"SELEKC!JA I SEMENARSTVO"PlANT BREEDING AND SEED PRODUCTION, VOL. VIII, No . 1-4 (2001) , STR. 45-49, NOVI SAD

UDK

KORISCENJE PROTEINSKIH MARKERA ZA KARAKTERIZACIJUI UTVRDIVANJE GENETICKE CISTOCE SEMENA KUKURUZA

DRINIC MIADENOVIC, SNEZANA, KONSTANTINOV, KOSANAI

IZVOD: Kontrola geneticke Cistoce i identtfikacija genotipa je od velikog znacaja II suimjazama proizuodnje eksperimentalnih i komercijalnib hibrida i odrzauanju linija kukuruza. (J

radu su korticeni proteini kttce za geneticleu karakterizaciju genotipoua kuleuruza kao i zauturdiuanjegeneticke cistoce semena. Eiektroforezomproteini klice su razduojeni na uelileibrojfrakcija koje pokazuju oisoteu beterogenost. Sui ispitani genotipoui kllkllnlza imali SIt

fedtnstuenu proteinsku sliku pri cemu se odreden brojproteinsktb frakcija nalazi na pribliznoistojpoziciji u suim ispitanim uzorcima tako da se koriste kao referentne.Rozlike u proteinskomsastauu linija mogu da se koriste i za uturdiuanje ueze izmedu bibrida i roditeljskib linija..tIetod je brz, jeftin i podaci mogu da se koriste za forrniranje geneticke identifikacione kartelinija i bibrida kuleuruza.

Kljucrie reci: proteini klice, elektroforeza, geneticlea identifikacija, genetictea cistoca

UVOD: Odrzavan]e genctlcke u nifor­mnosti linlja i hibrida kukuruza je jedan odpreduslova uspesne proizvodnje i plasiranjana tcZiSte komcrcijalnog hibridnog semena.Genericki neclsro scme dovodi do pojavcbiliaka Cije karakteristfke nepredvidljivoodstupaju od occkivanih, a prisusrvo semenasamooplodene majke u hibridnom scmenudo smanjenja prinosa usled smanjenog brojaheterottcnih individua. Zato je kontrolagenerickc ctstoce semena linija i hibrida odvelikog znacaja za sernenarstvo. NajeeScekorisccnc metodc za odredivanje genetickecistoce semcna obuhvataju : i) morfoloskemetode, Ii) analiza izozima, iii) Izoelekrricnofokusiranje zeina . Tradicionalno gcnctickacis toea semena se odredivala pracenjernmorfolosklh osobina biljaka u razlicitirnfazama razvoja u poljskim uslovima. Medutimmorfoloske osobine su pod uticajernspoljasnje sredine i nisu pouzdan pokazateljgenotipa (Smith i Wych, 1986) . Elektoforezaizozima je dosta koriscena za odredivanjegenericke cistoce semena (Cardy et al., 1980,Goodman i Stuber, 1980, Cardy andKanncnber, 1982), kao i za karakterizaciju in­bred linija (Goodman i Stuber, 1980, Cardy

and Kanncnber, 1982, Stuber and Goodman .1983) i hibrida (Smith , 1984 . Smith andWeissinger, 1984) kukuruza . Mada je metodaveoma efikasna za odrcdivanje genetickeCistoce i genetlcku karakterizaciju (Tanksley iOrton, 1983) ima odredcne nedostatke kaosto su duzina trajanja, skupa je, zahtevamultilokusnu analizu nekoliko cnzima.Izoelektricno fokusiranjc zeina se koristi zaodredivanje geneticke cistoce semcna(Righetti et al ., 1977, Motto et al., 1979) . alivisoka ceria ogranicava njegovu siruupotrebu. U cilju da se prcvazidu ncki odnavcdenih ncdostataka razvijene sujednostavnc metode elektroforeze proteinana poliakrilamidnom gelu (Koranyi et al .,1989, Wang et al ., 1994) za genetickuidentifikaciju genotipova kukuruza kao i zaodredivanje geneticke eistoce i uniformnostiroditeljskih Hnija i hibrida kukuruza. Ciljnaseg rada je ispitivanje mogucnosti iopravdanosti kortsccnja proteina klicc zageneticku karakterizaciju inbred linija ihibrida kukuruza i odredivanje genetickccistoce komercijalnih hibrida kukuruza.

Originalni naucni rad (Original scintlflc paper)I Dr SNEZANA MIADENOVIC DRlNIC, viSi naucni saradnik, dr KOSANA KONSTANTINOV, naucnisavemik, Institut za kukuruz "Zemun Polje", Beograd-Zcmun

45

Materijal i rnetode

U radu jc analizirano osamnaestsamooplodnih linija standarnog kvalitetazrna, razlicitlh FAO grupa zren]a (200·600) idva komcrcijalna hibrida kukuruzastandardnog kvalitcta zrna FAO grupe zren]a400 odnosno 600, proizvedeni u Instituru zakukuruz. Klica je izolovana iz pojedinacnihzrna i tkivo kllce je homogcnizovano u puferuza ekstrakciju (Lacmmli , 1970) . Nakonhomogcnizacijc suspenzija jc centrifugirana iproteini su razdvojeni clektroforezom napoliakrilamidnom gclu .

Za utvrdivanjc genctlcke clsroceispitivanog hibrida analizirano [e 100pojedlnacnlh kllca/genotipu . Na osnovudobijenih elcktroforegrarna grupe traka sukodirane na osnovu broja, distribucije iinteziteta traka, Razlicite kombinacije traka naosnovu Inteziteta (dva nlvoa : inteziteta slab i[ak) i poloza]a su oznacene slovima a-k (npr.kornbinacija trake jakog inreziteta i iznad njetrake slabog inteziteta je obelezena slovom b).

Rezultatl i dlskusija

U ovim tstrazivanjima protcini suizolovani iz kliee samooplodnih Iinija i

komcrcijalnih hibrida kukuruza. Dobijenirezultarl su pokazali da proteini klice mogu dase koriste za odredivanjc gcnctickogidcntiteta linija i hibrida kukuruza, kao i zautvrc1ivanje geneticke cistoce semena . Madaprotcinski markeri jos nisu genetickl mapiraniza njihovu prakticnu primenu za identit1kacijugerrnplazme i utvrdivan]c gcncncke cisroce tonijc ncophodno (Tanksley, 1983) .

Utvrdene su kako kvantitativne tako j

kvalitativne razlike (broj, rasporcd iintenzitet) proteinskih frakcija . Nekeprotcinske frakcijc se nalaze na istoj poziciji irelativno su isrog intcnzireta u svim ispitanimuzorcima i koriste se kao refercntnc taka da jeu odnosu na njih e1ektroforegram svakoguzorka podeljen u nekoliko rcgiona,

Druge proreinske frakcijc unutar regionase razlikuju u zavlsnosu od analiziranoggenoripa. Grupe proteinskih frakcija suoznacene prema broju, pozieiji i relativnominrenzitetu traka unutar njih . Na taj nacln jemoguce predstaviti svaki gcnotip spccificnomserijom kodova.

lJ kodovima brojevi znace pojedinacnuproteinsku frakeiju date grupe. Brojeviprikazani u zagradama se odnose nadistribuciju frakcija u grupi (2 +2 za frakciicsllcnog inteziteta u 2+2 distribueiji) . Razlike II

intezitetu su oznacene slovima (a-k) .

Tab. 1. Kodoui sedam samooplodnib linija kuteuruzaTab. 1.Codes ofseven inbred lines

linija 1 2 3 4 5 (, -;region

3( 1+ 2) 3(1+2) 3 (1+2) 3(1+2) 2k 2k 5(1 + 2)I 4(2+2) 4(2+2) 4 (2+2) 4(2+2) 4(2+2) 4(2+2) 4(2+2)

1 1 1 1 1 1 1

4(2b+2c) 4(2b+2e) 4 (2k+2a) 4(3;+1) 4(2b+2a) 4(3i+l) 4(3c+l )11 4(3e+ I) 4 (3+1) 4(3e+ 1) 4(2b+2) 4(3e+ 1) 4( 3+ 1) '1(3+1)

3g 3d 3d 3g 3d 2c 2c

3c :Ie 3e 4 (3i+ l ) 3e 3g 2b2 23 23 23 2a 3(1+23) 3(1+23)

III 4(3c+1) 3(1+2c) 4 (2b+2c) 3g 3d 1 11 1 1 1 1 2k 2k1 3(1+2b) 3(1+2b) 1 3c 1 1

1 3i 3e 1 1 1 1IV 23 1 1 3h 23 23 23

2c 2c 2c 2c 2c 2c zc

Elektroforezom proterru klice surazdvojeni na veliki broj proteinskih frakcijakojc pokazuju heterogenost razltcitihgenotipova kukuruza . Sve ispitivane inbredlinije su imale specificnu protcinsku sliku. Nasl.1 je prikazan elektroforegrarn sedam od 18ispitivanih inbred linija kukuruza . Kodovi

46

ovih linija su prikazani u tab.L Najvcci brojproteinskih frakeija je u regionima II i III.

Elektroforcgrami hihridnih kombinacijasu poredeni u odnosu na rodirelje i

koelektroforezu roditelja (Ll +L2, occktvanclektroforegram hibrida pod pretpostavkomda se proteini nasleduju aditivno).

51. 1. Elektroforegram proteina lelice sedaminbred linija kuteurura

Fig. 1. Electropboregram ofembryo proteinsofseven maize inbred lines

M

Poredenjern elektroforegrama roditeljskihlinija (Ll i L2) i elektroforegrarna hibridnckombinacije (Ll x L2) utvrdeno je da posrojinekoliko vrsta protcinskih frakcija . hibrid imatrake zajcdnicke za oba roditelja; hibrid imadve trake, jcdnu od oca drugu od majkc(kodorninatnost ekspresije roditcljskog genau hibridirna +) ; traka poreklorn od majkc - ;traka poreklorn od o ca ~; traka speciflcna za

hibrid ~. Na s1.2 jc prikazan elektroforegrarnroditeljskih linija i njihove hibridnckombinacije.

Sf. 2. Elektroofregram proteina kliceroditeljskib linija (Ll, /2) i bibridakukuruza

Fig. 2 Electropboregram ofembryo proteinsofparental lines and hybrids

III

IV

Tab. 2. Kodoui roditeljskih linija (Ll, 12) i bibrida (Ll x /2)Tab. 2. Scores of inbred lines (Ll, 12) and hybrid

Genot ip region Linija I (m ajka) Linija 2 (ot ac) hibrid Poreklo frakeija

Z 2b Zb Zajedrucke

I 4(2b+2a) 2k 3(1+2) Zajedni':ke

2 I 1 Zajcdnicke

3e 2e Ze Otac

II 5(Za+3g) 4(1+3g) 5(1+Zb+Z) Hibrid

3(2a+l ) 3(1+2c) 3(1+2c) otac

2c 1 2a Hibrid

3 (1+2) 4 (1+3) 4(1+3) Zajednicke

III 1 1 1 Zajednicke

1 1 1 Zajednicke

Zb 1 1 Zajednlcke

1 1 Majka2c

IV 2e Ze Zajednicke1

1 1 Zajednicke

Kod hibrrda pored traka koje su

zajednicke za oba roditelja i kojih je najveci

broj, otkrivene su dye trake nasledene od oca

47

(L2), jedna traka nasledena o d majke i tritrake specificne za hibrid . Poredenjernelektroforegrarna hibrida roditeljskth

kornponenti urvrdeno je da proteinska slikahibrida nije prost zbir proteinskih frakcijaroditeljskih komponenti sto ukazuje rianeaditivno nasledivanje protelna klice. Ovo jeu saglasnosti sa rezultatima Korney-a i sar.(1989) i Wang-a i sar. (1994) . Kodoviroditeljskih linija i hibrida su prikazani natabeli 2.

Sl. 3. Proteinski kompleks pojedinacnibbiljaka komercijalnog bibrida leukuruza

Fig. j Protein comp lex of individualseedlings of the hybrid

Gencticki cisto seme kako Iinija tako ihibrida bi trebalo da pokaze uniformnuproteinsku sliku u svim pojedirracnirnk1icama. U ovorn radu je ispitana generlckacistoca jednog komercijalnog hibrida .Dobijena je uniformna proteinska slika u svimpojedinacnim uzorcima, sto ukazuje 0

genetickoj cistoei ispitanog semena. Na s1.3 jeprikazan proteinski kompleks pojedinacnih

biljaka proucavanog hibrida, FAO grupezrenja 600 . Prerna Korney i sar. (1989) , nekiuzorci imaju heterogenu proteinsku sliku stoje posledica intralinijske varijabilnosti koja sckrece od 2-12%. Veti procenar od ovoga jeposledica mutaci]a ili stranooplodnje . Unasrrn ispitivanjima geneti ckc clstoceroditeliskih kornponenti analiziranog hibrida(rezultari nisu prikazani u ovom radu)intralinijska varijabilnost se kretala u ovimgranicama. U odnosu na druge mctode ko]ese koriste za utvrdivanje genetickc Cistocesemeria metoda koriscena u ovorn radu jemnogo brza i jcftinija .

Zakljucak

Dobijeni rezultan su pokazali da an alizaprotcina klice elektroforezorn na SDS-PAAm oze da se koristi u oplemcnjivanju iproizvodnji sernena kukuruza kao brz i jcftinmetod za gcncri cku karakterizacijuselekcionog materi jala kao i za ispitivanjegeneticke Cisroce semena kukuruza. Visokarezolucija, reproduktivnost , st abrln aproteinska slika uzorka su osnovne prednostiove rnetode. Jasne razlike proteinskogkompleksa klice razltcirih genotipovakukuruza osim za urvrdivanje razlika izrncdulinija i hibrida mogu da se korisre i zautvrdivanje odnosa izrnedu hibrida iroditeljskih komponenti , odredivanjestabilnosti inbred linija u procesuoplemenjivanja, odredivanje gcnctickecistoce linija i hibrida kukuruza kao iurvrdivanje samooplodnje i stranooplodnje usernenu hibrida .

LITERATURA

CARDY, I3.J., STUBER, c.w. and GOODMAN,M.M. (1980) : Tehniques for st arch gel elec­trophoresis of enzymes from maize. Insti­tute of Statistics Mimeo Series No .1317.North Carolina State University, Releight.

CARDY, 13.]. and KANNENBERG, L.W (1982) :A1lozyme variability among maize inbredlines and hybrids : Application for cultivaridentification. Crop Sci. 22:1016-1020.

GODMAN M.M. and STUBER, c.w. (1980) : Ge­netic identification of lines and crosses us­ing isoenzyme electrophoresis. Proceed­ings of the Annual Corn and sorghum Re­se arch Conference, 35: 10-31.

KORNAYI, P. (1989) : Simple purity checking ofmaize lines and hybrids by protein mono-

48

mer analysis. Seed Sci . and Tech. 17 :161-168.

LAEMMLI , V.K (19 70) : Cleavage of structuralproteins during the assembly of the head ofbacteriophage '1'4. Nature 22 7: 680-685 .

MOTTO, M., SAIAMINI, E, REGGIANI , F. andSOAVE,C. (1979) : Evaulation ofgenetic pu­rity in hybrid corn seed production throughzein isoelectrophoretic patterns. Maydica24 : 223 .

RlGHETI'I, P.G., GIANAZA, E., VI01TI, A. andSOAVE, C. (1977): Heterogeneity ofstorageproteins in maize. Planta 136:1 IS .

SMITH , J .S.c. and WEISSINGER, I-I. (1984) :Rapid monitoring of purity in seed lots ofhybrid maize modifications ofcurrent tech-

nologies. Maize Genetics CooperationNews Letter 58 :103-105 .

SMITH , ].S.C. (1984) : Genetic variabilitywithin U.S. commercial hybrid maize (Zeamays L.). Maydica 29 : 175-184.

SMITH, ].S.C and WYCH, R.D. (1986) : Theidentification of female selfs in hybridmaize: A comparison using electrophoresisand morphology. Seed Sci. Tech. 14:1.

Sl1JBER, CW and GOODMAN, M.M. (1983) :Allozyme genotypes for popular and histor­ical important inbred lines of corn. U.S.Dept. OfAgriculture, Agriculture ResearchService, Southern Series 16:29.

TANKSLEY, S.D. (1983) : Molecular markers inplant breeding. Plant Molecular Biology Re­porter 1,3-8.

TANKSLEY, S.D. and ORTON, T.J. (1983) :Isozymes in Plant Genetics and Breeding,parts AQ and B, Elsevier, New York.

WANG,C, BAIN, K., ZHANG, H. , ZHOU, Z. andWANG, J. (1994): Polyacrilamide gel elec­trophoresis of salt soluble proteins formaize variety identification and genetic pu­rity assessment. Seed Sci. Tech. 22 :51-5 7.

GENETICALLY CHARACTERIZATION AND SIMPLE PURllY CHECKINGOF MAIZE SEED BY PROTEIN MARKERS

DRINIC MLADENOVIC SNEZANAAND KONSTANTINOV KOSANA

SUMMARY

Purity control and genetically characterization ofmaize inbred lines and hybrids have greatimportance in every phase ofexperimental or comercial hybrid seed production and inbred main­tenance . Embryo proteins as genetic markers for maize genotypic identification as well as geneticpurity determination were used . By electrophoresis embryo proteins have been separated intonumerous components and showed great heterogeneity. Ail analysed genotypes have specificprotein pattern. Some of protein fraction appeared for each genotype at the same position andcould be use as reference bands. The differences ofprotein complex among various maize varlet­ies could be use to detect relationship between hybrids and their parental lines . The method israpid, cheap and date can be use to form genetically identification card ofinbred lines and hybrids .

49