne točke. Istraţivanja su pokazala da apipunktura moţe biti

učinkovita alternativna metoda liječenja pacijenata s bolnim oštećenjima ţivčanih završetaka

(neuropatija) posebno kod onih koji slabo reagiraju na analgetike. U liječenju se danas

primjenjuju razni apitoksinski preparati u obliku injekcija za potkoţnu i intravensku primjenu

ili se na bazi otrova izraĎuju masti i kreme. TakoĎer se efikasnom pokazala metoda uvoĎenja

otrova kroz koţu postupkom elektroforeze i ultrazvuka. Izvrsni rezultati liječenja pčelinjim

otrovom pokazali su se kod astme, koprivnjače (urtikarije), upale ţivaca (neuritis,

lumboishialgija, išijas) i jakih bolova u predjelu ţivaca (neuralgija ţivca trigeminusa), upaleslušnog ţivca, osteohondroze, neuralgije kriţa, Behterevljeve bolesti, reumatskih bolesti,

reumatoidnog artritisa, reumatskog poliartritisa, artroze (kraljeţnice i koljena), upale

arterijskog zida (endarteritis), kod postoperativnih oţiljaka, upale jajnika, jajovoda i nekih

dijelova maternice, psorijaze, multiple skleroze i imunoterapije.

Danas se sve više istraţuje protutumorski učinak pčelinjeg otrova. Protutumorski učinak se

prepisuje melitinu, bazičnom polipeptidu koji čini 50-70 % suhe tvari pčelinjeg otrova.

Zaustavljanje njihova rasta temelji se na inhibiciji kalmodulina, proteina koji veţe kalcij i imavaţnu ulogu u staničnoj proliferaciji. Melitin je pokazao najsnaţniju citotoksičnu aktivnost na

leukemijske stance miša i ljudi u odnosu na druge strukturno slične sastavnice koje inhibiraju

aktivnost kalmodulina. Opaţanja pokazuju da protutumorski i protumetastatski učinak

pčelinjeg otrova ovisi o načinu davanja pčelinjeg otrova i da jedan od mehanizama zasigurno

jest izravni doticaj tumorskih stanica s sastavnicama pčelinjeg otrova koji uzrokuje promjene

u strukturi i funkciji receptora na opni tumorskih stanica kao i cijeloj tumorskoj stanici, te

induciraju smrt stanice apoptozom i/ili nekrozom.

Uočen je farmakološki sinergizam melitina sa antibioticima i sekundarnim biljnim

metabolitima protiv patogenih mikroorganizama (Issam, Stefan, Reichling, Winka, 2014.).

Pčelinji otrov i melitin pokazali su širok i spektar antibakterijske aktivnosti i to protiv 51

soja Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija. Otrov i melitin imaju takoĎer i fungicidna

svojstva.



31

UtvrĎeno je da pčelinji otrov i melitin sinergistički pojačavaju baktericidno i fungicidno

djelovanje lijekova, a pogotovo kad lijek utječe na više molekularnih ciljeva (Issam, Stefan,

Reichling, Winka, 2014.).

Tablica 4. – biološka djelovanja pčelinjeg otrova i njegove komponente

(http://en.wikipedia.org/wiki/apitherapy.).

Komponenta Djelovanje

Melitin Veće doze uzrokuju upalu, bol i spazam bronhija, smanjuju krvnitlak i sprječavaju zgrušavanje krvi, djeluju antibakterijski, štite odzračenja, djeluju na centralni ţivčani sustav. Male dozesprječavaju upale. Proširena citotoksičnost i hemoliza

Fosfolifaza A2 Hidrolizira fosfolipide i time rastvara staničnu membranu krvnihtjelašca, smanjuje krvni tlak i sprječava zgrušavanje krvi. Jaki jealergen i zbog toga najštetniji sastavni dio pčelinjeg otrova

Hijaluronidaza Omogućuje daljnje prodiranje otrova u tkivo, proširuje krvne ţile i povećava njihovu propusnost, tako da dolazi do povećane prokrvljenosti; alergen

Kisela fosfataza Alergen

Apamin Biološki aktivan peptid, nervni otrov. Stimulira oslobaĎanjetjelesnog kortizola, djeluje protuupalno, pojačava obrambenisustav

MCD peptid OslobaĎa biogene amine iz mastocita i prouzrokuje bol Inhibitor proteaza Smanjuju aktivnost različitih proteaza: tripsin, kimotripsin,

plazmin, trombin. Protuupalno djelovanje, zaustavlja krvarenje

Adolapin Protuupalno, antireumatski, ublaţava bolove

Histamin Proširuje krvne ţile i povećava prokrvljenost; alergen



32

6. UreĎaj za prikupljanje pčelinjeg otrova

Tehnologija u svim sferama ljudske djelatnosti svakim danom postaje sve razvijenija i

sloţenija, a tehnologija dobivanja pčelinjeg otrova ostala je ista, odnosno pčelinji otrovdobivamo elektrostimulacijom (elektrošokovima). Valja napomenuti da to nije jedini način

dobivanja otrova, ali je najjednostavniji i najučinkovitiji, a sa aspekta očuvanja zdravlja i

kvalitete ţivota pčelinje zajednice te pčele kao jedinke, najmanje štetan. Naime, drugi načini

dobivanja otrova podrazumijevaju fizičko izdvajanje ţalčanog aparata iz tijela pčele te

njegovo otvaranje, istiskivanje otrova, što na kraju dovodi do uginuća pčele. U suvremenom

pčelarstvu takav način je nedopustiv jer time gubimo pčele, a količine dobivenog otrova su

male zbog nemogućnosti „obrade“ većeg broja pčela u kratkom vremenu. Takav način

primjenjuje se samo u znanstvene svrhe, odnosno, kad su potrebne male količine otrova radi

kemijske i drugih analiza te kod proučavanja fiziologije sinteze otrova itd.

Dakle, dobivanje pčelinjeg otrova elektrostimulacijom omogućava nam dobivanje većih

količina otrova od velikog broja pčela bez ugroţavanja ţivota pčela i sigurnosti zajednice.

Naravno samo ako se pridrţavamo osnovnih pravila „dobre pčelarske prakse“.

Najčešći način dobivanja otrova je, kao što je spomento, elektrostimulacija, a jedino što je

bitno napomenuti jest da postoji velik broj različitih inačica, design-ova elektrostimulatora

(slika 18.). Detaljnijim uvidom u ureĎaje, vidimo da su svi slični i da na ovaj ili onaj način,

svaki od njih ima slični patent koji se ponavlja, uveden pred 30 -ak godina (Solodukho, et al.,

1977,1978.) te kasnije poboljšan (Oshevensky et al., 1985.). Najveća razlika meĎu ureĎajima

se moţda nalazi u sustavu upravljanja koji moţe biti ručni ili automatski te u kontroli oblika,

frekvencije, i amplitude izlaznog signala (elektrošoka) zajedno sa duljinom rada ureĎaja.

Potrebno je spomenuti da razlike mogu biti i u pomoćnim elementima ureĎaja, odnosno

raznim svjetlosnim i zvučnim indikatorima rada i pojedinih faza u radu ureĎaja, itd.



33

Slika 17. UreĎaj za prikupljanje otrova

Izvor: (http://google.com/venom/collector)

Dijelovi ureĎaja:

1. Izvor struje (akumulator ili ispravljač)

2. Elektronički dio (regulacija toka struje, napona, frekvencije, memorija)

3. Kolektorski okvir koji se sastoji od ţičane mreţe (koja je pod naponom), staklene ploče

tanke polietilenske membrane izmeĎu. Ovisno o konstrukciji kolektorski okvir moţe biti

različitih veličina i postavlja se izvan košnica na leto. Pčele pri slijetanju na ploču, odnosno pri

dodiru sa ţičanom mreţom zatvaraju strujni krug i dolazi do elektrostimulacije. Pritom zbog

elektrošoka savinu zadak prema ploči i pri dodiru ţalca sa pločom, ispuštaju otrov na ploču.

Cijeli proces sakupljanja otrova kod jedne pčelinje zajednice traje pola sata do najviše 45

minuta, amoţe se ponoviti svaka 3 tjedna. U slučaju da stimulator radi duţe od sat vremena,

odnosno da se otrov prikuplja prečesto, dolazi do negativnih posljedica za pčelinje društvo.

Pčelinji otrov iz ţalca izlazi u tekućem stanju pa se nakon sakupljanja mora osušiti na

tamnom mjestu. Suhi se otrov zatim struţe sa stakla i stavlja u tamnu staklenu posudicu i

stavlja na hladno. Da bi otrov ostao kvalitetan, potrebno ga je spremiti što prije na temperaturu

od -20°C. Tako spremljen otrov moţe se skladištiti nekoliko godina, a da ne gubi na kvaliteti.



34

U apiterapiji se najčešće koristi liofilizirani otrov, odnosno sušen u dubokom vakumu.

U alergologiji se koristi posebno očišćen otrov.

6.1. Način rada elektrostimulatora

Tehniku skupljanja pčelinjeg otrova elektrošokovima prvi su opisali Markovic i

Mollnar (1954.). Postoje različiti modeli i načini (Benton et al. 1963., Nowotnick, 1992.,

Nentschev, 1995., Krivtzov 1995., Fakhimzadeh 1998., i Šimić 1998.). Uvjeti za skupljanje

pčelinjeg otrova razlikuju se od autora do autora: napon 24-30 V, trajanje impulsa 2-3

sekunde, pauza od 3-6 sekundi i frekvencija impulsa od 50 do 1000Hz. Pčelama ne šteti

prilikom skupljanja otrova.

Princip rada elektrostimulatora svodi se na proizvodnju pulsirajućeg električnog

signala odreĎene frekvencije i amplitude, napona od 25-35V, njegovog grupiranja u klastere

odreĎene duljine trajanja, izmeĎu kojih je pauza, odnosno nema signala.

Svaki od ovih parametara signala moţe varirati, odnosno moţe biti promijenjen ovisno o

načinu i duljini trajanja rada ureĎaja. Npr. jačina signala, o blik impulsa (pravokutan,

sinusoidni...), frekvencija, duljina trajanja klastera (skupa signala) te pauzi izmeĎu njih.

Promjenu parametara moţemo regulirati ručno ili automatski, primjenom mikrokontrolera.



35

Slika 18. UreĎaj za prikupljanje otrova u radu

Izvor: http://pcelarstvo_radosevic/sakupljac)

Prikupljanje otrova (slika vrši se periodično iz nekoliko razloga, a najvaţniji je, što manjeugroziti ţivot pčelinje zajednice. Time ostavljamo mogućnost oporavka pčelinje zajednice,

odnosno ostavljamo izvjestan broj pčela „netaknut“ jer pčela bez otrova u odreĎenim

slučajevima nije u stanju efikasno braniti zajdenicu.

U dobivanju otrova moguće su osim klasičnih metoda i „proširene“ metode kao što je

zdruţena primjena elektrošokova i zvučnih valova. U tu se svrhu koriste standardni

elektrostimulatori, a zvuk se proizvodi generatorom zvuka i reproducira u zvučniku.

Frekvencija zvuka iznosi 130-250 Hz, jačine 80 dB (Muszynska & Rybak, 2002.)

Istraţivanja provedena u Poljskoj od 1998. do 2000. pokazala su da komb iniranom primjenom

elektrošokova i zvučnih valova dolazi do značajnih povećanja u prinosu otrova, čak za 86%

(Rybak i Skubida,2001.) količine dobiveneog otrova sa elektrostimulacijom bile su u rangu:

0.02-0.023 grama po košnici, dok su kod kombinirane prim jene iznosile: 0.02-0.4 grama po



36

košnici. Pretpostavlja se da frekvencija zvuka u rasponu 130-250Hz utječe na pojačanu fizičku

aktivnost pčela, čime se i pojačava djelovanje mišića ţalčanog aparata

(Rybak&Muszynska,1998.).



37

7. Zaključak

Pčelinji otrov ili apitoksin je gorka, gusta, homogena otopina koja se biosintetizira u

otrovnoj ţlijezdi pčela. Karakteristike otrova ovise o njegovom sastavu koji varira s obzirom

na vrstu pčele. Najviše je proučavan otrov medonosne pčele Apis mellifera mellifera, a

njegova ljekovita svojstva uočena su već na početku ljudskog interesa prema pčelama. Do

danas je u otrovu identificirano preko 60 različitih spojeva, od kojih najizraţenije fiziološki

aktivno i hemolitičko djelovanje imaju melitin, fosf olipaza A2, hijaluronidaza, MCD peptid,

apamin, prokamin te fiziološki aktivni amini kao histamin i dopamin. Pčelinji otrov se koristi

u liječenju brojnih reumatskih i koţnih bolesti, a uočena je i njegova protutumorska aktivnost.

Melitin, peptid kojeg u otrovu ima oko 50% od suhe tvari je najinteresantniji zbog dokazane

hemolitičke i protutumorske aktivnosti. U sinergiji sa fosfolipazama djeluje puno intenzivnije.

Ispitivanja uvoĎenja nanotehnologija u pripremi melitina kao protutumorskog cjepiva

pokazala su pozitivne rezultate te se intenzivno provode. Melitin se inkapsulira u polimerne

nanočestice koje su obloţene odreĎenim markerom koji ima povećani afinitet prema

tumorskim stanicama i time kontrolirano djeluje na oboljele stanice. Pčelinji otrov te meli tin

predtvaljaju alternativni iskorak u borbi sa teškim oboljenjima te će se u budućnosti zacijelointenzivno koristiti. Pčelinji otrov u komercijalne svrhe dobivamo sakupljanjem na

pčelinjacima, metodom elektrošokova, djelovanjem slabe struje. Melitin i pojedine

komponente otrova se mogu proizvoditi i kemijskim putem.



38

8. Popis literature

1. Alberts, B. (2008): Molecular biology of the cell. New York: Garland Science, p. 1298.

2. Belčić, J., Sulimanović, Đ., Katalinić, J. (1985.): Pčelarstvo, Nakladni zavod Znanje,

Zagreb: 67-68.

3. Doery, H.M., Pearson, J.E. (1961): Haemolysins in venoms of Australian snakes.

Observations on the haemolysins of the venoms of some Australian snakes and the separation

of phospholipase A from the venom of Pseudechis porphyriacus, Biochemical Journal, 78:

820-827.

4. Drici, M.D., Diochot, S., Terrenoire, C., Romey, G., Lazdunski, M. (2000): The bee venom

peptide tertiapin underlines the role of IKACh in acetylcholine-induced atrioventricular

blocks, British Journal of Pharmacology 131 (3): 569-577. doi:10.1038/sj.bjp.0703611.

PMC 1572365. PMID 11015309.

5. Faber, E.S.L., Sah, P. (2007): Functions of SK channels in central neurons, Clinical andexperimental pharmacology and physiology 34 (10): 1077-1083.

6. Gilson, M.K. & Honig, B.H. (1988) Energetics of charge-charge interactions in proteins,

Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 3 (1), 32-52.

7. Habermann, E., (1984): Apamin, Pharmacology & Therapeutics 25 (2): 255-70.

doi:10.1016/0163-7258(84)90046-9. PMID 6095335

8. Issam, AL-A., Zimmermann, S., Reichlinga, J., Winka, M. (2014):Pharmacological

synergism of bee venom and melittin with antibiotics and plant secondary metabolites against

multi-drug resistant microbial pathogens, Phytomedicine 22 (2) 245-255.

http://en.wikipedia.org/wiki/Digital_object_identifier

http://en.wikipedia.org/wiki/PubMed_Identifier

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6095335

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6095335

http://en.wikipedia.org/wiki/PubMed_Identifier

http://en.wikipedia.org/wiki/Digital_object_identifier



39

9. Kreil, G., Bachmayer, H. (1971): Biosynthesis of Melittin, a Toxic Peptide from Bee

Venom, European Journal of Biochemistry, 20 (3) 344-350.

10. Kanjhan, R., Coulson, EJ., Adams, D.J., Bellingham, M.C. (2005): Tertiapin-Q blocks

recombinant and native large conductance K+ channels in a use-dependent manner, The

journal of pharmacology and experimental therapeutics 314 (3): 1353-1361.

ydoi:10.1124/jpet.105.085928. PMID 15947038.

11. Laktić, Z., Šekulja, D. (2008): Suvremeno pčelarstvo, Nakladni zavod Globus, Zagreb:

338-341.

12. Ministarstvo poljoprivrede i šumarstva. Pravilnik o kakvoći meda i drugih pčelinjih

proizvoda. Narodne novine (70/97 i 36/98).

13. Son, D. J., Lee, J.W., Lee, Y.H., Song, H.S., Lee, C.K., Hong, J.T. (2007): Therapeutic

application of anti-arthritis, pain-releasing, and anti-cancer effects of bee venom and its

constituent compounds, Pharmacology & Therapeutics 115 (2): 246-70.

14. Szczęsna, T., Rybak -Chmielewska, H., (2004): The temperature correction factor for

electrical conductivity of honey, Journal of Apicultural science, 48 (2) 97-102.

15. Tucak Z., Bačić D., Horvat S., Puškadija Z. (2005): Pčelarstvo, Sveučilište J.J.

Strossmayera.

16. Wilcox, W., Eisenberg, D. (1992): Thermodynamics of melittin tetramerization

determined by circular dichroism and implications for protein folding, Protein Science 1(5):

641-53.



40

17. Wolfe, C., Cladera, J., O'Shea, P. (1998): Amino acid sequences which promote and

prevent the binding and membrane insertion of surface-active peptides: comparison of melittin

and promelittin, Molecular Membrane Biology 15(4): 221-7.



41

9. SAŽETAK

Pčelinji otrov medonosne pčele Apis mellifera mellifera njegova ljekovita svojstva

uočena su već u pčecima ljudskog rada sa pčelama. Do danas je u otrovu identificirano preko

60 različitih spojeva, od kojih najizraţenije fiziološki aktivno i hemolitičko djelovanje imaju

melitin, fosfolipaza A2, hijaluronidaza, MCD peptid, apamin, prokamin te amini, histamin i

dopamin. Pčelinji otrov se koristi u liječenju brojnih bolesti, a uočena je i njegova

protutumorska aktivnost. Melitin, peptid kojeg u otrovu ima oko 50% od suhe tvari je

najinteresantniji zbog dokazane hemolitičke i protutumorske aktivnosti. U sinergiji sa

fosfolipazama djeluje puno intenzivnije. Ispitivanja uvoĎenja nanotehnologija u pripremi

melitina kao protutumorskog cjepiva pokazala su pozitivne rezultate te se intenzivno provode.

Melitin se inkapsulira u polimerne nanočestice koje su obloţene odreĎenim markerom koji

ima povećani afinitet prema tumorskim stanicama. Pčelinji otrov te melitin predtvaljaju

alternativni iskorak u borbi sa teškim oboljenjima te će se u budućnosti zacijelo intenzivno

koristiti..

Ključne riječi: pčelinji otrov, melitin, primjena, protutumorska aktivnost



42

10. Summary

Bee venom and its healing properties were observed already at the begining of the

human interest in bees. To date, more than 60 different compounds have been identified in this

venom. Some of them, such as a melittin, phospholipase A2, hyaluronidase, MCD peptide,

apamine, prokamine and physiologically active amines such as histamine and dopamine, have

the most expressed physiological influence on the cell. Bee venom is used in treatment of

many diseases, and also its antitumor activity has been observed. Melittin, a peptide which

amount in the poison is about 50% of dry matter, is more interesting because of its proven

haemolytic and antitumor activity. It works much more intensley in synergy with

phospholipases. Investigations of introduction of nanotechnology in the preparation of melittin

as an anticancer drug have shown positive results and are carried out intensively. Melittin is

being encapsulated in polymeric nanoparticles that are coated with a specific marker which

has an increased affinity towards the tumor cells and thus it acts on affected cells in a

controlled way. Bee venom and melittin represent an alternative step forward in the fight

against serious diseases and will certainly be used intensively in the future.

Key words: bee venom, melittin, haemolytic and anti-tumor activity , use of bee venom in

medicine



43

11. POPIS SLIKA

Slika 1. Crteţ iz pećine, Bicorp, Španjolska: Sakupljanje meda

Slika 2. Kranjska pčela, Apis mellifera mellifera carnica

Slika 3. Pčela ostaje bez ţalčanog aparata

Slika 4. Shematski prikaz otrovne ţlijezde sa ţalčanim aparatom

Slika 5. Ţalac radilice sa vidljivim zupcima

Slika 6. Izoamil-acetat

Slika 7. Propil-acetat

Slika 8. Etil-acetat

Slika 9. PLA2 - mjesto hidrolize fosfolipaze A2

Slika 10. PLA1 i PLA2, mjesta djelovanja fosfolipaze B

Slika 11. Struktura apamina

Slika 12. Struktura terciapina

Slika 13. Struktura MCD peptida

Slika 14. Primarna struktura sekapina

Slika 15. Prikaz kvaterne strukture tetramera melitina

Slika 16. Eros, Venera i pčele, A. Dürer, 1514

Slika 17. UreĎaj za prikupl janje otrovaSlika 18. UreĎaj za prikupljanje otrova u radu



44

12. POPIS TABLICA

Tablica 1. Sistematika pčela (http://hr.wikipedia.org/wiki/Pčele)

Tablica 2. Sastav čvrstih tvari u pčelinjem otrovu, njihova koncentracija (%) i količina otrovau ubodu, nmol/ubod (O'Connor, Peck, Crane, 1990.)

Tablica 3. Relativne molekulske mase vaţnijih spojeva u pčelinjem otrovu

Tablica 4. – biološka djelovanja pčelinjeg otrova i njegove komponente

13. INTERNET STRANICE

http://honeybee.drawwing.org/book/dufour%E2%80%99s-gland (2014)

http://www.chm.bris.ac.uk/webprojects2001/loveridge/index-page8.html (2014)

http://www.rcsb.org/pdb/protein/P01501-UniProt (2014)

http://www.pcelarstvo-radosevic.hr/pcelinji-proizvodi/otrov (2014)

http://hr.wikipedia.org/wiki/P%C4%8Dele






45



TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera

Poljoprivredni fakultet u Osijeku

Diplomski rad


THE WAY OF OBTAINING AND USE OF BEE VENOM

Kristijan Peras

Sažetak: Pčelinji otrov medonosne pčele Apis mellifera mellifera njegova ljekovita svojstva uočena su

već u pčecima ljudskog rada sa pčelama. Do danas je u otrovu identificirano preko 60 različitih spojeva,

od kojih najizraženije fiziološki aktivno i hemolitičko djelovanje imaju melitin, fosfolipaza A2,hijaluronidaza, MCD peptid, apamin, prokamin te amini, histamin i dopamin. Pčelinji otrov se koristi u

liječenju brojnih bolesti, a uočena je i njegova protutumorska aktivnost. Melitin, peptid kojeg u otrovu

ima oko 50% od suhe tvari je najinteresantniji zbog dokazane hemolitičke i protutumorske aktivnosti. U

sinergiji sa fosfolipazama djeluje puno intenzivnije. Ispitivanja uvoĎenja nanotehnologija u pripremi

melitina kao protutumorskog cjepiva pokazala su pozitivne rezultate te se intenzivno provode. Melitin se

inkapsulira u polimerne nanočestice koje su obložene odreĎenim markerom koji ima povećani afinitet

prema tumorskim stanicama. Pčelinji otrov te melitin predtvaljaju alternativni iskorak u borbi sa teškim

oboljenjima te će se u budućnosti zacijelo intenzivno koristiti..

Ključne riječi: pčelinji otrov, melitin, primjena, protutumorska aktivnost

Summary:Bee venom and its healing properties were observed already at the begining of the human

interest in bees. To date, more than 60 different compounds have been identified in this venom. Some of

them, such as a melittin, phospholipase A2, hyaluronidase, MCD peptide, apamine, prokamine and

active amines such as histamine and dopamine, have the most expressed physiological influence on the

cell. Bee venom is used in treatment of many diseases, and also its antitumor activity has been observed.

Melittin, a peptide which amount in the poison is about 50% of dry matter, is more interesting because ofits proven haemolytic and antitumor activity. It works much more intensley in synergy with

phospholipases. Investigations of introduction of nanotechnology in the preparation of melittin as an

anticancer drug have shown positive results and are carried out intensively. Melittin is being

encapsulated in polymeric nanoparticles that are coated with a specific marker which has an increased

affinity towards the tumor cells and thus it acts on affected cells in a controlled way. Bee venom and

melittin represent an alternative step forward in the fight against serious diseases and will certainly be

used intensively in the future.

Key words: bee venom, melittin, haemolytic and anti-tumor activity, use of bee venom in medicine





Documents

Kristijan Peras.pdf