TC

DİCLE UumlNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTUumlSUuml

KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMİ İLE Bacillus licheniformis

ATCC 14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETİMİ UumlZERİNE BAZI

PARAMETRELERİN ARAŞTIRILMASI

Sedat KAYA

YUumlKSEK LİSANS TEZİ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

DİYARBAKIR

Haziran 2011

TC

DĠCLE UNĠVERSĠTESĠ

FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml MUumlDUumlRLUumlĞUuml

DĠYARBAKIR

Sedat KAYA tarafından yapılan ldquoKatı Faz Fermantasyon Youmlntemi ile Bacillus

licheniformis ATCC 14580rsquoden Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Bazı Parametrelerin

AraĢtırılmasırdquo konulu bu ccedilalıĢma juumlrimiz tarafından Biyoloji Anabilim Dalında

YUumlKSEK LĠSANS tezi olarak kabul edilmiĢtir

Juumlri Uumlyesinin

Uumlnvanı Adı Soyadı

BaĢkan Doccedil Dr Zuumlbeyde BAYSAL

Uumlye Doccedil Dr Veysel TOLAN

Uumlye Doccedil Dr Fikret UYAR (Danışman)

Tez Savunma Sınavı Tarihi 30062011

Yukarıdaki bilgilerin doğruluğunu onaylarım

07 2011

Prof Dr Hamdi TEMEL

Enstituuml Muumlduumlruuml

I

TEŞEKKUumlR

Yuumlksek Lisans oumlğrenimim ve tez konumun seccediliminde planlamasında deneysel

ccedilalıĢmalarım iccedilin gerekli kimyasal ve teccedilhizatların sağlanmasında ve tezimin yazımında bilgi ve

desteğiyle yol goumlsterip bana oumlrnek olan yardımlarını hiccedil esirgemeden buumltuumln desteğiyle her an

her konuda yanımda olan ccedilok değerli danıĢman hocam Sayın Doccedil Dr Fikret UYARrsquoa teĢekkuumlr

ederim

Deneysel ccedilalıĢmalarım sırasında karĢılaĢtığım sorunları aĢmak iccedilin ccediloumlzuumlm yolları

bulmak adına bilgisini esirgemeyerek destek veren ve yuumlksek lisans eğitimim suumlresince beni

youmlnlendiren yol goumlsteren ve laboratuvar ccedilalıĢmalarıma katkıda bulunan ikinci tez danıĢman

hocam Siirt Uumlniversitesi oumlğretim uumlyelerinden Sayın Yrd Doccedil Dr Nurullah AKCANrsquoa teĢekkuumlr

ederim

Laboratuar ccedilalıĢmalarım ve tez yazım aĢaması sırasında desteğini esirgemeyen Dicle

Uumlniversitesi Fen Fakuumlltesi Kimya Boumlluumlmuuml oumlğretim uumlyelerinden Sayın Doccedil Dr Zuumlbeyde

BAYSALrsquoa ve Dicle Uumlniversitesi Fen Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml oumlğretim uumlyelerinden Sayın

Prof Dr Abdunnasır YILDIZrsquoa teĢekkuumlr ederim

Manevi desteklerini hiccedilbir zaman esirgemeyen sayın hocalarım Yrd Doccedil Dr Birguumll

OTLUDĠL ve Yrd Doccedil Dr Sema AGUumlLOĞLU FĠNCANrsquo a teĢekkuumlr ederim

Tezimin yazım aĢamasında yardımlarını esirgemeyen arkadaĢlarım BARIġ ENEZ

BESĠ SERĠN ve YUSUF OumlNENrsquoe teĢekkuumlr ederim

Molekuumller Biyoloji AraĢtırma Laboratuarırsquonda yardımlarını goumlrduumlğuumlm Yuumlksek Lisans

ve Doktora yapan arkadaĢlara teĢekkuumlr ederim

Manevi desteklerinden dolayı Diyarbakır Ġl Kontrol Labaratuvar ġeflerinden Mehmet

DENĠZrsquoe ccedileviri konusunda yardımlarını esirgemeyen sayın arkadaĢlarım ESıddık

MARANGOZrsquoa ve Medeni AKGUumlNrsquoe teĢekkuumlr ederim

Hep bana destek olan varlıklarıyla daha guumlccedilluuml olmamı sağlayan dostlarıma teĢekkuumlr

ederim Ccedilok değerli arkadaĢım sayın Muumlrvet YILDIRIMrsquoa teĢekkuumlr ederim

Tuumlm hayatım boyunca hep yanımda olan ve desteklerini bana olan guumlvenlerini hep

uumlzerimde hissettiğim aileme teĢekkuumlr ederim

II

İCcedilİNDEKİLER

Sayfa

TEŞEKKUumlRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I

İCcedilİNDEKİLERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip II

OumlZEThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip V

ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VI

CcedilİZELGE LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VII

ŞEKİL LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VIII

KISALTMA VE SİMGELERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IX

1 GİRİŞhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1

11 Enzimlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1

112 Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2

1121 Proteazların Genel Oumlzelliklerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4

1122 Proteazların Sınıflandırılmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4

1123 Mikrobiyal Proteaz CcedileĢitlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip5

11231 Ekzopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6

11232 Endopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6

1124 Proteazların Etki Mekanizması helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip7

1125 Proteaz Kaynaklarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8

1126 Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

11282 Fırında PiĢirme Uygulamalarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

11284 Atık Arıtımı ve DoumlnuumlĢuumlmuumlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

III

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

12 Bacillus Cinsihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

121 Bacillus licheniformishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

1321 Biyolojik Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

1322 Fiziko-Kimyasal Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

2 KAYNAK OumlZETLERİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25

3 MATERYAL ve METOThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

31 Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

311 Kullanılan Kimyasal Maddeler helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3111 Azot Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3112 Karbon Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3113 Deterjanlar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3114 Metal Tuzları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3115 Besi Yeri Maddeleri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

312 Kullanılan Aletlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34

313Biyolojik Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

314 Mikroorganizmaların Uumlretimi ve Saklanmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

315 Substrat Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

316 Substrat Parccedila Buumlyuumlkluumlğuuml helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

317 Kullanılan Besiyerlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

318 SSF Besiyeri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

32 Metothelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

IV

321 Mikroorganizma Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

322 Ccediloumlzeltilerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonuhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38

324 Proteaz Aktivite Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

326 Protein Miktar Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Parametrelerin Etkisinin Ġncelenmesihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Besiyerlerinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip39

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi42

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisihelliphelliphelliphellip42

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip 43

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphellip43

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisihelliphelliphelliphelliphellip43

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44

4 ARAŞTIRMA BULGULARIhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip45

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55

6 KAYNAKLARhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65

OumlZGECcedilMĠġhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77

V

OumlZET

KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN

ARAġTIRILMASI

YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ

Sedat KAYA

DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ

FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml

BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI

2011

Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık

gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve

mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya

hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan

uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla

miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları

iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda

enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln

geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır

CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin

pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu

katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki

ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon

suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine

etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi

proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit

edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon

kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve

amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek

miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin

30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi

belirlendi

Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580

Proteaz Mısır kuumlspesi

VI

ABSTRACT

THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD

WAS EXAMINED

MSc THESIS

Sedat KAYA

DICLE UNIVERSTY

INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES

DEPARTMENT of BIOLOGY

2011

The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine

and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms

have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have

considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more

stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group

of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical

leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair

recovery of silver from x-ray films and used many more industries field

In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice

husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid

substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize

was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the

obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size

on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm

substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC

respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources

on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect

amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was

investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed

maize+5 Rice husk)

Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease

Crushed maize

VII

CcedilİZELGE LİSTESİ

Ccedilizelge No Sayfa

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3

Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama

Alanları ve Uumlreticileri 10

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11

Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20

VIII

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil No Sayfa

Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5

Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46

Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48

Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50

Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50

Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51

Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54

IX

KISALTMA VE SİMGELER

SSF Katı faz fermantasyonu

SmF Submerged fermentasyonu

YE Maya Oumlzuumltuuml

NB Nutrienth Broth

LB Laura Broth

IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği

RGPW Red Gram Plant Waste

TCA Trikloroasetikasit

CSL Corn Speed Luquor

pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı

aw Su aktivite faktoumlruuml

SDS Sodyum dodesil suumllfat

BSA Bovim serum albuumlmin

CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr

CuCl2 Bakır kloruumlr

MgCl2 Magnezyum kloruumlr

ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr

FeCl2 Demir kloruumlr

MnCl2 Mangan kloruumlr

NaCl Sodyum kloruumlr

Na2CO3 Sodyum karbonat

CuSO4 Bakır suumllfat

MgSO4 Magnezyum suumllfat

NaOH Sodyum hidroksit

(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat

Sedat KAYA

1

1GİRİŞ

11 Enzimler

Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve

organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere

enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların

yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten

şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir

molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)

Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar

farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil

olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783

yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek

kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere

doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden

elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını

saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları

hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini

ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili

Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz

enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)

Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim

piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı

beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini

karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır

Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda

organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan

2008)

Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan

bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel

katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

2

Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve

enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen

enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark

2005)

Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı

Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan

bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine

yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik

accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim

uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip

Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim

şartları belirlenecektir

112 Proteazlar

Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını

katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir

Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik

2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı

fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde

hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee

ve ark 2008)

İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok

uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)

Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin

proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler

10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde

bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin

edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere

yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark

1994 Schrerier 1997)

Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak

sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik

Sedat KAYA

3

oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan

ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve

ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları

deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık

arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde

peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir

kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)

Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde

edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında

kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim

pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları

ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)

Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri

Bakteriler

Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan

Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan

Bacillus firmus Alkalin Deterjan

Bacillus megaterium Alkalin Deterjan

Bacillus pumulis Alkalin Deterjan

Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan

Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan

Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda

Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda

Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda

Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda

Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda

Mantarlar

Aspergillus niger Alkalin Deterjan

Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus flavus Alkalin Deterjan

Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda

Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda

Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda

Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda

1 GİRİŞ

4

1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri

Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein

sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir

yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır

Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları

katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar

saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile

proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip

olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)

Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel

gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu

enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda

karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek

değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)

Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre

duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar

Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin

sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin

gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000

Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı

enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli

metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)

1122 Proteazların Sınıflandırılması

Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve

adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere

iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr

Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve

endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark

1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir

Sedat KAYA

5

Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel

gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein

proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar

(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)

Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral

proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)

1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri

Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca

peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha

sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)

1- Reaksiyon katalizi

2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı

3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler

Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir

Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)

1 GİRİŞ

6

Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml

katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin

proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)

ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak

bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar

11231 Ekzopeptidazlar

Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit

bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden

ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler

ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk

peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının

hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler

Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek

karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil

karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid

bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)

11232 Endopeptidazlar

Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan

peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana

ve ark 1995)

Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve

histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde

serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve

ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları

nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH

değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll

ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)

Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein

(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile

karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif

Sedat KAYA

7

merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside

edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir

Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin

katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH

değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır

Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara

goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar

aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların

yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2

) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat

yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali

miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve

ark 1998)

1124 Proteazların Etki Mekanizması

İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında

bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir

su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına

Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana

gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların

etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır

Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)

1 GİRİŞ

8

1125 Proteaz Kaynakları

Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda

bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik

goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları

olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları

birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri

kazanımları kolaydır (Pandey 2006)

Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve

ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği

belirtilmektedir

1126 Proteaz Uumlretimi

Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun

(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim

uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir

Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama

alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)

Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri

gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim

gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda

membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik

uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına

youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve

ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz

fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler

(Haki ve Rakshit 2003)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve

durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların

uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi

kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun

Sedat KAYA

9

şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize

edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma

inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz

sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar

Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli

kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla

kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli

ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks

hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri

tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca

Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar

uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli

oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu

enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)

Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri

belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal

kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla

değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi

alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge

12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri

goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların

varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli

kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)

1 GİRİŞ

10

Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve

uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)

Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal

Kaynak

Uygulama Alanı

Novo Nordisk

Danimarka

Alcalase

Savinase

Esparase

Biofeed pro

Durazym

Novozyme47 1MP

Novozyme 243

Nue

B licheniformis

Bacillus sp

B lentus

B licheniformis

Bacillus sp

Belirtilmiyor

B licheniformis

Bacillus sp

Deterjan ipek

Deterjan tekstil

Deterjan gıda ipek

Yem

Deterjan

Fotoğraf

Deri

Genencor

International

ABD

Purafact

Primatan

B lentus

Bakteriyel

Kaynaklı

Deterjan

Deri

Gist-Brocades

Hollanda

Subtilisin

Maxacal

Maxatase

B alcalophilus

Bacillus sp

Bacillus sp

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Solvay Enzymes

Almanya

Opticlean

Optimase

Maxapem

HT-proteolytic

Protease

B alcalophilus

B licheniformis

Bacillus spnin

Protein

muumlhendisliği ile

uumlretilmiş varyantı

B sublilis

B licheniformis

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Alkol iccedilki ekmek

yem gıda deri

fotoğrafik atık

Gıda atık

Amano

Pharmaceuticals

Japonya

Proleather

Collagenas

Amano protease S

Bacillus sp

Clostrodium sp

Bacillus sp

Gıda

Teknik

Gıda

Enzyme

Development

ABD

Enzeco alkaline

protease-L FG

Enzeco high

alkaline protease

B licheniformis

B licheniformis

Bacillus sp

Teknik

Gıda

Enduumlstriyel

Nagase

Biochemicals

Japonya

Bioprase

concantrate

Ps Protease

Ps Elastase

CrystProtease

CrystProtease

Bioprase

Bioprase SP-10

B sublilis

P aeruginoso

P aeruginoso

B subtilis(K2)

Bsubtilis(bioteus)

B sublilis

B sublilis

Kozmetik

farmasoumltik

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Deterjan temizlik

Gıda

Jodo Shusei Japonya Codo Bap

B licheniformis Deterjan gıda

Rohm Almanya Corolase 7089

B sublilis Gıda

Sedat KAYA

11

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları

Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002

Pandey 2004)

Enduumlstri

Proteaz Uygulama

Ekmek yapımı Noumltral proteaz

Hamur kalitesini arttırma

İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme

iccedileceklerde bulanıklığın

giderilmesi

Mandıra

Fungal proteazlar simozin

diğer proteazlar

Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt

suyunun işlenmesi modifiye

peynir enzim uumlretimi

Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin

uzaklaştırılması

Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday

gluteni gibi zengin protein

metaryallerinin modifikasyonu

Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden

tuumlylerin uzaklaştırılması

Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve

balık atıklarından protein eldesi

Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması

kan pıhtısını ccediloumlzme doku

iltihaplarının azaltılması tıbbı

uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt

lensler ve takma dişlerin

temizlenmesi

Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf

filmlerinden guumlmuumlş eldesi

Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers

Hidroliz

Enduumlstriyel ve Evsel

Atıkların İşlenmesi

Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel

faaliyetler sonucu meydana gelen

atıkların işlenmesi

1 GİRİŞ

12

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde

patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960

yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar

guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus

alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar

uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı

madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır

(Dağaşan 1997)

Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı

maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta

ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı

maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları

ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler

kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki

kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her

tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi

protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)

11282 Fırında Pişirme Uygulamaları

Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave

edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması

sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun

makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri

ve ark 2002)

Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik

olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır

Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak

bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil

giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun

yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini

sağlamaktadır (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

13

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar

Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin

olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin

ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim

suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından

tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine

ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara

sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar

sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada

yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)

Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok

oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin

salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin

pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri

peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln

lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin

fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da

kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri

meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin

1998)

11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml

Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol

miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla

kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik

aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu

etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır

Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla

atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir

1 GİRİŞ

14

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı

Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri

uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki

guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol

accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre

dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından

parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film

sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında

olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis

denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen

fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen

damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri

sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama

yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan

derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve

Saleemuddin 1998)

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı

Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik

ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı

verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini

sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin

proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak

1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi

yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

15

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı

Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal

proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik

enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden

olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku

boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma

şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm

sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak

bulunan ve Ca+2

tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir

(Claus ve ark 1986)

Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde

edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların

accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve

meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan

yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı

Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az

duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu

amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır

Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da

yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa

rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik

olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde

kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)

12 Bacillus Cinsi

Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde

endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek

başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan

huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998

Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir

1 GİRİŞ

16

ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış

goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı

enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda

kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum

37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli

enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi

duumlşuumlnuumllmektedirler

Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak

tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen

karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun

basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin

duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde

olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık

donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik

tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)

Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil

aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı

bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının

dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler

(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla

sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus

bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak

amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst

kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda

olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)

121 Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli

enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen

saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram

pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)

Sedat KAYA

17

Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip

amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan

oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın

olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis

kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen

diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri

(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu

2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)

Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel

farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında

değişmektedir (Akcan 2009)

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği

Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda

katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır

(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde

umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu

nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan

mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında

bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole

edilmiştir (Singhania ve ark 2009)

Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri

uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar

buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı

uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel

fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil

kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak

buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait

ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml

peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek

1 GİRİŞ

18

verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının

uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer

olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize

edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)

Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler

alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik

olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda

kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren

biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı

maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml

bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)

SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar

kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu

pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır

unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar

kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark

2009)

Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF

genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir

SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların

SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite

goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan

mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli

avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece

ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte

ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin

kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet

ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla

biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi

oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek

kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)

Sedat KAYA

19

SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum

koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH

inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen

azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)

Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda

SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat

olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin

SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)

SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır

1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir

2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak

kullanılır (Nigam ve Singh 1994)

1 GİRİŞ

20

Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)

ABİYOLOJİK UYGULAMALARI

MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı

Hz İsa‟nın doğumundan

oumlnce Asya‟da

Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den

yararlanılmıştır

MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma

MOuml 1500 Koji işlemi

7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi

18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı

18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit

kullanımı

1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri

1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit

1920-1940

Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal

enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin

gerccedilekleştirilmesi

1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen

olağanuumlstuuml gelişme

1950-1960

Steroid transformasyonu

1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan

yemlerinin uumlretimi

1980-1990

Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi

column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri

ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar

1990-Guumlnuumlmuumlze kadar

SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler

biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki

ilerlemeler

Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım

enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu

biyotranformasyonlar

Sedat KAYA

21

B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER

Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon

ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin

oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin

Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit

Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-

ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik

noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz

feruloil para-kaumaroil esteraz

Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit

Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol

aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar

biyopestisitlerbiyoherbisitler

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları

SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre

belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır

SSF‟in daha fazla verime sahip olması

SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır

Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır

Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-

Guerra ve ark 2003)

Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar

Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)

Koumlpuumlklenmenin olmaması

Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik

Daha basit fermantasyon ortamı

Daha kolay havalandırma

1 GİRİŞ

22

Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım

Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)

Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği

Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası

Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet

Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren

yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması

Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda

otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya

gereksinim yoktur

Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir

Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)

SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş

mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha

guumlvenilirdir

Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile

karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar

Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon

Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması

Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması

Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar

Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi

Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması

Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması

Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi

Sedat KAYA

23

Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama

homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)

Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması

zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin

tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)

Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur

Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk

oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-

Guerra ve ark 2003)

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler

Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)

1 Biyolojik faktoumlrler

2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

1321 Biyolojik Faktoumlrler

Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve

uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli

tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)

Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir

Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan

uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler

1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli

faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi

sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon

kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein

sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme

işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin

eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

24

Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde

gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi

protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin

induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi

şeklindedir

Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu

nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak

nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir

Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır

SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan

biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile

sağlanabilir

Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey

alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok

kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok

mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme

meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller

kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha

etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan

oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml

belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Sedat KAYA

25

2 KAYNAK OumlZETLERİ

Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den

elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH

aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH

85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır

Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı

duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen

Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini

uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk

molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln

inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak

kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir

Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik

bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler

Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz

mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1

NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı

kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr

kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda

elde edilmiştir

Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından

izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719

suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın

azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği

belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+

ve

Cu2+

iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir

Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali

proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini

karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı

olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir

2 KAYNAK OumlZETLERİ

26

Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini

baskıladığını tespit etmişlerdir

Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis

Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi

mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip

proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH

60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir

Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip

ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek

amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki

izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit

etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir

Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak

belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir

Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday

kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini

buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum

enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu

05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC

250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite

goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de

goumlzlenmiştir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve

buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir

Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim

aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak

buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık

başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm

hacmi 20 olarak rapor etmişler

Sedat KAYA

27

Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya

proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak

bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin

proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu

kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini

20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70

olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla

iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir

Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin

alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC

olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir

Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil

olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler

Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz

uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı

Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak

proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi

kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi

gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen

enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı

olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum

436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak

belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu

kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak

belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF

youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir

Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından

izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı

substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona

bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen

2 KAYNAK OumlZETLERİ

28

karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır

Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve

sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini

goumlstermektedir

Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde

yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda

kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada

katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar

ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF

youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde

etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini

olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2

ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve

maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu

etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr

Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi

aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya

ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla

artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot

kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim

uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon

suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir

Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve

kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit

etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz

uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta

ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve

amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır

Sedat KAYA

29

Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan

ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize

edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite

(2560 U ml-1

) değeri 48 saatten sonra (g-1

) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4

1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin

proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında

stabilite goumlstermiştir

Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum

kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir

Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas

aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin

bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir

(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz

aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟

da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz

uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak

pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz

aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu

sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken

yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir

Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis

DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak

atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı

patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin

hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi

patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve

Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da

yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve

maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz

uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi

2 KAYNAK OumlZETLERİ

30

37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen

enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu

goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu

sonuccedillar alınacağı umulmaktadır

Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis

N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3

K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında

gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve

yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren

ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz

uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları

96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10

mM Ca2+

iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini

korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve

pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween

65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda

muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135

ve 126 oranlarında koruyabilmiştir

Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1

tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin

optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin

proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı

test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur

Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite

goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde

oumlzellikle Ca2+

Mg2+

ve Cu2+

bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan

inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden

olduğunu tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

31

Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar

katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma

ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda

enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug

ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil

nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi

22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot

kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug

yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide

bulunduğunu belirlemişlerdir

Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum

aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu

ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+

Mg2+

ve

Mn2+

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+

‟nin olumsuz

etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan

derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini

yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20

Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol

ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden

olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini

goumlzlemlemişlerdir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık

materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı

substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla

uumlretim gerccedilekleştirmiştir

Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi

ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday

kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil

olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca

+2

2 KAYNAK OumlZETLERİ

32

ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg

+2 Cu

+2 Fe

+2 Co

+2 ve Zn

+2 iyonları ise

aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe

ederken Cu+2

iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın

metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir

Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi

iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi

iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim

uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla

uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk

olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti

Ca2+

ve Mg2+

kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin

optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin

pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+

ve Ca2+

iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa

olarak tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

33

3 MATERYAL ve METOT

31 Materyal

311 Kullanılan kimyasal maddeler

Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum

dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit

(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat

sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de

Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir

3111 Azot kaynakları

Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract

MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir

3112 Karbon kaynakları

Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den

temin edilmiştir

3113 Deterjanlar

Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan

temin edilmiştir

3114 Metal tuzları

FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de

Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir

3115 Besi yeri maddeleri

Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone

ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir

3 MATERYAL ve METOD

34

312 Kullanılan aletler

İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)

Steril Kabin ( Telstar AV-100)

Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)

Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)

Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)

Vorteks (Stuart) (VWR International )

Magnetik Karıştırıcı (Stuart)

Deep-Freeze (Haris -70ordmC)

Etuumlv (Heraus)

Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)

Otoklav (HIRAYAMA)

Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)

pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)

Sterilizatoumlr (Heraus)

Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)

313 Biyolojik materyal

Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis

ATCC 14580 suşu kullanılmıştır

314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması

Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine

ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda

kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı

Sedat KAYA

35

315 Substrat seccedilimi

Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday

kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi

kullanılmıştır

316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml

Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil

kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı

elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı

substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı

317 Kullanılan Besiyerleri

Sıvı besiyeri

Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf

suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi

sağlandıktan sonra otoklavlandı

Katı besiyeri

10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya

tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

SmF besiyeri

02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler

iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı

016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

3 MATERYAL ve METOD

36

318 SSF besiyeri

Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki

eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde

substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer

iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi

121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye

gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona

bırakıldı

Sedat KAYA

37

32 METOT

321 Mikroorganizma Uumlretimi

Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi

katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona

bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve

NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı

İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı

Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik

erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek

mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi

Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de

150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin

sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan

arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı

322 Ccediloumlzeltiler

Ccediloumlzeltilerin hazırlanması

Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması

pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml

01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan

sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

3 MATERYAL ve METOD

38

pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

Alkalin Ccediloumlzeltisi

4 Na2CO3

4 Na-K tartarat

2 CuSO4

Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde

hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları

sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı

Azo-kazein hazırlanması

005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi

sağlanarak hazırlandı

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu

Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri

ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre

sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5

dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant

uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı

324 Proteaz Aktivite Tayini

Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein

(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu

suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de

bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi

1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile

gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)

Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan

enzim miktarı olarak tanımlandı

Sedat KAYA

39

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi

Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu

arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu

substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave

edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı

NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave

edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar

inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce

oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF

besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı

santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı

(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı

326 Protein Miktar Tayini

Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak

Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen

(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin

protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı

Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl

saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra

uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek

30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm

yapıldı (Lowry ve ark 1951)

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin

Etkisi

SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek

iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri

yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı

3 MATERYAL ve METOD

40

İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika

santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere

aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı

Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml

ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim

kaynağı olarak kullanıldı

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin

Etkisi

Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere

konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha

sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra

37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96

120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi

belirlendi

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml

bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi

uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat

sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon

(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan

1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)

eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril

sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst

sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Sedat KAYA

41

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35

37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten

sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı

pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı

Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav

sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF

besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g

2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak

inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından

aktivite tayini yapıldı

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı

besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi

yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda

ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak

eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen

materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp

proteaz aktivite tayini yapıldı

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

3 MATERYAL ve METOD

42

Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki

atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası

her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra

farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan

oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat

Karışımının Belirlenmesi

Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24

saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır

kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g

2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların

her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi

yapıldı

Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda

SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı

olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki

Substratın Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu

subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra

inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki

substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat

kullanıldı

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının

Etkisi

Sedat KAYA

43

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon

kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten

sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp

100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine

eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı

Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun

ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde

edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot

kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp

hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF

ortamlarına eklenerek otoklavlandı

Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim

yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının

Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01

olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2

001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip

otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi

yapıldı

Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

3 MATERYAL ve METOD

44

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon

başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki

sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık

belirlenmeye ccedilalışıldı

Sedat KAYA

45

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı

arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de

goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Pirinccedil

Kab

uğu

Mer

cim

ek K

abuğ

u

Mıs

ır K

uumlspe

si

Arp

a K

abuğ

u

Buğ

day

Kab

uğu

Pam

uk K

abuğ

u

Sp

esif

ik A

ktiv

ite(

Um

g

24

48

72

96

120

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF

ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz

uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu

ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite

değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk

kabuğunda elde edilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

46

42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk

oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg

olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte

goumlre azaldığı belirlenmiştir

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

12 24 48 72 96 120

Zaman

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

um

g)

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Sedat KAYA

47

43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı

substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl

1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme

suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı

olarak kullanıldı

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Saf su

Ccedileş

me

suyu

NaC

I

Tris-

HCl p

H9

SDS

Tw

een-

80

Trit

onX

100

Ekstraksiyon ortamı (10 ml)

Sp

esif

ik A

kti

vit

e (U

mg

)

Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon

ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana

getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk

proteaz uumlretimine rastlanıldı

44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı

SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin

SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz

aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)

olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

48

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 30 35 37 40 45 50 55

İnkubasyon sıcaklıgı (degC)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin

mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan

ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80

(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

4 5 6 7 8 9 10pH

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi

Sedat KAYA

49

46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi

iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı

ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı

arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde

edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

10 20 30 40 50 60 70

Nem seviyesi ()

Sesi

fik

ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi

47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

50

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1 2 3 4 5 6 8

İnokulum (ml)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında

(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi

iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

60 100 120 150 180 200

Ccedilalkalama hızı (rpm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Sedat KAYA

51

49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının

Belirlenmesi

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil

kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında

maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 g pk +

05 g mk

20 g pk + 10

g mk

15 g pk + 15

g mk

10 g pk + 20

g mk

05 g pk+ 25

g mk

Mısır

Kuumlspesi 3 g

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi

mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu

410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın

Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı

partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da

goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta

1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

52

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

500 1000 1500

Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi

411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz

suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda

(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz

Karbon Kaynakaları (1)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Sedat KAYA

53

412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton

maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave

edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Kon

trol

Et oumlzuuml

tuuml

Kaz

ein

Pepto

n

Tripto

n

May

a oumlz

uumltuuml

Am

onyu

m n

itrat

Am

onyu

m suumll

fat

Am

onyu

m k

lorid

Azot Kaynakları (1)

Spes

ifik

Akti

vit

e (U

mg)

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi

413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen

01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen

Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)

ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi

Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe

edilmiştir (Şekil 43)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

54

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum

suumllfat

Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat

Metal Tuzları ( 01)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi

414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini

belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50

60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı

Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te

goumlsterilmiştir

0

20

40

60

80

100

120

15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90

Sıcaklık (degC)

Roumlla

tif

Akti

vit

e

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Sedat KAYA

55

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda

oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal

formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler

azaldığından dolayı da avantajlıdır

Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat

olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller

enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde

olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de

kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)

Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde

gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal

olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal

bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)

SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir

faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi

atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda

da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel

olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)

Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz

uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr

edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca

zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri

mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış

olabilir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF

youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En

iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

56

Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı

ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde

elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde

etmişlerdir

Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam

bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon

suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon

ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda

enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan

kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi

sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)

Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte

1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki

ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)

Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında

enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark

(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle

kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir

Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve

bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk

solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi

fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)

Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli

bir farktoumlrduumlr

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı

substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi

ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme

suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme

yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te

Sedat KAYA

57

amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila

oumlnemlidir

Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz

aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)

Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada

proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından

elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan

ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark

1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile

45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996

Gangadharan ve ark 2006)

SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın

gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından

ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat

fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve

mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık

aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)

Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık

literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır

İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder

metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol

accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı

ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve

Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda

kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri

besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık

biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak

kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

58

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil

pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak

tespit edilmiştir (Şekil 45)

pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen

bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması

gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar

Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını

oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de

etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı

değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol

oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir

Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla

kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine

başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik

goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)

Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor

edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit

edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek

pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan

enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde

kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)

Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz

aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit

etmişlerdir

Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil

pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit

edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği

yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak

goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)

Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-

110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite

Sedat KAYA

59

goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği

alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır

Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH

değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi

GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu

belirtmişlerdir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat

olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin

yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat

miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor

edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark

2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda

nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar

Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve

metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını

optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de

değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk

olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve

enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında

ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi

nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve

substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)

bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz

sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

60

İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile

ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin

azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm

hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen

uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar

(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak

yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve

katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi

azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005

Chutmanop ve ark 2008)

Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun

inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus

sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit

etmşlerdir

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)

olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile

paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda

60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin

azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı

substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta

yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde

etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma

fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama

yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir

Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları

farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm

olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon

sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri

huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava

Sedat KAYA

61

akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan

enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim

denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı

fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan

zayıf havalandırma oranına neden olabilir

Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler

alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin

mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF

koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm

ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil

kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum

enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)

Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak

SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve

Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark

2009 Tanyıldızı ve ark 2007)

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk

partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil

410)

Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel

olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar

ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat

parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum

havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay

goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk

partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk

parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

62

iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği

ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay

metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde

etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları

bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim

sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup

bulunmaması ile ilişkilidir

Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle

formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel

tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı

tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların

beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en

buumlyuumlk besin kaynağıdır

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite

değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış

goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005

Mukherjee ve ark 2009)

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından

kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)

Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde

bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr

etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az

olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki

fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

Sedat KAYA

63

aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de

goumlsterilmiştir

Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel

suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade

edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi

azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin

besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini

vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili

ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki

ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve

ark 1995)

Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et

ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır

Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)

ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları

bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini

olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların

substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir

Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim

maliyetini azaltmaktadır

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01

konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis

ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)

iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal

tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır

Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında

eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik

ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)

Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin

bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak

kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

64

B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti

azalabilir

Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde

edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+

ve Hg2+

iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır

Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2

Mg+2

ve Mn+2

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu

etkilerken Cu+2

nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir

Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr

ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim

uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)

İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten

dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir

Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme

ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye

başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve

ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal

atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında

enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha

fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların

kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir

SEDAT KAYA

65

6 KAYNAKLAR

Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi

Science 43(4) 257-262

Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis

Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156

Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a

soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to

soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136

Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması

Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır

Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının

oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Ankara

Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-

Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-

glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110

Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource

Technology 64 175ndash183

Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548

Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase

from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food

Engineering 79 950-955

Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre

dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen

Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara

Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing

Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology

Advances 11 539ndash547

6 KAYNAKLAR

66

Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-

amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry

38 1665ndash1668

Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu

nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik

Enstituumlsuuml Kocaeli

Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-

tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus

licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768

Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable

Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial

Thecnology 32 294-304

Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A

Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process

Biochemistry 42 1150-1154

Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5

Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme

production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering

26 100-106

Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995

Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis

PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243

ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic

Bacteriology 1105ndash1141

Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid

protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial

Biotechnology 10 17ndash30

Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran

M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine

Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-

961

SEDAT KAYA

67

Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease

production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates

Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018

Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on

laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302

Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal

inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2

iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans

Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5

Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)

Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel

Konular ve Uygulamalar 14-15

Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003

Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal

Cleaner Production 11 533ndash611

Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid

state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil

Bioresource Technology 101 1385-1388

El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the

ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production

scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593

Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease

production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation

Process Biochemistry 40 1951ndash1956

Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice

spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402

Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra

cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544

Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996

Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and

characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332

Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry

69 18-28

6 KAYNAKLAR

68

Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of

Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132

Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid

Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology

Biotechnology 44 (2) 269ndash274

George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of

protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess

Engineering 16 381-382

Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara

Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-

amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616

Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular

approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32

Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva

R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition

2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22

Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable

enzymes Bioresource Technology 89 17-34

Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM

1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435

Biotechnology Letters 19 675ndash712

He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-

like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326

Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline

proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1

Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical

Engineering 4771-79

Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic

bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36

415- 424

Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231

SEDAT KAYA

69

John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16

Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate

for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in

a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144

Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant

alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula

leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447

Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis

of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65

150ndash153

Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile

ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Diyarbakır

Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and

characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal

Microbiology Biotechnology 32 335-344

Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms

aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785

Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995

Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and

stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri

Apply Environment Microbiology 61 3098-3104

Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase

Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial

Biotechnology 46 106-111

Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial

viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594

Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For

Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729

Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease

From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-

1705

6 KAYNAKLAR

70

Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and

Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672

Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State

Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr

Bioengineering 100 168ndash17

Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a

bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422

Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical

Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus

subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39

Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various

chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229

Turkish Journal of Biology 99-103

Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined

Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular

Biology 235 1560-1584

Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and

optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp

CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537

Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine

Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis

Journal Moleculer Biology 76 103-122

Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic

enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14

Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A

in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and

Purification 57 01ndash107

Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production

of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661

Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for

improvement Trends in Food Science and Technology 8 339

SEDAT KAYA

71

Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin

phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275

Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase

production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and

Microbial Technology 39 56ndash59

Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5

Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent

tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as

substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735

Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel

substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF

Process Biochemistry 45 47-53

Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an

alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654

Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline

protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203

Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83

Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a

thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate

Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of

enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361

Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under

solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and

Biotechnology 84 (8) 1246-1249

Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices

Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78

Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium

composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis

N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394

Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular

α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203

6 KAYNAKLAR

72

Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state

fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90

Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995

Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264

Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their

applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423

Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by

Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab

shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10

Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash

performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal

Microbiology Biotechnology 17 493ndash497

Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from

Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779

Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen

proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara

Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul

Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State

Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169

Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84

Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in

solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology

16 578-584

Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid

substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource

Technology 97 (1) 171-177

Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization

of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state

Fermentation 33-183-189

TC

DĠCLE UNĠVERSĠTESĠ

FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml MUumlDUumlRLUumlĞUuml

DĠYARBAKIR

Sedat KAYA tarafından yapılan ldquoKatı Faz Fermantasyon Youmlntemi ile Bacillus

licheniformis ATCC 14580rsquoden Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Bazı Parametrelerin

AraĢtırılmasırdquo konulu bu ccedilalıĢma juumlrimiz tarafından Biyoloji Anabilim Dalında

YUumlKSEK LĠSANS tezi olarak kabul edilmiĢtir

Juumlri Uumlyesinin

Uumlnvanı Adı Soyadı

BaĢkan Doccedil Dr Zuumlbeyde BAYSAL

Uumlye Doccedil Dr Veysel TOLAN

Uumlye Doccedil Dr Fikret UYAR (Danışman)

Tez Savunma Sınavı Tarihi 30062011

Yukarıdaki bilgilerin doğruluğunu onaylarım

07 2011

Prof Dr Hamdi TEMEL

Enstituuml Muumlduumlruuml

I

TEŞEKKUumlR

Yuumlksek Lisans oumlğrenimim ve tez konumun seccediliminde planlamasında deneysel

ccedilalıĢmalarım iccedilin gerekli kimyasal ve teccedilhizatların sağlanmasında ve tezimin yazımında bilgi ve

desteğiyle yol goumlsterip bana oumlrnek olan yardımlarını hiccedil esirgemeden buumltuumln desteğiyle her an

her konuda yanımda olan ccedilok değerli danıĢman hocam Sayın Doccedil Dr Fikret UYARrsquoa teĢekkuumlr

ederim

Deneysel ccedilalıĢmalarım sırasında karĢılaĢtığım sorunları aĢmak iccedilin ccediloumlzuumlm yolları

bulmak adına bilgisini esirgemeyerek destek veren ve yuumlksek lisans eğitimim suumlresince beni

youmlnlendiren yol goumlsteren ve laboratuvar ccedilalıĢmalarıma katkıda bulunan ikinci tez danıĢman

hocam Siirt Uumlniversitesi oumlğretim uumlyelerinden Sayın Yrd Doccedil Dr Nurullah AKCANrsquoa teĢekkuumlr

ederim

Laboratuar ccedilalıĢmalarım ve tez yazım aĢaması sırasında desteğini esirgemeyen Dicle

Uumlniversitesi Fen Fakuumlltesi Kimya Boumlluumlmuuml oumlğretim uumlyelerinden Sayın Doccedil Dr Zuumlbeyde

BAYSALrsquoa ve Dicle Uumlniversitesi Fen Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml oumlğretim uumlyelerinden Sayın

Prof Dr Abdunnasır YILDIZrsquoa teĢekkuumlr ederim

Manevi desteklerini hiccedilbir zaman esirgemeyen sayın hocalarım Yrd Doccedil Dr Birguumll

OTLUDĠL ve Yrd Doccedil Dr Sema AGUumlLOĞLU FĠNCANrsquo a teĢekkuumlr ederim

Tezimin yazım aĢamasında yardımlarını esirgemeyen arkadaĢlarım BARIġ ENEZ

BESĠ SERĠN ve YUSUF OumlNENrsquoe teĢekkuumlr ederim

Molekuumller Biyoloji AraĢtırma Laboratuarırsquonda yardımlarını goumlrduumlğuumlm Yuumlksek Lisans

ve Doktora yapan arkadaĢlara teĢekkuumlr ederim

Manevi desteklerinden dolayı Diyarbakır Ġl Kontrol Labaratuvar ġeflerinden Mehmet

DENĠZrsquoe ccedileviri konusunda yardımlarını esirgemeyen sayın arkadaĢlarım ESıddık

MARANGOZrsquoa ve Medeni AKGUumlNrsquoe teĢekkuumlr ederim

Hep bana destek olan varlıklarıyla daha guumlccedilluuml olmamı sağlayan dostlarıma teĢekkuumlr

ederim Ccedilok değerli arkadaĢım sayın Muumlrvet YILDIRIMrsquoa teĢekkuumlr ederim

Tuumlm hayatım boyunca hep yanımda olan ve desteklerini bana olan guumlvenlerini hep

uumlzerimde hissettiğim aileme teĢekkuumlr ederim

II

İCcedilİNDEKİLER

Sayfa

TEŞEKKUumlRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I

İCcedilİNDEKİLERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip II

OumlZEThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip V

ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VI

CcedilİZELGE LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VII

ŞEKİL LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VIII

KISALTMA VE SİMGELERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IX

1 GİRİŞhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1

11 Enzimlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1

112 Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2

1121 Proteazların Genel Oumlzelliklerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4

1122 Proteazların Sınıflandırılmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4

1123 Mikrobiyal Proteaz CcedileĢitlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip5

11231 Ekzopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6

11232 Endopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6

1124 Proteazların Etki Mekanizması helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip7

1125 Proteaz Kaynaklarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8

1126 Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

11282 Fırında PiĢirme Uygulamalarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

11284 Atık Arıtımı ve DoumlnuumlĢuumlmuumlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

III

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

12 Bacillus Cinsihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

121 Bacillus licheniformishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

1321 Biyolojik Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

1322 Fiziko-Kimyasal Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

2 KAYNAK OumlZETLERİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25

3 MATERYAL ve METOThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

31 Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

311 Kullanılan Kimyasal Maddeler helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3111 Azot Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3112 Karbon Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3113 Deterjanlar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3114 Metal Tuzları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3115 Besi Yeri Maddeleri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

312 Kullanılan Aletlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34

313Biyolojik Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

314 Mikroorganizmaların Uumlretimi ve Saklanmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

315 Substrat Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

316 Substrat Parccedila Buumlyuumlkluumlğuuml helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

317 Kullanılan Besiyerlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

318 SSF Besiyeri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

32 Metothelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

IV

321 Mikroorganizma Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

322 Ccediloumlzeltilerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonuhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38

324 Proteaz Aktivite Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

326 Protein Miktar Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Parametrelerin Etkisinin Ġncelenmesihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Besiyerlerinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip39

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi42

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisihelliphelliphelliphellip42

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip 43

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphellip43

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisihelliphelliphelliphelliphellip43

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44

4 ARAŞTIRMA BULGULARIhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip45

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55

6 KAYNAKLARhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65

OumlZGECcedilMĠġhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77

V

OumlZET

KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN

ARAġTIRILMASI

YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ

Sedat KAYA

DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ

FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml

BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI

2011

Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık

gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve

mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya

hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan

uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla

miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları

iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda

enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln

geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır

CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin

pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu

katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki

ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon

suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine

etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi

proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit

edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon

kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve

amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek

miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin

30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi

belirlendi

Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580

Proteaz Mısır kuumlspesi

VI

ABSTRACT

THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD

WAS EXAMINED

MSc THESIS

Sedat KAYA

DICLE UNIVERSTY

INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES

DEPARTMENT of BIOLOGY

2011

The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine

and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms

have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have

considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more

stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group

of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical

leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair

recovery of silver from x-ray films and used many more industries field

In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice

husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid

substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize

was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the

obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size

on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm

substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC

respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources

on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect

amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was

investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed

maize+5 Rice husk)

Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease

Crushed maize

VII

CcedilİZELGE LİSTESİ

Ccedilizelge No Sayfa

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3

Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama

Alanları ve Uumlreticileri 10

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11

Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20

VIII

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil No Sayfa

Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5

Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46

Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48

Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50

Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50

Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51

Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54

IX

KISALTMA VE SİMGELER

SSF Katı faz fermantasyonu

SmF Submerged fermentasyonu

YE Maya Oumlzuumltuuml

NB Nutrienth Broth

LB Laura Broth

IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği

RGPW Red Gram Plant Waste

TCA Trikloroasetikasit

CSL Corn Speed Luquor

pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı

aw Su aktivite faktoumlruuml

SDS Sodyum dodesil suumllfat

BSA Bovim serum albuumlmin

CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr

CuCl2 Bakır kloruumlr

MgCl2 Magnezyum kloruumlr

ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr

FeCl2 Demir kloruumlr

MnCl2 Mangan kloruumlr

NaCl Sodyum kloruumlr

Na2CO3 Sodyum karbonat

CuSO4 Bakır suumllfat

MgSO4 Magnezyum suumllfat

NaOH Sodyum hidroksit

(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat

Sedat KAYA

1

1GİRİŞ

11 Enzimler

Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve

organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere

enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların

yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten

şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir

molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)

Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar

farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil

olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783

yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek

kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere

doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden

elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını

saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları

hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini

ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili

Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz

enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)

Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim

piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı

beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini

karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır

Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda

organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan

2008)

Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan

bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel

katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

2

Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve

enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen

enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark

2005)

Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı

Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan

bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine

yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik

accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim

uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip

Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim

şartları belirlenecektir

112 Proteazlar

Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını

katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir

Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik

2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı

fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde

hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee

ve ark 2008)

İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok

uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)

Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin

proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler

10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde

bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin

edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere

yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark

1994 Schrerier 1997)

Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak

sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik

Sedat KAYA

3

oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan

ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve

ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları

deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık

arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde

peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir

kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)

Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde

edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında

kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim

pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları

ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)

Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri

Bakteriler

Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan

Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan

Bacillus firmus Alkalin Deterjan

Bacillus megaterium Alkalin Deterjan

Bacillus pumulis Alkalin Deterjan

Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan

Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan

Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda

Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda

Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda

Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda

Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda

Mantarlar

Aspergillus niger Alkalin Deterjan

Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus flavus Alkalin Deterjan

Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda

Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda

Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda

Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda

1 GİRİŞ

4

1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri

Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein

sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir

yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır

Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları

katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar

saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile

proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip

olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)

Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel

gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu

enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda

karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek

değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)

Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre

duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar

Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin

sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin

gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000

Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı

enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli

metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)

1122 Proteazların Sınıflandırılması

Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve

adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere

iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr

Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve

endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark

1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir

Sedat KAYA

5

Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel

gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein

proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar

(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)

Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral

proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)

1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri

Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca

peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha

sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)

1- Reaksiyon katalizi

2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı

3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler

Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir

Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)

1 GİRİŞ

6

Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml

katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin

proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)

ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak

bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar

11231 Ekzopeptidazlar

Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit

bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden

ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler

ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk

peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının

hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler

Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek

karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil

karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid

bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)

11232 Endopeptidazlar

Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan

peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana

ve ark 1995)

Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve

histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde

serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve

ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları

nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH

değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll

ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)

Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein

(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile

karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif

Sedat KAYA

7

merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside

edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir

Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin

katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH

değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır

Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara

goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar

aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların

yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2

) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat

yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali

miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve

ark 1998)

1124 Proteazların Etki Mekanizması

İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında

bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir

su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına

Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana

gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların

etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır

Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)

1 GİRİŞ

8

1125 Proteaz Kaynakları

Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda

bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik

goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları

olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları

birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri

kazanımları kolaydır (Pandey 2006)

Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve

ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği

belirtilmektedir

1126 Proteaz Uumlretimi

Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun

(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim

uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir

Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama

alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)

Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri

gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim

gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda

membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik

uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına

youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve

ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz

fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler

(Haki ve Rakshit 2003)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve

durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların

uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi

kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun

Sedat KAYA

9

şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize

edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma

inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz

sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar

Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli

kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla

kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli

ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks

hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri

tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca

Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar

uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli

oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu

enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)

Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri

belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal

kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla

değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi

alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge

12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri

goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların

varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli

kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)

1 GİRİŞ

10

Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve

uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)

Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal

Kaynak

Uygulama Alanı

Novo Nordisk

Danimarka

Alcalase

Savinase

Esparase

Biofeed pro

Durazym

Novozyme47 1MP

Novozyme 243

Nue

B licheniformis

Bacillus sp

B lentus

B licheniformis

Bacillus sp

Belirtilmiyor

B licheniformis

Bacillus sp

Deterjan ipek

Deterjan tekstil

Deterjan gıda ipek

Yem

Deterjan

Fotoğraf

Deri

Genencor

International

ABD

Purafact

Primatan

B lentus

Bakteriyel

Kaynaklı

Deterjan

Deri

Gist-Brocades

Hollanda

Subtilisin

Maxacal

Maxatase

B alcalophilus

Bacillus sp

Bacillus sp

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Solvay Enzymes

Almanya

Opticlean

Optimase

Maxapem

HT-proteolytic

Protease

B alcalophilus

B licheniformis

Bacillus spnin

Protein

muumlhendisliği ile

uumlretilmiş varyantı

B sublilis

B licheniformis

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Alkol iccedilki ekmek

yem gıda deri

fotoğrafik atık

Gıda atık

Amano

Pharmaceuticals

Japonya

Proleather

Collagenas

Amano protease S

Bacillus sp

Clostrodium sp

Bacillus sp

Gıda

Teknik

Gıda

Enzyme

Development

ABD

Enzeco alkaline

protease-L FG

Enzeco high

alkaline protease

B licheniformis

B licheniformis

Bacillus sp

Teknik

Gıda

Enduumlstriyel

Nagase

Biochemicals

Japonya

Bioprase

concantrate

Ps Protease

Ps Elastase

CrystProtease

CrystProtease

Bioprase

Bioprase SP-10

B sublilis

P aeruginoso

P aeruginoso

B subtilis(K2)

Bsubtilis(bioteus)

B sublilis

B sublilis

Kozmetik

farmasoumltik

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Deterjan temizlik

Gıda

Jodo Shusei Japonya Codo Bap

B licheniformis Deterjan gıda

Rohm Almanya Corolase 7089

B sublilis Gıda

Sedat KAYA

11

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları

Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002

Pandey 2004)

Enduumlstri

Proteaz Uygulama

Ekmek yapımı Noumltral proteaz

Hamur kalitesini arttırma

İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme

iccedileceklerde bulanıklığın

giderilmesi

Mandıra

Fungal proteazlar simozin

diğer proteazlar

Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt

suyunun işlenmesi modifiye

peynir enzim uumlretimi

Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin

uzaklaştırılması

Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday

gluteni gibi zengin protein

metaryallerinin modifikasyonu

Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden

tuumlylerin uzaklaştırılması

Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve

balık atıklarından protein eldesi

Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması

kan pıhtısını ccediloumlzme doku

iltihaplarının azaltılması tıbbı

uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt

lensler ve takma dişlerin

temizlenmesi

Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf

filmlerinden guumlmuumlş eldesi

Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers

Hidroliz

Enduumlstriyel ve Evsel

Atıkların İşlenmesi

Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel

faaliyetler sonucu meydana gelen

atıkların işlenmesi

1 GİRİŞ

12

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde

patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960

yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar

guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus

alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar

uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı

madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır

(Dağaşan 1997)

Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı

maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta

ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı

maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları

ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler

kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki

kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her

tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi

protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)

11282 Fırında Pişirme Uygulamaları

Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave

edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması

sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun

makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri

ve ark 2002)

Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik

olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır

Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak

bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil

giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun

yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini

sağlamaktadır (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

13

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar

Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin

olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin

ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim

suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından

tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine

ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara

sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar

sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada

yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)

Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok

oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin

salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin

pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri

peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln

lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin

fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da

kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri

meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin

1998)

11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml

Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol

miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla

kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik

aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu

etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır

Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla

atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir

1 GİRİŞ

14

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı

Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri

uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki

guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol

accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre

dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından

parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film

sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında

olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis

denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen

fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen

damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri

sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama

yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan

derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve

Saleemuddin 1998)

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı

Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik

ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı

verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini

sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin

proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak

1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi

yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

15

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı

Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal

proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik

enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden

olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku

boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma

şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm

sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak

bulunan ve Ca+2

tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir

(Claus ve ark 1986)

Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde

edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların

accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve

meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan

yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı

Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az

duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu

amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır

Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da

yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa

rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik

olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde

kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)

12 Bacillus Cinsi

Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde

endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek

başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan

huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998

Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir

1 GİRİŞ

16

ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış

goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı

enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda

kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum

37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli

enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi

duumlşuumlnuumllmektedirler

Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak

tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen

karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun

basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin

duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde

olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık

donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik

tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)

Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil

aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı

bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının

dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler

(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla

sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus

bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak

amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst

kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda

olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)

121 Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli

enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen

saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram

pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)

Sedat KAYA

17

Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip

amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan

oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın

olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis

kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen

diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri

(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu

2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)

Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel

farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında

değişmektedir (Akcan 2009)

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği

Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda

katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır

(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde

umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu

nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan

mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında

bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole

edilmiştir (Singhania ve ark 2009)

Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri

uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar

buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı

uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel

fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil

kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak

buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait

ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml

peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek

1 GİRİŞ

18

verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının

uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer

olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize

edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)

Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler

alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik

olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda

kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren

biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı

maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml

bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)

SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar

kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu

pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır

unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar

kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark

2009)

Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF

genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir

SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların

SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite

goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan

mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli

avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece

ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte

ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin

kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet

ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla

biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi

oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek

kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)

Sedat KAYA

19

SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum

koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH

inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen

azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)

Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda

SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat

olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin

SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)

SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır

1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir

2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak

kullanılır (Nigam ve Singh 1994)

1 GİRİŞ

20

Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)

ABİYOLOJİK UYGULAMALARI

MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı

Hz İsa‟nın doğumundan

oumlnce Asya‟da

Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den

yararlanılmıştır

MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma

MOuml 1500 Koji işlemi

7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi

18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı

18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit

kullanımı

1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri

1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit

1920-1940

Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal

enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin

gerccedilekleştirilmesi

1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen

olağanuumlstuuml gelişme

1950-1960

Steroid transformasyonu

1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan

yemlerinin uumlretimi

1980-1990

Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi

column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri

ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar

1990-Guumlnuumlmuumlze kadar

SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler

biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki

ilerlemeler

Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım

enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu

biyotranformasyonlar

Sedat KAYA

21

B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER

Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon

ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin

oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin

Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit

Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-

ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik

noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz

feruloil para-kaumaroil esteraz

Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit

Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol

aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar

biyopestisitlerbiyoherbisitler

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları

SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre

belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır

SSF‟in daha fazla verime sahip olması

SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır

Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır

Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-

Guerra ve ark 2003)

Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar

Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)

Koumlpuumlklenmenin olmaması

Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik

Daha basit fermantasyon ortamı

Daha kolay havalandırma

1 GİRİŞ

22

Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım

Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)

Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği

Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası

Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet

Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren

yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması

Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda

otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya

gereksinim yoktur

Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir

Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)

SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş

mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha

guumlvenilirdir

Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile

karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar

Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon

Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması

Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması

Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar

Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi

Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması

Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması

Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi

Sedat KAYA

23

Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama

homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)

Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması

zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin

tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)

Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur

Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk

oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-

Guerra ve ark 2003)

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler

Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)

1 Biyolojik faktoumlrler

2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

1321 Biyolojik Faktoumlrler

Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve

uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli

tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)

Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir

Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan

uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler

1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli

faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi

sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon

kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein

sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme

işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin

eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

24

Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde

gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi

protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin

induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi

şeklindedir

Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu

nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak

nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir

Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır

SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan

biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile

sağlanabilir

Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey

alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok

kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok

mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme

meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller

kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha

etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan

oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml

belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Sedat KAYA

25

2 KAYNAK OumlZETLERİ

Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den

elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH

aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH

85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır

Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı

duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen

Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini

uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk

molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln

inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak

kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir

Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik

bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler

Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz

mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1

NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı

kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr

kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda

elde edilmiştir

Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından

izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719

suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın

azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği

belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+

ve

Cu2+

iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir

Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali

proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini

karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı

olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir

2 KAYNAK OumlZETLERİ

26

Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini

baskıladığını tespit etmişlerdir

Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis

Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi

mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip

proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH

60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir

Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip

ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek

amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki

izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit

etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir

Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak

belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir

Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday

kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini

buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum

enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu

05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC

250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite

goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de

goumlzlenmiştir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve

buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir

Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim

aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak

buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık

başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm

hacmi 20 olarak rapor etmişler

Sedat KAYA

27

Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya

proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak

bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin

proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu

kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini

20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70

olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla

iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir

Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin

alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC

olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir

Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil

olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler

Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz

uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı

Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak

proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi

kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi

gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen

enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı

olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum

436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak

belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu

kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak

belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF

youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir

Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından

izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı

substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona

bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen

2 KAYNAK OumlZETLERİ

28

karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır

Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve

sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini

goumlstermektedir

Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde

yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda

kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada

katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar

ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF

youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde

etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini

olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2

ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve

maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu

etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr

Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi

aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya

ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla

artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot

kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim

uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon

suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir

Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve

kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit

etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz

uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta

ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve

amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır

Sedat KAYA

29

Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan

ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize

edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite

(2560 U ml-1

) değeri 48 saatten sonra (g-1

) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4

1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin

proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında

stabilite goumlstermiştir

Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum

kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir

Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas

aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin

bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir

(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz

aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟

da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz

uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak

pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz

aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu

sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken

yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir

Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis

DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak

atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı

patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin

hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi

patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve

Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da

yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve

maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz

uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi

2 KAYNAK OumlZETLERİ

30

37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen

enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu

goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu

sonuccedillar alınacağı umulmaktadır

Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis

N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3

K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında

gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve

yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren

ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz

uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları

96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10

mM Ca2+

iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini

korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve

pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween

65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda

muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135

ve 126 oranlarında koruyabilmiştir

Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1

tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin

optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin

proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı

test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur

Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite

goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde

oumlzellikle Ca2+

Mg2+

ve Cu2+

bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan

inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden

olduğunu tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

31

Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar

katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma

ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda

enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug

ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil

nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi

22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot

kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug

yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide

bulunduğunu belirlemişlerdir

Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum

aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu

ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+

Mg2+

ve

Mn2+

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+

‟nin olumsuz

etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan

derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini

yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20

Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol

ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden

olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini

goumlzlemlemişlerdir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık

materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı

substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla

uumlretim gerccedilekleştirmiştir

Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi

ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday

kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil

olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca

+2

2 KAYNAK OumlZETLERİ

32

ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg

+2 Cu

+2 Fe

+2 Co

+2 ve Zn

+2 iyonları ise

aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe

ederken Cu+2

iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın

metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir

Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi

iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi

iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim

uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla

uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk

olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti

Ca2+

ve Mg2+

kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin

optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin

pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+

ve Ca2+

iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa

olarak tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

33

3 MATERYAL ve METOT

31 Materyal

311 Kullanılan kimyasal maddeler

Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum

dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit

(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat

sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de

Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir

3111 Azot kaynakları

Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract

MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir

3112 Karbon kaynakları

Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den

temin edilmiştir

3113 Deterjanlar

Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan

temin edilmiştir

3114 Metal tuzları

FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de

Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir

3115 Besi yeri maddeleri

Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone

ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir

3 MATERYAL ve METOD

34

312 Kullanılan aletler

İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)

Steril Kabin ( Telstar AV-100)

Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)

Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)

Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)

Vorteks (Stuart) (VWR International )

Magnetik Karıştırıcı (Stuart)

Deep-Freeze (Haris -70ordmC)

Etuumlv (Heraus)

Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)

Otoklav (HIRAYAMA)

Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)

pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)

Sterilizatoumlr (Heraus)

Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)

313 Biyolojik materyal

Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis

ATCC 14580 suşu kullanılmıştır

314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması

Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine

ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda

kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı

Sedat KAYA

35

315 Substrat seccedilimi

Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday

kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi

kullanılmıştır

316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml

Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil

kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı

elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı

substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı

317 Kullanılan Besiyerleri

Sıvı besiyeri

Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf

suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi

sağlandıktan sonra otoklavlandı

Katı besiyeri

10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya

tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

SmF besiyeri

02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler

iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı

016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

3 MATERYAL ve METOD

36

318 SSF besiyeri

Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki

eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde

substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer

iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi

121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye

gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona

bırakıldı

Sedat KAYA

37

32 METOT

321 Mikroorganizma Uumlretimi

Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi

katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona

bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve

NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı

İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı

Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik

erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek

mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi

Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de

150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin

sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan

arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı

322 Ccediloumlzeltiler

Ccediloumlzeltilerin hazırlanması

Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması

pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml

01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan

sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

3 MATERYAL ve METOD

38

pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

Alkalin Ccediloumlzeltisi

4 Na2CO3

4 Na-K tartarat

2 CuSO4

Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde

hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları

sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı

Azo-kazein hazırlanması

005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi

sağlanarak hazırlandı

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu

Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri

ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre

sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5

dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant

uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı

324 Proteaz Aktivite Tayini

Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein

(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu

suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de

bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi

1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile

gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)

Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan

enzim miktarı olarak tanımlandı

Sedat KAYA

39

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi

Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu

arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu

substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave

edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı

NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave

edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar

inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce

oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF

besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı

santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı

(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı

326 Protein Miktar Tayini

Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak

Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen

(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin

protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı

Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl

saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra

uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek

30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm

yapıldı (Lowry ve ark 1951)

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin

Etkisi

SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek

iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri

yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı

3 MATERYAL ve METOD

40

İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika

santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere

aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı

Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml

ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim

kaynağı olarak kullanıldı

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin

Etkisi

Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere

konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha

sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra

37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96

120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi

belirlendi

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml

bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi

uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat

sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon

(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan

1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)

eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril

sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst

sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Sedat KAYA

41

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35

37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten

sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı

pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı

Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav

sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF

besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g

2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak

inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından

aktivite tayini yapıldı

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı

besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi

yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda

ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak

eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen

materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp

proteaz aktivite tayini yapıldı

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

3 MATERYAL ve METOD

42

Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki

atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası

her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra

farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan

oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat

Karışımının Belirlenmesi

Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24

saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır

kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g

2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların

her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi

yapıldı

Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda

SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı

olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki

Substratın Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu

subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra

inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki

substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat

kullanıldı

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının

Etkisi

Sedat KAYA

43

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon

kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten

sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp

100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine

eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı

Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun

ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde

edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot

kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp

hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF

ortamlarına eklenerek otoklavlandı

Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim

yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının

Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01

olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2

001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip

otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi

yapıldı

Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

3 MATERYAL ve METOD

44

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon

başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki

sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık

belirlenmeye ccedilalışıldı

Sedat KAYA

45

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı

arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de

goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Pirinccedil

Kab

uğu

Mer

cim

ek K

abuğ

u

Mıs

ır K

uumlspe

si

Arp

a K

abuğ

u

Buğ

day

Kab

uğu

Pam

uk K

abuğ

u

Sp

esif

ik A

ktiv

ite(

Um

g

24

48

72

96

120

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF

ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz

uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu

ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite

değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk

kabuğunda elde edilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

46

42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk

oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg

olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte

goumlre azaldığı belirlenmiştir

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

12 24 48 72 96 120

Zaman

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

um

g)

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Sedat KAYA

47

43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı

substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl

1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme

suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı

olarak kullanıldı

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Saf su

Ccedileş

me

suyu

NaC

I

Tris-

HCl p

H9

SDS

Tw

een-

80

Trit

onX

100

Ekstraksiyon ortamı (10 ml)

Sp

esif

ik A

kti

vit

e (U

mg

)

Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon

ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana

getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk

proteaz uumlretimine rastlanıldı

44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı

SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin

SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz

aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)

olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

48

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 30 35 37 40 45 50 55

İnkubasyon sıcaklıgı (degC)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin

mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan

ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80

(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

4 5 6 7 8 9 10pH

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi

Sedat KAYA

49

46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi

iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı

ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı

arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde

edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

10 20 30 40 50 60 70

Nem seviyesi ()

Sesi

fik

ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi

47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

50

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1 2 3 4 5 6 8

İnokulum (ml)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında

(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi

iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

60 100 120 150 180 200

Ccedilalkalama hızı (rpm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Sedat KAYA

51

49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının

Belirlenmesi

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil

kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında

maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 g pk +

05 g mk

20 g pk + 10

g mk

15 g pk + 15

g mk

10 g pk + 20

g mk

05 g pk+ 25

g mk

Mısır

Kuumlspesi 3 g

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi

mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu

410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın

Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı

partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da

goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta

1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

52

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

500 1000 1500

Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi

411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz

suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda

(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz

Karbon Kaynakaları (1)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Sedat KAYA

53

412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton

maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave

edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Kon

trol

Et oumlzuuml

tuuml

Kaz

ein

Pepto

n

Tripto

n

May

a oumlz

uumltuuml

Am

onyu

m n

itrat

Am

onyu

m suumll

fat

Am

onyu

m k

lorid

Azot Kaynakları (1)

Spes

ifik

Akti

vit

e (U

mg)

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi

413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen

01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen

Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)

ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi

Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe

edilmiştir (Şekil 43)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

54

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum

suumllfat

Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat

Metal Tuzları ( 01)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi

414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini

belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50

60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı

Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te

goumlsterilmiştir

0

20

40

60

80

100

120

15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90

Sıcaklık (degC)

Roumlla

tif

Akti

vit

e

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Sedat KAYA

55

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda

oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal

formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler

azaldığından dolayı da avantajlıdır

Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat

olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller

enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde

olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de

kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)

Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde

gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal

olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal

bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)

SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir

faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi

atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda

da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel

olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)

Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz

uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr

edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca

zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri

mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış

olabilir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF

youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En

iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

56

Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı

ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde

elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde

etmişlerdir

Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam

bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon

suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon

ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda

enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan

kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi

sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)

Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte

1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki

ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)

Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında

enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark

(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle

kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir

Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve

bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk

solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi

fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)

Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli

bir farktoumlrduumlr

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı

substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi

ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme

suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme

yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te

Sedat KAYA

57

amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila

oumlnemlidir

Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz

aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)

Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada

proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından

elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan

ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark

1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile

45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996

Gangadharan ve ark 2006)

SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın

gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından

ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat

fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve

mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık

aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)

Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık

literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır

İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder

metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol

accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı

ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve

Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda

kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri

besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık

biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak

kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

58

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil

pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak

tespit edilmiştir (Şekil 45)

pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen

bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması

gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar

Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını

oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de

etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı

değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol

oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir

Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla

kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine

başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik

goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)

Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor

edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit

edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek

pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan

enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde

kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)

Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz

aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit

etmişlerdir

Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil

pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit

edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği

yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak

goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)

Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-

110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite

Sedat KAYA

59

goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği

alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır

Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH

değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi

GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu

belirtmişlerdir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat

olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin

yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat

miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor

edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark

2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda

nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar

Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve

metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını

optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de

değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk

olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve

enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında

ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi

nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve

substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)

bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz

sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

60

İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile

ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin

azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm

hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen

uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar

(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak

yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve

katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi

azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005

Chutmanop ve ark 2008)

Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun

inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus

sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit

etmşlerdir

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)

olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile

paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda

60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin

azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı

substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta

yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde

etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma

fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama

yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir

Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları

farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm

olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon

sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri

huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava

Sedat KAYA

61

akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan

enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim

denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı

fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan

zayıf havalandırma oranına neden olabilir

Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler

alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin

mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF

koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm

ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil

kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum

enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)

Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak

SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve

Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark

2009 Tanyıldızı ve ark 2007)

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk

partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil

410)

Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel

olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar

ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat

parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum

havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay

goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk

partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk

parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

62

iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği

ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay

metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde

etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları

bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim

sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup

bulunmaması ile ilişkilidir

Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle

formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel

tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı

tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların

beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en

buumlyuumlk besin kaynağıdır

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite

değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış

goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005

Mukherjee ve ark 2009)

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından

kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)

Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde

bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr

etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az

olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki

fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

Sedat KAYA

63

aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de

goumlsterilmiştir

Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel

suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade

edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi

azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin

besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini

vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili

ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki

ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve

ark 1995)

Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et

ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır

Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)

ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları

bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini

olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların

substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir

Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim

maliyetini azaltmaktadır

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01

konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis

ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)

iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal

tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır

Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında

eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik

ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)

Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin

bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak

kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

64

B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti

azalabilir

Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde

edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+

ve Hg2+

iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır

Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2

Mg+2

ve Mn+2

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu

etkilerken Cu+2

nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir

Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr

ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim

uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)

İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten

dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir

Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme

ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye

başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve

ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal

atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında

enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha

fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların

kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir

SEDAT KAYA

65

6 KAYNAKLAR

Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi

Science 43(4) 257-262

Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis

Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156

Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a

soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to

soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136

Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması

Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır

Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının

oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Ankara

Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-

Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-

glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110

Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource

Technology 64 175ndash183

Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548

Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase

from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food

Engineering 79 950-955

Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre

dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen

Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara

Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing

Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology

Advances 11 539ndash547

6 KAYNAKLAR

66

Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-

amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry

38 1665ndash1668

Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu

nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik

Enstituumlsuuml Kocaeli

Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-

tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus

licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768

Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable

Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial

Thecnology 32 294-304

Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A

Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process

Biochemistry 42 1150-1154

Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5

Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme

production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering

26 100-106

Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995

Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis

PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243

ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic

Bacteriology 1105ndash1141

Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid

protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial

Biotechnology 10 17ndash30

Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran

M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine

Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-

961

SEDAT KAYA

67

Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease

production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates

Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018

Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on

laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302

Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal

inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2

iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans

Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5

Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)

Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel

Konular ve Uygulamalar 14-15

Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003

Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal

Cleaner Production 11 533ndash611

Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid

state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil

Bioresource Technology 101 1385-1388

El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the

ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production

scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593

Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease

production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation

Process Biochemistry 40 1951ndash1956

Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice

spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402

Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra

cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544

Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996

Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and

characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332

Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry

69 18-28

6 KAYNAKLAR

68

Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of

Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132

Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid

Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology

Biotechnology 44 (2) 269ndash274

George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of

protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess

Engineering 16 381-382

Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara

Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-

amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616

Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular

approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32

Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva

R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition

2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22

Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable

enzymes Bioresource Technology 89 17-34

Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM

1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435

Biotechnology Letters 19 675ndash712

He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-

like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326

Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline

proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1

Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical

Engineering 4771-79

Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic

bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36

415- 424

Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231

SEDAT KAYA

69

John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16

Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate

for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in

a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144

Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant

alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula

leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447

Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis

of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65

150ndash153

Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile

ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Diyarbakır

Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and

characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal

Microbiology Biotechnology 32 335-344

Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms

aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785

Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995

Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and

stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri

Apply Environment Microbiology 61 3098-3104

Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase

Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial

Biotechnology 46 106-111

Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial

viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594

Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For

Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729

Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease

From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-

1705

6 KAYNAKLAR

70

Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and

Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672

Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State

Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr

Bioengineering 100 168ndash17

Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a

bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422

Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical

Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus

subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39

Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various

chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229

Turkish Journal of Biology 99-103

Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined

Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular

Biology 235 1560-1584

Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and

optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp

CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537

Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine

Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis

Journal Moleculer Biology 76 103-122

Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic

enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14

Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A

in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and

Purification 57 01ndash107

Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production

of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661

Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for

improvement Trends in Food Science and Technology 8 339

SEDAT KAYA

71

Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin

phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275

Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase

production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and

Microbial Technology 39 56ndash59

Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5

Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent

tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as

substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735

Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel

substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF

Process Biochemistry 45 47-53

Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an

alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654

Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline

protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203

Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83

Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a

thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate

Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of

enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361

Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under

solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and

Biotechnology 84 (8) 1246-1249

Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices

Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78

Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium

composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis

N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394

Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular

α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203

6 KAYNAKLAR

72

Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state

fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90

Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995

Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264

Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their

applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423

Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by

Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab

shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10

Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash

performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal

Microbiology Biotechnology 17 493ndash497

Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from

Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779

Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen

proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara

Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul

Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State

Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169

Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84

Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in

solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology

16 578-584

Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid

substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource

Technology 97 (1) 171-177

Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization

of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state

Fermentation 33-183-189

I

TEŞEKKUumlR

Yuumlksek Lisans oumlğrenimim ve tez konumun seccediliminde planlamasında deneysel

ccedilalıĢmalarım iccedilin gerekli kimyasal ve teccedilhizatların sağlanmasında ve tezimin yazımında bilgi ve

desteğiyle yol goumlsterip bana oumlrnek olan yardımlarını hiccedil esirgemeden buumltuumln desteğiyle her an

her konuda yanımda olan ccedilok değerli danıĢman hocam Sayın Doccedil Dr Fikret UYARrsquoa teĢekkuumlr

ederim

Deneysel ccedilalıĢmalarım sırasında karĢılaĢtığım sorunları aĢmak iccedilin ccediloumlzuumlm yolları

bulmak adına bilgisini esirgemeyerek destek veren ve yuumlksek lisans eğitimim suumlresince beni

youmlnlendiren yol goumlsteren ve laboratuvar ccedilalıĢmalarıma katkıda bulunan ikinci tez danıĢman

hocam Siirt Uumlniversitesi oumlğretim uumlyelerinden Sayın Yrd Doccedil Dr Nurullah AKCANrsquoa teĢekkuumlr

ederim

Laboratuar ccedilalıĢmalarım ve tez yazım aĢaması sırasında desteğini esirgemeyen Dicle

Uumlniversitesi Fen Fakuumlltesi Kimya Boumlluumlmuuml oumlğretim uumlyelerinden Sayın Doccedil Dr Zuumlbeyde

BAYSALrsquoa ve Dicle Uumlniversitesi Fen Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml oumlğretim uumlyelerinden Sayın

Prof Dr Abdunnasır YILDIZrsquoa teĢekkuumlr ederim

Manevi desteklerini hiccedilbir zaman esirgemeyen sayın hocalarım Yrd Doccedil Dr Birguumll

OTLUDĠL ve Yrd Doccedil Dr Sema AGUumlLOĞLU FĠNCANrsquo a teĢekkuumlr ederim

Tezimin yazım aĢamasında yardımlarını esirgemeyen arkadaĢlarım BARIġ ENEZ

BESĠ SERĠN ve YUSUF OumlNENrsquoe teĢekkuumlr ederim

Molekuumller Biyoloji AraĢtırma Laboratuarırsquonda yardımlarını goumlrduumlğuumlm Yuumlksek Lisans

ve Doktora yapan arkadaĢlara teĢekkuumlr ederim

Manevi desteklerinden dolayı Diyarbakır Ġl Kontrol Labaratuvar ġeflerinden Mehmet

DENĠZrsquoe ccedileviri konusunda yardımlarını esirgemeyen sayın arkadaĢlarım ESıddık

MARANGOZrsquoa ve Medeni AKGUumlNrsquoe teĢekkuumlr ederim

Hep bana destek olan varlıklarıyla daha guumlccedilluuml olmamı sağlayan dostlarıma teĢekkuumlr

ederim Ccedilok değerli arkadaĢım sayın Muumlrvet YILDIRIMrsquoa teĢekkuumlr ederim

Tuumlm hayatım boyunca hep yanımda olan ve desteklerini bana olan guumlvenlerini hep

uumlzerimde hissettiğim aileme teĢekkuumlr ederim

II

İCcedilİNDEKİLER

Sayfa

TEŞEKKUumlRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I

İCcedilİNDEKİLERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip II

OumlZEThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip V

ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VI

CcedilİZELGE LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VII

ŞEKİL LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VIII

KISALTMA VE SİMGELERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IX

1 GİRİŞhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1

11 Enzimlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1

112 Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2

1121 Proteazların Genel Oumlzelliklerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4

1122 Proteazların Sınıflandırılmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4

1123 Mikrobiyal Proteaz CcedileĢitlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip5

11231 Ekzopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6

11232 Endopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6

1124 Proteazların Etki Mekanizması helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip7

1125 Proteaz Kaynaklarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8

1126 Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

11282 Fırında PiĢirme Uygulamalarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

11284 Atık Arıtımı ve DoumlnuumlĢuumlmuumlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

III

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

12 Bacillus Cinsihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

121 Bacillus licheniformishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

1321 Biyolojik Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

1322 Fiziko-Kimyasal Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

2 KAYNAK OumlZETLERİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25

3 MATERYAL ve METOThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

31 Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

311 Kullanılan Kimyasal Maddeler helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3111 Azot Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3112 Karbon Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3113 Deterjanlar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3114 Metal Tuzları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3115 Besi Yeri Maddeleri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

312 Kullanılan Aletlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34

313Biyolojik Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

314 Mikroorganizmaların Uumlretimi ve Saklanmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

315 Substrat Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

316 Substrat Parccedila Buumlyuumlkluumlğuuml helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

317 Kullanılan Besiyerlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

318 SSF Besiyeri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

32 Metothelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

IV

321 Mikroorganizma Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

322 Ccediloumlzeltilerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonuhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38

324 Proteaz Aktivite Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

326 Protein Miktar Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Parametrelerin Etkisinin Ġncelenmesihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Besiyerlerinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip39

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi42

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisihelliphelliphelliphellip42

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip 43

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphellip43

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisihelliphelliphelliphelliphellip43

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44

4 ARAŞTIRMA BULGULARIhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip45

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55

6 KAYNAKLARhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65

OumlZGECcedilMĠġhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77

V

OumlZET

KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN

ARAġTIRILMASI

YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ

Sedat KAYA

DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ

FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml

BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI

2011

Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık

gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve

mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya

hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan

uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla

miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları

iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda

enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln

geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır

CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin

pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu

katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki

ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon

suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine

etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi

proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit

edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon

kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve

amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek

miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin

30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi

belirlendi

Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580

Proteaz Mısır kuumlspesi

VI

ABSTRACT

THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD

WAS EXAMINED

MSc THESIS

Sedat KAYA

DICLE UNIVERSTY

INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES

DEPARTMENT of BIOLOGY

2011

The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine

and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms

have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have

considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more

stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group

of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical

leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair

recovery of silver from x-ray films and used many more industries field

In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice

husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid

substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize

was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the

obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size

on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm

substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC

respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources

on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect

amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was

investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed

maize+5 Rice husk)

Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease

Crushed maize

VII

CcedilİZELGE LİSTESİ

Ccedilizelge No Sayfa

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3

Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama

Alanları ve Uumlreticileri 10

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11

Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20

VIII

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil No Sayfa

Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5

Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46

Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48

Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50

Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50

Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51

Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54

IX

KISALTMA VE SİMGELER

SSF Katı faz fermantasyonu

SmF Submerged fermentasyonu

YE Maya Oumlzuumltuuml

NB Nutrienth Broth

LB Laura Broth

IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği

RGPW Red Gram Plant Waste

TCA Trikloroasetikasit

CSL Corn Speed Luquor

pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı

aw Su aktivite faktoumlruuml

SDS Sodyum dodesil suumllfat

BSA Bovim serum albuumlmin

CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr

CuCl2 Bakır kloruumlr

MgCl2 Magnezyum kloruumlr

ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr

FeCl2 Demir kloruumlr

MnCl2 Mangan kloruumlr

NaCl Sodyum kloruumlr

Na2CO3 Sodyum karbonat

CuSO4 Bakır suumllfat

MgSO4 Magnezyum suumllfat

NaOH Sodyum hidroksit

(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat

Sedat KAYA

1

1GİRİŞ

11 Enzimler

Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve

organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere

enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların

yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten

şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir

molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)

Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar

farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil

olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783

yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek

kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere

doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden

elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını

saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları

hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini

ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili

Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz

enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)

Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim

piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı

beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini

karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır

Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda

organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan

2008)

Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan

bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel

katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

2

Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve

enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen

enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark

2005)

Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı

Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan

bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine

yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik

accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim

uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip

Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim

şartları belirlenecektir

112 Proteazlar

Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını

katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir

Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik

2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı

fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde

hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee

ve ark 2008)

İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok

uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)

Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin

proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler

10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde

bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin

edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere

yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark

1994 Schrerier 1997)

Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak

sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik

Sedat KAYA

3

oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan

ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve

ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları

deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık

arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde

peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir

kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)

Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde

edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında

kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim

pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları

ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)

Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri

Bakteriler

Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan

Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan

Bacillus firmus Alkalin Deterjan

Bacillus megaterium Alkalin Deterjan

Bacillus pumulis Alkalin Deterjan

Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan

Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan

Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda

Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda

Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda

Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda

Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda

Mantarlar

Aspergillus niger Alkalin Deterjan

Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus flavus Alkalin Deterjan

Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda

Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda

Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda

Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda

1 GİRİŞ

4

1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri

Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein

sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir

yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır

Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları

katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar

saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile

proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip

olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)

Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel

gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu

enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda

karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek

değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)

Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre

duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar

Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin

sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin

gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000

Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı

enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli

metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)

1122 Proteazların Sınıflandırılması

Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve

adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere

iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr

Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve

endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark

1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir

Sedat KAYA

5

Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel

gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein

proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar

(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)

Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral

proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)

1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri

Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca

peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha

sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)

1- Reaksiyon katalizi

2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı

3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler

Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir

Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)

1 GİRİŞ

6

Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml

katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin

proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)

ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak

bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar

11231 Ekzopeptidazlar

Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit

bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden

ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler

ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk

peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının

hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler

Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek

karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil

karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid

bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)

11232 Endopeptidazlar

Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan

peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana

ve ark 1995)

Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve

histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde

serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve

ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları

nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH

değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll

ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)

Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein

(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile

karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif

Sedat KAYA

7

merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside

edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir

Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin

katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH

değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır

Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara

goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar

aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların

yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2

) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat

yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali

miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve

ark 1998)

1124 Proteazların Etki Mekanizması

İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında

bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir

su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına

Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana

gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların

etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır

Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)

1 GİRİŞ

8

1125 Proteaz Kaynakları

Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda

bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik

goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları

olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları

birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri

kazanımları kolaydır (Pandey 2006)

Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve

ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği

belirtilmektedir

1126 Proteaz Uumlretimi

Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun

(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim

uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir

Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama

alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)

Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri

gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim

gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda

membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik

uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına

youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve

ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz

fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler

(Haki ve Rakshit 2003)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve

durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların

uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi

kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun

Sedat KAYA

9

şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize

edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma

inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz

sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar

Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli

kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla

kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli

ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks

hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri

tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca

Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar

uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli

oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu

enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)

Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri

belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal

kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla

değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi

alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge

12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri

goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların

varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli

kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)

1 GİRİŞ

10

Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve

uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)

Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal

Kaynak

Uygulama Alanı

Novo Nordisk

Danimarka

Alcalase

Savinase

Esparase

Biofeed pro

Durazym

Novozyme47 1MP

Novozyme 243

Nue

B licheniformis

Bacillus sp

B lentus

B licheniformis

Bacillus sp

Belirtilmiyor

B licheniformis

Bacillus sp

Deterjan ipek

Deterjan tekstil

Deterjan gıda ipek

Yem

Deterjan

Fotoğraf

Deri

Genencor

International

ABD

Purafact

Primatan

B lentus

Bakteriyel

Kaynaklı

Deterjan

Deri

Gist-Brocades

Hollanda

Subtilisin

Maxacal

Maxatase

B alcalophilus

Bacillus sp

Bacillus sp

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Solvay Enzymes

Almanya

Opticlean

Optimase

Maxapem

HT-proteolytic

Protease

B alcalophilus

B licheniformis

Bacillus spnin

Protein

muumlhendisliği ile

uumlretilmiş varyantı

B sublilis

B licheniformis

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Alkol iccedilki ekmek

yem gıda deri

fotoğrafik atık

Gıda atık

Amano

Pharmaceuticals

Japonya

Proleather

Collagenas

Amano protease S

Bacillus sp

Clostrodium sp

Bacillus sp

Gıda

Teknik

Gıda

Enzyme

Development

ABD

Enzeco alkaline

protease-L FG

Enzeco high

alkaline protease

B licheniformis

B licheniformis

Bacillus sp

Teknik

Gıda

Enduumlstriyel

Nagase

Biochemicals

Japonya

Bioprase

concantrate

Ps Protease

Ps Elastase

CrystProtease

CrystProtease

Bioprase

Bioprase SP-10

B sublilis

P aeruginoso

P aeruginoso

B subtilis(K2)

Bsubtilis(bioteus)

B sublilis

B sublilis

Kozmetik

farmasoumltik

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Deterjan temizlik

Gıda

Jodo Shusei Japonya Codo Bap

B licheniformis Deterjan gıda

Rohm Almanya Corolase 7089

B sublilis Gıda

Sedat KAYA

11

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları

Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002

Pandey 2004)

Enduumlstri

Proteaz Uygulama

Ekmek yapımı Noumltral proteaz

Hamur kalitesini arttırma

İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme

iccedileceklerde bulanıklığın

giderilmesi

Mandıra

Fungal proteazlar simozin

diğer proteazlar

Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt

suyunun işlenmesi modifiye

peynir enzim uumlretimi

Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin

uzaklaştırılması

Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday

gluteni gibi zengin protein

metaryallerinin modifikasyonu

Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden

tuumlylerin uzaklaştırılması

Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve

balık atıklarından protein eldesi

Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması

kan pıhtısını ccediloumlzme doku

iltihaplarının azaltılması tıbbı

uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt

lensler ve takma dişlerin

temizlenmesi

Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf

filmlerinden guumlmuumlş eldesi

Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers

Hidroliz

Enduumlstriyel ve Evsel

Atıkların İşlenmesi

Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel

faaliyetler sonucu meydana gelen

atıkların işlenmesi

1 GİRİŞ

12

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde

patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960

yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar

guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus

alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar

uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı

madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır

(Dağaşan 1997)

Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı

maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta

ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı

maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları

ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler

kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki

kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her

tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi

protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)

11282 Fırında Pişirme Uygulamaları

Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave

edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması

sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun

makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri

ve ark 2002)

Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik

olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır

Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak

bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil

giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun

yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini

sağlamaktadır (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

13

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar

Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin

olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin

ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim

suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından

tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine

ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara

sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar

sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada

yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)

Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok

oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin

salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin

pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri

peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln

lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin

fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da

kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri

meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin

1998)

11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml

Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol

miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla

kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik

aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu

etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır

Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla

atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir

1 GİRİŞ

14

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı

Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri

uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki

guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol

accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre

dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından

parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film

sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında

olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis

denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen

fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen

damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri

sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama

yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan

derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve

Saleemuddin 1998)

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı

Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik

ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı

verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini

sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin

proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak

1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi

yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

15

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı

Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal

proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik

enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden

olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku

boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma

şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm

sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak

bulunan ve Ca+2

tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir

(Claus ve ark 1986)

Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde

edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların

accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve

meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan

yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı

Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az

duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu

amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır

Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da

yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa

rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik

olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde

kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)

12 Bacillus Cinsi

Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde

endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek

başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan

huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998

Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir

1 GİRİŞ

16

ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış

goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı

enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda

kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum

37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli

enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi

duumlşuumlnuumllmektedirler

Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak

tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen

karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun

basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin

duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde

olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık

donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik

tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)

Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil

aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı

bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının

dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler

(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla

sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus

bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak

amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst

kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda

olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)

121 Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli

enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen

saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram

pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)

Sedat KAYA

17

Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip

amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan

oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın

olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis

kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen

diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri

(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu

2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)

Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel

farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında

değişmektedir (Akcan 2009)

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği

Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda

katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır

(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde

umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu

nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan

mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında

bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole

edilmiştir (Singhania ve ark 2009)

Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri

uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar

buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı

uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel

fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil

kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak

buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait

ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml

peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek

1 GİRİŞ

18

verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının

uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer

olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize

edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)

Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler

alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik

olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda

kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren

biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı

maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml

bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)

SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar

kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu

pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır

unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar

kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark

2009)

Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF

genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir

SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların

SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite

goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan

mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli

avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece

ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte

ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin

kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet

ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla

biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi

oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek

kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)

Sedat KAYA

19

SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum

koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH

inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen

azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)

Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda

SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat

olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin

SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)

SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır

1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir

2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak

kullanılır (Nigam ve Singh 1994)

1 GİRİŞ

20

Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)

ABİYOLOJİK UYGULAMALARI

MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı

Hz İsa‟nın doğumundan

oumlnce Asya‟da

Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den

yararlanılmıştır

MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma

MOuml 1500 Koji işlemi

7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi

18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı

18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit

kullanımı

1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri

1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit

1920-1940

Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal

enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin

gerccedilekleştirilmesi

1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen

olağanuumlstuuml gelişme

1950-1960

Steroid transformasyonu

1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan

yemlerinin uumlretimi

1980-1990

Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi

column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri

ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar

1990-Guumlnuumlmuumlze kadar

SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler

biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki

ilerlemeler

Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım

enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu

biyotranformasyonlar

Sedat KAYA

21

B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER

Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon

ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin

oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin

Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit

Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-

ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik

noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz

feruloil para-kaumaroil esteraz

Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit

Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol

aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar

biyopestisitlerbiyoherbisitler

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları

SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre

belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır

SSF‟in daha fazla verime sahip olması

SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır

Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır

Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-

Guerra ve ark 2003)

Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar

Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)

Koumlpuumlklenmenin olmaması

Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik

Daha basit fermantasyon ortamı

Daha kolay havalandırma

1 GİRİŞ

22

Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım

Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)

Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği

Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası

Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet

Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren

yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması

Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda

otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya

gereksinim yoktur

Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir

Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)

SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş

mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha

guumlvenilirdir

Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile

karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar

Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon

Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması

Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması

Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar

Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi

Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması

Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması

Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi

Sedat KAYA

23

Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama

homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)

Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması

zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin

tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)

Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur

Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk

oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-

Guerra ve ark 2003)

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler

Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)

1 Biyolojik faktoumlrler

2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

1321 Biyolojik Faktoumlrler

Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve

uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli

tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)

Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir

Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan

uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler

1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli

faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi

sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon

kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein

sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme

işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin

eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

24

Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde

gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi

protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin

induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi

şeklindedir

Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu

nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak

nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir

Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır

SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan

biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile

sağlanabilir

Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey

alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok

kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok

mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme

meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller

kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha

etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan

oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml

belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Sedat KAYA

25

2 KAYNAK OumlZETLERİ

Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den

elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH

aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH

85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır

Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı

duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen

Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini

uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk

molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln

inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak

kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir

Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik

bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler

Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz

mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1

NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı

kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr

kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda

elde edilmiştir

Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından

izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719

suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın

azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği

belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+

ve

Cu2+

iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir

Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali

proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini

karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı

olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir

2 KAYNAK OumlZETLERİ

26

Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini

baskıladığını tespit etmişlerdir

Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis

Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi

mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip

proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH

60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir

Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip

ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek

amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki

izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit

etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir

Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak

belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir

Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday

kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini

buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum

enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu

05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC

250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite

goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de

goumlzlenmiştir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve

buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir

Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim

aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak

buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık

başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm

hacmi 20 olarak rapor etmişler

Sedat KAYA

27

Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya

proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak

bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin

proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu

kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini

20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70

olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla

iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir

Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin

alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC

olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir

Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil

olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler

Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz

uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı

Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak

proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi

kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi

gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen

enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı

olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum

436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak

belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu

kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak

belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF

youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir

Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından

izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı

substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona

bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen

2 KAYNAK OumlZETLERİ

28

karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır

Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve

sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini

goumlstermektedir

Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde

yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda

kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada

katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar

ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF

youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde

etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini

olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2

ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve

maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu

etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr

Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi

aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya

ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla

artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot

kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim

uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon

suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir

Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve

kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit

etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz

uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta

ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve

amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır

Sedat KAYA

29

Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan

ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize

edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite

(2560 U ml-1

) değeri 48 saatten sonra (g-1

) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4

1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin

proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında

stabilite goumlstermiştir

Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum

kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir

Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas

aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin

bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir

(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz

aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟

da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz

uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak

pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz

aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu

sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken

yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir

Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis

DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak

atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı

patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin

hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi

patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve

Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da

yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve

maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz

uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi

2 KAYNAK OumlZETLERİ

30

37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen

enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu

goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu

sonuccedillar alınacağı umulmaktadır

Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis

N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3

K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında

gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve

yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren

ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz

uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları

96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10

mM Ca2+

iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini

korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve

pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween

65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda

muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135

ve 126 oranlarında koruyabilmiştir

Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1

tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin

optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin

proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı

test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur

Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite

goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde

oumlzellikle Ca2+

Mg2+

ve Cu2+

bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan

inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden

olduğunu tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

31

Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar

katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma

ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda

enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug

ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil

nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi

22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot

kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug

yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide

bulunduğunu belirlemişlerdir

Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum

aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu

ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+

Mg2+

ve

Mn2+

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+

‟nin olumsuz

etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan

derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini

yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20

Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol

ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden

olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini

goumlzlemlemişlerdir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık

materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı

substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla

uumlretim gerccedilekleştirmiştir

Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi

ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday

kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil

olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca

+2

2 KAYNAK OumlZETLERİ

32

ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg

+2 Cu

+2 Fe

+2 Co

+2 ve Zn

+2 iyonları ise

aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe

ederken Cu+2

iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın

metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir

Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi

iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi

iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim

uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla

uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk

olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti

Ca2+

ve Mg2+

kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin

optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin

pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+

ve Ca2+

iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa

olarak tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

33

3 MATERYAL ve METOT

31 Materyal

311 Kullanılan kimyasal maddeler

Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum

dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit

(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat

sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de

Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir

3111 Azot kaynakları

Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract

MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir

3112 Karbon kaynakları

Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den

temin edilmiştir

3113 Deterjanlar

Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan

temin edilmiştir

3114 Metal tuzları

FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de

Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir

3115 Besi yeri maddeleri

Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone

ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir

3 MATERYAL ve METOD

34

312 Kullanılan aletler

İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)

Steril Kabin ( Telstar AV-100)

Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)

Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)

Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)

Vorteks (Stuart) (VWR International )

Magnetik Karıştırıcı (Stuart)

Deep-Freeze (Haris -70ordmC)

Etuumlv (Heraus)

Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)

Otoklav (HIRAYAMA)

Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)

pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)

Sterilizatoumlr (Heraus)

Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)

313 Biyolojik materyal

Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis

ATCC 14580 suşu kullanılmıştır

314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması

Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine

ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda

kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı

Sedat KAYA

35

315 Substrat seccedilimi

Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday

kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi

kullanılmıştır

316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml

Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil

kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı

elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı

substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı

317 Kullanılan Besiyerleri

Sıvı besiyeri

Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf

suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi

sağlandıktan sonra otoklavlandı

Katı besiyeri

10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya

tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

SmF besiyeri

02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler

iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı

016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

3 MATERYAL ve METOD

36

318 SSF besiyeri

Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki

eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde

substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer

iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi

121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye

gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona

bırakıldı

Sedat KAYA

37

32 METOT

321 Mikroorganizma Uumlretimi

Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi

katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona

bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve

NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı

İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı

Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik

erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek

mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi

Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de

150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin

sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan

arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı

322 Ccediloumlzeltiler

Ccediloumlzeltilerin hazırlanması

Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması

pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml

01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan

sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

3 MATERYAL ve METOD

38

pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

Alkalin Ccediloumlzeltisi

4 Na2CO3

4 Na-K tartarat

2 CuSO4

Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde

hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları

sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı

Azo-kazein hazırlanması

005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi

sağlanarak hazırlandı

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu

Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri

ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre

sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5

dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant

uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı

324 Proteaz Aktivite Tayini

Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein

(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu

suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de

bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi

1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile

gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)

Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan

enzim miktarı olarak tanımlandı

Sedat KAYA

39

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi

Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu

arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu

substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave

edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı

NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave

edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar

inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce

oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF

besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı

santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı

(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı

326 Protein Miktar Tayini

Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak

Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen

(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin

protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı

Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl

saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra

uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek

30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm

yapıldı (Lowry ve ark 1951)

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin

Etkisi

SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek

iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri

yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı

3 MATERYAL ve METOD

40

İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika

santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere

aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı

Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml

ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim

kaynağı olarak kullanıldı

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin

Etkisi

Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere

konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha

sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra

37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96

120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi

belirlendi

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml

bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi

uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat

sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon

(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan

1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)

eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril

sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst

sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Sedat KAYA

41

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35

37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten

sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı

pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı

Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav

sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF

besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g

2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak

inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından

aktivite tayini yapıldı

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı

besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi

yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda

ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak

eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen

materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp

proteaz aktivite tayini yapıldı

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

3 MATERYAL ve METOD

42

Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki

atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası

her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra

farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan

oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat

Karışımının Belirlenmesi

Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24

saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır

kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g

2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların

her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi

yapıldı

Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda

SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı

olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki

Substratın Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu

subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra

inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki

substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat

kullanıldı

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının

Etkisi

Sedat KAYA

43

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon

kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten

sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp

100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine

eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı

Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun

ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde

edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot

kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp

hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF

ortamlarına eklenerek otoklavlandı

Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim

yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının

Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01

olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2

001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip

otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi

yapıldı

Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

3 MATERYAL ve METOD

44

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon

başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki

sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık

belirlenmeye ccedilalışıldı

Sedat KAYA

45

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı

arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de

goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Pirinccedil

Kab

uğu

Mer

cim

ek K

abuğ

u

Mıs

ır K

uumlspe

si

Arp

a K

abuğ

u

Buğ

day

Kab

uğu

Pam

uk K

abuğ

u

Sp

esif

ik A

ktiv

ite(

Um

g

24

48

72

96

120

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF

ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz

uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu

ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite

değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk

kabuğunda elde edilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

46

42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk

oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg

olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte

goumlre azaldığı belirlenmiştir

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

12 24 48 72 96 120

Zaman

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

um

g)

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Sedat KAYA

47

43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı

substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl

1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme

suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı

olarak kullanıldı

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Saf su

Ccedileş

me

suyu

NaC

I

Tris-

HCl p

H9

SDS

Tw

een-

80

Trit

onX

100

Ekstraksiyon ortamı (10 ml)

Sp

esif

ik A

kti

vit

e (U

mg

)

Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon

ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana

getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk

proteaz uumlretimine rastlanıldı

44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı

SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin

SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz

aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)

olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

48

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 30 35 37 40 45 50 55

İnkubasyon sıcaklıgı (degC)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin

mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan

ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80

(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

4 5 6 7 8 9 10pH

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi

Sedat KAYA

49

46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi

iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı

ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı

arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde

edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

10 20 30 40 50 60 70

Nem seviyesi ()

Sesi

fik

ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi

47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

50

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1 2 3 4 5 6 8

İnokulum (ml)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında

(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi

iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

60 100 120 150 180 200

Ccedilalkalama hızı (rpm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Sedat KAYA

51

49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının

Belirlenmesi

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil

kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında

maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 g pk +

05 g mk

20 g pk + 10

g mk

15 g pk + 15

g mk

10 g pk + 20

g mk

05 g pk+ 25

g mk

Mısır

Kuumlspesi 3 g

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi

mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu

410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın

Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı

partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da

goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta

1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

52

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

500 1000 1500

Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi

411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz

suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda

(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz

Karbon Kaynakaları (1)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Sedat KAYA

53

412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton

maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave

edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Kon

trol

Et oumlzuuml

tuuml

Kaz

ein

Pepto

n

Tripto

n

May

a oumlz

uumltuuml

Am

onyu

m n

itrat

Am

onyu

m suumll

fat

Am

onyu

m k

lorid

Azot Kaynakları (1)

Spes

ifik

Akti

vit

e (U

mg)

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi

413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen

01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen

Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)

ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi

Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe

edilmiştir (Şekil 43)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

54

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum

suumllfat

Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat

Metal Tuzları ( 01)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi

414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini

belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50

60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı

Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te

goumlsterilmiştir

0

20

40

60

80

100

120

15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90

Sıcaklık (degC)

Roumlla

tif

Akti

vit

e

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Sedat KAYA

55

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda

oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal

formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler

azaldığından dolayı da avantajlıdır

Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat

olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller

enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde

olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de

kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)

Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde

gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal

olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal

bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)

SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir

faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi

atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda

da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel

olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)

Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz

uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr

edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca

zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri

mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış

olabilir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF

youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En

iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

56

Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı

ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde

elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde

etmişlerdir

Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam

bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon

suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon

ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda

enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan

kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi

sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)

Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte

1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki

ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)

Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında

enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark

(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle

kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir

Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve

bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk

solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi

fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)

Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli

bir farktoumlrduumlr

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı

substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi

ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme

suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme

yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te

Sedat KAYA

57

amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila

oumlnemlidir

Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz

aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)

Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada

proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından

elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan

ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark

1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile

45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996

Gangadharan ve ark 2006)

SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın

gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından

ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat

fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve

mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık

aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)

Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık

literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır

İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder

metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol

accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı

ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve

Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda

kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri

besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık

biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak

kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

58

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil

pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak

tespit edilmiştir (Şekil 45)

pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen

bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması

gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar

Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını

oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de

etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı

değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol

oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir

Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla

kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine

başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik

goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)

Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor

edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit

edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek

pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan

enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde

kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)

Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz

aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit

etmişlerdir

Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil

pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit

edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği

yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak

goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)

Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-

110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite

Sedat KAYA

59

goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği

alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır

Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH

değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi

GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu

belirtmişlerdir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat

olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin

yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat

miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor

edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark

2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda

nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar

Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve

metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını

optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de

değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk

olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve

enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında

ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi

nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve

substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)

bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz

sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

60

İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile

ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin

azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm

hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen

uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar

(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak

yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve

katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi

azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005

Chutmanop ve ark 2008)

Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun

inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus

sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit

etmşlerdir

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)

olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile

paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda

60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin

azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı

substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta

yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde

etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma

fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama

yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir

Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları

farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm

olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon

sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri

huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava

Sedat KAYA

61

akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan

enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim

denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı

fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan

zayıf havalandırma oranına neden olabilir

Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler

alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin

mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF

koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm

ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil

kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum

enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)

Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak

SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve

Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark

2009 Tanyıldızı ve ark 2007)

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk

partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil

410)

Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel

olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar

ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat

parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum

havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay

goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk

partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk

parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

62

iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği

ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay

metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde

etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları

bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim

sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup

bulunmaması ile ilişkilidir

Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle

formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel

tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı

tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların

beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en

buumlyuumlk besin kaynağıdır

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite

değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış

goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005

Mukherjee ve ark 2009)

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından

kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)

Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde

bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr

etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az

olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki

fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

Sedat KAYA

63

aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de

goumlsterilmiştir

Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel

suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade

edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi

azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin

besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini

vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili

ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki

ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve

ark 1995)

Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et

ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır

Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)

ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları

bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini

olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların

substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir

Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim

maliyetini azaltmaktadır

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01

konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis

ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)

iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal

tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır

Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında

eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik

ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)

Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin

bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak

kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

64

B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti

azalabilir

Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde

edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+

ve Hg2+

iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır

Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2

Mg+2

ve Mn+2

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu

etkilerken Cu+2

nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir

Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr

ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim

uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)

İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten

dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir

Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme

ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye

başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve

ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal

atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında

enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha

fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların

kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir

SEDAT KAYA

65

6 KAYNAKLAR

Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi

Science 43(4) 257-262

Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis

Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156

Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a

soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to

soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136

Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması

Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır

Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının

oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Ankara

Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-

Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-

glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110

Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource

Technology 64 175ndash183

Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548

Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase

from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food

Engineering 79 950-955

Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre

dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen

Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara

Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing

Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology

Advances 11 539ndash547

6 KAYNAKLAR

66

Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-

amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry

38 1665ndash1668

Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu

nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik

Enstituumlsuuml Kocaeli

Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-

tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus

licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768

Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable

Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial

Thecnology 32 294-304

Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A

Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process

Biochemistry 42 1150-1154

Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5

Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme

production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering

26 100-106

Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995

Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis

PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243

ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic

Bacteriology 1105ndash1141

Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid

protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial

Biotechnology 10 17ndash30

Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran

M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine

Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-

961

SEDAT KAYA

67

Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease

production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates

Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018

Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on

laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302

Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal

inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2

iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans

Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5

Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)

Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel

Konular ve Uygulamalar 14-15

Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003

Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal

Cleaner Production 11 533ndash611

Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid

state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil

Bioresource Technology 101 1385-1388

El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the

ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production

scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593

Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease

production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation

Process Biochemistry 40 1951ndash1956

Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice

spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402

Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra

cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544

Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996

Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and

characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332

Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry

69 18-28

6 KAYNAKLAR

68

Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of

Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132

Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid

Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology

Biotechnology 44 (2) 269ndash274

George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of

protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess

Engineering 16 381-382

Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara

Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-

amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616

Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular

approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32

Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva

R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition

2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22

Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable

enzymes Bioresource Technology 89 17-34

Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM

1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435

Biotechnology Letters 19 675ndash712

He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-

like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326

Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline

proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1

Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical

Engineering 4771-79

Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic

bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36

415- 424

Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231

SEDAT KAYA

69

John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16

Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate

for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in

a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144

Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant

alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula

leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447

Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis

of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65

150ndash153

Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile

ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Diyarbakır

Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and

characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal

Microbiology Biotechnology 32 335-344

Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms

aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785

Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995

Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and

stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri

Apply Environment Microbiology 61 3098-3104

Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase

Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial

Biotechnology 46 106-111

Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial

viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594

Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For

Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729

Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease

From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-

1705

6 KAYNAKLAR

70

Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and

Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672

Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State

Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr

Bioengineering 100 168ndash17

Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a

bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422

Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical

Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus

subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39

Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various

chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229

Turkish Journal of Biology 99-103

Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined

Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular

Biology 235 1560-1584

Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and

optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp

CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537

Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine

Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis

Journal Moleculer Biology 76 103-122

Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic

enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14

Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A

in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and

Purification 57 01ndash107

Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production

of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661

Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for

improvement Trends in Food Science and Technology 8 339

SEDAT KAYA

71

Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin

phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275

Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase

production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and

Microbial Technology 39 56ndash59

Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5

Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent

tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as

substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735

Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel

substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF

Process Biochemistry 45 47-53

Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an

alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654

Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline

protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203

Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83

Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a

thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate

Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of

enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361

Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under

solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and

Biotechnology 84 (8) 1246-1249

Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices

Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78

Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium

composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis

N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394

Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular

α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203

6 KAYNAKLAR

72

Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state

fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90

Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995

Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264

Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their

applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423

Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by

Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab

shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10

Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash

performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal

Microbiology Biotechnology 17 493ndash497

Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from

Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779

Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen

proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara

Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul

Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State

Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169

Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84

Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in

solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology

16 578-584

Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid

substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource

Technology 97 (1) 171-177

Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization

of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state

Fermentation 33-183-189

II

İCcedilİNDEKİLER

Sayfa

TEŞEKKUumlRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I

İCcedilİNDEKİLERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip II

OumlZEThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip V

ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VI

CcedilİZELGE LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VII

ŞEKİL LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VIII

KISALTMA VE SİMGELERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IX

1 GİRİŞhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1

11 Enzimlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1

112 Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2

1121 Proteazların Genel Oumlzelliklerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4

1122 Proteazların Sınıflandırılmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4

1123 Mikrobiyal Proteaz CcedileĢitlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip5

11231 Ekzopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6

11232 Endopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6

1124 Proteazların Etki Mekanizması helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip7

1125 Proteaz Kaynaklarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8

1126 Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

11282 Fırında PiĢirme Uygulamalarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

11284 Atık Arıtımı ve DoumlnuumlĢuumlmuumlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

III

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

12 Bacillus Cinsihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

121 Bacillus licheniformishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

1321 Biyolojik Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

1322 Fiziko-Kimyasal Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

2 KAYNAK OumlZETLERİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25

3 MATERYAL ve METOThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

31 Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

311 Kullanılan Kimyasal Maddeler helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3111 Azot Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3112 Karbon Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3113 Deterjanlar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3114 Metal Tuzları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3115 Besi Yeri Maddeleri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

312 Kullanılan Aletlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34

313Biyolojik Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

314 Mikroorganizmaların Uumlretimi ve Saklanmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

315 Substrat Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

316 Substrat Parccedila Buumlyuumlkluumlğuuml helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

317 Kullanılan Besiyerlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

318 SSF Besiyeri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

32 Metothelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

IV

321 Mikroorganizma Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

322 Ccediloumlzeltilerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonuhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38

324 Proteaz Aktivite Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

326 Protein Miktar Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Parametrelerin Etkisinin Ġncelenmesihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Besiyerlerinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip39

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi42

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisihelliphelliphelliphellip42

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip 43

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphellip43

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisihelliphelliphelliphelliphellip43

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44

4 ARAŞTIRMA BULGULARIhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip45

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55

6 KAYNAKLARhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65

OumlZGECcedilMĠġhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77

V

OumlZET

KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN

ARAġTIRILMASI

YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ

Sedat KAYA

DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ

FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml

BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI

2011

Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık

gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve

mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya

hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan

uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla

miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları

iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda

enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln

geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır

CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin

pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu

katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki

ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon

suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine

etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi

proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit

edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon

kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve

amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek

miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin

30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi

belirlendi

Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580

Proteaz Mısır kuumlspesi

VI

ABSTRACT

THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD

WAS EXAMINED

MSc THESIS

Sedat KAYA

DICLE UNIVERSTY

INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES

DEPARTMENT of BIOLOGY

2011

The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine

and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms

have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have

considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more

stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group

of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical

leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair

recovery of silver from x-ray films and used many more industries field

In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice

husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid

substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize

was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the

obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size

on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm

substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC

respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources

on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect

amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was

investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed

maize+5 Rice husk)

Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease

Crushed maize

VII

CcedilİZELGE LİSTESİ

Ccedilizelge No Sayfa

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3

Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama

Alanları ve Uumlreticileri 10

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11

Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20

VIII

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil No Sayfa

Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5

Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46

Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48

Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50

Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50

Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51

Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54

IX

KISALTMA VE SİMGELER

SSF Katı faz fermantasyonu

SmF Submerged fermentasyonu

YE Maya Oumlzuumltuuml

NB Nutrienth Broth

LB Laura Broth

IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği

RGPW Red Gram Plant Waste

TCA Trikloroasetikasit

CSL Corn Speed Luquor

pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı

aw Su aktivite faktoumlruuml

SDS Sodyum dodesil suumllfat

BSA Bovim serum albuumlmin

CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr

CuCl2 Bakır kloruumlr

MgCl2 Magnezyum kloruumlr

ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr

FeCl2 Demir kloruumlr

MnCl2 Mangan kloruumlr

NaCl Sodyum kloruumlr

Na2CO3 Sodyum karbonat

CuSO4 Bakır suumllfat

MgSO4 Magnezyum suumllfat

NaOH Sodyum hidroksit

(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat

Sedat KAYA

1

1GİRİŞ

11 Enzimler

Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve

organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere

enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların

yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten

şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir

molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)

Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar

farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil

olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783

yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek

kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere

doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden

elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını

saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları

hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini

ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili

Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz

enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)

Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim

piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı

beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini

karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır

Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda

organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan

2008)

Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan

bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel

katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

2

Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve

enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen

enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark

2005)

Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı

Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan

bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine

yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik

accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim

uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip

Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim

şartları belirlenecektir

112 Proteazlar

Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını

katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir

Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik

2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı

fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde

hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee

ve ark 2008)

İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok

uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)

Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin

proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler

10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde

bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin

edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere

yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark

1994 Schrerier 1997)

Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak

sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik

Sedat KAYA

3

oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan

ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve

ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları

deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık

arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde

peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir

kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)

Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde

edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında

kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim

pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları

ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)

Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri

Bakteriler

Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan

Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan

Bacillus firmus Alkalin Deterjan

Bacillus megaterium Alkalin Deterjan

Bacillus pumulis Alkalin Deterjan

Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan

Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan

Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda

Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda

Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda

Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda

Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda

Mantarlar

Aspergillus niger Alkalin Deterjan

Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus flavus Alkalin Deterjan

Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda

Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda

Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda

Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda

1 GİRİŞ

4

1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri

Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein

sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir

yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır

Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları

katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar

saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile

proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip

olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)

Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel

gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu

enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda

karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek

değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)

Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre

duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar

Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin

sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin

gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000

Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı

enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli

metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)

1122 Proteazların Sınıflandırılması

Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve

adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere

iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr

Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve

endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark

1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir

Sedat KAYA

5

Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel

gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein

proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar

(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)

Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral

proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)

1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri

Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca

peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha

sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)

1- Reaksiyon katalizi

2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı

3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler

Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir

Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)

1 GİRİŞ

6

Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml

katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin

proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)

ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak

bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar

11231 Ekzopeptidazlar

Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit

bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden

ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler

ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk

peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının

hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler

Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek

karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil

karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid

bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)

11232 Endopeptidazlar

Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan

peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana

ve ark 1995)

Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve

histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde

serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve

ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları

nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH

değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll

ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)

Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein

(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile

karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif

Sedat KAYA

7

merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside

edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir

Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin

katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH

değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır

Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara

goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar

aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların

yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2

) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat

yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali

miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve

ark 1998)

1124 Proteazların Etki Mekanizması

İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında

bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir

su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına

Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana

gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların

etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır

Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)

1 GİRİŞ

8

1125 Proteaz Kaynakları

Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda

bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik

goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları

olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları

birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri

kazanımları kolaydır (Pandey 2006)

Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve

ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği

belirtilmektedir

1126 Proteaz Uumlretimi

Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun

(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim

uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir

Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama

alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)

Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri

gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim

gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda

membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik

uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına

youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve

ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz

fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler

(Haki ve Rakshit 2003)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve

durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların

uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi

kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun

Sedat KAYA

9

şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize

edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma

inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz

sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar

Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli

kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla

kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli

ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks

hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri

tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca

Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar

uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli

oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu

enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)

Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri

belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal

kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla

değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi

alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge

12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri

goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların

varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli

kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)

1 GİRİŞ

10

Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve

uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)

Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal

Kaynak

Uygulama Alanı

Novo Nordisk

Danimarka

Alcalase

Savinase

Esparase

Biofeed pro

Durazym

Novozyme47 1MP

Novozyme 243

Nue

B licheniformis

Bacillus sp

B lentus

B licheniformis

Bacillus sp

Belirtilmiyor

B licheniformis

Bacillus sp

Deterjan ipek

Deterjan tekstil

Deterjan gıda ipek

Yem

Deterjan

Fotoğraf

Deri

Genencor

International

ABD

Purafact

Primatan

B lentus

Bakteriyel

Kaynaklı

Deterjan

Deri

Gist-Brocades

Hollanda

Subtilisin

Maxacal

Maxatase

B alcalophilus

Bacillus sp

Bacillus sp

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Solvay Enzymes

Almanya

Opticlean

Optimase

Maxapem

HT-proteolytic

Protease

B alcalophilus

B licheniformis

Bacillus spnin

Protein

muumlhendisliği ile

uumlretilmiş varyantı

B sublilis

B licheniformis

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Alkol iccedilki ekmek

yem gıda deri

fotoğrafik atık

Gıda atık

Amano

Pharmaceuticals

Japonya

Proleather

Collagenas

Amano protease S

Bacillus sp

Clostrodium sp

Bacillus sp

Gıda

Teknik

Gıda

Enzyme

Development

ABD

Enzeco alkaline

protease-L FG

Enzeco high

alkaline protease

B licheniformis

B licheniformis

Bacillus sp

Teknik

Gıda

Enduumlstriyel

Nagase

Biochemicals

Japonya

Bioprase

concantrate

Ps Protease

Ps Elastase

CrystProtease

CrystProtease

Bioprase

Bioprase SP-10

B sublilis

P aeruginoso

P aeruginoso

B subtilis(K2)

Bsubtilis(bioteus)

B sublilis

B sublilis

Kozmetik

farmasoumltik

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Deterjan temizlik

Gıda

Jodo Shusei Japonya Codo Bap

B licheniformis Deterjan gıda

Rohm Almanya Corolase 7089

B sublilis Gıda

Sedat KAYA

11

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları

Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002

Pandey 2004)

Enduumlstri

Proteaz Uygulama

Ekmek yapımı Noumltral proteaz

Hamur kalitesini arttırma

İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme

iccedileceklerde bulanıklığın

giderilmesi

Mandıra

Fungal proteazlar simozin

diğer proteazlar

Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt

suyunun işlenmesi modifiye

peynir enzim uumlretimi

Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin

uzaklaştırılması

Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday

gluteni gibi zengin protein

metaryallerinin modifikasyonu

Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden

tuumlylerin uzaklaştırılması

Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve

balık atıklarından protein eldesi

Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması

kan pıhtısını ccediloumlzme doku

iltihaplarının azaltılması tıbbı

uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt

lensler ve takma dişlerin

temizlenmesi

Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf

filmlerinden guumlmuumlş eldesi

Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers

Hidroliz

Enduumlstriyel ve Evsel

Atıkların İşlenmesi

Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel

faaliyetler sonucu meydana gelen

atıkların işlenmesi

1 GİRİŞ

12

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde

patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960

yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar

guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus

alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar

uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı

madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır

(Dağaşan 1997)

Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı

maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta

ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı

maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları

ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler

kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki

kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her

tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi

protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)

11282 Fırında Pişirme Uygulamaları

Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave

edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması

sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun

makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri

ve ark 2002)

Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik

olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır

Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak

bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil

giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun

yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini

sağlamaktadır (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

13

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar

Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin

olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin

ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim

suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından

tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine

ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara

sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar

sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada

yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)

Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok

oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin

salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin

pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri

peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln

lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin

fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da

kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri

meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin

1998)

11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml

Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol

miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla

kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik

aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu

etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır

Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla

atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir

1 GİRİŞ

14

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı

Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri

uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki

guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol

accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre

dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından

parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film

sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında

olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis

denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen

fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen

damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri

sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama

yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan

derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve

Saleemuddin 1998)

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı

Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik

ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı

verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini

sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin

proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak

1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi

yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

15

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı

Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal

proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik

enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden

olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku

boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma

şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm

sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak

bulunan ve Ca+2

tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir

(Claus ve ark 1986)

Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde

edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların

accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve

meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan

yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı

Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az

duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu

amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır

Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da

yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa

rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik

olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde

kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)

12 Bacillus Cinsi

Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde

endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek

başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan

huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998

Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir

1 GİRİŞ

16

ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış

goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı

enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda

kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum

37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli

enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi

duumlşuumlnuumllmektedirler

Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak

tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen

karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun

basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin

duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde

olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık

donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik

tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)

Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil

aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı

bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının

dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler

(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla

sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus

bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak

amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst

kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda

olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)

121 Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli

enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen

saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram

pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)

Sedat KAYA

17

Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip

amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan

oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın

olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis

kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen

diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri

(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu

2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)

Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel

farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında

değişmektedir (Akcan 2009)

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği

Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda

katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır

(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde

umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu

nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan

mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında

bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole

edilmiştir (Singhania ve ark 2009)

Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri

uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar

buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı

uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel

fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil

kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak

buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait

ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml

peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek

1 GİRİŞ

18

verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının

uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer

olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize

edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)

Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler

alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik

olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda

kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren

biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı

maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml

bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)

SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar

kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu

pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır

unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar

kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark

2009)

Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF

genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir

SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların

SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite

goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan

mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli

avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece

ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte

ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin

kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet

ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla

biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi

oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek

kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)

Sedat KAYA

19

SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum

koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH

inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen

azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)

Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda

SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat

olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin

SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)

SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır

1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir

2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak

kullanılır (Nigam ve Singh 1994)

1 GİRİŞ

20

Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)

ABİYOLOJİK UYGULAMALARI

MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı

Hz İsa‟nın doğumundan

oumlnce Asya‟da

Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den

yararlanılmıştır

MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma

MOuml 1500 Koji işlemi

7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi

18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı

18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit

kullanımı

1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri

1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit

1920-1940

Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal

enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin

gerccedilekleştirilmesi

1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen

olağanuumlstuuml gelişme

1950-1960

Steroid transformasyonu

1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan

yemlerinin uumlretimi

1980-1990

Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi

column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri

ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar

1990-Guumlnuumlmuumlze kadar

SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler

biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki

ilerlemeler

Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım

enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu

biyotranformasyonlar

Sedat KAYA

21

B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER

Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon

ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin

oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin

Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit

Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-

ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik

noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz

feruloil para-kaumaroil esteraz

Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit

Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol

aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar

biyopestisitlerbiyoherbisitler

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları

SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre

belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır

SSF‟in daha fazla verime sahip olması

SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır

Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır

Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-

Guerra ve ark 2003)

Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar

Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)

Koumlpuumlklenmenin olmaması

Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik

Daha basit fermantasyon ortamı

Daha kolay havalandırma

1 GİRİŞ

22

Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım

Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)

Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği

Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası

Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet

Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren

yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması

Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda

otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya

gereksinim yoktur

Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir

Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)

SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş

mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha

guumlvenilirdir

Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile

karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar

Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon

Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması

Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması

Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar

Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi

Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması

Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması

Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi

Sedat KAYA

23

Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama

homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)

Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması

zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin

tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)

Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur

Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk

oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-

Guerra ve ark 2003)

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler

Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)

1 Biyolojik faktoumlrler

2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

1321 Biyolojik Faktoumlrler

Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve

uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli

tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)

Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir

Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan

uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler

1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli

faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi

sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon

kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein

sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme

işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin

eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

24

Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde

gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi

protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin

induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi

şeklindedir

Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu

nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak

nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir

Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır

SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan

biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile

sağlanabilir

Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey

alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok

kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok

mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme

meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller

kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha

etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan

oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml

belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Sedat KAYA

25

2 KAYNAK OumlZETLERİ

Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den

elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH

aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH

85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır

Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı

duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen

Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini

uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk

molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln

inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak

kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir

Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik

bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler

Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz

mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1

NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı

kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr

kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda

elde edilmiştir

Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından

izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719

suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın

azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği

belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+

ve

Cu2+

iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir

Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali

proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini

karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı

olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir

2 KAYNAK OumlZETLERİ

26

Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini

baskıladığını tespit etmişlerdir

Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis

Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi

mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip

proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH

60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir

Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip

ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek

amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki

izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit

etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir

Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak

belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir

Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday

kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini

buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum

enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu

05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC

250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite

goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de

goumlzlenmiştir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve

buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir

Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim

aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak

buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık

başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm

hacmi 20 olarak rapor etmişler

Sedat KAYA

27

Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya

proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak

bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin

proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu

kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini

20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70

olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla

iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir

Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin

alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC

olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir

Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil

olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler

Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz

uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı

Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak

proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi

kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi

gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen

enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı

olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum

436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak

belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu

kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak

belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF

youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir

Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından

izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı

substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona

bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen

2 KAYNAK OumlZETLERİ

28

karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır

Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve

sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini

goumlstermektedir

Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde

yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda

kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada

katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar

ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF

youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde

etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini

olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2

ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve

maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu

etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr

Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi

aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya

ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla

artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot

kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim

uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon

suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir

Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve

kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit

etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz

uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta

ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve

amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır

Sedat KAYA

29

Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan

ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize

edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite

(2560 U ml-1

) değeri 48 saatten sonra (g-1

) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4

1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin

proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında

stabilite goumlstermiştir

Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum

kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir

Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas

aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin

bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir

(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz

aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟

da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz

uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak

pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz

aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu

sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken

yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir

Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis

DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak

atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı

patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin

hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi

patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve

Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da

yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve

maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz

uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi

2 KAYNAK OumlZETLERİ

30

37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen

enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu

goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu

sonuccedillar alınacağı umulmaktadır

Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis

N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3

K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında

gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve

yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren

ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz

uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları

96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10

mM Ca2+

iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini

korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve

pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween

65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda

muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135

ve 126 oranlarında koruyabilmiştir

Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1

tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin

optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin

proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı

test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur

Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite

goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde

oumlzellikle Ca2+

Mg2+

ve Cu2+

bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan

inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden

olduğunu tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

31

Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar

katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma

ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda

enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug

ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil

nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi

22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot

kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug

yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide

bulunduğunu belirlemişlerdir

Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum

aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu

ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+

Mg2+

ve

Mn2+

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+

‟nin olumsuz

etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan

derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini

yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20

Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol

ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden

olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini

goumlzlemlemişlerdir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık

materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı

substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla

uumlretim gerccedilekleştirmiştir

Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi

ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday

kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil

olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca

+2

2 KAYNAK OumlZETLERİ

32

ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg

+2 Cu

+2 Fe

+2 Co

+2 ve Zn

+2 iyonları ise

aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe

ederken Cu+2

iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın

metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir

Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi

iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi

iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim

uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla

uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk

olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti

Ca2+

ve Mg2+

kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin

optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin

pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+

ve Ca2+

iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa

olarak tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

33

3 MATERYAL ve METOT

31 Materyal

311 Kullanılan kimyasal maddeler

Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum

dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit

(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat

sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de

Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir

3111 Azot kaynakları

Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract

MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir

3112 Karbon kaynakları

Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den

temin edilmiştir

3113 Deterjanlar

Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan

temin edilmiştir

3114 Metal tuzları

FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de

Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir

3115 Besi yeri maddeleri

Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone

ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir

3 MATERYAL ve METOD

34

312 Kullanılan aletler

İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)

Steril Kabin ( Telstar AV-100)

Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)

Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)

Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)

Vorteks (Stuart) (VWR International )

Magnetik Karıştırıcı (Stuart)

Deep-Freeze (Haris -70ordmC)

Etuumlv (Heraus)

Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)

Otoklav (HIRAYAMA)

Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)

pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)

Sterilizatoumlr (Heraus)

Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)

313 Biyolojik materyal

Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis

ATCC 14580 suşu kullanılmıştır

314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması

Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine

ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda

kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı

Sedat KAYA

35

315 Substrat seccedilimi

Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday

kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi

kullanılmıştır

316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml

Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil

kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı

elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı

substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı

317 Kullanılan Besiyerleri

Sıvı besiyeri

Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf

suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi

sağlandıktan sonra otoklavlandı

Katı besiyeri

10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya

tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

SmF besiyeri

02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler

iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı

016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

3 MATERYAL ve METOD

36

318 SSF besiyeri

Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki

eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde

substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer

iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi

121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye

gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona

bırakıldı

Sedat KAYA

37

32 METOT

321 Mikroorganizma Uumlretimi

Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi

katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona

bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve

NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı

İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı

Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik

erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek

mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi

Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de

150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin

sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan

arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı

322 Ccediloumlzeltiler

Ccediloumlzeltilerin hazırlanması

Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması

pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml

01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan

sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

3 MATERYAL ve METOD

38

pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

Alkalin Ccediloumlzeltisi

4 Na2CO3

4 Na-K tartarat

2 CuSO4

Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde

hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları

sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı

Azo-kazein hazırlanması

005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi

sağlanarak hazırlandı

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu

Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri

ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre

sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5

dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant

uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı

324 Proteaz Aktivite Tayini

Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein

(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu

suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de

bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi

1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile

gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)

Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan

enzim miktarı olarak tanımlandı

Sedat KAYA

39

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi

Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu

arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu

substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave

edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı

NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave

edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar

inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce

oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF

besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı

santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı

(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı

326 Protein Miktar Tayini

Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak

Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen

(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin

protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı

Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl

saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra

uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek

30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm

yapıldı (Lowry ve ark 1951)

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin

Etkisi

SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek

iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri

yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı

3 MATERYAL ve METOD

40

İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika

santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere

aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı

Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml

ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim

kaynağı olarak kullanıldı

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin

Etkisi

Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere

konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha

sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra

37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96

120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi

belirlendi

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml

bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi

uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat

sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon

(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan

1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)

eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril

sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst

sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Sedat KAYA

41

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35

37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten

sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı

pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı

Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav

sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF

besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g

2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak

inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından

aktivite tayini yapıldı

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı

besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi

yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda

ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak

eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen

materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp

proteaz aktivite tayini yapıldı

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

3 MATERYAL ve METOD

42

Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki

atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası

her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra

farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan

oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat

Karışımının Belirlenmesi

Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24

saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır

kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g

2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların

her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi

yapıldı

Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda

SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı

olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki

Substratın Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu

subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra

inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki

substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat

kullanıldı

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının

Etkisi

Sedat KAYA

43

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon

kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten

sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp

100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine

eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı

Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun

ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde

edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot

kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp

hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF

ortamlarına eklenerek otoklavlandı

Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim

yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının

Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01

olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2

001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip

otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi

yapıldı

Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

3 MATERYAL ve METOD

44

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon

başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki

sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık

belirlenmeye ccedilalışıldı

Sedat KAYA

45

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı

arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de

goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Pirinccedil

Kab

uğu

Mer

cim

ek K

abuğ

u

Mıs

ır K

uumlspe

si

Arp

a K

abuğ

u

Buğ

day

Kab

uğu

Pam

uk K

abuğ

u

Sp

esif

ik A

ktiv

ite(

Um

g

24

48

72

96

120

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF

ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz

uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu

ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite

değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk

kabuğunda elde edilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

46

42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk

oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg

olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte

goumlre azaldığı belirlenmiştir

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

12 24 48 72 96 120

Zaman

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

um

g)

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Sedat KAYA

47

43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı

substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl

1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme

suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı

olarak kullanıldı

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Saf su

Ccedileş

me

suyu

NaC

I

Tris-

HCl p

H9

SDS

Tw

een-

80

Trit

onX

100

Ekstraksiyon ortamı (10 ml)

Sp

esif

ik A

kti

vit

e (U

mg

)

Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon

ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana

getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk

proteaz uumlretimine rastlanıldı

44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı

SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin

SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz

aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)

olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

48

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 30 35 37 40 45 50 55

İnkubasyon sıcaklıgı (degC)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin

mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan

ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80

(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

4 5 6 7 8 9 10pH

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi

Sedat KAYA

49

46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi

iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı

ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı

arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde

edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

10 20 30 40 50 60 70

Nem seviyesi ()

Sesi

fik

ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi

47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

50

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1 2 3 4 5 6 8

İnokulum (ml)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında

(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi

iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

60 100 120 150 180 200

Ccedilalkalama hızı (rpm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Sedat KAYA

51

49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının

Belirlenmesi

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil

kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında

maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 g pk +

05 g mk

20 g pk + 10

g mk

15 g pk + 15

g mk

10 g pk + 20

g mk

05 g pk+ 25

g mk

Mısır

Kuumlspesi 3 g

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi

mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu

410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın

Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı

partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da

goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta

1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

52

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

500 1000 1500

Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi

411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz

suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda

(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz

Karbon Kaynakaları (1)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Sedat KAYA

53

412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton

maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave

edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Kon

trol

Et oumlzuuml

tuuml

Kaz

ein

Pepto

n

Tripto

n

May

a oumlz

uumltuuml

Am

onyu

m n

itrat

Am

onyu

m suumll

fat

Am

onyu

m k

lorid

Azot Kaynakları (1)

Spes

ifik

Akti

vit

e (U

mg)

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi

413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen

01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen

Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)

ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi

Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe

edilmiştir (Şekil 43)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

54

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum

suumllfat

Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat

Metal Tuzları ( 01)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi

414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini

belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50

60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı

Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te

goumlsterilmiştir

0

20

40

60

80

100

120

15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90

Sıcaklık (degC)

Roumlla

tif

Akti

vit

e

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Sedat KAYA

55

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda

oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal

formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler

azaldığından dolayı da avantajlıdır

Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat

olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller

enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde

olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de

kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)

Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde

gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal

olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal

bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)

SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir

faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi

atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda

da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel

olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)

Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz

uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr

edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca

zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri

mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış

olabilir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF

youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En

iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

56

Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı

ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde

elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde

etmişlerdir

Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam

bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon

suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon

ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda

enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan

kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi

sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)

Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte

1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki

ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)

Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında

enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark

(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle

kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir

Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve

bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk

solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi

fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)

Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli

bir farktoumlrduumlr

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı

substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi

ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme

suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme

yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te

Sedat KAYA

57

amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila

oumlnemlidir

Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz

aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)

Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada

proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından

elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan

ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark

1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile

45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996

Gangadharan ve ark 2006)

SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın

gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından

ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat

fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve

mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık

aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)

Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık

literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır

İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder

metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol

accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı

ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve

Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda

kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri

besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık

biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak

kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

58

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil

pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak

tespit edilmiştir (Şekil 45)

pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen

bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması

gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar

Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını

oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de

etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı

değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol

oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir

Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla

kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine

başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik

goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)

Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor

edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit

edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek

pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan

enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde

kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)

Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz

aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit

etmişlerdir

Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil

pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit

edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği

yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak

goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)

Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-

110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite

Sedat KAYA

59

goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği

alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır

Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH

değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi

GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu

belirtmişlerdir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat

olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin

yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat

miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor

edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark

2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda

nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar

Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve

metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını

optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de

değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk

olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve

enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında

ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi

nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve

substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)

bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz

sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

60

İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile

ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin

azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm

hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen

uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar

(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak

yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve

katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi

azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005

Chutmanop ve ark 2008)

Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun

inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus

sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit

etmşlerdir

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)

olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile

paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda

60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin

azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı

substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta

yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde

etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma

fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama

yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir

Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları

farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm

olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon

sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri

huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava

Sedat KAYA

61

akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan

enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim

denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı

fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan

zayıf havalandırma oranına neden olabilir

Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler

alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin

mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF

koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm

ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil

kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum

enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)

Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak

SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve

Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark

2009 Tanyıldızı ve ark 2007)

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk

partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil

410)

Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel

olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar

ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat

parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum

havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay

goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk

partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk

parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

62

iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği

ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay

metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde

etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları

bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim

sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup

bulunmaması ile ilişkilidir

Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle

formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel

tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı

tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların

beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en

buumlyuumlk besin kaynağıdır

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite

değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış

goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005

Mukherjee ve ark 2009)

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından

kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)

Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde

bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr

etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az

olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki

fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

Sedat KAYA

63

aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de

goumlsterilmiştir

Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel

suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade

edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi

azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin

besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini

vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili

ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki

ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve

ark 1995)

Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et

ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır

Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)

ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları

bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini

olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların

substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir

Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim

maliyetini azaltmaktadır

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01

konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis

ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)

iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal

tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır

Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında

eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik

ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)

Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin

bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak

kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

64

B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti

azalabilir

Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde

edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+

ve Hg2+

iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır

Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2

Mg+2

ve Mn+2

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu

etkilerken Cu+2

nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir

Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr

ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim

uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)

İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten

dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir

Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme

ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye

başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve

ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal

atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında

enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha

fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların

kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir

SEDAT KAYA

65

6 KAYNAKLAR

Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi

Science 43(4) 257-262

Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis

Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156

Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a

soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to

soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136

Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması

Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır

Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının

oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Ankara

Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-

Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-

glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110

Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource

Technology 64 175ndash183

Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548

Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase

from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food

Engineering 79 950-955

Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre

dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen

Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara

Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing

Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology

Advances 11 539ndash547

6 KAYNAKLAR

66

Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-

amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry

38 1665ndash1668

Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu

nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik

Enstituumlsuuml Kocaeli

Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-

tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus

licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768

Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable

Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial

Thecnology 32 294-304

Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A

Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process

Biochemistry 42 1150-1154

Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5

Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme

production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering

26 100-106

Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995

Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis

PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243

ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic

Bacteriology 1105ndash1141

Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid

protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial

Biotechnology 10 17ndash30

Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran

M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine

Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-

961

SEDAT KAYA

67

Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease

production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates

Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018

Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on

laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302

Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal

inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2

iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans

Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5

Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)

Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel

Konular ve Uygulamalar 14-15

Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003

Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal

Cleaner Production 11 533ndash611

Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid

state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil

Bioresource Technology 101 1385-1388

El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the

ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production

scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593

Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease

production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation

Process Biochemistry 40 1951ndash1956

Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice

spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402

Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra

cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544

Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996

Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and

characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332

Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry

69 18-28

6 KAYNAKLAR

68

Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of

Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132

Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid

Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology

Biotechnology 44 (2) 269ndash274

George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of

protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess

Engineering 16 381-382

Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara

Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-

amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616

Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular

approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32

Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva

R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition

2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22

Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable

enzymes Bioresource Technology 89 17-34

Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM

1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435

Biotechnology Letters 19 675ndash712

He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-

like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326

Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline

proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1

Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical

Engineering 4771-79

Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic

bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36

415- 424

Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231

SEDAT KAYA

69

John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16

Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate

for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in

a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144

Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant

alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula

leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447

Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis

of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65

150ndash153

Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile

ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Diyarbakır

Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and

characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal

Microbiology Biotechnology 32 335-344

Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms

aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785

Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995

Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and

stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri

Apply Environment Microbiology 61 3098-3104

Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase

Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial

Biotechnology 46 106-111

Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial

viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594

Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For

Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729

Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease

From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-

1705

6 KAYNAKLAR

70

Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and

Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672

Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State

Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr

Bioengineering 100 168ndash17

Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a

bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422

Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical

Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus

subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39

Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various

chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229

Turkish Journal of Biology 99-103

Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined

Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular

Biology 235 1560-1584

Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and

optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp

CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537

Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine

Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis

Journal Moleculer Biology 76 103-122

Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic

enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14

Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A

in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and

Purification 57 01ndash107

Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production

of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661

Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for

improvement Trends in Food Science and Technology 8 339

SEDAT KAYA

71

Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin

phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275

Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase

production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and

Microbial Technology 39 56ndash59

Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5

Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent

tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as

substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735

Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel

substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF

Process Biochemistry 45 47-53

Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an

alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654

Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline

protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203

Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83

Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a

thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate

Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of

enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361

Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under

solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and

Biotechnology 84 (8) 1246-1249

Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices

Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78

Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium

composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis

N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394

Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular

α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203

6 KAYNAKLAR

72

Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state

fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90

Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995

Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264

Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their

applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423

Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by

Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab

shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10

Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash

performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal

Microbiology Biotechnology 17 493ndash497

Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from

Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779

Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen

proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara

Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul

Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State

Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169

Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84

Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in

solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology

16 578-584

Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid

substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource

Technology 97 (1) 171-177

Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization

of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state

Fermentation 33-183-189

III

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

12 Bacillus Cinsihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

121 Bacillus licheniformishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

1321 Biyolojik Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

1322 Fiziko-Kimyasal Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23

2 KAYNAK OumlZETLERİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25

3 MATERYAL ve METOThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

31 Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

311 Kullanılan Kimyasal Maddeler helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3111 Azot Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3112 Karbon Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3113 Deterjanlar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3114 Metal Tuzları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

3115 Besi Yeri Maddeleri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

312 Kullanılan Aletlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34

313Biyolojik Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

314 Mikroorganizmaların Uumlretimi ve Saklanmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

315 Substrat Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

316 Substrat Parccedila Buumlyuumlkluumlğuuml helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

317 Kullanılan Besiyerlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

318 SSF Besiyeri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

32 Metothelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

IV

321 Mikroorganizma Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

322 Ccediloumlzeltilerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonuhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38

324 Proteaz Aktivite Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

326 Protein Miktar Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Parametrelerin Etkisinin Ġncelenmesihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Besiyerlerinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip39

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi42

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisihelliphelliphelliphellip42

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip 43

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphellip43

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisihelliphelliphelliphelliphellip43

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44

4 ARAŞTIRMA BULGULARIhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip45

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55

6 KAYNAKLARhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65

OumlZGECcedilMĠġhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77

V

OumlZET

KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN

ARAġTIRILMASI

YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ

Sedat KAYA

DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ

FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml

BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI

2011

Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık

gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve

mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya

hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan

uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla

miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları

iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda

enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln

geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır

CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin

pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu

katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki

ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon

suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine

etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi

proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit

edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon

kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve

amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek

miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin

30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi

belirlendi

Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580

Proteaz Mısır kuumlspesi

VI

ABSTRACT

THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD

WAS EXAMINED

MSc THESIS

Sedat KAYA

DICLE UNIVERSTY

INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES

DEPARTMENT of BIOLOGY

2011

The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine

and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms

have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have

considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more

stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group

of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical

leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair

recovery of silver from x-ray films and used many more industries field

In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice

husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid

substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize

was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the

obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size

on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm

substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC

respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources

on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect

amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was

investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed

maize+5 Rice husk)

Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease

Crushed maize

VII

CcedilİZELGE LİSTESİ

Ccedilizelge No Sayfa

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3

Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama

Alanları ve Uumlreticileri 10

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11

Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20

VIII

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil No Sayfa

Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5

Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46

Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48

Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50

Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50

Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51

Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54

IX

KISALTMA VE SİMGELER

SSF Katı faz fermantasyonu

SmF Submerged fermentasyonu

YE Maya Oumlzuumltuuml

NB Nutrienth Broth

LB Laura Broth

IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği

RGPW Red Gram Plant Waste

TCA Trikloroasetikasit

CSL Corn Speed Luquor

pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı

aw Su aktivite faktoumlruuml

SDS Sodyum dodesil suumllfat

BSA Bovim serum albuumlmin

CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr

CuCl2 Bakır kloruumlr

MgCl2 Magnezyum kloruumlr

ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr

FeCl2 Demir kloruumlr

MnCl2 Mangan kloruumlr

NaCl Sodyum kloruumlr

Na2CO3 Sodyum karbonat

CuSO4 Bakır suumllfat

MgSO4 Magnezyum suumllfat

NaOH Sodyum hidroksit

(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat

Sedat KAYA

1

1GİRİŞ

11 Enzimler

Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve

organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere

enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların

yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten

şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir

molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)

Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar

farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil

olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783

yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek

kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere

doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden

elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını

saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları

hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini

ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili

Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz

enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)

Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim

piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı

beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini

karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır

Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda

organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan

2008)

Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan

bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel

katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

2

Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve

enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen

enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark

2005)

Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı

Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan

bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine

yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik

accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim

uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip

Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim

şartları belirlenecektir

112 Proteazlar

Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını

katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir

Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik

2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı

fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde

hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee

ve ark 2008)

İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok

uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)

Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin

proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler

10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde

bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin

edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere

yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark

1994 Schrerier 1997)

Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak

sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik

Sedat KAYA

3

oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan

ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve

ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları

deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık

arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde

peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir

kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)

Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde

edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında

kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim

pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları

ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)

Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri

Bakteriler

Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan

Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan

Bacillus firmus Alkalin Deterjan

Bacillus megaterium Alkalin Deterjan

Bacillus pumulis Alkalin Deterjan

Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan

Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan

Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda

Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda

Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda

Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda

Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda

Mantarlar

Aspergillus niger Alkalin Deterjan

Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus flavus Alkalin Deterjan

Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda

Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda

Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda

Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda

1 GİRİŞ

4

1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri

Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein

sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir

yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır

Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları

katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar

saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile

proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip

olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)

Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel

gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu

enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda

karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek

değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)

Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre

duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar

Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin

sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin

gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000

Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı

enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli

metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)

1122 Proteazların Sınıflandırılması

Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve

adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere

iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr

Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve

endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark

1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir

Sedat KAYA

5

Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel

gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein

proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar

(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)

Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral

proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)

1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri

Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca

peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha

sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)

1- Reaksiyon katalizi

2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı

3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler

Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir

Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)

1 GİRİŞ

6

Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml

katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin

proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)

ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak

bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar

11231 Ekzopeptidazlar

Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit

bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden

ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler

ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk

peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının

hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler

Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek

karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil

karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid

bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)

11232 Endopeptidazlar

Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan

peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana

ve ark 1995)

Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve

histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde

serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve

ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları

nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH

değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll

ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)

Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein

(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile

karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif

Sedat KAYA

7

merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside

edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir

Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin

katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH

değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır

Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara

goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar

aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların

yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2

) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat

yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali

miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve

ark 1998)

1124 Proteazların Etki Mekanizması

İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında

bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir

su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına

Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana

gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların

etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır

Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)

1 GİRİŞ

8

1125 Proteaz Kaynakları

Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda

bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik

goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları

olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları

birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri

kazanımları kolaydır (Pandey 2006)

Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve

ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği

belirtilmektedir

1126 Proteaz Uumlretimi

Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun

(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim

uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir

Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama

alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)

Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri

gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim

gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda

membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik

uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına

youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve

ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz

fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler

(Haki ve Rakshit 2003)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve

durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların

uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi

kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun

Sedat KAYA

9

şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize

edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma

inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz

sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar

Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli

kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla

kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli

ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks

hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri

tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca

Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar

uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli

oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu

enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)

Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri

belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal

kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla

değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi

alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge

12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri

goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların

varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli

kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)

1 GİRİŞ

10

Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve

uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)

Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal

Kaynak

Uygulama Alanı

Novo Nordisk

Danimarka

Alcalase

Savinase

Esparase

Biofeed pro

Durazym

Novozyme47 1MP

Novozyme 243

Nue

B licheniformis

Bacillus sp

B lentus

B licheniformis

Bacillus sp

Belirtilmiyor

B licheniformis

Bacillus sp

Deterjan ipek

Deterjan tekstil

Deterjan gıda ipek

Yem

Deterjan

Fotoğraf

Deri

Genencor

International

ABD

Purafact

Primatan

B lentus

Bakteriyel

Kaynaklı

Deterjan

Deri

Gist-Brocades

Hollanda

Subtilisin

Maxacal

Maxatase

B alcalophilus

Bacillus sp

Bacillus sp

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Solvay Enzymes

Almanya

Opticlean

Optimase

Maxapem

HT-proteolytic

Protease

B alcalophilus

B licheniformis

Bacillus spnin

Protein

muumlhendisliği ile

uumlretilmiş varyantı

B sublilis

B licheniformis

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Alkol iccedilki ekmek

yem gıda deri

fotoğrafik atık

Gıda atık

Amano

Pharmaceuticals

Japonya

Proleather

Collagenas

Amano protease S

Bacillus sp

Clostrodium sp

Bacillus sp

Gıda

Teknik

Gıda

Enzyme

Development

ABD

Enzeco alkaline

protease-L FG

Enzeco high

alkaline protease

B licheniformis

B licheniformis

Bacillus sp

Teknik

Gıda

Enduumlstriyel

Nagase

Biochemicals

Japonya

Bioprase

concantrate

Ps Protease

Ps Elastase

CrystProtease

CrystProtease

Bioprase

Bioprase SP-10

B sublilis

P aeruginoso

P aeruginoso

B subtilis(K2)

Bsubtilis(bioteus)

B sublilis

B sublilis

Kozmetik

farmasoumltik

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Deterjan temizlik

Gıda

Jodo Shusei Japonya Codo Bap

B licheniformis Deterjan gıda

Rohm Almanya Corolase 7089

B sublilis Gıda

Sedat KAYA

11

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları

Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002

Pandey 2004)

Enduumlstri

Proteaz Uygulama

Ekmek yapımı Noumltral proteaz

Hamur kalitesini arttırma

İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme

iccedileceklerde bulanıklığın

giderilmesi

Mandıra

Fungal proteazlar simozin

diğer proteazlar

Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt

suyunun işlenmesi modifiye

peynir enzim uumlretimi

Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin

uzaklaştırılması

Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday

gluteni gibi zengin protein

metaryallerinin modifikasyonu

Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden

tuumlylerin uzaklaştırılması

Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve

balık atıklarından protein eldesi

Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması

kan pıhtısını ccediloumlzme doku

iltihaplarının azaltılması tıbbı

uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt

lensler ve takma dişlerin

temizlenmesi

Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf

filmlerinden guumlmuumlş eldesi

Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers

Hidroliz

Enduumlstriyel ve Evsel

Atıkların İşlenmesi

Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel

faaliyetler sonucu meydana gelen

atıkların işlenmesi

1 GİRİŞ

12

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde

patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960

yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar

guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus

alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar

uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı

madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır

(Dağaşan 1997)

Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı

maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta

ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı

maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları

ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler

kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki

kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her

tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi

protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)

11282 Fırında Pişirme Uygulamaları

Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave

edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması

sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun

makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri

ve ark 2002)

Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik

olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır

Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak

bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil

giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun

yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini

sağlamaktadır (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

13

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar

Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin

olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin

ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim

suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından

tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine

ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara

sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar

sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada

yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)

Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok

oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin

salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin

pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri

peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln

lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin

fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da

kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri

meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin

1998)

11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml

Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol

miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla

kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik

aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu

etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır

Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla

atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir

1 GİRİŞ

14

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı

Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri

uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki

guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol

accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre

dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından

parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film

sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında

olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis

denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen

fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen

damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri

sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama

yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan

derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve

Saleemuddin 1998)

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı

Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik

ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı

verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini

sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin

proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak

1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi

yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

15

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı

Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal

proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik

enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden

olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku

boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma

şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm

sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak

bulunan ve Ca+2

tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir

(Claus ve ark 1986)

Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde

edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların

accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve

meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan

yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı

Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az

duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu

amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır

Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da

yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa

rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik

olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde

kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)

12 Bacillus Cinsi

Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde

endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek

başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan

huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998

Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir

1 GİRİŞ

16

ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış

goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı

enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda

kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum

37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli

enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi

duumlşuumlnuumllmektedirler

Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak

tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen

karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun

basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin

duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde

olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık

donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik

tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)

Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil

aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı

bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının

dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler

(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla

sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus

bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak

amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst

kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda

olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)

121 Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli

enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen

saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram

pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)

Sedat KAYA

17

Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip

amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan

oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın

olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis

kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen

diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri

(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu

2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)

Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel

farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında

değişmektedir (Akcan 2009)

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği

Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda

katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır

(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde

umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu

nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan

mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında

bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole

edilmiştir (Singhania ve ark 2009)

Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri

uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar

buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı

uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel

fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil

kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak

buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait

ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml

peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek

1 GİRİŞ

18

verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının

uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer

olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize

edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)

Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler

alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik

olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda

kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren

biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı

maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml

bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)

SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar

kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu

pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır

unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar

kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark

2009)

Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF

genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir

SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların

SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite

goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan

mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli

avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece

ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte

ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin

kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet

ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla

biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi

oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek

kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)

Sedat KAYA

19

SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum

koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH

inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen

azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)

Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda

SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat

olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin

SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)

SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır

1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir

2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak

kullanılır (Nigam ve Singh 1994)

1 GİRİŞ

20

Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)

ABİYOLOJİK UYGULAMALARI

MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı

Hz İsa‟nın doğumundan

oumlnce Asya‟da

Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den

yararlanılmıştır

MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma

MOuml 1500 Koji işlemi

7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi

18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı

18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit

kullanımı

1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri

1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit

1920-1940

Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal

enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin

gerccedilekleştirilmesi

1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen

olağanuumlstuuml gelişme

1950-1960

Steroid transformasyonu

1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan

yemlerinin uumlretimi

1980-1990

Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi

column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri

ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar

1990-Guumlnuumlmuumlze kadar

SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler

biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki

ilerlemeler

Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım

enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu

biyotranformasyonlar

Sedat KAYA

21

B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER

Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon

ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin

oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin

Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit

Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-

ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik

noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz

feruloil para-kaumaroil esteraz

Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit

Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol

aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar

biyopestisitlerbiyoherbisitler

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları

SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre

belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır

SSF‟in daha fazla verime sahip olması

SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır

Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır

Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-

Guerra ve ark 2003)

Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar

Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)

Koumlpuumlklenmenin olmaması

Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik

Daha basit fermantasyon ortamı

Daha kolay havalandırma

1 GİRİŞ

22

Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım

Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)

Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği

Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası

Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet

Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren

yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması

Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda

otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya

gereksinim yoktur

Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir

Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)

SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş

mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha

guumlvenilirdir

Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile

karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar

Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon

Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması

Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması

Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar

Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi

Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması

Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması

Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi

Sedat KAYA

23

Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama

homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)

Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması

zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin

tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)

Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur

Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk

oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-

Guerra ve ark 2003)

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler

Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)

1 Biyolojik faktoumlrler

2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

1321 Biyolojik Faktoumlrler

Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve

uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli

tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)

Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir

Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan

uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler

1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli

faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi

sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon

kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein

sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme

işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin

eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

24

Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde

gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi

protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin

induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi

şeklindedir

Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu

nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak

nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir

Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır

SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan

biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile

sağlanabilir

Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey

alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok

kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok

mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme

meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller

kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha

etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan

oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml

belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Sedat KAYA

25

2 KAYNAK OumlZETLERİ

Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den

elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH

aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH

85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır

Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı

duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen

Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini

uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk

molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln

inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak

kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir

Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik

bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler

Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz

mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1

NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı

kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr

kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda

elde edilmiştir

Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından

izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719

suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın

azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği

belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+

ve

Cu2+

iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir

Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali

proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini

karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı

olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir

2 KAYNAK OumlZETLERİ

26

Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini

baskıladığını tespit etmişlerdir

Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis

Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi

mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip

proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH

60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir

Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip

ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek

amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki

izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit

etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir

Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak

belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir

Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday

kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini

buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum

enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu

05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC

250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite

goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de

goumlzlenmiştir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve

buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir

Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim

aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak

buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık

başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm

hacmi 20 olarak rapor etmişler

Sedat KAYA

27

Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya

proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak

bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin

proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu

kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini

20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70

olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla

iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir

Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin

alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC

olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir

Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil

olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler

Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz

uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı

Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak

proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi

kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi

gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen

enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı

olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum

436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak

belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu

kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak

belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF

youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir

Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından

izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı

substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona

bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen

2 KAYNAK OumlZETLERİ

28

karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır

Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve

sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini

goumlstermektedir

Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde

yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda

kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada

katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar

ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF

youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde

etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini

olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2

ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve

maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu

etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr

Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi

aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya

ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla

artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot

kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim

uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon

suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir

Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve

kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit

etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz

uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta

ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve

amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır

Sedat KAYA

29

Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan

ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize

edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite

(2560 U ml-1

) değeri 48 saatten sonra (g-1

) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4

1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin

proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında

stabilite goumlstermiştir

Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum

kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir

Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas

aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin

bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir

(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz

aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟

da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz

uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak

pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz

aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu

sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken

yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir

Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis

DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak

atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı

patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin

hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi

patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve

Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da

yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve

maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz

uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi

2 KAYNAK OumlZETLERİ

30

37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen

enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu

goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu

sonuccedillar alınacağı umulmaktadır

Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis

N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3

K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında

gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve

yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren

ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz

uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları

96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10

mM Ca2+

iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini

korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve

pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween

65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda

muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135

ve 126 oranlarında koruyabilmiştir

Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1

tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin

optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin

proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı

test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur

Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite

goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde

oumlzellikle Ca2+

Mg2+

ve Cu2+

bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan

inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden

olduğunu tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

31

Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar

katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma

ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda

enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug

ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil

nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi

22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot

kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug

yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide

bulunduğunu belirlemişlerdir

Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum

aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu

ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+

Mg2+

ve

Mn2+

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+

‟nin olumsuz

etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan

derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini

yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20

Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol

ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden

olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini

goumlzlemlemişlerdir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık

materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı

substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla

uumlretim gerccedilekleştirmiştir

Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi

ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday

kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil

olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca

+2

2 KAYNAK OumlZETLERİ

32

ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg

+2 Cu

+2 Fe

+2 Co

+2 ve Zn

+2 iyonları ise

aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe

ederken Cu+2

iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın

metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir

Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi

iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi

iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim

uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla

uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk

olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti

Ca2+

ve Mg2+

kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin

optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin

pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+

ve Ca2+

iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa

olarak tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

33

3 MATERYAL ve METOT

31 Materyal

311 Kullanılan kimyasal maddeler

Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum

dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit

(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat

sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de

Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir

3111 Azot kaynakları

Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract

MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir

3112 Karbon kaynakları

Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den

temin edilmiştir

3113 Deterjanlar

Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan

temin edilmiştir

3114 Metal tuzları

FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de

Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir

3115 Besi yeri maddeleri

Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone

ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir

3 MATERYAL ve METOD

34

312 Kullanılan aletler

İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)

Steril Kabin ( Telstar AV-100)

Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)

Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)

Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)

Vorteks (Stuart) (VWR International )

Magnetik Karıştırıcı (Stuart)

Deep-Freeze (Haris -70ordmC)

Etuumlv (Heraus)

Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)

Otoklav (HIRAYAMA)

Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)

pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)

Sterilizatoumlr (Heraus)

Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)

313 Biyolojik materyal

Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis

ATCC 14580 suşu kullanılmıştır

314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması

Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine

ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda

kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı

Sedat KAYA

35

315 Substrat seccedilimi

Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday

kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi

kullanılmıştır

316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml

Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil

kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı

elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı

substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı

317 Kullanılan Besiyerleri

Sıvı besiyeri

Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf

suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi

sağlandıktan sonra otoklavlandı

Katı besiyeri

10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya

tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

SmF besiyeri

02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler

iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı

016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

3 MATERYAL ve METOD

36

318 SSF besiyeri

Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki

eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde

substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer

iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi

121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye

gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona

bırakıldı

Sedat KAYA

37

32 METOT

321 Mikroorganizma Uumlretimi

Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi

katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona

bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve

NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı

İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı

Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik

erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek

mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi

Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de

150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin

sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan

arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı

322 Ccediloumlzeltiler

Ccediloumlzeltilerin hazırlanması

Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması

pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml

01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan

sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

3 MATERYAL ve METOD

38

pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

Alkalin Ccediloumlzeltisi

4 Na2CO3

4 Na-K tartarat

2 CuSO4

Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde

hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları

sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı

Azo-kazein hazırlanması

005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi

sağlanarak hazırlandı

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu

Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri

ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre

sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5

dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant

uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı

324 Proteaz Aktivite Tayini

Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein

(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu

suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de

bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi

1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile

gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)

Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan

enzim miktarı olarak tanımlandı

Sedat KAYA

39

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi

Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu

arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu

substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave

edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı

NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave

edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar

inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce

oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF

besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı

santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı

(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı

326 Protein Miktar Tayini

Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak

Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen

(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin

protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı

Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl

saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra

uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek

30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm

yapıldı (Lowry ve ark 1951)

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin

Etkisi

SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek

iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri

yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı

3 MATERYAL ve METOD

40

İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika

santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere

aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı

Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml

ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim

kaynağı olarak kullanıldı

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin

Etkisi

Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere

konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha

sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra

37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96

120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi

belirlendi

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml

bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi

uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat

sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon

(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan

1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)

eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril

sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst

sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Sedat KAYA

41

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35

37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten

sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı

pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı

Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav

sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF

besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g

2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak

inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından

aktivite tayini yapıldı

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı

besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi

yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda

ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak

eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen

materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp

proteaz aktivite tayini yapıldı

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

3 MATERYAL ve METOD

42

Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki

atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası

her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra

farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan

oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat

Karışımının Belirlenmesi

Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24

saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır

kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g

2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların

her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi

yapıldı

Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda

SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı

olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki

Substratın Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu

subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra

inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki

substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat

kullanıldı

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının

Etkisi

Sedat KAYA

43

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon

kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten

sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp

100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine

eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı

Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun

ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde

edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot

kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp

hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF

ortamlarına eklenerek otoklavlandı

Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim

yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının

Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01

olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2

001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip

otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi

yapıldı

Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

3 MATERYAL ve METOD

44

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon

başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki

sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık

belirlenmeye ccedilalışıldı

Sedat KAYA

45

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı

arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de

goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Pirinccedil

Kab

uğu

Mer

cim

ek K

abuğ

u

Mıs

ır K

uumlspe

si

Arp

a K

abuğ

u

Buğ

day

Kab

uğu

Pam

uk K

abuğ

u

Sp

esif

ik A

ktiv

ite(

Um

g

24

48

72

96

120

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF

ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz

uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu

ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite

değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk

kabuğunda elde edilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

46

42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk

oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg

olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte

goumlre azaldığı belirlenmiştir

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

12 24 48 72 96 120

Zaman

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

um

g)

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Sedat KAYA

47

43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı

substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl

1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme

suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı

olarak kullanıldı

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Saf su

Ccedileş

me

suyu

NaC

I

Tris-

HCl p

H9

SDS

Tw

een-

80

Trit

onX

100

Ekstraksiyon ortamı (10 ml)

Sp

esif

ik A

kti

vit

e (U

mg

)

Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon

ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana

getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk

proteaz uumlretimine rastlanıldı

44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı

SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin

SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz

aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)

olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

48

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 30 35 37 40 45 50 55

İnkubasyon sıcaklıgı (degC)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin

mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan

ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80

(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

4 5 6 7 8 9 10pH

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi

Sedat KAYA

49

46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi

iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı

ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı

arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde

edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

10 20 30 40 50 60 70

Nem seviyesi ()

Sesi

fik

ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi

47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

50

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1 2 3 4 5 6 8

İnokulum (ml)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında

(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi

iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

60 100 120 150 180 200

Ccedilalkalama hızı (rpm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Sedat KAYA

51

49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının

Belirlenmesi

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil

kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında

maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 g pk +

05 g mk

20 g pk + 10

g mk

15 g pk + 15

g mk

10 g pk + 20

g mk

05 g pk+ 25

g mk

Mısır

Kuumlspesi 3 g

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi

mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu

410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın

Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı

partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da

goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta

1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

52

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

500 1000 1500

Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi

411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz

suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda

(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz

Karbon Kaynakaları (1)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Sedat KAYA

53

412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton

maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave

edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Kon

trol

Et oumlzuuml

tuuml

Kaz

ein

Pepto

n

Tripto

n

May

a oumlz

uumltuuml

Am

onyu

m n

itrat

Am

onyu

m suumll

fat

Am

onyu

m k

lorid

Azot Kaynakları (1)

Spes

ifik

Akti

vit

e (U

mg)

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi

413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen

01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen

Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)

ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi

Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe

edilmiştir (Şekil 43)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

54

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum

suumllfat

Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat

Metal Tuzları ( 01)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi

414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini

belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50

60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı

Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te

goumlsterilmiştir

0

20

40

60

80

100

120

15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90

Sıcaklık (degC)

Roumlla

tif

Akti

vit

e

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Sedat KAYA

55

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda

oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal

formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler

azaldığından dolayı da avantajlıdır

Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat

olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller

enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde

olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de

kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)

Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde

gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal

olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal

bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)

SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir

faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi

atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda

da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel

olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)

Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz

uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr

edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca

zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri

mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış

olabilir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF

youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En

iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

56

Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı

ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde

elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde

etmişlerdir

Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam

bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon

suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon

ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda

enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan

kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi

sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)

Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte

1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki

ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)

Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında

enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark

(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle

kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir

Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve

bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk

solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi

fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)

Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli

bir farktoumlrduumlr

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı

substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi

ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme

suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme

yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te

Sedat KAYA

57

amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila

oumlnemlidir

Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz

aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)

Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada

proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından

elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan

ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark

1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile

45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996

Gangadharan ve ark 2006)

SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın

gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından

ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat

fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve

mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık

aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)

Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık

literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır

İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder

metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol

accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı

ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve

Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda

kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri

besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık

biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak

kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

58

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil

pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak

tespit edilmiştir (Şekil 45)

pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen

bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması

gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar

Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını

oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de

etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı

değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol

oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir

Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla

kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine

başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik

goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)

Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor

edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit

edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek

pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan

enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde

kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)

Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz

aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit

etmişlerdir

Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil

pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit

edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği

yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak

goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)

Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-

110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite

Sedat KAYA

59

goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği

alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır

Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH

değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi

GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu

belirtmişlerdir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat

olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin

yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat

miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor

edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark

2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda

nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar

Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve

metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını

optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de

değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk

olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve

enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında

ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi

nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve

substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)

bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz

sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

60

İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile

ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin

azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm

hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen

uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar

(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak

yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve

katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi

azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005

Chutmanop ve ark 2008)

Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun

inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus

sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit

etmşlerdir

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)

olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile

paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda

60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin

azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı

substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta

yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde

etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma

fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama

yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir

Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları

farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm

olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon

sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri

huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava

Sedat KAYA

61

akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan

enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim

denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı

fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan

zayıf havalandırma oranına neden olabilir

Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler

alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin

mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF

koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm

ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil

kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum

enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)

Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak

SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve

Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark

2009 Tanyıldızı ve ark 2007)

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk

partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil

410)

Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel

olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar

ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat

parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum

havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay

goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk

partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk

parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

62

iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği

ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay

metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde

etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları

bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim

sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup

bulunmaması ile ilişkilidir

Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle

formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel

tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı

tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların

beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en

buumlyuumlk besin kaynağıdır

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite

değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış

goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005

Mukherjee ve ark 2009)

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından

kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)

Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde

bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr

etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az

olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki

fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

Sedat KAYA

63

aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de

goumlsterilmiştir

Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel

suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade

edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi

azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin

besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini

vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili

ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki

ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve

ark 1995)

Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et

ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır

Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)

ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları

bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini

olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların

substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir

Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim

maliyetini azaltmaktadır

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01

konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis

ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)

iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal

tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır

Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında

eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik

ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)

Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin

bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak

kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

64

B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti

azalabilir

Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde

edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+

ve Hg2+

iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır

Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2

Mg+2

ve Mn+2

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu

etkilerken Cu+2

nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir

Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr

ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim

uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)

İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten

dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir

Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme

ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye

başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve

ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal

atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında

enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha

fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların

kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir

SEDAT KAYA

65

6 KAYNAKLAR

Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi

Science 43(4) 257-262

Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis

Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156

Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a

soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to

soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136

Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması

Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır

Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının

oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Ankara

Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-

Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-

glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110

Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource

Technology 64 175ndash183

Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548

Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase

from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food

Engineering 79 950-955

Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre

dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen

Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara

Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing

Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology

Advances 11 539ndash547

6 KAYNAKLAR

66

Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-

amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry

38 1665ndash1668

Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu

nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik

Enstituumlsuuml Kocaeli

Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-

tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus

licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768

Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable

Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial

Thecnology 32 294-304

Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A

Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process

Biochemistry 42 1150-1154

Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5

Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme

production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering

26 100-106

Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995

Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis

PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243

ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic

Bacteriology 1105ndash1141

Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid

protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial

Biotechnology 10 17ndash30

Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran

M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine

Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-

961

SEDAT KAYA

67

Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease

production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates

Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018

Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on

laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302

Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal

inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2

iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans

Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5

Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)

Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel

Konular ve Uygulamalar 14-15

Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003

Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal

Cleaner Production 11 533ndash611

Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid

state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil

Bioresource Technology 101 1385-1388

El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the

ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production

scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593

Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease

production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation

Process Biochemistry 40 1951ndash1956

Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice

spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402

Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra

cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544

Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996

Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and

characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332

Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry

69 18-28

6 KAYNAKLAR

68

Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of

Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132

Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid

Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology

Biotechnology 44 (2) 269ndash274

George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of

protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess

Engineering 16 381-382

Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara

Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-

amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616

Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular

approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32

Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva

R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition

2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22

Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable

enzymes Bioresource Technology 89 17-34

Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM

1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435

Biotechnology Letters 19 675ndash712

He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-

like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326

Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline

proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1

Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical

Engineering 4771-79

Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic

bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36

415- 424

Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231

SEDAT KAYA

69

John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16

Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate

for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in

a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144

Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant

alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula

leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447

Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis

of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65

150ndash153

Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile

ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Diyarbakır

Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and

characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal

Microbiology Biotechnology 32 335-344

Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms

aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785

Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995

Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and

stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri

Apply Environment Microbiology 61 3098-3104

Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase

Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial

Biotechnology 46 106-111

Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial

viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594

Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For

Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729

Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease

From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-

1705

6 KAYNAKLAR

70

Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and

Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672

Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State

Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr

Bioengineering 100 168ndash17

Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a

bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422

Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical

Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus

subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39

Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various

chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229

Turkish Journal of Biology 99-103

Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined

Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular

Biology 235 1560-1584

Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and

optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp

CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537

Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine

Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis

Journal Moleculer Biology 76 103-122

Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic

enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14

Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A

in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and

Purification 57 01ndash107

Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production

of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661

Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for

improvement Trends in Food Science and Technology 8 339

SEDAT KAYA

71

Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin

phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275

Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase

production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and

Microbial Technology 39 56ndash59

Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5

Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent

tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as

substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735

Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel

substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF

Process Biochemistry 45 47-53

Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an

alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654

Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline

protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203

Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83

Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a

thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate

Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of

enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361

Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under

solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and

Biotechnology 84 (8) 1246-1249

Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices

Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78

Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium

composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis

N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394

Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular

α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203

6 KAYNAKLAR

72

Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state

fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90

Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995

Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264

Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their

applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423

Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by

Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab

shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10

Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash

performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal

Microbiology Biotechnology 17 493ndash497

Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from

Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779

Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen

proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara

Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul

Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State

Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169

Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84

Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in

solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology

16 578-584

Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid

substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource

Technology 97 (1) 171-177

Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization

of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state

Fermentation 33-183-189

IV

321 Mikroorganizma Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

322 Ccediloumlzeltilerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonuhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38

324 Proteaz Aktivite Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

326 Protein Miktar Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Parametrelerin Etkisinin Ġncelenmesihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Besiyerlerinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip39

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi42

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisihelliphelliphelliphellip42

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip 43

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphellip43

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisihelliphelliphelliphelliphellip43

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44

4 ARAŞTIRMA BULGULARIhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip45

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55

6 KAYNAKLARhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65

OumlZGECcedilMĠġhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77

V

OumlZET

KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN

ARAġTIRILMASI

YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ

Sedat KAYA

DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ

FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml

BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI

2011

Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık

gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve

mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya

hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan

uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla

miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları

iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda

enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln

geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır

CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin

pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu

katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki

ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon

suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine

etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi

proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit

edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon

kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve

amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek

miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin

30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi

belirlendi

Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580

Proteaz Mısır kuumlspesi

VI

ABSTRACT

THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD

WAS EXAMINED

MSc THESIS

Sedat KAYA

DICLE UNIVERSTY

INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES

DEPARTMENT of BIOLOGY

2011

The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine

and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms

have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have

considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more

stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group

of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical

leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair

recovery of silver from x-ray films and used many more industries field

In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice

husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid

substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize

was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the

obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size

on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm

substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC

respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources

on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect

amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was

investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed

maize+5 Rice husk)

Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease

Crushed maize

VII

CcedilİZELGE LİSTESİ

Ccedilizelge No Sayfa

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3

Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama

Alanları ve Uumlreticileri 10

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11

Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20

VIII

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil No Sayfa

Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5

Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46

Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48

Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50

Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50

Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51

Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54

IX

KISALTMA VE SİMGELER

SSF Katı faz fermantasyonu

SmF Submerged fermentasyonu

YE Maya Oumlzuumltuuml

NB Nutrienth Broth

LB Laura Broth

IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği

RGPW Red Gram Plant Waste

TCA Trikloroasetikasit

CSL Corn Speed Luquor

pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı

aw Su aktivite faktoumlruuml

SDS Sodyum dodesil suumllfat

BSA Bovim serum albuumlmin

CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr

CuCl2 Bakır kloruumlr

MgCl2 Magnezyum kloruumlr

ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr

FeCl2 Demir kloruumlr

MnCl2 Mangan kloruumlr

NaCl Sodyum kloruumlr

Na2CO3 Sodyum karbonat

CuSO4 Bakır suumllfat

MgSO4 Magnezyum suumllfat

NaOH Sodyum hidroksit

(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat

Sedat KAYA

1

1GİRİŞ

11 Enzimler

Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve

organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere

enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların

yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten

şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir

molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)

Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar

farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil

olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783

yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek

kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere

doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden

elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını

saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları

hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini

ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili

Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz

enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)

Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim

piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı

beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini

karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır

Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda

organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan

2008)

Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan

bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel

katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

2

Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve

enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen

enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark

2005)

Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı

Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan

bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine

yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik

accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim

uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip

Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim

şartları belirlenecektir

112 Proteazlar

Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını

katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir

Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik

2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı

fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde

hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee

ve ark 2008)

İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok

uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)

Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin

proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler

10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde

bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin

edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere

yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark

1994 Schrerier 1997)

Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak

sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik

Sedat KAYA

3

oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan

ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve

ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları

deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık

arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde

peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir

kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)

Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde

edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında

kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim

pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları

ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)

Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri

Bakteriler

Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan

Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan

Bacillus firmus Alkalin Deterjan

Bacillus megaterium Alkalin Deterjan

Bacillus pumulis Alkalin Deterjan

Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan

Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan

Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda

Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda

Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda

Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda

Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda

Mantarlar

Aspergillus niger Alkalin Deterjan

Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus flavus Alkalin Deterjan

Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda

Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda

Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda

Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda

1 GİRİŞ

4

1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri

Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein

sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir

yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır

Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları

katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar

saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile

proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip

olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)

Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel

gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu

enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda

karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek

değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)

Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre

duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar

Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin

sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin

gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000

Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı

enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli

metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)

1122 Proteazların Sınıflandırılması

Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve

adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere

iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr

Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve

endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark

1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir

Sedat KAYA

5

Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel

gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein

proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar

(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)

Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral

proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)

1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri

Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca

peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha

sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)

1- Reaksiyon katalizi

2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı

3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler

Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir

Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)

1 GİRİŞ

6

Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml

katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin

proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)

ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak

bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar

11231 Ekzopeptidazlar

Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit

bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden

ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler

ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk

peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının

hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler

Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek

karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil

karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid

bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)

11232 Endopeptidazlar

Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan

peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana

ve ark 1995)

Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve

histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde

serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve

ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları

nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH

değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll

ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)

Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein

(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile

karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif

Sedat KAYA

7

merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside

edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir

Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin

katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH

değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır

Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara

goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar

aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların

yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2

) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat

yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali

miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve

ark 1998)

1124 Proteazların Etki Mekanizması

İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında

bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir

su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına

Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana

gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların

etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır

Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)

1 GİRİŞ

8

1125 Proteaz Kaynakları

Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda

bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik

goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları

olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları

birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri

kazanımları kolaydır (Pandey 2006)

Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve

ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği

belirtilmektedir

1126 Proteaz Uumlretimi

Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun

(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim

uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir

Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama

alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)

Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri

gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim

gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda

membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik

uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına

youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve

ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz

fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler

(Haki ve Rakshit 2003)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve

durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların

uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi

kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun

Sedat KAYA

9

şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize

edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma

inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz

sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar

Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli

kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla

kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli

ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks

hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri

tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca

Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar

uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli

oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu

enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)

Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri

belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal

kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla

değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi

alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge

12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri

goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların

varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli

kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)

1 GİRİŞ

10

Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve

uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)

Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal

Kaynak

Uygulama Alanı

Novo Nordisk

Danimarka

Alcalase

Savinase

Esparase

Biofeed pro

Durazym

Novozyme47 1MP

Novozyme 243

Nue

B licheniformis

Bacillus sp

B lentus

B licheniformis

Bacillus sp

Belirtilmiyor

B licheniformis

Bacillus sp

Deterjan ipek

Deterjan tekstil

Deterjan gıda ipek

Yem

Deterjan

Fotoğraf

Deri

Genencor

International

ABD

Purafact

Primatan

B lentus

Bakteriyel

Kaynaklı

Deterjan

Deri

Gist-Brocades

Hollanda

Subtilisin

Maxacal

Maxatase

B alcalophilus

Bacillus sp

Bacillus sp

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Solvay Enzymes

Almanya

Opticlean

Optimase

Maxapem

HT-proteolytic

Protease

B alcalophilus

B licheniformis

Bacillus spnin

Protein

muumlhendisliği ile

uumlretilmiş varyantı

B sublilis

B licheniformis

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Alkol iccedilki ekmek

yem gıda deri

fotoğrafik atık

Gıda atık

Amano

Pharmaceuticals

Japonya

Proleather

Collagenas

Amano protease S

Bacillus sp

Clostrodium sp

Bacillus sp

Gıda

Teknik

Gıda

Enzyme

Development

ABD

Enzeco alkaline

protease-L FG

Enzeco high

alkaline protease

B licheniformis

B licheniformis

Bacillus sp

Teknik

Gıda

Enduumlstriyel

Nagase

Biochemicals

Japonya

Bioprase

concantrate

Ps Protease

Ps Elastase

CrystProtease

CrystProtease

Bioprase

Bioprase SP-10

B sublilis

P aeruginoso

P aeruginoso

B subtilis(K2)

Bsubtilis(bioteus)

B sublilis

B sublilis

Kozmetik

farmasoumltik

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Deterjan temizlik

Gıda

Jodo Shusei Japonya Codo Bap

B licheniformis Deterjan gıda

Rohm Almanya Corolase 7089

B sublilis Gıda

Sedat KAYA

11

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları

Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002

Pandey 2004)

Enduumlstri

Proteaz Uygulama

Ekmek yapımı Noumltral proteaz

Hamur kalitesini arttırma

İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme

iccedileceklerde bulanıklığın

giderilmesi

Mandıra

Fungal proteazlar simozin

diğer proteazlar

Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt

suyunun işlenmesi modifiye

peynir enzim uumlretimi

Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin

uzaklaştırılması

Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday

gluteni gibi zengin protein

metaryallerinin modifikasyonu

Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden

tuumlylerin uzaklaştırılması

Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve

balık atıklarından protein eldesi

Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması

kan pıhtısını ccediloumlzme doku

iltihaplarının azaltılması tıbbı

uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt

lensler ve takma dişlerin

temizlenmesi

Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf

filmlerinden guumlmuumlş eldesi

Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers

Hidroliz

Enduumlstriyel ve Evsel

Atıkların İşlenmesi

Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel

faaliyetler sonucu meydana gelen

atıkların işlenmesi

1 GİRİŞ

12

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde

patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960

yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar

guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus

alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar

uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı

madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır

(Dağaşan 1997)

Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı

maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta

ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı

maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları

ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler

kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki

kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her

tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi

protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)

11282 Fırında Pişirme Uygulamaları

Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave

edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması

sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun

makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri

ve ark 2002)

Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik

olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır

Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak

bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil

giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun

yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini

sağlamaktadır (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

13

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar

Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin

olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin

ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim

suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından

tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine

ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara

sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar

sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada

yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)

Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok

oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin

salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin

pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri

peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln

lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin

fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da

kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri

meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin

1998)

11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml

Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol

miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla

kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik

aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu

etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır

Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla

atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir

1 GİRİŞ

14

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı

Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri

uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki

guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol

accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre

dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından

parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film

sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında

olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis

denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen

fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen

damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri

sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama

yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan

derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve

Saleemuddin 1998)

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı

Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik

ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı

verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini

sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin

proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak

1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi

yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

15

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı

Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal

proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik

enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden

olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku

boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma

şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm

sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak

bulunan ve Ca+2

tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir

(Claus ve ark 1986)

Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde

edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların

accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve

meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan

yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı

Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az

duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu

amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır

Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da

yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa

rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik

olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde

kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)

12 Bacillus Cinsi

Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde

endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek

başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan

huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998

Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir

1 GİRİŞ

16

ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış

goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı

enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda

kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum

37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli

enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi

duumlşuumlnuumllmektedirler

Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak

tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen

karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun

basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin

duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde

olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık

donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik

tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)

Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil

aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı

bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının

dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler

(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla

sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus

bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak

amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst

kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda

olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)

121 Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli

enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen

saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram

pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)

Sedat KAYA

17

Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip

amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan

oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın

olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis

kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen

diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri

(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu

2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)

Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel

farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında

değişmektedir (Akcan 2009)

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği

Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda

katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır

(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde

umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu

nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan

mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında

bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole

edilmiştir (Singhania ve ark 2009)

Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri

uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar

buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı

uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel

fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil

kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak

buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait

ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml

peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek

1 GİRİŞ

18

verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının

uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer

olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize

edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)

Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler

alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik

olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda

kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren

biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı

maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml

bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)

SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar

kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu

pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır

unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar

kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark

2009)

Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF

genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir

SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların

SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite

goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan

mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli

avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece

ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte

ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin

kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet

ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla

biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi

oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek

kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)

Sedat KAYA

19

SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum

koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH

inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen

azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)

Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda

SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat

olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin

SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)

SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır

1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir

2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak

kullanılır (Nigam ve Singh 1994)

1 GİRİŞ

20

Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)

ABİYOLOJİK UYGULAMALARI

MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı

Hz İsa‟nın doğumundan

oumlnce Asya‟da

Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den

yararlanılmıştır

MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma

MOuml 1500 Koji işlemi

7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi

18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı

18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit

kullanımı

1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri

1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit

1920-1940

Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal

enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin

gerccedilekleştirilmesi

1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen

olağanuumlstuuml gelişme

1950-1960

Steroid transformasyonu

1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan

yemlerinin uumlretimi

1980-1990

Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi

column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri

ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar

1990-Guumlnuumlmuumlze kadar

SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler

biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki

ilerlemeler

Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım

enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu

biyotranformasyonlar

Sedat KAYA

21

B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER

Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon

ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin

oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin

Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit

Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-

ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik

noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz

feruloil para-kaumaroil esteraz

Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit

Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol

aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar

biyopestisitlerbiyoherbisitler

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları

SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre

belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır

SSF‟in daha fazla verime sahip olması

SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır

Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır

Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-

Guerra ve ark 2003)

Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar

Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)

Koumlpuumlklenmenin olmaması

Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik

Daha basit fermantasyon ortamı

Daha kolay havalandırma

1 GİRİŞ

22

Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım

Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)

Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği

Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası

Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet

Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren

yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması

Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda

otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya

gereksinim yoktur

Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir

Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)

SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş

mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha

guumlvenilirdir

Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile

karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar

Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon

Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması

Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması

Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar

Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi

Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması

Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması

Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi

Sedat KAYA

23

Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama

homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)

Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması

zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin

tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)

Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur

Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk

oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-

Guerra ve ark 2003)

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler

Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)

1 Biyolojik faktoumlrler

2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

1321 Biyolojik Faktoumlrler

Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve

uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli

tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)

Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir

Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan

uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler

1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli

faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi

sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon

kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein

sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme

işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin

eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

24

Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde

gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi

protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin

induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi

şeklindedir

Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu

nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak

nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir

Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır

SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan

biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile

sağlanabilir

Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey

alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok

kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok

mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme

meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller

kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha

etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan

oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml

belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Sedat KAYA

25

2 KAYNAK OumlZETLERİ

Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den

elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH

aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH

85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır

Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı

duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen

Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini

uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk

molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln

inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak

kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir

Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik

bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler

Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz

mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1

NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı

kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr

kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda

elde edilmiştir

Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından

izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719

suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın

azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği

belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+

ve

Cu2+

iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir

Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali

proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini

karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı

olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir

2 KAYNAK OumlZETLERİ

26

Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini

baskıladığını tespit etmişlerdir

Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis

Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi

mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip

proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH

60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir

Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip

ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek

amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki

izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit

etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir

Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak

belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir

Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday

kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini

buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum

enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu

05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC

250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite

goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de

goumlzlenmiştir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve

buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir

Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim

aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak

buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık

başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm

hacmi 20 olarak rapor etmişler

Sedat KAYA

27

Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya

proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak

bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin

proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu

kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini

20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70

olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla

iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir

Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin

alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC

olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir

Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil

olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler

Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz

uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı

Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak

proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi

kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi

gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen

enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı

olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum

436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak

belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu

kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak

belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF

youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir

Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından

izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı

substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona

bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen

2 KAYNAK OumlZETLERİ

28

karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır

Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve

sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini

goumlstermektedir

Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde

yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda

kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada

katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar

ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF

youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde

etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini

olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2

ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve

maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu

etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr

Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi

aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya

ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla

artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot

kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim

uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon

suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir

Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve

kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit

etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz

uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta

ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve

amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır

Sedat KAYA

29

Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan

ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize

edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite

(2560 U ml-1

) değeri 48 saatten sonra (g-1

) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4

1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin

proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında

stabilite goumlstermiştir

Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum

kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir

Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas

aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin

bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir

(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz

aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟

da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz

uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak

pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz

aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu

sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken

yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir

Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis

DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak

atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı

patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin

hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi

patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve

Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da

yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve

maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz

uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi

2 KAYNAK OumlZETLERİ

30

37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen

enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu

goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu

sonuccedillar alınacağı umulmaktadır

Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis

N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3

K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında

gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve

yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren

ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz

uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları

96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10

mM Ca2+

iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini

korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve

pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween

65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda

muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135

ve 126 oranlarında koruyabilmiştir

Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1

tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin

optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin

proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı

test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur

Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite

goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde

oumlzellikle Ca2+

Mg2+

ve Cu2+

bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan

inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden

olduğunu tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

31

Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar

katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma

ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda

enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug

ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil

nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi

22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot

kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug

yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide

bulunduğunu belirlemişlerdir

Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum

aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu

ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+

Mg2+

ve

Mn2+

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+

‟nin olumsuz

etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan

derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini

yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20

Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol

ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden

olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini

goumlzlemlemişlerdir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık

materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı

substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla

uumlretim gerccedilekleştirmiştir

Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi

ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday

kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil

olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca

+2

2 KAYNAK OumlZETLERİ

32

ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg

+2 Cu

+2 Fe

+2 Co

+2 ve Zn

+2 iyonları ise

aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe

ederken Cu+2

iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın

metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir

Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi

iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi

iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim

uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla

uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk

olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti

Ca2+

ve Mg2+

kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin

optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin

pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+

ve Ca2+

iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa

olarak tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

33

3 MATERYAL ve METOT

31 Materyal

311 Kullanılan kimyasal maddeler

Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum

dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit

(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat

sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de

Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir

3111 Azot kaynakları

Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract

MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir

3112 Karbon kaynakları

Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den

temin edilmiştir

3113 Deterjanlar

Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan

temin edilmiştir

3114 Metal tuzları

FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de

Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir

3115 Besi yeri maddeleri

Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone

ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir

3 MATERYAL ve METOD

34

312 Kullanılan aletler

İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)

Steril Kabin ( Telstar AV-100)

Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)

Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)

Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)

Vorteks (Stuart) (VWR International )

Magnetik Karıştırıcı (Stuart)

Deep-Freeze (Haris -70ordmC)

Etuumlv (Heraus)

Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)

Otoklav (HIRAYAMA)

Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)

pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)

Sterilizatoumlr (Heraus)

Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)

313 Biyolojik materyal

Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis

ATCC 14580 suşu kullanılmıştır

314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması

Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine

ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda

kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı

Sedat KAYA

35

315 Substrat seccedilimi

Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday

kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi

kullanılmıştır

316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml

Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil

kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı

elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı

substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı

317 Kullanılan Besiyerleri

Sıvı besiyeri

Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf

suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi

sağlandıktan sonra otoklavlandı

Katı besiyeri

10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya

tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

SmF besiyeri

02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler

iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı

016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

3 MATERYAL ve METOD

36

318 SSF besiyeri

Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki

eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde

substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer

iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi

121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye

gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona

bırakıldı

Sedat KAYA

37

32 METOT

321 Mikroorganizma Uumlretimi

Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi

katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona

bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve

NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı

İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı

Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik

erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek

mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi

Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de

150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin

sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan

arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı

322 Ccediloumlzeltiler

Ccediloumlzeltilerin hazırlanması

Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması

pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml

01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan

sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

3 MATERYAL ve METOD

38

pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

Alkalin Ccediloumlzeltisi

4 Na2CO3

4 Na-K tartarat

2 CuSO4

Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde

hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları

sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı

Azo-kazein hazırlanması

005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi

sağlanarak hazırlandı

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu

Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri

ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre

sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5

dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant

uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı

324 Proteaz Aktivite Tayini

Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein

(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu

suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de

bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi

1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile

gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)

Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan

enzim miktarı olarak tanımlandı

Sedat KAYA

39

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi

Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu

arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu

substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave

edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı

NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave

edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar

inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce

oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF

besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı

santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı

(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı

326 Protein Miktar Tayini

Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak

Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen

(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin

protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı

Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl

saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra

uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek

30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm

yapıldı (Lowry ve ark 1951)

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin

Etkisi

SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek

iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri

yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı

3 MATERYAL ve METOD

40

İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika

santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere

aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı

Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml

ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim

kaynağı olarak kullanıldı

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin

Etkisi

Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere

konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha

sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra

37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96

120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi

belirlendi

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml

bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi

uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat

sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon

(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan

1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)

eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril

sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst

sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Sedat KAYA

41

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35

37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten

sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı

pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı

Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav

sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF

besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g

2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak

inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından

aktivite tayini yapıldı

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı

besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi

yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda

ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak

eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen

materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp

proteaz aktivite tayini yapıldı

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

3 MATERYAL ve METOD

42

Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki

atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası

her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra

farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan

oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat

Karışımının Belirlenmesi

Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24

saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır

kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g

2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların

her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi

yapıldı

Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda

SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı

olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki

Substratın Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu

subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra

inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki

substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat

kullanıldı

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının

Etkisi

Sedat KAYA

43

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon

kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten

sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp

100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine

eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı

Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun

ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde

edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot

kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp

hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF

ortamlarına eklenerek otoklavlandı

Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim

yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının

Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01

olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2

001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip

otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi

yapıldı

Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

3 MATERYAL ve METOD

44

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon

başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki

sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık

belirlenmeye ccedilalışıldı

Sedat KAYA

45

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı

arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de

goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Pirinccedil

Kab

uğu

Mer

cim

ek K

abuğ

u

Mıs

ır K

uumlspe

si

Arp

a K

abuğ

u

Buğ

day

Kab

uğu

Pam

uk K

abuğ

u

Sp

esif

ik A

ktiv

ite(

Um

g

24

48

72

96

120

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF

ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz

uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu

ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite

değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk

kabuğunda elde edilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

46

42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk

oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg

olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte

goumlre azaldığı belirlenmiştir

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

12 24 48 72 96 120

Zaman

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

um

g)

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Sedat KAYA

47

43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı

substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl

1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme

suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı

olarak kullanıldı

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Saf su

Ccedileş

me

suyu

NaC

I

Tris-

HCl p

H9

SDS

Tw

een-

80

Trit

onX

100

Ekstraksiyon ortamı (10 ml)

Sp

esif

ik A

kti

vit

e (U

mg

)

Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon

ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana

getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk

proteaz uumlretimine rastlanıldı

44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı

SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin

SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz

aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)

olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

48

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 30 35 37 40 45 50 55

İnkubasyon sıcaklıgı (degC)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin

mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan

ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80

(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

4 5 6 7 8 9 10pH

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi

Sedat KAYA

49

46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi

iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı

ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı

arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde

edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

10 20 30 40 50 60 70

Nem seviyesi ()

Sesi

fik

ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi

47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

50

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1 2 3 4 5 6 8

İnokulum (ml)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında

(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi

iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

60 100 120 150 180 200

Ccedilalkalama hızı (rpm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Sedat KAYA

51

49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının

Belirlenmesi

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil

kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında

maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 g pk +

05 g mk

20 g pk + 10

g mk

15 g pk + 15

g mk

10 g pk + 20

g mk

05 g pk+ 25

g mk

Mısır

Kuumlspesi 3 g

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi

mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu

410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın

Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı

partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da

goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta

1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

52

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

500 1000 1500

Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi

411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz

suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda

(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz

Karbon Kaynakaları (1)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Sedat KAYA

53

412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton

maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave

edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Kon

trol

Et oumlzuuml

tuuml

Kaz

ein

Pepto

n

Tripto

n

May

a oumlz

uumltuuml

Am

onyu

m n

itrat

Am

onyu

m suumll

fat

Am

onyu

m k

lorid

Azot Kaynakları (1)

Spes

ifik

Akti

vit

e (U

mg)

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi

413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen

01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen

Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)

ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi

Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe

edilmiştir (Şekil 43)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

54

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum

suumllfat

Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat

Metal Tuzları ( 01)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi

414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini

belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50

60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı

Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te

goumlsterilmiştir

0

20

40

60

80

100

120

15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90

Sıcaklık (degC)

Roumlla

tif

Akti

vit

e

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Sedat KAYA

55

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda

oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal

formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler

azaldığından dolayı da avantajlıdır

Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat

olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller

enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde

olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de

kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)

Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde

gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal

olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal

bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)

SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir

faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi

atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda

da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel

olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)

Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz

uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr

edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca

zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri

mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış

olabilir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF

youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En

iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

56

Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı

ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde

elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde

etmişlerdir

Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam

bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon

suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon

ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda

enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan

kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi

sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)

Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte

1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki

ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)

Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında

enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark

(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle

kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir

Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve

bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk

solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi

fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)

Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli

bir farktoumlrduumlr

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı

substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi

ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme

suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme

yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te

Sedat KAYA

57

amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila

oumlnemlidir

Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz

aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)

Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada

proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından

elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan

ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark

1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile

45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996

Gangadharan ve ark 2006)

SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın

gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından

ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat

fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve

mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık

aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)

Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık

literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır

İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder

metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol

accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı

ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve

Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda

kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri

besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık

biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak

kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

58

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil

pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak

tespit edilmiştir (Şekil 45)

pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen

bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması

gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar

Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını

oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de

etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı

değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol

oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir

Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla

kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine

başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik

goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)

Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor

edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit

edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek

pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan

enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde

kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)

Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz

aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit

etmişlerdir

Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil

pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit

edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği

yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak

goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)

Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-

110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite

Sedat KAYA

59

goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği

alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır

Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH

değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi

GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu

belirtmişlerdir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat

olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin

yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat

miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor

edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark

2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda

nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar

Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve

metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını

optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de

değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk

olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve

enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında

ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi

nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve

substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)

bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz

sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

60

İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile

ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin

azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm

hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen

uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar

(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak

yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve

katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi

azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005

Chutmanop ve ark 2008)

Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun

inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus

sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit

etmşlerdir

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)

olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile

paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda

60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin

azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı

substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta

yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde

etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma

fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama

yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir

Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları

farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm

olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon

sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri

huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava

Sedat KAYA

61

akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan

enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim

denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı

fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan

zayıf havalandırma oranına neden olabilir

Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler

alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin

mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF

koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm

ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil

kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum

enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)

Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak

SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve

Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark

2009 Tanyıldızı ve ark 2007)

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk

partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil

410)

Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel

olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar

ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat

parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum

havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay

goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk

partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk

parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

62

iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği

ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay

metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde

etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları

bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim

sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup

bulunmaması ile ilişkilidir

Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle

formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel

tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı

tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların

beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en

buumlyuumlk besin kaynağıdır

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite

değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış

goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005

Mukherjee ve ark 2009)

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından

kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)

Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde

bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr

etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az

olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki

fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

Sedat KAYA

63

aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de

goumlsterilmiştir

Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel

suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade

edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi

azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin

besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini

vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili

ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki

ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve

ark 1995)

Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et

ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır

Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)

ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları

bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini

olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların

substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir

Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim

maliyetini azaltmaktadır

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01

konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis

ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)

iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal

tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır

Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında

eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik

ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)

Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin

bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak

kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

64

B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti

azalabilir

Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde

edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+

ve Hg2+

iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır

Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2

Mg+2

ve Mn+2

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu

etkilerken Cu+2

nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir

Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr

ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim

uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)

İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten

dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir

Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme

ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye

başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve

ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal

atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında

enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha

fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların

kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir

SEDAT KAYA

65

6 KAYNAKLAR

Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi

Science 43(4) 257-262

Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis

Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156

Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a

soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to

soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136

Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması

Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır

Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının

oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Ankara

Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-

Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-

glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110

Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource

Technology 64 175ndash183

Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548

Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase

from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food

Engineering 79 950-955

Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre

dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen

Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara

Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing

Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology

Advances 11 539ndash547

6 KAYNAKLAR

66

Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-

amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry

38 1665ndash1668

Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu

nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik

Enstituumlsuuml Kocaeli

Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-

tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus

licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768

Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable

Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial

Thecnology 32 294-304

Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A

Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process

Biochemistry 42 1150-1154

Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5

Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme

production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering

26 100-106

Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995

Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis

PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243

ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic

Bacteriology 1105ndash1141

Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid

protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial

Biotechnology 10 17ndash30

Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran

M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine

Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-

961

SEDAT KAYA

67

Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease

production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates

Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018

Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on

laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302

Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal

inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2

iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans

Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5

Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)

Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel

Konular ve Uygulamalar 14-15

Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003

Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal

Cleaner Production 11 533ndash611

Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid

state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil

Bioresource Technology 101 1385-1388

El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the

ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production

scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593

Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease

production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation

Process Biochemistry 40 1951ndash1956

Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice

spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402

Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra

cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544

Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996

Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and

characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332

Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry

69 18-28

6 KAYNAKLAR

68

Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of

Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132

Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid

Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology

Biotechnology 44 (2) 269ndash274

George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of

protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess

Engineering 16 381-382

Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara

Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-

amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616

Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular

approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32

Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva

R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition

2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22

Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable

enzymes Bioresource Technology 89 17-34

Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM

1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435

Biotechnology Letters 19 675ndash712

He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-

like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326

Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline

proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1

Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical

Engineering 4771-79

Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic

bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36

415- 424

Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231

SEDAT KAYA

69

John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16

Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate

for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in

a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144

Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant

alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula

leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447

Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis

of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65

150ndash153

Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile

ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Diyarbakır

Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and

characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal

Microbiology Biotechnology 32 335-344

Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms

aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785

Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995

Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and

stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri

Apply Environment Microbiology 61 3098-3104

Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase

Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial

Biotechnology 46 106-111

Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial

viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594

Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For

Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729

Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease

From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-

1705

6 KAYNAKLAR

70

Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and

Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672

Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State

Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr

Bioengineering 100 168ndash17

Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a

bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422

Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical

Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus

subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39

Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various

chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229

Turkish Journal of Biology 99-103

Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined

Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular

Biology 235 1560-1584

Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and

optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp

CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537

Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine

Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis

Journal Moleculer Biology 76 103-122

Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic

enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14

Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A

in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and

Purification 57 01ndash107

Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production

of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661

Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for

improvement Trends in Food Science and Technology 8 339

SEDAT KAYA

71

Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin

phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275

Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase

production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and

Microbial Technology 39 56ndash59

Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5

Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent

tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as

substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735

Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel

substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF

Process Biochemistry 45 47-53

Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an

alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654

Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline

protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203

Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83

Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a

thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate

Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of

enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361

Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under

solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and

Biotechnology 84 (8) 1246-1249

Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices

Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78

Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium

composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis

N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394

Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular

α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203

6 KAYNAKLAR

72

Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state

fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90

Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995

Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264

Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their

applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423

Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by

Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab

shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10

Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash

performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal

Microbiology Biotechnology 17 493ndash497

Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from

Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779

Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen

proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara

Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul

Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State

Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169

Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84

Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in

solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology

16 578-584

Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid

substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource

Technology 97 (1) 171-177

Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization

of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state

Fermentation 33-183-189

V

OumlZET

KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN

ARAġTIRILMASI

YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ

Sedat KAYA

DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ

FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml

BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI

2011

Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık

gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve

mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya

hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan

uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla

miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları

iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda

enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln

geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır

CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC

14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin

pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu

katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki

ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon

suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine

etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi

proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit

edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon

kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve

amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek

miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin

30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi

belirlendi

Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580

Proteaz Mısır kuumlspesi

VI

ABSTRACT

THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD

WAS EXAMINED

MSc THESIS

Sedat KAYA

DICLE UNIVERSTY

INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES

DEPARTMENT of BIOLOGY

2011

The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine

and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms

have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have

considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more

stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group

of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical

leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair

recovery of silver from x-ray films and used many more industries field

In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice

husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid

substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize

was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the

obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size

on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm

substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC

respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources

on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect

amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was

investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed

maize+5 Rice husk)

Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease

Crushed maize

VII

CcedilİZELGE LİSTESİ

Ccedilizelge No Sayfa

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3

Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama

Alanları ve Uumlreticileri 10

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11

Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20

VIII

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil No Sayfa

Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5

Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46

Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48

Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50

Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50

Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51

Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54

IX

KISALTMA VE SİMGELER

SSF Katı faz fermantasyonu

SmF Submerged fermentasyonu

YE Maya Oumlzuumltuuml

NB Nutrienth Broth

LB Laura Broth

IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği

RGPW Red Gram Plant Waste

TCA Trikloroasetikasit

CSL Corn Speed Luquor

pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı

aw Su aktivite faktoumlruuml

SDS Sodyum dodesil suumllfat

BSA Bovim serum albuumlmin

CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr

CuCl2 Bakır kloruumlr

MgCl2 Magnezyum kloruumlr

ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr

FeCl2 Demir kloruumlr

MnCl2 Mangan kloruumlr

NaCl Sodyum kloruumlr

Na2CO3 Sodyum karbonat

CuSO4 Bakır suumllfat

MgSO4 Magnezyum suumllfat

NaOH Sodyum hidroksit

(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat

Sedat KAYA

1

1GİRİŞ

11 Enzimler

Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve

organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere

enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların

yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten

şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir

molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)

Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar

farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil

olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783

yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek

kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere

doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden

elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını

saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları

hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini

ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili

Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz

enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)

Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim

piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı

beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini

karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır

Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda

organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan

2008)

Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan

bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel

katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

2

Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve

enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen

enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark

2005)

Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı

Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan

bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine

yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik

accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim

uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip

Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim

şartları belirlenecektir

112 Proteazlar

Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını

katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir

Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik

2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı

fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde

hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee

ve ark 2008)

İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok

uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)

Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin

proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler

10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde

bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin

edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere

yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark

1994 Schrerier 1997)

Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak

sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik

Sedat KAYA

3

oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan

ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve

ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları

deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık

arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde

peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir

kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)

Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde

edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında

kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim

pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları

ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)

Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri

Bakteriler

Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan

Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan

Bacillus firmus Alkalin Deterjan

Bacillus megaterium Alkalin Deterjan

Bacillus pumulis Alkalin Deterjan

Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan

Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan

Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda

Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda

Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda

Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda

Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda

Mantarlar

Aspergillus niger Alkalin Deterjan

Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus flavus Alkalin Deterjan

Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda

Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda

Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda

Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda

1 GİRİŞ

4

1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri

Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein

sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir

yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır

Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları

katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar

saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile

proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip

olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)

Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel

gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu

enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda

karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek

değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)

Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre

duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar

Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin

sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin

gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000

Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı

enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli

metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)

1122 Proteazların Sınıflandırılması

Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve

adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere

iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr

Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve

endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark

1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir

Sedat KAYA

5

Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel

gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein

proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar

(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)

Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral

proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)

1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri

Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca

peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha

sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)

1- Reaksiyon katalizi

2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı

3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler

Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir

Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)

1 GİRİŞ

6

Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml

katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin

proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)

ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak

bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar

11231 Ekzopeptidazlar

Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit

bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden

ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler

ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk

peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının

hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler

Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek

karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil

karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid

bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)

11232 Endopeptidazlar

Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan

peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana

ve ark 1995)

Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve

histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde

serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve

ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları

nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH

değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll

ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)

Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein

(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile

karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif

Sedat KAYA

7

merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside

edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir

Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin

katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH

değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır

Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara

goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar

aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların

yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2

) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat

yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali

miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve

ark 1998)

1124 Proteazların Etki Mekanizması

İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında

bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir

su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına

Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana

gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların

etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır

Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)

1 GİRİŞ

8

1125 Proteaz Kaynakları

Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda

bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik

goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları

olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları

birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri

kazanımları kolaydır (Pandey 2006)

Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve

ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği

belirtilmektedir

1126 Proteaz Uumlretimi

Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun

(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim

uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir

Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama

alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)

Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri

gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim

gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda

membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik

uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına

youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve

ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz

fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler

(Haki ve Rakshit 2003)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve

durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların

uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi

kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun

Sedat KAYA

9

şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize

edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma

inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz

sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar

Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli

kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla

kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli

ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks

hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri

tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca

Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar

uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli

oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu

enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)

Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri

belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal

kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla

değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi

alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge

12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri

goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların

varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli

kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)

1 GİRİŞ

10

Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve

uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)

Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal

Kaynak

Uygulama Alanı

Novo Nordisk

Danimarka

Alcalase

Savinase

Esparase

Biofeed pro

Durazym

Novozyme47 1MP

Novozyme 243

Nue

B licheniformis

Bacillus sp

B lentus

B licheniformis

Bacillus sp

Belirtilmiyor

B licheniformis

Bacillus sp

Deterjan ipek

Deterjan tekstil

Deterjan gıda ipek

Yem

Deterjan

Fotoğraf

Deri

Genencor

International

ABD

Purafact

Primatan

B lentus

Bakteriyel

Kaynaklı

Deterjan

Deri

Gist-Brocades

Hollanda

Subtilisin

Maxacal

Maxatase

B alcalophilus

Bacillus sp

Bacillus sp

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Solvay Enzymes

Almanya

Opticlean

Optimase

Maxapem

HT-proteolytic

Protease

B alcalophilus

B licheniformis

Bacillus spnin

Protein

muumlhendisliği ile

uumlretilmiş varyantı

B sublilis

B licheniformis

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Alkol iccedilki ekmek

yem gıda deri

fotoğrafik atık

Gıda atık

Amano

Pharmaceuticals

Japonya

Proleather

Collagenas

Amano protease S

Bacillus sp

Clostrodium sp

Bacillus sp

Gıda

Teknik

Gıda

Enzyme

Development

ABD

Enzeco alkaline

protease-L FG

Enzeco high

alkaline protease

B licheniformis

B licheniformis

Bacillus sp

Teknik

Gıda

Enduumlstriyel

Nagase

Biochemicals

Japonya

Bioprase

concantrate

Ps Protease

Ps Elastase

CrystProtease

CrystProtease

Bioprase

Bioprase SP-10

B sublilis

P aeruginoso

P aeruginoso

B subtilis(K2)

Bsubtilis(bioteus)

B sublilis

B sublilis

Kozmetik

farmasoumltik

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Deterjan temizlik

Gıda

Jodo Shusei Japonya Codo Bap

B licheniformis Deterjan gıda

Rohm Almanya Corolase 7089

B sublilis Gıda

Sedat KAYA

11

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları

Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002

Pandey 2004)

Enduumlstri

Proteaz Uygulama

Ekmek yapımı Noumltral proteaz

Hamur kalitesini arttırma

İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme

iccedileceklerde bulanıklığın

giderilmesi

Mandıra

Fungal proteazlar simozin

diğer proteazlar

Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt

suyunun işlenmesi modifiye

peynir enzim uumlretimi

Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin

uzaklaştırılması

Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday

gluteni gibi zengin protein

metaryallerinin modifikasyonu

Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden

tuumlylerin uzaklaştırılması

Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve

balık atıklarından protein eldesi

Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması

kan pıhtısını ccediloumlzme doku

iltihaplarının azaltılması tıbbı

uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt

lensler ve takma dişlerin

temizlenmesi

Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf

filmlerinden guumlmuumlş eldesi

Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers

Hidroliz

Enduumlstriyel ve Evsel

Atıkların İşlenmesi

Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel

faaliyetler sonucu meydana gelen

atıkların işlenmesi

1 GİRİŞ

12

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde

patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960

yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar

guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus

alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar

uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı

madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır

(Dağaşan 1997)

Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı

maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta

ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı

maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları

ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler

kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki

kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her

tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi

protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)

11282 Fırında Pişirme Uygulamaları

Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave

edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması

sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun

makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri

ve ark 2002)

Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik

olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır

Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak

bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil

giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun

yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini

sağlamaktadır (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

13

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar

Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin

olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin

ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim

suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından

tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine

ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara

sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar

sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada

yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)

Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok

oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin

salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin

pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri

peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln

lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin

fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da

kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri

meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin

1998)

11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml

Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol

miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla

kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik

aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu

etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır

Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla

atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir

1 GİRİŞ

14

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı

Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri

uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki

guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol

accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre

dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından

parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film

sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında

olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis

denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen

fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen

damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri

sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama

yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan

derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve

Saleemuddin 1998)

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı

Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik

ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı

verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini

sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin

proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak

1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi

yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

15

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı

Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal

proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik

enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden

olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku

boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma

şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm

sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak

bulunan ve Ca+2

tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir

(Claus ve ark 1986)

Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde

edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların

accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve

meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan

yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı

Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az

duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu

amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır

Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da

yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa

rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik

olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde

kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)

12 Bacillus Cinsi

Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde

endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek

başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan

huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998

Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir

1 GİRİŞ

16

ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış

goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı

enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda

kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum

37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli

enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi

duumlşuumlnuumllmektedirler

Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak

tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen

karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun

basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin

duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde

olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık

donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik

tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)

Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil

aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı

bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının

dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler

(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla

sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus

bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak

amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst

kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda

olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)

121 Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli

enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen

saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram

pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)

Sedat KAYA

17

Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip

amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan

oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın

olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis

kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen

diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri

(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu

2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)

Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel

farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında

değişmektedir (Akcan 2009)

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği

Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda

katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır

(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde

umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu

nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan

mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında

bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole

edilmiştir (Singhania ve ark 2009)

Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri

uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar

buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı

uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel

fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil

kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak

buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait

ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml

peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek

1 GİRİŞ

18

verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının

uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer

olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize

edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)

Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler

alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik

olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda

kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren

biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı

maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml

bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)

SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar

kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu

pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır

unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar

kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark

2009)

Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF

genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir

SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların

SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite

goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan

mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli

avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece

ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte

ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin

kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet

ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla

biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi

oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek

kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)

Sedat KAYA

19

SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum

koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH

inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen

azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)

Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda

SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat

olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin

SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)

SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır

1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir

2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak

kullanılır (Nigam ve Singh 1994)

1 GİRİŞ

20

Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)

ABİYOLOJİK UYGULAMALARI

MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı

Hz İsa‟nın doğumundan

oumlnce Asya‟da

Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den

yararlanılmıştır

MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma

MOuml 1500 Koji işlemi

7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi

18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı

18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit

kullanımı

1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri

1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit

1920-1940

Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal

enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin

gerccedilekleştirilmesi

1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen

olağanuumlstuuml gelişme

1950-1960

Steroid transformasyonu

1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan

yemlerinin uumlretimi

1980-1990

Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi

column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri

ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar

1990-Guumlnuumlmuumlze kadar

SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler

biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki

ilerlemeler

Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım

enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu

biyotranformasyonlar

Sedat KAYA

21

B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER

Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon

ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin

oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin

Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit

Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-

ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik

noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz

feruloil para-kaumaroil esteraz

Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit

Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol

aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar

biyopestisitlerbiyoherbisitler

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları

SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre

belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır

SSF‟in daha fazla verime sahip olması

SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır

Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır

Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-

Guerra ve ark 2003)

Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar

Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)

Koumlpuumlklenmenin olmaması

Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik

Daha basit fermantasyon ortamı

Daha kolay havalandırma

1 GİRİŞ

22

Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım

Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)

Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği

Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası

Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet

Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren

yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması

Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda

otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya

gereksinim yoktur

Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir

Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)

SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş

mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha

guumlvenilirdir

Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile

karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar

Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon

Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması

Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması

Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar

Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi

Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması

Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması

Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi

Sedat KAYA

23

Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama

homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)

Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması

zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin

tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)

Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur

Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk

oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-

Guerra ve ark 2003)

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler

Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)

1 Biyolojik faktoumlrler

2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

1321 Biyolojik Faktoumlrler

Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve

uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli

tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)

Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir

Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan

uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler

1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli

faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi

sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon

kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein

sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme

işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin

eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

24

Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde

gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi

protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin

induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi

şeklindedir

Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu

nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak

nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir

Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır

SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan

biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile

sağlanabilir

Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey

alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok

kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok

mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme

meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller

kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha

etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan

oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml

belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Sedat KAYA

25

2 KAYNAK OumlZETLERİ

Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den

elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH

aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH

85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır

Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı

duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen

Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini

uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk

molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln

inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak

kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir

Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik

bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler

Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz

mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1

NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı

kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr

kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda

elde edilmiştir

Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından

izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719

suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın

azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği

belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+

ve

Cu2+

iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir

Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali

proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini

karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı

olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir

2 KAYNAK OumlZETLERİ

26

Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini

baskıladığını tespit etmişlerdir

Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis

Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi

mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip

proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH

60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir

Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip

ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek

amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki

izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit

etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir

Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak

belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir

Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday

kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini

buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum

enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu

05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC

250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite

goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de

goumlzlenmiştir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve

buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir

Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim

aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak

buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık

başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm

hacmi 20 olarak rapor etmişler

Sedat KAYA

27

Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya

proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak

bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin

proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu

kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini

20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70

olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla

iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir

Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin

alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC

olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir

Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil

olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler

Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz

uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı

Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak

proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi

kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi

gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen

enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı

olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum

436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak

belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu

kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak

belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF

youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir

Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından

izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı

substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona

bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen

2 KAYNAK OumlZETLERİ

28

karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır

Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve

sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini

goumlstermektedir

Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde

yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda

kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada

katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar

ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF

youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde

etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini

olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2

ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve

maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu

etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr

Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi

aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya

ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla

artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot

kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim

uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon

suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir

Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve

kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit

etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz

uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta

ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve

amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır

Sedat KAYA

29

Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan

ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize

edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite

(2560 U ml-1

) değeri 48 saatten sonra (g-1

) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4

1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin

proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında

stabilite goumlstermiştir

Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum

kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir

Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas

aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin

bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir

(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz

aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟

da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz

uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak

pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz

aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu

sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken

yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir

Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis

DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak

atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı

patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin

hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi

patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve

Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da

yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve

maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz

uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi

2 KAYNAK OumlZETLERİ

30

37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen

enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu

goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu

sonuccedillar alınacağı umulmaktadır

Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis

N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3

K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında

gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve

yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren

ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz

uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları

96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10

mM Ca2+

iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini

korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve

pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween

65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda

muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135

ve 126 oranlarında koruyabilmiştir

Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1

tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin

optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin

proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı

test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur

Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite

goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde

oumlzellikle Ca2+

Mg2+

ve Cu2+

bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan

inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden

olduğunu tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

31

Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar

katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma

ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda

enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug

ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil

nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi

22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot

kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug

yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide

bulunduğunu belirlemişlerdir

Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum

aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu

ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+

Mg2+

ve

Mn2+

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+

‟nin olumsuz

etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan

derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini

yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20

Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol

ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden

olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini

goumlzlemlemişlerdir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık

materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı

substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla

uumlretim gerccedilekleştirmiştir

Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi

ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday

kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil

olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca

+2

2 KAYNAK OumlZETLERİ

32

ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg

+2 Cu

+2 Fe

+2 Co

+2 ve Zn

+2 iyonları ise

aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe

ederken Cu+2

iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın

metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir

Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi

iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi

iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim

uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla

uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk

olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti

Ca2+

ve Mg2+

kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin

optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin

pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+

ve Ca2+

iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa

olarak tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

33

3 MATERYAL ve METOT

31 Materyal

311 Kullanılan kimyasal maddeler

Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum

dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit

(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat

sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de

Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir

3111 Azot kaynakları

Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract

MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir

3112 Karbon kaynakları

Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den

temin edilmiştir

3113 Deterjanlar

Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan

temin edilmiştir

3114 Metal tuzları

FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de

Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir

3115 Besi yeri maddeleri

Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone

ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir

3 MATERYAL ve METOD

34

312 Kullanılan aletler

İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)

Steril Kabin ( Telstar AV-100)

Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)

Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)

Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)

Vorteks (Stuart) (VWR International )

Magnetik Karıştırıcı (Stuart)

Deep-Freeze (Haris -70ordmC)

Etuumlv (Heraus)

Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)

Otoklav (HIRAYAMA)

Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)

pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)

Sterilizatoumlr (Heraus)

Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)

313 Biyolojik materyal

Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis

ATCC 14580 suşu kullanılmıştır

314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması

Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine

ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda

kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı

Sedat KAYA

35

315 Substrat seccedilimi

Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday

kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi

kullanılmıştır

316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml

Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil

kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı

elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı

substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı

317 Kullanılan Besiyerleri

Sıvı besiyeri

Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf

suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi

sağlandıktan sonra otoklavlandı

Katı besiyeri

10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya

tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

SmF besiyeri

02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler

iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı

016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

3 MATERYAL ve METOD

36

318 SSF besiyeri

Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki

eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde

substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer

iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi

121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye

gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona

bırakıldı

Sedat KAYA

37

32 METOT

321 Mikroorganizma Uumlretimi

Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi

katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona

bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve

NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı

İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı

Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik

erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek

mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi

Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de

150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin

sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan

arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı

322 Ccediloumlzeltiler

Ccediloumlzeltilerin hazırlanması

Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması

pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml

01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan

sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

3 MATERYAL ve METOD

38

pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

Alkalin Ccediloumlzeltisi

4 Na2CO3

4 Na-K tartarat

2 CuSO4

Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde

hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları

sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı

Azo-kazein hazırlanması

005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi

sağlanarak hazırlandı

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu

Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri

ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre

sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5

dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant

uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı

324 Proteaz Aktivite Tayini

Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein

(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu

suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de

bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi

1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile

gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)

Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan

enzim miktarı olarak tanımlandı

Sedat KAYA

39

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi

Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu

arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu

substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave

edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı

NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave

edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar

inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce

oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF

besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı

santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı

(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı

326 Protein Miktar Tayini

Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak

Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen

(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin

protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı

Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl

saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra

uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek

30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm

yapıldı (Lowry ve ark 1951)

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin

Etkisi

SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek

iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri

yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı

3 MATERYAL ve METOD

40

İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika

santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere

aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı

Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml

ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim

kaynağı olarak kullanıldı

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin

Etkisi

Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere

konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha

sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra

37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96

120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi

belirlendi

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml

bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi

uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat

sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon

(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan

1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)

eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril

sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst

sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Sedat KAYA

41

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35

37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten

sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı

pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı

Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav

sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF

besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g

2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak

inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından

aktivite tayini yapıldı

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı

besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi

yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda

ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak

eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen

materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp

proteaz aktivite tayini yapıldı

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

3 MATERYAL ve METOD

42

Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki

atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası

her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra

farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan

oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat

Karışımının Belirlenmesi

Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24

saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır

kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g

2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların

her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi

yapıldı

Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda

SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı

olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki

Substratın Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu

subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra

inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki

substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat

kullanıldı

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının

Etkisi

Sedat KAYA

43

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon

kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten

sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp

100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine

eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı

Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun

ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde

edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot

kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp

hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF

ortamlarına eklenerek otoklavlandı

Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim

yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının

Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01

olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2

001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip

otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi

yapıldı

Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

3 MATERYAL ve METOD

44

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon

başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki

sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık

belirlenmeye ccedilalışıldı

Sedat KAYA

45

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı

arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de

goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Pirinccedil

Kab

uğu

Mer

cim

ek K

abuğ

u

Mıs

ır K

uumlspe

si

Arp

a K

abuğ

u

Buğ

day

Kab

uğu

Pam

uk K

abuğ

u

Sp

esif

ik A

ktiv

ite(

Um

g

24

48

72

96

120

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF

ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz

uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu

ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite

değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk

kabuğunda elde edilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

46

42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk

oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg

olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte

goumlre azaldığı belirlenmiştir

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

12 24 48 72 96 120

Zaman

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

um

g)

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Sedat KAYA

47

43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı

substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl

1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme

suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı

olarak kullanıldı

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Saf su

Ccedileş

me

suyu

NaC

I

Tris-

HCl p

H9

SDS

Tw

een-

80

Trit

onX

100

Ekstraksiyon ortamı (10 ml)

Sp

esif

ik A

kti

vit

e (U

mg

)

Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon

ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana

getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk

proteaz uumlretimine rastlanıldı

44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı

SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin

SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz

aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)

olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

48

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 30 35 37 40 45 50 55

İnkubasyon sıcaklıgı (degC)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin

mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan

ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80

(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

4 5 6 7 8 9 10pH

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi

Sedat KAYA

49

46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi

iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı

ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı

arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde

edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

10 20 30 40 50 60 70

Nem seviyesi ()

Sesi

fik

ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi

47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

50

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1 2 3 4 5 6 8

İnokulum (ml)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında

(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi

iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

60 100 120 150 180 200

Ccedilalkalama hızı (rpm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Sedat KAYA

51

49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının

Belirlenmesi

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil

kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında

maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 g pk +

05 g mk

20 g pk + 10

g mk

15 g pk + 15

g mk

10 g pk + 20

g mk

05 g pk+ 25

g mk

Mısır

Kuumlspesi 3 g

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi

mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu

410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın

Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı

partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da

goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta

1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

52

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

500 1000 1500

Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi

411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz

suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda

(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz

Karbon Kaynakaları (1)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Sedat KAYA

53

412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton

maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave

edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Kon

trol

Et oumlzuuml

tuuml

Kaz

ein

Pepto

n

Tripto

n

May

a oumlz

uumltuuml

Am

onyu

m n

itrat

Am

onyu

m suumll

fat

Am

onyu

m k

lorid

Azot Kaynakları (1)

Spes

ifik

Akti

vit

e (U

mg)

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi

413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen

01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen

Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)

ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi

Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe

edilmiştir (Şekil 43)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

54

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum

suumllfat

Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat

Metal Tuzları ( 01)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi

414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini

belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50

60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı

Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te

goumlsterilmiştir

0

20

40

60

80

100

120

15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90

Sıcaklık (degC)

Roumlla

tif

Akti

vit

e

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Sedat KAYA

55

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda

oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal

formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler

azaldığından dolayı da avantajlıdır

Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat

olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller

enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde

olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de

kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)

Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde

gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal

olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal

bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)

SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir

faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi

atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda

da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel

olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)

Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz

uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr

edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca

zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri

mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış

olabilir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF

youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En

iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

56

Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı

ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde

elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde

etmişlerdir

Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam

bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon

suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon

ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda

enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan

kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi

sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)

Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte

1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki

ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)

Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında

enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark

(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle

kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir

Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve

bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk

solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi

fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)

Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli

bir farktoumlrduumlr

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı

substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi

ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme

suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme

yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te

Sedat KAYA

57

amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila

oumlnemlidir

Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz

aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)

Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada

proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından

elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan

ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark

1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile

45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996

Gangadharan ve ark 2006)

SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın

gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından

ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat

fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve

mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık

aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)

Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık

literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır

İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder

metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol

accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı

ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve

Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda

kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri

besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık

biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak

kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

58

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil

pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak

tespit edilmiştir (Şekil 45)

pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen

bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması

gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar

Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını

oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de

etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı

değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol

oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir

Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla

kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine

başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik

goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)

Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor

edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit

edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek

pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan

enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde

kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)

Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz

aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit

etmişlerdir

Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil

pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit

edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği

yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak

goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)

Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-

110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite

Sedat KAYA

59

goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği

alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır

Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH

değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi

GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu

belirtmişlerdir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat

olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin

yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat

miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor

edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark

2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda

nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar

Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve

metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını

optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de

değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk

olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve

enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında

ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi

nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve

substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)

bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz

sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

60

İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile

ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin

azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm

hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen

uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar

(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak

yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve

katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi

azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005

Chutmanop ve ark 2008)

Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun

inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus

sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit

etmşlerdir

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)

olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile

paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda

60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin

azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı

substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta

yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde

etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma

fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama

yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir

Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları

farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm

olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon

sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri

huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava

Sedat KAYA

61

akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan

enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim

denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı

fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan

zayıf havalandırma oranına neden olabilir

Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler

alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin

mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF

koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm

ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil

kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum

enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)

Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak

SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve

Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark

2009 Tanyıldızı ve ark 2007)

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk

partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil

410)

Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel

olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar

ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat

parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum

havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay

goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk

partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk

parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

62

iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği

ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay

metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde

etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları

bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim

sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup

bulunmaması ile ilişkilidir

Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle

formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel

tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı

tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların

beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en

buumlyuumlk besin kaynağıdır

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite

değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış

goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005

Mukherjee ve ark 2009)

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından

kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)

Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde

bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr

etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az

olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki

fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

Sedat KAYA

63

aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de

goumlsterilmiştir

Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel

suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade

edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi

azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin

besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini

vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili

ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki

ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve

ark 1995)

Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et

ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır

Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)

ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları

bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini

olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların

substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir

Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim

maliyetini azaltmaktadır

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01

konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis

ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)

iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal

tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır

Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında

eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik

ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)

Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin

bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak

kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

64

B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti

azalabilir

Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde

edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+

ve Hg2+

iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır

Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2

Mg+2

ve Mn+2

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu

etkilerken Cu+2

nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir

Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr

ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim

uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)

İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten

dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir

Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme

ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye

başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve

ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal

atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında

enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha

fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların

kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir

SEDAT KAYA

65

6 KAYNAKLAR

Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi

Science 43(4) 257-262

Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis

Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156

Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a

soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to

soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136

Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması

Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır

Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının

oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Ankara

Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-

Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-

glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110

Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource

Technology 64 175ndash183

Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548

Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase

from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food

Engineering 79 950-955

Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre

dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen

Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara

Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing

Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology

Advances 11 539ndash547

6 KAYNAKLAR

66

Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-

amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry

38 1665ndash1668

Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu

nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik

Enstituumlsuuml Kocaeli

Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-

tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus

licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768

Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable

Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial

Thecnology 32 294-304

Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A

Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process

Biochemistry 42 1150-1154

Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5

Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme

production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering

26 100-106

Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995

Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis

PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243

ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic

Bacteriology 1105ndash1141

Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid

protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial

Biotechnology 10 17ndash30

Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran

M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine

Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-

961

SEDAT KAYA

67

Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease

production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates

Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018

Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on

laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302

Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal

inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2

iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans

Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5

Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)

Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel

Konular ve Uygulamalar 14-15

Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003

Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal

Cleaner Production 11 533ndash611

Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid

state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil

Bioresource Technology 101 1385-1388

El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the

ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production

scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593

Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease

production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation

Process Biochemistry 40 1951ndash1956

Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice

spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402

Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra

cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544

Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996

Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and

characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332

Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry

69 18-28

6 KAYNAKLAR

68

Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of

Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132

Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid

Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology

Biotechnology 44 (2) 269ndash274

George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of

protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess

Engineering 16 381-382

Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara

Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-

amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616

Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular

approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32

Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva

R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition

2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22

Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable

enzymes Bioresource Technology 89 17-34

Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM

1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435

Biotechnology Letters 19 675ndash712

He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-

like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326

Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline

proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1

Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical

Engineering 4771-79

Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic

bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36

415- 424

Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231

SEDAT KAYA

69

John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16

Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate

for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in

a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144

Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant

alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula

leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447

Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis

of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65

150ndash153

Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile

ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Diyarbakır

Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and

characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal

Microbiology Biotechnology 32 335-344

Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms

aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785

Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995

Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and

stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri

Apply Environment Microbiology 61 3098-3104

Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase

Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial

Biotechnology 46 106-111

Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial

viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594

Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For

Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729

Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease

From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-

1705

6 KAYNAKLAR

70

Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and

Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672

Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State

Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr

Bioengineering 100 168ndash17

Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a

bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422

Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical

Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus

subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39

Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various

chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229

Turkish Journal of Biology 99-103

Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined

Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular

Biology 235 1560-1584

Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and

optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp

CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537

Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine

Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis

Journal Moleculer Biology 76 103-122

Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic

enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14

Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A

in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and

Purification 57 01ndash107

Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production

of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661

Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for

improvement Trends in Food Science and Technology 8 339

SEDAT KAYA

71

Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin

phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275

Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase

production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and

Microbial Technology 39 56ndash59

Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5

Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent

tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as

substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735

Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel

substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF

Process Biochemistry 45 47-53

Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an

alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654

Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline

protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203

Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83

Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a

thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate

Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of

enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361

Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under

solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and

Biotechnology 84 (8) 1246-1249

Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices

Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78

Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium

composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis

N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394

Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular

α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203

6 KAYNAKLAR

72

Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state

fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90

Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995

Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264

Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their

applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423

Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by

Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab

shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10

Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash

performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal

Microbiology Biotechnology 17 493ndash497

Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from

Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779

Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen

proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara

Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul

Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State

Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169

Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84

Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in

solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology

16 578-584

Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid

substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource

Technology 97 (1) 171-177

Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization

of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state

Fermentation 33-183-189

VI

ABSTRACT

THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD

WAS EXAMINED

MSc THESIS

Sedat KAYA

DICLE UNIVERSTY

INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES

DEPARTMENT of BIOLOGY

2011

The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine

and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms

have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have

considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more

stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group

of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical

leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair

recovery of silver from x-ray films and used many more industries field

In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus

licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice

husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid

substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize

was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the

obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size

on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm

substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC

respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources

on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect

amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was

investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed

maize+5 Rice husk)

Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease

Crushed maize

VII

CcedilİZELGE LİSTESİ

Ccedilizelge No Sayfa

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3

Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama

Alanları ve Uumlreticileri 10

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11

Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20

VIII

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil No Sayfa

Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5

Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46

Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48

Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50

Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50

Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51

Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54

IX

KISALTMA VE SİMGELER

SSF Katı faz fermantasyonu

SmF Submerged fermentasyonu

YE Maya Oumlzuumltuuml

NB Nutrienth Broth

LB Laura Broth

IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği

RGPW Red Gram Plant Waste

TCA Trikloroasetikasit

CSL Corn Speed Luquor

pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı

aw Su aktivite faktoumlruuml

SDS Sodyum dodesil suumllfat

BSA Bovim serum albuumlmin

CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr

CuCl2 Bakır kloruumlr

MgCl2 Magnezyum kloruumlr

ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr

FeCl2 Demir kloruumlr

MnCl2 Mangan kloruumlr

NaCl Sodyum kloruumlr

Na2CO3 Sodyum karbonat

CuSO4 Bakır suumllfat

MgSO4 Magnezyum suumllfat

NaOH Sodyum hidroksit

(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat

Sedat KAYA

1

1GİRİŞ

11 Enzimler

Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve

organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere

enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların

yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten

şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir

molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)

Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar

farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil

olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783

yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek

kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere

doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden

elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını

saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları

hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini

ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili

Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz

enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)

Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim

piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı

beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini

karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır

Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda

organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan

2008)

Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan

bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel

katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

2

Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve

enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen

enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark

2005)

Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı

Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan

bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine

yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik

accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim

uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip

Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim

şartları belirlenecektir

112 Proteazlar

Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını

katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir

Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik

2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı

fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde

hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee

ve ark 2008)

İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok

uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)

Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin

proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler

10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde

bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin

edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere

yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark

1994 Schrerier 1997)

Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak

sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik

Sedat KAYA

3

oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan

ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve

ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları

deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık

arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde

peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir

kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)

Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde

edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında

kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim

pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları

ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)

Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri

Bakteriler

Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan

Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan

Bacillus firmus Alkalin Deterjan

Bacillus megaterium Alkalin Deterjan

Bacillus pumulis Alkalin Deterjan

Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan

Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan

Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda

Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda

Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda

Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda

Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda

Mantarlar

Aspergillus niger Alkalin Deterjan

Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus flavus Alkalin Deterjan

Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda

Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda

Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda

Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda

1 GİRİŞ

4

1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri

Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein

sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir

yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır

Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları

katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar

saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile

proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip

olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)

Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel

gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu

enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda

karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek

değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)

Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre

duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar

Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin

sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin

gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000

Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı

enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli

metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)

1122 Proteazların Sınıflandırılması

Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve

adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere

iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr

Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve

endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark

1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir

Sedat KAYA

5

Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel

gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein

proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar

(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)

Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral

proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)

1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri

Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca

peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha

sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)

1- Reaksiyon katalizi

2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı

3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler

Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir

Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)

1 GİRİŞ

6

Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml

katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin

proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)

ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak

bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar

11231 Ekzopeptidazlar

Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit

bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden

ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler

ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk

peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının

hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler

Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek

karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil

karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid

bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)

11232 Endopeptidazlar

Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan

peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana

ve ark 1995)

Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve

histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde

serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve

ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları

nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH

değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll

ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)

Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein

(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile

karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif

Sedat KAYA

7

merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside

edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir

Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin

katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH

değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır

Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara

goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar

aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların

yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2

) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat

yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali

miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve

ark 1998)

1124 Proteazların Etki Mekanizması

İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında

bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir

su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına

Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana

gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların

etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır

Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)

1 GİRİŞ

8

1125 Proteaz Kaynakları

Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda

bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik

goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları

olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları

birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri

kazanımları kolaydır (Pandey 2006)

Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve

ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği

belirtilmektedir

1126 Proteaz Uumlretimi

Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun

(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim

uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir

Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama

alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)

Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri

gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim

gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda

membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik

uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına

youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve

ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz

fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler

(Haki ve Rakshit 2003)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve

durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların

uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi

kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun

Sedat KAYA

9

şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize

edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma

inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz

sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar

Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli

kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla

kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli

ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks

hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri

tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca

Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar

uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli

oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu

enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)

Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri

belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal

kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla

değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi

alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge

12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri

goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların

varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli

kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)

1 GİRİŞ

10

Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve

uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)

Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal

Kaynak

Uygulama Alanı

Novo Nordisk

Danimarka

Alcalase

Savinase

Esparase

Biofeed pro

Durazym

Novozyme47 1MP

Novozyme 243

Nue

B licheniformis

Bacillus sp

B lentus

B licheniformis

Bacillus sp

Belirtilmiyor

B licheniformis

Bacillus sp

Deterjan ipek

Deterjan tekstil

Deterjan gıda ipek

Yem

Deterjan

Fotoğraf

Deri

Genencor

International

ABD

Purafact

Primatan

B lentus

Bakteriyel

Kaynaklı

Deterjan

Deri

Gist-Brocades

Hollanda

Subtilisin

Maxacal

Maxatase

B alcalophilus

Bacillus sp

Bacillus sp

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Solvay Enzymes

Almanya

Opticlean

Optimase

Maxapem

HT-proteolytic

Protease

B alcalophilus

B licheniformis

Bacillus spnin

Protein

muumlhendisliği ile

uumlretilmiş varyantı

B sublilis

B licheniformis

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Alkol iccedilki ekmek

yem gıda deri

fotoğrafik atık

Gıda atık

Amano

Pharmaceuticals

Japonya

Proleather

Collagenas

Amano protease S

Bacillus sp

Clostrodium sp

Bacillus sp

Gıda

Teknik

Gıda

Enzyme

Development

ABD

Enzeco alkaline

protease-L FG

Enzeco high

alkaline protease

B licheniformis

B licheniformis

Bacillus sp

Teknik

Gıda

Enduumlstriyel

Nagase

Biochemicals

Japonya

Bioprase

concantrate

Ps Protease

Ps Elastase

CrystProtease

CrystProtease

Bioprase

Bioprase SP-10

B sublilis

P aeruginoso

P aeruginoso

B subtilis(K2)

Bsubtilis(bioteus)

B sublilis

B sublilis

Kozmetik

farmasoumltik

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Deterjan temizlik

Gıda

Jodo Shusei Japonya Codo Bap

B licheniformis Deterjan gıda

Rohm Almanya Corolase 7089

B sublilis Gıda

Sedat KAYA

11

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları

Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002

Pandey 2004)

Enduumlstri

Proteaz Uygulama

Ekmek yapımı Noumltral proteaz

Hamur kalitesini arttırma

İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme

iccedileceklerde bulanıklığın

giderilmesi

Mandıra

Fungal proteazlar simozin

diğer proteazlar

Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt

suyunun işlenmesi modifiye

peynir enzim uumlretimi

Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin

uzaklaştırılması

Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday

gluteni gibi zengin protein

metaryallerinin modifikasyonu

Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden

tuumlylerin uzaklaştırılması

Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve

balık atıklarından protein eldesi

Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması

kan pıhtısını ccediloumlzme doku

iltihaplarının azaltılması tıbbı

uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt

lensler ve takma dişlerin

temizlenmesi

Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf

filmlerinden guumlmuumlş eldesi

Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers

Hidroliz

Enduumlstriyel ve Evsel

Atıkların İşlenmesi

Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel

faaliyetler sonucu meydana gelen

atıkların işlenmesi

1 GİRİŞ

12

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde

patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960

yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar

guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus

alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar

uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı

madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır

(Dağaşan 1997)

Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı

maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta

ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı

maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları

ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler

kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki

kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her

tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi

protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)

11282 Fırında Pişirme Uygulamaları

Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave

edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması

sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun

makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri

ve ark 2002)

Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik

olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır

Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak

bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil

giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun

yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini

sağlamaktadır (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

13

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar

Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin

olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin

ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim

suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından

tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine

ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara

sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar

sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada

yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)

Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok

oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin

salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin

pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri

peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln

lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin

fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da

kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri

meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin

1998)

11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml

Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol

miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla

kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik

aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu

etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır

Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla

atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir

1 GİRİŞ

14

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı

Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri

uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki

guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol

accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre

dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından

parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film

sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında

olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis

denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen

fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen

damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri

sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama

yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan

derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve

Saleemuddin 1998)

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı

Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik

ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı

verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini

sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin

proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak

1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi

yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

15

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı

Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal

proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik

enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden

olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku

boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma

şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm

sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak

bulunan ve Ca+2

tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir

(Claus ve ark 1986)

Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde

edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların

accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve

meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan

yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı

Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az

duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu

amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır

Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da

yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa

rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik

olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde

kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)

12 Bacillus Cinsi

Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde

endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek

başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan

huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998

Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir

1 GİRİŞ

16

ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış

goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı

enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda

kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum

37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli

enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi

duumlşuumlnuumllmektedirler

Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak

tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen

karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun

basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin

duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde

olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık

donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik

tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)

Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil

aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı

bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının

dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler

(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla

sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus

bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak

amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst

kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda

olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)

121 Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli

enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen

saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram

pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)

Sedat KAYA

17

Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip

amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan

oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın

olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis

kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen

diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri

(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu

2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)

Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel

farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında

değişmektedir (Akcan 2009)

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği

Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda

katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır

(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde

umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu

nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan

mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında

bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole

edilmiştir (Singhania ve ark 2009)

Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri

uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar

buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı

uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel

fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil

kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak

buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait

ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml

peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek

1 GİRİŞ

18

verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının

uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer

olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize

edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)

Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler

alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik

olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda

kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren

biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı

maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml

bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)

SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar

kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu

pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır

unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar

kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark

2009)

Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF

genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir

SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların

SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite

goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan

mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli

avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece

ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte

ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin

kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet

ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla

biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi

oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek

kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)

Sedat KAYA

19

SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum

koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH

inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen

azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)

Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda

SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat

olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin

SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)

SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır

1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir

2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak

kullanılır (Nigam ve Singh 1994)

1 GİRİŞ

20

Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)

ABİYOLOJİK UYGULAMALARI

MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı

Hz İsa‟nın doğumundan

oumlnce Asya‟da

Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den

yararlanılmıştır

MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma

MOuml 1500 Koji işlemi

7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi

18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı

18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit

kullanımı

1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri

1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit

1920-1940

Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal

enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin

gerccedilekleştirilmesi

1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen

olağanuumlstuuml gelişme

1950-1960

Steroid transformasyonu

1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan

yemlerinin uumlretimi

1980-1990

Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi

column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri

ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar

1990-Guumlnuumlmuumlze kadar

SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler

biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki

ilerlemeler

Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım

enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu

biyotranformasyonlar

Sedat KAYA

21

B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER

Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon

ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin

oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin

Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit

Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-

ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik

noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz

feruloil para-kaumaroil esteraz

Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit

Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol

aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar

biyopestisitlerbiyoherbisitler

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları

SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre

belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır

SSF‟in daha fazla verime sahip olması

SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır

Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır

Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-

Guerra ve ark 2003)

Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar

Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)

Koumlpuumlklenmenin olmaması

Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik

Daha basit fermantasyon ortamı

Daha kolay havalandırma

1 GİRİŞ

22

Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım

Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)

Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği

Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası

Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet

Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren

yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması

Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda

otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya

gereksinim yoktur

Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir

Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)

SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş

mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha

guumlvenilirdir

Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile

karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar

Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon

Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması

Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması

Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar

Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi

Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması

Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması

Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi

Sedat KAYA

23

Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama

homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)

Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması

zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin

tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)

Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur

Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk

oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-

Guerra ve ark 2003)

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler

Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)

1 Biyolojik faktoumlrler

2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

1321 Biyolojik Faktoumlrler

Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve

uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli

tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)

Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir

Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan

uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler

1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli

faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi

sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon

kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein

sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme

işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin

eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

24

Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde

gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi

protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin

induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi

şeklindedir

Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu

nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak

nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir

Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır

SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan

biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile

sağlanabilir

Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey

alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok

kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok

mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme

meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller

kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha

etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan

oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml

belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Sedat KAYA

25

2 KAYNAK OumlZETLERİ

Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den

elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH

aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH

85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır

Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı

duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen

Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini

uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk

molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln

inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak

kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir

Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik

bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler

Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz

mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1

NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı

kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr

kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda

elde edilmiştir

Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından

izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719

suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın

azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği

belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+

ve

Cu2+

iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir

Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali

proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini

karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı

olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir

2 KAYNAK OumlZETLERİ

26

Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini

baskıladığını tespit etmişlerdir

Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis

Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi

mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip

proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH

60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir

Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip

ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek

amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki

izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit

etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir

Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak

belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir

Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday

kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini

buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum

enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu

05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC

250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite

goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de

goumlzlenmiştir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve

buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir

Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim

aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak

buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık

başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm

hacmi 20 olarak rapor etmişler

Sedat KAYA

27

Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya

proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak

bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin

proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu

kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini

20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70

olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla

iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir

Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin

alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC

olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir

Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil

olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler

Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz

uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı

Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak

proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi

kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi

gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen

enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı

olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum

436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak

belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu

kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak

belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF

youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir

Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından

izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı

substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona

bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen

2 KAYNAK OumlZETLERİ

28

karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır

Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve

sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini

goumlstermektedir

Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde

yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda

kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada

katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar

ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF

youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde

etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini

olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2

ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve

maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu

etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr

Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi

aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya

ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla

artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot

kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim

uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon

suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir

Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve

kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit

etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz

uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta

ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve

amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır

Sedat KAYA

29

Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan

ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize

edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite

(2560 U ml-1

) değeri 48 saatten sonra (g-1

) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4

1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin

proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında

stabilite goumlstermiştir

Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum

kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir

Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas

aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin

bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir

(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz

aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟

da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz

uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak

pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz

aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu

sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken

yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir

Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis

DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak

atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı

patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin

hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi

patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve

Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da

yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve

maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz

uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi

2 KAYNAK OumlZETLERİ

30

37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen

enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu

goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu

sonuccedillar alınacağı umulmaktadır

Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis

N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3

K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında

gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve

yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren

ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz

uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları

96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10

mM Ca2+

iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini

korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve

pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween

65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda

muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135

ve 126 oranlarında koruyabilmiştir

Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1

tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin

optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin

proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı

test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur

Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite

goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde

oumlzellikle Ca2+

Mg2+

ve Cu2+

bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan

inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden

olduğunu tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

31

Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar

katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma

ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda

enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug

ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil

nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi

22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot

kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug

yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide

bulunduğunu belirlemişlerdir

Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum

aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu

ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+

Mg2+

ve

Mn2+

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+

‟nin olumsuz

etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan

derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini

yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20

Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol

ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden

olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini

goumlzlemlemişlerdir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık

materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı

substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla

uumlretim gerccedilekleştirmiştir

Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi

ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday

kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil

olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca

+2

2 KAYNAK OumlZETLERİ

32

ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg

+2 Cu

+2 Fe

+2 Co

+2 ve Zn

+2 iyonları ise

aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe

ederken Cu+2

iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın

metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir

Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi

iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi

iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim

uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla

uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk

olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti

Ca2+

ve Mg2+

kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin

optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin

pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+

ve Ca2+

iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa

olarak tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

33

3 MATERYAL ve METOT

31 Materyal

311 Kullanılan kimyasal maddeler

Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum

dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit

(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat

sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de

Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir

3111 Azot kaynakları

Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract

MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir

3112 Karbon kaynakları

Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den

temin edilmiştir

3113 Deterjanlar

Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan

temin edilmiştir

3114 Metal tuzları

FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de

Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir

3115 Besi yeri maddeleri

Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone

ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir

3 MATERYAL ve METOD

34

312 Kullanılan aletler

İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)

Steril Kabin ( Telstar AV-100)

Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)

Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)

Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)

Vorteks (Stuart) (VWR International )

Magnetik Karıştırıcı (Stuart)

Deep-Freeze (Haris -70ordmC)

Etuumlv (Heraus)

Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)

Otoklav (HIRAYAMA)

Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)

pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)

Sterilizatoumlr (Heraus)

Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)

313 Biyolojik materyal

Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis

ATCC 14580 suşu kullanılmıştır

314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması

Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine

ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda

kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı

Sedat KAYA

35

315 Substrat seccedilimi

Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday

kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi

kullanılmıştır

316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml

Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil

kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı

elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı

substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı

317 Kullanılan Besiyerleri

Sıvı besiyeri

Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf

suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi

sağlandıktan sonra otoklavlandı

Katı besiyeri

10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya

tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

SmF besiyeri

02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler

iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı

016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

3 MATERYAL ve METOD

36

318 SSF besiyeri

Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki

eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde

substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer

iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi

121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye

gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona

bırakıldı

Sedat KAYA

37

32 METOT

321 Mikroorganizma Uumlretimi

Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi

katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona

bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve

NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı

İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı

Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik

erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek

mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi

Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de

150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin

sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan

arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı

322 Ccediloumlzeltiler

Ccediloumlzeltilerin hazırlanması

Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması

pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml

01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan

sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

3 MATERYAL ve METOD

38

pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

Alkalin Ccediloumlzeltisi

4 Na2CO3

4 Na-K tartarat

2 CuSO4

Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde

hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları

sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı

Azo-kazein hazırlanması

005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi

sağlanarak hazırlandı

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu

Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri

ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre

sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5

dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant

uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı

324 Proteaz Aktivite Tayini

Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein

(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu

suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de

bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi

1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile

gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)

Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan

enzim miktarı olarak tanımlandı

Sedat KAYA

39

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi

Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu

arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu

substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave

edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı

NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave

edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar

inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce

oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF

besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı

santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı

(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı

326 Protein Miktar Tayini

Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak

Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen

(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin

protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı

Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl

saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra

uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek

30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm

yapıldı (Lowry ve ark 1951)

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin

Etkisi

SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek

iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri

yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı

3 MATERYAL ve METOD

40

İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika

santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere

aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı

Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml

ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim

kaynağı olarak kullanıldı

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin

Etkisi

Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere

konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha

sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra

37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96

120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi

belirlendi

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml

bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi

uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat

sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon

(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan

1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)

eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril

sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst

sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Sedat KAYA

41

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35

37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten

sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı

pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı

Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav

sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF

besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g

2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak

inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından

aktivite tayini yapıldı

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı

besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi

yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda

ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak

eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen

materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp

proteaz aktivite tayini yapıldı

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

3 MATERYAL ve METOD

42

Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki

atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası

her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra

farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan

oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat

Karışımının Belirlenmesi

Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24

saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır

kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g

2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların

her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi

yapıldı

Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda

SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı

olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki

Substratın Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu

subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra

inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki

substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat

kullanıldı

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının

Etkisi

Sedat KAYA

43

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon

kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten

sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp

100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine

eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı

Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun

ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde

edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot

kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp

hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF

ortamlarına eklenerek otoklavlandı

Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim

yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının

Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01

olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2

001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip

otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi

yapıldı

Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

3 MATERYAL ve METOD

44

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon

başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki

sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık

belirlenmeye ccedilalışıldı

Sedat KAYA

45

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı

arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de

goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Pirinccedil

Kab

uğu

Mer

cim

ek K

abuğ

u

Mıs

ır K

uumlspe

si

Arp

a K

abuğ

u

Buğ

day

Kab

uğu

Pam

uk K

abuğ

u

Sp

esif

ik A

ktiv

ite(

Um

g

24

48

72

96

120

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF

ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz

uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu

ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite

değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk

kabuğunda elde edilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

46

42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk

oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg

olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte

goumlre azaldığı belirlenmiştir

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

12 24 48 72 96 120

Zaman

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

um

g)

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Sedat KAYA

47

43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı

substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl

1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme

suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı

olarak kullanıldı

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Saf su

Ccedileş

me

suyu

NaC

I

Tris-

HCl p

H9

SDS

Tw

een-

80

Trit

onX

100

Ekstraksiyon ortamı (10 ml)

Sp

esif

ik A

kti

vit

e (U

mg

)

Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon

ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana

getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk

proteaz uumlretimine rastlanıldı

44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı

SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin

SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz

aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)

olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

48

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 30 35 37 40 45 50 55

İnkubasyon sıcaklıgı (degC)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin

mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan

ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80

(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

4 5 6 7 8 9 10pH

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi

Sedat KAYA

49

46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi

iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı

ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı

arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde

edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

10 20 30 40 50 60 70

Nem seviyesi ()

Sesi

fik

ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi

47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

50

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1 2 3 4 5 6 8

İnokulum (ml)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında

(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi

iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

60 100 120 150 180 200

Ccedilalkalama hızı (rpm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Sedat KAYA

51

49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının

Belirlenmesi

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil

kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında

maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 g pk +

05 g mk

20 g pk + 10

g mk

15 g pk + 15

g mk

10 g pk + 20

g mk

05 g pk+ 25

g mk

Mısır

Kuumlspesi 3 g

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi

mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu

410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın

Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı

partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da

goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta

1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

52

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

500 1000 1500

Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi

411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz

suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda

(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz

Karbon Kaynakaları (1)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Sedat KAYA

53

412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton

maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave

edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Kon

trol

Et oumlzuuml

tuuml

Kaz

ein

Pepto

n

Tripto

n

May

a oumlz

uumltuuml

Am

onyu

m n

itrat

Am

onyu

m suumll

fat

Am

onyu

m k

lorid

Azot Kaynakları (1)

Spes

ifik

Akti

vit

e (U

mg)

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi

413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen

01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen

Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)

ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi

Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe

edilmiştir (Şekil 43)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

54

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum

suumllfat

Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat

Metal Tuzları ( 01)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi

414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini

belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50

60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı

Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te

goumlsterilmiştir

0

20

40

60

80

100

120

15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90

Sıcaklık (degC)

Roumlla

tif

Akti

vit

e

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Sedat KAYA

55

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda

oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal

formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler

azaldığından dolayı da avantajlıdır

Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat

olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller

enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde

olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de

kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)

Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde

gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal

olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal

bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)

SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir

faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi

atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda

da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel

olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)

Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz

uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr

edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca

zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri

mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış

olabilir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF

youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En

iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

56

Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı

ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde

elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde

etmişlerdir

Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam

bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon

suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon

ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda

enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan

kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi

sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)

Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte

1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki

ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)

Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında

enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark

(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle

kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir

Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve

bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk

solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi

fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)

Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli

bir farktoumlrduumlr

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı

substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi

ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme

suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme

yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te

Sedat KAYA

57

amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila

oumlnemlidir

Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz

aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)

Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada

proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından

elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan

ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark

1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile

45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996

Gangadharan ve ark 2006)

SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın

gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından

ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat

fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve

mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık

aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)

Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık

literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır

İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder

metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol

accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı

ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve

Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda

kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri

besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık

biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak

kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

58

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil

pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak

tespit edilmiştir (Şekil 45)

pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen

bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması

gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar

Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını

oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de

etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı

değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol

oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir

Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla

kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine

başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik

goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)

Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor

edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit

edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek

pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan

enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde

kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)

Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz

aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit

etmişlerdir

Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil

pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit

edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği

yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak

goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)

Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-

110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite

Sedat KAYA

59

goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği

alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır

Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH

değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi

GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu

belirtmişlerdir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat

olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin

yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat

miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor

edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark

2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda

nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar

Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve

metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını

optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de

değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk

olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve

enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında

ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi

nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve

substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)

bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz

sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

60

İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile

ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin

azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm

hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen

uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar

(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak

yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve

katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi

azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005

Chutmanop ve ark 2008)

Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun

inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus

sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit

etmşlerdir

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)

olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile

paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda

60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin

azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı

substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta

yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde

etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma

fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama

yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir

Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları

farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm

olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon

sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri

huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava

Sedat KAYA

61

akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan

enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim

denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı

fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan

zayıf havalandırma oranına neden olabilir

Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler

alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin

mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF

koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm

ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil

kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum

enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)

Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak

SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve

Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark

2009 Tanyıldızı ve ark 2007)

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk

partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil

410)

Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel

olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar

ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat

parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum

havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay

goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk

partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk

parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

62

iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği

ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay

metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde

etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları

bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim

sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup

bulunmaması ile ilişkilidir

Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle

formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel

tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı

tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların

beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en

buumlyuumlk besin kaynağıdır

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite

değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış

goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005

Mukherjee ve ark 2009)

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından

kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)

Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde

bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr

etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az

olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki

fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

Sedat KAYA

63

aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de

goumlsterilmiştir

Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel

suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade

edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi

azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin

besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini

vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili

ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki

ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve

ark 1995)

Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et

ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır

Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)

ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları

bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini

olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların

substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir

Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim

maliyetini azaltmaktadır

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01

konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis

ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)

iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal

tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır

Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında

eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik

ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)

Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin

bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak

kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

64

B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti

azalabilir

Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde

edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+

ve Hg2+

iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır

Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2

Mg+2

ve Mn+2

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu

etkilerken Cu+2

nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir

Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr

ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim

uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)

İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten

dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir

Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme

ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye

başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve

ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal

atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında

enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha

fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların

kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir

SEDAT KAYA

65

6 KAYNAKLAR

Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi

Science 43(4) 257-262

Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis

Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156

Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a

soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to

soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136

Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması

Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır

Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının

oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Ankara

Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-

Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-

glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110

Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource

Technology 64 175ndash183

Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548

Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase

from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food

Engineering 79 950-955

Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre

dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen

Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara

Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing

Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology

Advances 11 539ndash547

6 KAYNAKLAR

66

Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-

amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry

38 1665ndash1668

Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu

nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik

Enstituumlsuuml Kocaeli

Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-

tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus

licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768

Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable

Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial

Thecnology 32 294-304

Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A

Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process

Biochemistry 42 1150-1154

Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5

Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme

production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering

26 100-106

Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995

Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis

PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243

ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic

Bacteriology 1105ndash1141

Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid

protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial

Biotechnology 10 17ndash30

Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran

M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine

Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-

961

SEDAT KAYA

67

Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease

production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates

Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018

Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on

laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302

Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal

inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2

iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans

Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5

Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)

Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel

Konular ve Uygulamalar 14-15

Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003

Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal

Cleaner Production 11 533ndash611

Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid

state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil

Bioresource Technology 101 1385-1388

El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the

ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production

scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593

Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease

production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation

Process Biochemistry 40 1951ndash1956

Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice

spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402

Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra

cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544

Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996

Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and

characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332

Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry

69 18-28

6 KAYNAKLAR

68

Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of

Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132

Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid

Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology

Biotechnology 44 (2) 269ndash274

George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of

protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess

Engineering 16 381-382

Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara

Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-

amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616

Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular

approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32

Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva

R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition

2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22

Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable

enzymes Bioresource Technology 89 17-34

Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM

1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435

Biotechnology Letters 19 675ndash712

He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-

like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326

Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline

proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1

Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical

Engineering 4771-79

Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic

bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36

415- 424

Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231

SEDAT KAYA

69

John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16

Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate

for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in

a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144

Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant

alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula

leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447

Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis

of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65

150ndash153

Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile

ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Diyarbakır

Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and

characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal

Microbiology Biotechnology 32 335-344

Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms

aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785

Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995

Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and

stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri

Apply Environment Microbiology 61 3098-3104

Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase

Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial

Biotechnology 46 106-111

Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial

viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594

Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For

Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729

Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease

From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-

1705

6 KAYNAKLAR

70

Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and

Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672

Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State

Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr

Bioengineering 100 168ndash17

Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a

bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422

Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical

Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus

subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39

Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various

chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229

Turkish Journal of Biology 99-103

Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined

Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular

Biology 235 1560-1584

Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and

optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp

CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537

Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine

Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis

Journal Moleculer Biology 76 103-122

Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic

enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14

Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A

in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and

Purification 57 01ndash107

Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production

of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661

Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for

improvement Trends in Food Science and Technology 8 339

SEDAT KAYA

71

Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin

phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275

Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase

production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and

Microbial Technology 39 56ndash59

Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5

Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent

tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as

substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735

Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel

substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF

Process Biochemistry 45 47-53

Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an

alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654

Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline

protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203

Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83

Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a

thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate

Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of

enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361

Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under

solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and

Biotechnology 84 (8) 1246-1249

Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices

Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78

Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium

composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis

N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394

Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular

α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203

6 KAYNAKLAR

72

Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state

fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90

Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995

Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264

Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their

applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423

Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by

Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab

shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10

Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash

performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal

Microbiology Biotechnology 17 493ndash497

Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from

Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779

Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen

proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara

Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul

Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State

Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169

Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84

Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in

solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology

16 578-584

Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid

substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource

Technology 97 (1) 171-177

Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization

of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state

Fermentation 33-183-189

VII

CcedilİZELGE LİSTESİ

Ccedilizelge No Sayfa

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3

Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama

Alanları ve Uumlreticileri 10

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11

Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20

VIII

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil No Sayfa

Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5

Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46

Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48

Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50

Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50

Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51

Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54

IX

KISALTMA VE SİMGELER

SSF Katı faz fermantasyonu

SmF Submerged fermentasyonu

YE Maya Oumlzuumltuuml

NB Nutrienth Broth

LB Laura Broth

IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği

RGPW Red Gram Plant Waste

TCA Trikloroasetikasit

CSL Corn Speed Luquor

pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı

aw Su aktivite faktoumlruuml

SDS Sodyum dodesil suumllfat

BSA Bovim serum albuumlmin

CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr

CuCl2 Bakır kloruumlr

MgCl2 Magnezyum kloruumlr

ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr

FeCl2 Demir kloruumlr

MnCl2 Mangan kloruumlr

NaCl Sodyum kloruumlr

Na2CO3 Sodyum karbonat

CuSO4 Bakır suumllfat

MgSO4 Magnezyum suumllfat

NaOH Sodyum hidroksit

(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat

Sedat KAYA

1

1GİRİŞ

11 Enzimler

Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve

organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere

enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların

yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten

şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir

molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)

Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar

farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil

olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783

yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek

kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere

doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden

elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını

saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları

hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini

ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili

Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz

enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)

Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim

piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı

beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini

karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır

Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda

organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan

2008)

Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan

bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel

katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

2

Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve

enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen

enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark

2005)

Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı

Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan

bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine

yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik

accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim

uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip

Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim

şartları belirlenecektir

112 Proteazlar

Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını

katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir

Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik

2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı

fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde

hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee

ve ark 2008)

İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok

uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)

Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin

proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler

10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde

bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin

edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere

yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark

1994 Schrerier 1997)

Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak

sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik

Sedat KAYA

3

oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan

ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve

ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları

deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık

arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde

peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir

kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)

Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde

edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında

kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim

pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları

ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)

Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri

Bakteriler

Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan

Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan

Bacillus firmus Alkalin Deterjan

Bacillus megaterium Alkalin Deterjan

Bacillus pumulis Alkalin Deterjan

Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan

Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan

Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda

Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda

Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda

Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda

Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda

Mantarlar

Aspergillus niger Alkalin Deterjan

Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus flavus Alkalin Deterjan

Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda

Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda

Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda

Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda

1 GİRİŞ

4

1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri

Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein

sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir

yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır

Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları

katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar

saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile

proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip

olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)

Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel

gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu

enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda

karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek

değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)

Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre

duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar

Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin

sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin

gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000

Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı

enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli

metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)

1122 Proteazların Sınıflandırılması

Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve

adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere

iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr

Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve

endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark

1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir

Sedat KAYA

5

Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel

gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein

proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar

(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)

Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral

proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)

1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri

Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca

peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha

sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)

1- Reaksiyon katalizi

2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı

3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler

Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir

Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)

1 GİRİŞ

6

Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml

katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin

proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)

ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak

bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar

11231 Ekzopeptidazlar

Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit

bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden

ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler

ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk

peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının

hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler

Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek

karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil

karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid

bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)

11232 Endopeptidazlar

Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan

peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana

ve ark 1995)

Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve

histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde

serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve

ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları

nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH

değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll

ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)

Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein

(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile

karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif

Sedat KAYA

7

merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside

edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir

Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin

katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH

değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır

Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara

goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar

aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların

yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2

) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat

yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali

miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve

ark 1998)

1124 Proteazların Etki Mekanizması

İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında

bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir

su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına

Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana

gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların

etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır

Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)

1 GİRİŞ

8

1125 Proteaz Kaynakları

Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda

bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik

goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları

olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları

birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri

kazanımları kolaydır (Pandey 2006)

Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve

ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği

belirtilmektedir

1126 Proteaz Uumlretimi

Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun

(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim

uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir

Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama

alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)

Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri

gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim

gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda

membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik

uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına

youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve

ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz

fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler

(Haki ve Rakshit 2003)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve

durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların

uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi

kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun

Sedat KAYA

9

şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize

edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma

inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz

sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar

Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli

kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla

kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli

ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks

hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri

tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca

Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar

uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli

oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu

enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)

Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri

belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal

kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla

değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi

alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge

12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri

goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların

varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli

kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)

1 GİRİŞ

10

Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve

uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)

Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal

Kaynak

Uygulama Alanı

Novo Nordisk

Danimarka

Alcalase

Savinase

Esparase

Biofeed pro

Durazym

Novozyme47 1MP

Novozyme 243

Nue

B licheniformis

Bacillus sp

B lentus

B licheniformis

Bacillus sp

Belirtilmiyor

B licheniformis

Bacillus sp

Deterjan ipek

Deterjan tekstil

Deterjan gıda ipek

Yem

Deterjan

Fotoğraf

Deri

Genencor

International

ABD

Purafact

Primatan

B lentus

Bakteriyel

Kaynaklı

Deterjan

Deri

Gist-Brocades

Hollanda

Subtilisin

Maxacal

Maxatase

B alcalophilus

Bacillus sp

Bacillus sp

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Solvay Enzymes

Almanya

Opticlean

Optimase

Maxapem

HT-proteolytic

Protease

B alcalophilus

B licheniformis

Bacillus spnin

Protein

muumlhendisliği ile

uumlretilmiş varyantı

B sublilis

B licheniformis

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Alkol iccedilki ekmek

yem gıda deri

fotoğrafik atık

Gıda atık

Amano

Pharmaceuticals

Japonya

Proleather

Collagenas

Amano protease S

Bacillus sp

Clostrodium sp

Bacillus sp

Gıda

Teknik

Gıda

Enzyme

Development

ABD

Enzeco alkaline

protease-L FG

Enzeco high

alkaline protease

B licheniformis

B licheniformis

Bacillus sp

Teknik

Gıda

Enduumlstriyel

Nagase

Biochemicals

Japonya

Bioprase

concantrate

Ps Protease

Ps Elastase

CrystProtease

CrystProtease

Bioprase

Bioprase SP-10

B sublilis

P aeruginoso

P aeruginoso

B subtilis(K2)

Bsubtilis(bioteus)

B sublilis

B sublilis

Kozmetik

farmasoumltik

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Deterjan temizlik

Gıda

Jodo Shusei Japonya Codo Bap

B licheniformis Deterjan gıda

Rohm Almanya Corolase 7089

B sublilis Gıda

Sedat KAYA

11

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları

Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002

Pandey 2004)

Enduumlstri

Proteaz Uygulama

Ekmek yapımı Noumltral proteaz

Hamur kalitesini arttırma

İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme

iccedileceklerde bulanıklığın

giderilmesi

Mandıra

Fungal proteazlar simozin

diğer proteazlar

Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt

suyunun işlenmesi modifiye

peynir enzim uumlretimi

Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin

uzaklaştırılması

Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday

gluteni gibi zengin protein

metaryallerinin modifikasyonu

Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden

tuumlylerin uzaklaştırılması

Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve

balık atıklarından protein eldesi

Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması

kan pıhtısını ccediloumlzme doku

iltihaplarının azaltılması tıbbı

uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt

lensler ve takma dişlerin

temizlenmesi

Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf

filmlerinden guumlmuumlş eldesi

Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers

Hidroliz

Enduumlstriyel ve Evsel

Atıkların İşlenmesi

Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel

faaliyetler sonucu meydana gelen

atıkların işlenmesi

1 GİRİŞ

12

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde

patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960

yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar

guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus

alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar

uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı

madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır

(Dağaşan 1997)

Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı

maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta

ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı

maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları

ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler

kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki

kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her

tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi

protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)

11282 Fırında Pişirme Uygulamaları

Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave

edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması

sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun

makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri

ve ark 2002)

Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik

olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır

Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak

bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil

giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun

yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini

sağlamaktadır (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

13

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar

Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin

olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin

ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim

suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından

tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine

ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara

sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar

sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada

yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)

Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok

oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin

salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin

pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri

peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln

lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin

fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da

kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri

meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin

1998)

11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml

Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol

miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla

kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik

aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu

etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır

Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla

atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir

1 GİRİŞ

14

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı

Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri

uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki

guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol

accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre

dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından

parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film

sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında

olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis

denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen

fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen

damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri

sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama

yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan

derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve

Saleemuddin 1998)

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı

Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik

ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı

verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini

sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin

proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak

1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi

yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

15

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı

Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal

proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik

enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden

olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku

boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma

şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm

sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak

bulunan ve Ca+2

tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir

(Claus ve ark 1986)

Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde

edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların

accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve

meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan

yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı

Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az

duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu

amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır

Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da

yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa

rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik

olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde

kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)

12 Bacillus Cinsi

Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde

endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek

başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan

huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998

Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir

1 GİRİŞ

16

ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış

goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı

enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda

kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum

37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli

enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi

duumlşuumlnuumllmektedirler

Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak

tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen

karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun

basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin

duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde

olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık

donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik

tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)

Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil

aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı

bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının

dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler

(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla

sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus

bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak

amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst

kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda

olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)

121 Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli

enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen

saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram

pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)

Sedat KAYA

17

Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip

amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan

oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın

olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis

kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen

diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri

(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu

2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)

Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel

farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında

değişmektedir (Akcan 2009)

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği

Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda

katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır

(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde

umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu

nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan

mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında

bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole

edilmiştir (Singhania ve ark 2009)

Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri

uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar

buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı

uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel

fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil

kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak

buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait

ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml

peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek

1 GİRİŞ

18

verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının

uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer

olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize

edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)

Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler

alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik

olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda

kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren

biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı

maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml

bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)

SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar

kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu

pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır

unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar

kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark

2009)

Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF

genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir

SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların

SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite

goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan

mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli

avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece

ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte

ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin

kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet

ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla

biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi

oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek

kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)

Sedat KAYA

19

SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum

koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH

inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen

azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)

Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda

SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat

olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin

SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)

SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır

1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir

2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak

kullanılır (Nigam ve Singh 1994)

1 GİRİŞ

20

Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)

ABİYOLOJİK UYGULAMALARI

MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı

Hz İsa‟nın doğumundan

oumlnce Asya‟da

Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den

yararlanılmıştır

MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma

MOuml 1500 Koji işlemi

7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi

18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı

18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit

kullanımı

1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri

1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit

1920-1940

Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal

enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin

gerccedilekleştirilmesi

1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen

olağanuumlstuuml gelişme

1950-1960

Steroid transformasyonu

1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan

yemlerinin uumlretimi

1980-1990

Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi

column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri

ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar

1990-Guumlnuumlmuumlze kadar

SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler

biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki

ilerlemeler

Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım

enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu

biyotranformasyonlar

Sedat KAYA

21

B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER

Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon

ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin

oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin

Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit

Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-

ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik

noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz

feruloil para-kaumaroil esteraz

Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit

Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol

aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar

biyopestisitlerbiyoherbisitler

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları

SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre

belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır

SSF‟in daha fazla verime sahip olması

SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır

Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır

Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-

Guerra ve ark 2003)

Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar

Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)

Koumlpuumlklenmenin olmaması

Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik

Daha basit fermantasyon ortamı

Daha kolay havalandırma

1 GİRİŞ

22

Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım

Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)

Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği

Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası

Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet

Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren

yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması

Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda

otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya

gereksinim yoktur

Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir

Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)

SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş

mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha

guumlvenilirdir

Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile

karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar

Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon

Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması

Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması

Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar

Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi

Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması

Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması

Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi

Sedat KAYA

23

Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama

homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)

Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması

zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin

tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)

Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur

Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk

oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-

Guerra ve ark 2003)

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler

Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)

1 Biyolojik faktoumlrler

2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

1321 Biyolojik Faktoumlrler

Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve

uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli

tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)

Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir

Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan

uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler

1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli

faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi

sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon

kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein

sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme

işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin

eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

24

Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde

gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi

protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin

induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi

şeklindedir

Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu

nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak

nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir

Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır

SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan

biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile

sağlanabilir

Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey

alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok

kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok

mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme

meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller

kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha

etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan

oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml

belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Sedat KAYA

25

2 KAYNAK OumlZETLERİ

Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den

elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH

aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH

85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır

Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı

duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen

Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini

uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk

molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln

inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak

kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir

Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik

bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler

Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz

mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1

NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı

kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr

kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda

elde edilmiştir

Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından

izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719

suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın

azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği

belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+

ve

Cu2+

iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir

Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali

proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini

karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı

olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir

2 KAYNAK OumlZETLERİ

26

Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini

baskıladığını tespit etmişlerdir

Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis

Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi

mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip

proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH

60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir

Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip

ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek

amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki

izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit

etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir

Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak

belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir

Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday

kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini

buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum

enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu

05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC

250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite

goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de

goumlzlenmiştir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve

buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir

Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim

aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak

buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık

başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm

hacmi 20 olarak rapor etmişler

Sedat KAYA

27

Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya

proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak

bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin

proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu

kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini

20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70

olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla

iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir

Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin

alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC

olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir

Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil

olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler

Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz

uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı

Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak

proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi

kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi

gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen

enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı

olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum

436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak

belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu

kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak

belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF

youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir

Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından

izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı

substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona

bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen

2 KAYNAK OumlZETLERİ

28

karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır

Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve

sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini

goumlstermektedir

Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde

yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda

kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada

katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar

ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF

youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde

etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini

olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2

ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve

maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu

etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr

Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi

aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya

ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla

artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot

kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim

uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon

suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir

Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve

kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit

etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz

uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta

ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve

amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır

Sedat KAYA

29

Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan

ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize

edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite

(2560 U ml-1

) değeri 48 saatten sonra (g-1

) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4

1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin

proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında

stabilite goumlstermiştir

Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum

kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir

Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas

aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin

bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir

(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz

aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟

da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz

uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak

pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz

aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu

sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken

yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir

Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis

DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak

atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı

patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin

hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi

patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve

Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da

yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve

maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz

uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi

2 KAYNAK OumlZETLERİ

30

37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen

enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu

goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu

sonuccedillar alınacağı umulmaktadır

Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis

N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3

K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında

gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve

yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren

ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz

uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları

96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10

mM Ca2+

iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini

korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve

pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween

65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda

muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135

ve 126 oranlarında koruyabilmiştir

Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1

tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin

optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin

proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı

test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur

Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite

goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde

oumlzellikle Ca2+

Mg2+

ve Cu2+

bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan

inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden

olduğunu tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

31

Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar

katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma

ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda

enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug

ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil

nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi

22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot

kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug

yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide

bulunduğunu belirlemişlerdir

Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum

aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu

ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+

Mg2+

ve

Mn2+

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+

‟nin olumsuz

etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan

derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini

yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20

Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol

ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden

olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini

goumlzlemlemişlerdir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık

materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı

substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla

uumlretim gerccedilekleştirmiştir

Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi

ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday

kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil

olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca

+2

2 KAYNAK OumlZETLERİ

32

ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg

+2 Cu

+2 Fe

+2 Co

+2 ve Zn

+2 iyonları ise

aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe

ederken Cu+2

iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın

metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir

Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi

iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi

iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim

uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla

uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk

olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti

Ca2+

ve Mg2+

kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin

optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin

pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+

ve Ca2+

iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa

olarak tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

33

3 MATERYAL ve METOT

31 Materyal

311 Kullanılan kimyasal maddeler

Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum

dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit

(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat

sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de

Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir

3111 Azot kaynakları

Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract

MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir

3112 Karbon kaynakları

Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den

temin edilmiştir

3113 Deterjanlar

Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan

temin edilmiştir

3114 Metal tuzları

FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de

Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir

3115 Besi yeri maddeleri

Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone

ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir

3 MATERYAL ve METOD

34

312 Kullanılan aletler

İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)

Steril Kabin ( Telstar AV-100)

Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)

Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)

Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)

Vorteks (Stuart) (VWR International )

Magnetik Karıştırıcı (Stuart)

Deep-Freeze (Haris -70ordmC)

Etuumlv (Heraus)

Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)

Otoklav (HIRAYAMA)

Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)

pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)

Sterilizatoumlr (Heraus)

Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)

313 Biyolojik materyal

Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis

ATCC 14580 suşu kullanılmıştır

314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması

Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine

ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda

kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı

Sedat KAYA

35

315 Substrat seccedilimi

Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday

kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi

kullanılmıştır

316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml

Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil

kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı

elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı

substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı

317 Kullanılan Besiyerleri

Sıvı besiyeri

Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf

suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi

sağlandıktan sonra otoklavlandı

Katı besiyeri

10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya

tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

SmF besiyeri

02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler

iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı

016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

3 MATERYAL ve METOD

36

318 SSF besiyeri

Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki

eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde

substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer

iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi

121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye

gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona

bırakıldı

Sedat KAYA

37

32 METOT

321 Mikroorganizma Uumlretimi

Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi

katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona

bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve

NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı

İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı

Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik

erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek

mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi

Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de

150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin

sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan

arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı

322 Ccediloumlzeltiler

Ccediloumlzeltilerin hazırlanması

Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması

pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml

01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan

sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

3 MATERYAL ve METOD

38

pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

Alkalin Ccediloumlzeltisi

4 Na2CO3

4 Na-K tartarat

2 CuSO4

Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde

hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları

sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı

Azo-kazein hazırlanması

005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi

sağlanarak hazırlandı

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu

Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri

ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre

sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5

dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant

uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı

324 Proteaz Aktivite Tayini

Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein

(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu

suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de

bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi

1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile

gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)

Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan

enzim miktarı olarak tanımlandı

Sedat KAYA

39

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi

Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu

arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu

substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave

edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı

NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave

edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar

inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce

oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF

besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı

santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı

(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı

326 Protein Miktar Tayini

Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak

Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen

(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin

protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı

Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl

saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra

uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek

30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm

yapıldı (Lowry ve ark 1951)

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin

Etkisi

SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek

iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri

yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı

3 MATERYAL ve METOD

40

İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika

santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere

aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı

Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml

ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim

kaynağı olarak kullanıldı

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin

Etkisi

Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere

konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha

sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra

37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96

120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi

belirlendi

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml

bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi

uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat

sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon

(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan

1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)

eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril

sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst

sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Sedat KAYA

41

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35

37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten

sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı

pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı

Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav

sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF

besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g

2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak

inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından

aktivite tayini yapıldı

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı

besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi

yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda

ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak

eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen

materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp

proteaz aktivite tayini yapıldı

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

3 MATERYAL ve METOD

42

Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki

atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası

her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra

farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan

oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat

Karışımının Belirlenmesi

Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24

saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır

kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g

2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların

her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi

yapıldı

Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda

SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı

olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki

Substratın Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu

subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra

inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki

substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat

kullanıldı

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının

Etkisi

Sedat KAYA

43

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon

kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten

sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp

100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine

eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı

Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun

ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde

edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot

kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp

hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF

ortamlarına eklenerek otoklavlandı

Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim

yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının

Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01

olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2

001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip

otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi

yapıldı

Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

3 MATERYAL ve METOD

44

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon

başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki

sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık

belirlenmeye ccedilalışıldı

Sedat KAYA

45

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı

arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de

goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Pirinccedil

Kab

uğu

Mer

cim

ek K

abuğ

u

Mıs

ır K

uumlspe

si

Arp

a K

abuğ

u

Buğ

day

Kab

uğu

Pam

uk K

abuğ

u

Sp

esif

ik A

ktiv

ite(

Um

g

24

48

72

96

120

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF

ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz

uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu

ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite

değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk

kabuğunda elde edilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

46

42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk

oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg

olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte

goumlre azaldığı belirlenmiştir

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

12 24 48 72 96 120

Zaman

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

um

g)

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Sedat KAYA

47

43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı

substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl

1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme

suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı

olarak kullanıldı

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Saf su

Ccedileş

me

suyu

NaC

I

Tris-

HCl p

H9

SDS

Tw

een-

80

Trit

onX

100

Ekstraksiyon ortamı (10 ml)

Sp

esif

ik A

kti

vit

e (U

mg

)

Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon

ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana

getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk

proteaz uumlretimine rastlanıldı

44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı

SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin

SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz

aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)

olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

48

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 30 35 37 40 45 50 55

İnkubasyon sıcaklıgı (degC)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin

mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan

ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80

(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

4 5 6 7 8 9 10pH

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi

Sedat KAYA

49

46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi

iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı

ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı

arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde

edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

10 20 30 40 50 60 70

Nem seviyesi ()

Sesi

fik

ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi

47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

50

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1 2 3 4 5 6 8

İnokulum (ml)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında

(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi

iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

60 100 120 150 180 200

Ccedilalkalama hızı (rpm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Sedat KAYA

51

49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının

Belirlenmesi

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil

kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında

maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 g pk +

05 g mk

20 g pk + 10

g mk

15 g pk + 15

g mk

10 g pk + 20

g mk

05 g pk+ 25

g mk

Mısır

Kuumlspesi 3 g

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi

mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu

410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın

Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı

partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da

goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta

1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

52

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

500 1000 1500

Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi

411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz

suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda

(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz

Karbon Kaynakaları (1)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Sedat KAYA

53

412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton

maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave

edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Kon

trol

Et oumlzuuml

tuuml

Kaz

ein

Pepto

n

Tripto

n

May

a oumlz

uumltuuml

Am

onyu

m n

itrat

Am

onyu

m suumll

fat

Am

onyu

m k

lorid

Azot Kaynakları (1)

Spes

ifik

Akti

vit

e (U

mg)

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi

413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen

01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen

Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)

ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi

Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe

edilmiştir (Şekil 43)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

54

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum

suumllfat

Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat

Metal Tuzları ( 01)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi

414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini

belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50

60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı

Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te

goumlsterilmiştir

0

20

40

60

80

100

120

15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90

Sıcaklık (degC)

Roumlla

tif

Akti

vit

e

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Sedat KAYA

55

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda

oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal

formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler

azaldığından dolayı da avantajlıdır

Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat

olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller

enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde

olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de

kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)

Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde

gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal

olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal

bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)

SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir

faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi

atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda

da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel

olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)

Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz

uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr

edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca

zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri

mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış

olabilir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF

youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En

iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

56

Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı

ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde

elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde

etmişlerdir

Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam

bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon

suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon

ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda

enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan

kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi

sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)

Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte

1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki

ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)

Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında

enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark

(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle

kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir

Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve

bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk

solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi

fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)

Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli

bir farktoumlrduumlr

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı

substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi

ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme

suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme

yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te

Sedat KAYA

57

amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila

oumlnemlidir

Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz

aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)

Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada

proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından

elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan

ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark

1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile

45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996

Gangadharan ve ark 2006)

SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın

gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından

ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat

fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve

mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık

aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)

Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık

literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır

İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder

metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol

accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı

ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve

Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda

kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri

besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık

biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak

kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

58

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil

pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak

tespit edilmiştir (Şekil 45)

pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen

bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması

gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar

Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını

oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de

etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı

değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol

oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir

Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla

kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine

başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik

goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)

Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor

edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit

edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek

pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan

enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde

kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)

Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz

aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit

etmişlerdir

Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil

pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit

edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği

yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak

goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)

Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-

110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite

Sedat KAYA

59

goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği

alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır

Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH

değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi

GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu

belirtmişlerdir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat

olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin

yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat

miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor

edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark

2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda

nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar

Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve

metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını

optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de

değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk

olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve

enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında

ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi

nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve

substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)

bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz

sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

60

İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile

ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin

azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm

hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen

uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar

(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak

yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve

katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi

azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005

Chutmanop ve ark 2008)

Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun

inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus

sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit

etmşlerdir

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)

olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile

paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda

60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin

azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı

substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta

yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde

etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma

fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama

yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir

Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları

farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm

olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon

sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri

huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava

Sedat KAYA

61

akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan

enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim

denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı

fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan

zayıf havalandırma oranına neden olabilir

Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler

alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin

mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF

koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm

ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil

kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum

enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)

Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak

SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve

Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark

2009 Tanyıldızı ve ark 2007)

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk

partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil

410)

Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel

olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar

ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat

parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum

havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay

goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk

partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk

parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

62

iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği

ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay

metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde

etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları

bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim

sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup

bulunmaması ile ilişkilidir

Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle

formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel

tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı

tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların

beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en

buumlyuumlk besin kaynağıdır

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite

değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış

goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005

Mukherjee ve ark 2009)

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından

kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)

Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde

bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr

etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az

olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki

fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

Sedat KAYA

63

aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de

goumlsterilmiştir

Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel

suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade

edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi

azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin

besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini

vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili

ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki

ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve

ark 1995)

Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et

ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır

Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)

ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları

bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini

olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların

substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir

Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim

maliyetini azaltmaktadır

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01

konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis

ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)

iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal

tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır

Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında

eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik

ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)

Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin

bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak

kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

64

B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti

azalabilir

Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde

edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+

ve Hg2+

iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır

Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2

Mg+2

ve Mn+2

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu

etkilerken Cu+2

nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir

Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr

ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim

uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)

İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten

dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir

Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme

ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye

başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve

ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal

atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında

enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha

fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların

kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir

SEDAT KAYA

65

6 KAYNAKLAR

Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi

Science 43(4) 257-262

Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis

Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156

Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a

soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to

soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136

Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması

Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır

Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının

oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Ankara

Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-

Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-

glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110

Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource

Technology 64 175ndash183

Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548

Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase

from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food

Engineering 79 950-955

Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre

dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen

Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara

Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing

Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology

Advances 11 539ndash547

6 KAYNAKLAR

66

Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-

amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry

38 1665ndash1668

Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu

nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik

Enstituumlsuuml Kocaeli

Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-

tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus

licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768

Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable

Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial

Thecnology 32 294-304

Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A

Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process

Biochemistry 42 1150-1154

Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5

Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme

production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering

26 100-106

Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995

Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis

PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243

ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic

Bacteriology 1105ndash1141

Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid

protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial

Biotechnology 10 17ndash30

Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran

M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine

Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-

961

SEDAT KAYA

67

Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease

production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates

Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018

Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on

laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302

Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal

inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2

iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans

Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5

Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)

Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel

Konular ve Uygulamalar 14-15

Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003

Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal

Cleaner Production 11 533ndash611

Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid

state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil

Bioresource Technology 101 1385-1388

El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the

ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production

scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593

Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease

production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation

Process Biochemistry 40 1951ndash1956

Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice

spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402

Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra

cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544

Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996

Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and

characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332

Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry

69 18-28

6 KAYNAKLAR

68

Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of

Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132

Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid

Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology

Biotechnology 44 (2) 269ndash274

George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of

protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess

Engineering 16 381-382

Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara

Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-

amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616

Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular

approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32

Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva

R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition

2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22

Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable

enzymes Bioresource Technology 89 17-34

Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM

1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435

Biotechnology Letters 19 675ndash712

He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-

like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326

Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline

proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1

Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical

Engineering 4771-79

Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic

bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36

415- 424

Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231

SEDAT KAYA

69

John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16

Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate

for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in

a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144

Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant

alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula

leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447

Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis

of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65

150ndash153

Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile

ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Diyarbakır

Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and

characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal

Microbiology Biotechnology 32 335-344

Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms

aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785

Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995

Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and

stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri

Apply Environment Microbiology 61 3098-3104

Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase

Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial

Biotechnology 46 106-111

Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial

viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594

Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For

Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729

Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease

From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-

1705

6 KAYNAKLAR

70

Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and

Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672

Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State

Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr

Bioengineering 100 168ndash17

Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a

bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422

Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical

Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus

subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39

Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various

chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229

Turkish Journal of Biology 99-103

Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined

Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular

Biology 235 1560-1584

Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and

optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp

CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537

Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine

Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis

Journal Moleculer Biology 76 103-122

Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic

enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14

Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A

in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and

Purification 57 01ndash107

Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production

of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661

Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for

improvement Trends in Food Science and Technology 8 339

SEDAT KAYA

71

Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin

phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275

Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase

production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and

Microbial Technology 39 56ndash59

Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5

Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent

tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as

substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735

Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel

substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF

Process Biochemistry 45 47-53

Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an

alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654

Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline

protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203

Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83

Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a

thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate

Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of

enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361

Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under

solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and

Biotechnology 84 (8) 1246-1249

Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices

Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78

Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium

composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis

N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394

Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular

α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203

6 KAYNAKLAR

72

Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state

fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90

Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995

Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264

Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their

applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423

Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by

Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab

shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10

Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash

performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal

Microbiology Biotechnology 17 493ndash497

Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from

Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779

Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen

proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara

Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul

Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State

Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169

Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84

Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in

solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology

16 578-584

Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid

substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource

Technology 97 (1) 171-177

Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization

of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state

Fermentation 33-183-189

VIII

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil No Sayfa

Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5

Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46

Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48

Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50

Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50

Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51

Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54

IX

KISALTMA VE SİMGELER

SSF Katı faz fermantasyonu

SmF Submerged fermentasyonu

YE Maya Oumlzuumltuuml

NB Nutrienth Broth

LB Laura Broth

IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği

RGPW Red Gram Plant Waste

TCA Trikloroasetikasit

CSL Corn Speed Luquor

pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı

aw Su aktivite faktoumlruuml

SDS Sodyum dodesil suumllfat

BSA Bovim serum albuumlmin

CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr

CuCl2 Bakır kloruumlr

MgCl2 Magnezyum kloruumlr

ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr

FeCl2 Demir kloruumlr

MnCl2 Mangan kloruumlr

NaCl Sodyum kloruumlr

Na2CO3 Sodyum karbonat

CuSO4 Bakır suumllfat

MgSO4 Magnezyum suumllfat

NaOH Sodyum hidroksit

(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat

Sedat KAYA

1

1GİRİŞ

11 Enzimler

Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve

organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere

enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların

yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten

şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir

molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)

Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar

farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil

olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783

yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek

kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere

doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden

elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını

saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları

hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini

ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili

Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz

enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)

Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim

piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı

beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini

karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır

Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda

organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan

2008)

Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan

bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel

katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

2

Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve

enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen

enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark

2005)

Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı

Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan

bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine

yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik

accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim

uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip

Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim

şartları belirlenecektir

112 Proteazlar

Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını

katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir

Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik

2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı

fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde

hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee

ve ark 2008)

İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok

uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)

Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin

proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler

10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde

bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin

edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere

yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark

1994 Schrerier 1997)

Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak

sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik

Sedat KAYA

3

oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan

ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve

ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları

deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık

arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde

peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir

kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)

Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde

edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında

kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim

pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları

ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)

Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri

Bakteriler

Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan

Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan

Bacillus firmus Alkalin Deterjan

Bacillus megaterium Alkalin Deterjan

Bacillus pumulis Alkalin Deterjan

Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan

Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan

Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda

Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda

Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda

Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda

Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda

Mantarlar

Aspergillus niger Alkalin Deterjan

Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus flavus Alkalin Deterjan

Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda

Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda

Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda

Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda

1 GİRİŞ

4

1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri

Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein

sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir

yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır

Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları

katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar

saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile

proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip

olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)

Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel

gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu

enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda

karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek

değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)

Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre

duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar

Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin

sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin

gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000

Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı

enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli

metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)

1122 Proteazların Sınıflandırılması

Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve

adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere

iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr

Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve

endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark

1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir

Sedat KAYA

5

Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel

gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein

proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar

(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)

Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral

proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)

1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri

Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca

peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha

sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)

1- Reaksiyon katalizi

2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı

3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler

Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir

Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)

1 GİRİŞ

6

Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml

katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin

proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)

ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak

bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar

11231 Ekzopeptidazlar

Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit

bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden

ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler

ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk

peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının

hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler

Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek

karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil

karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid

bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)

11232 Endopeptidazlar

Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan

peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana

ve ark 1995)

Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve

histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde

serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve

ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları

nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH

değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll

ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)

Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein

(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile

karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif

Sedat KAYA

7

merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside

edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir

Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin

katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH

değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır

Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara

goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar

aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların

yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2

) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat

yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali

miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve

ark 1998)

1124 Proteazların Etki Mekanizması

İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında

bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir

su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına

Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana

gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların

etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır

Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)

1 GİRİŞ

8

1125 Proteaz Kaynakları

Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda

bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik

goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları

olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları

birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri

kazanımları kolaydır (Pandey 2006)

Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve

ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği

belirtilmektedir

1126 Proteaz Uumlretimi

Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun

(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim

uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir

Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama

alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)

Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri

gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim

gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda

membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik

uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına

youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve

ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz

fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler

(Haki ve Rakshit 2003)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve

durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların

uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi

kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun

Sedat KAYA

9

şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize

edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma

inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz

sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar

Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli

kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla

kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli

ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks

hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri

tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca

Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar

uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli

oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu

enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)

Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri

belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal

kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla

değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi

alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge

12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri

goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların

varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli

kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)

1 GİRİŞ

10

Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve

uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)

Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal

Kaynak

Uygulama Alanı

Novo Nordisk

Danimarka

Alcalase

Savinase

Esparase

Biofeed pro

Durazym

Novozyme47 1MP

Novozyme 243

Nue

B licheniformis

Bacillus sp

B lentus

B licheniformis

Bacillus sp

Belirtilmiyor

B licheniformis

Bacillus sp

Deterjan ipek

Deterjan tekstil

Deterjan gıda ipek

Yem

Deterjan

Fotoğraf

Deri

Genencor

International

ABD

Purafact

Primatan

B lentus

Bakteriyel

Kaynaklı

Deterjan

Deri

Gist-Brocades

Hollanda

Subtilisin

Maxacal

Maxatase

B alcalophilus

Bacillus sp

Bacillus sp

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Solvay Enzymes

Almanya

Opticlean

Optimase

Maxapem

HT-proteolytic

Protease

B alcalophilus

B licheniformis

Bacillus spnin

Protein

muumlhendisliği ile

uumlretilmiş varyantı

B sublilis

B licheniformis

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Alkol iccedilki ekmek

yem gıda deri

fotoğrafik atık

Gıda atık

Amano

Pharmaceuticals

Japonya

Proleather

Collagenas

Amano protease S

Bacillus sp

Clostrodium sp

Bacillus sp

Gıda

Teknik

Gıda

Enzyme

Development

ABD

Enzeco alkaline

protease-L FG

Enzeco high

alkaline protease

B licheniformis

B licheniformis

Bacillus sp

Teknik

Gıda

Enduumlstriyel

Nagase

Biochemicals

Japonya

Bioprase

concantrate

Ps Protease

Ps Elastase

CrystProtease

CrystProtease

Bioprase

Bioprase SP-10

B sublilis

P aeruginoso

P aeruginoso

B subtilis(K2)

Bsubtilis(bioteus)

B sublilis

B sublilis

Kozmetik

farmasoumltik

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Deterjan temizlik

Gıda

Jodo Shusei Japonya Codo Bap

B licheniformis Deterjan gıda

Rohm Almanya Corolase 7089

B sublilis Gıda

Sedat KAYA

11

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları

Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002

Pandey 2004)

Enduumlstri

Proteaz Uygulama

Ekmek yapımı Noumltral proteaz

Hamur kalitesini arttırma

İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme

iccedileceklerde bulanıklığın

giderilmesi

Mandıra

Fungal proteazlar simozin

diğer proteazlar

Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt

suyunun işlenmesi modifiye

peynir enzim uumlretimi

Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin

uzaklaştırılması

Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday

gluteni gibi zengin protein

metaryallerinin modifikasyonu

Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden

tuumlylerin uzaklaştırılması

Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve

balık atıklarından protein eldesi

Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması

kan pıhtısını ccediloumlzme doku

iltihaplarının azaltılması tıbbı

uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt

lensler ve takma dişlerin

temizlenmesi

Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf

filmlerinden guumlmuumlş eldesi

Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers

Hidroliz

Enduumlstriyel ve Evsel

Atıkların İşlenmesi

Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel

faaliyetler sonucu meydana gelen

atıkların işlenmesi

1 GİRİŞ

12

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde

patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960

yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar

guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus

alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar

uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı

madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır

(Dağaşan 1997)

Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı

maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta

ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı

maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları

ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler

kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki

kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her

tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi

protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)

11282 Fırında Pişirme Uygulamaları

Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave

edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması

sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun

makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri

ve ark 2002)

Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik

olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır

Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak

bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil

giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun

yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini

sağlamaktadır (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

13

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar

Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin

olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin

ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim

suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından

tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine

ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara

sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar

sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada

yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)

Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok

oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin

salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin

pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri

peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln

lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin

fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da

kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri

meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin

1998)

11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml

Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol

miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla

kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik

aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu

etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır

Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla

atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir

1 GİRİŞ

14

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı

Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri

uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki

guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol

accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre

dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından

parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film

sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında

olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis

denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen

fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen

damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri

sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama

yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan

derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve

Saleemuddin 1998)

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı

Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik

ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı

verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini

sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin

proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak

1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi

yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

15

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı

Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal

proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik

enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden

olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku

boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma

şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm

sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak

bulunan ve Ca+2

tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir

(Claus ve ark 1986)

Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde

edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların

accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve

meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan

yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı

Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az

duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu

amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır

Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da

yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa

rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik

olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde

kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)

12 Bacillus Cinsi

Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde

endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek

başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan

huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998

Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir

1 GİRİŞ

16

ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış

goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı

enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda

kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum

37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli

enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi

duumlşuumlnuumllmektedirler

Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak

tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen

karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun

basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin

duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde

olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık

donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik

tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)

Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil

aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı

bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının

dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler

(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla

sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus

bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak

amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst

kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda

olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)

121 Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli

enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen

saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram

pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)

Sedat KAYA

17

Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip

amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan

oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın

olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis

kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen

diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri

(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu

2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)

Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel

farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında

değişmektedir (Akcan 2009)

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği

Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda

katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır

(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde

umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu

nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan

mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında

bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole

edilmiştir (Singhania ve ark 2009)

Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri

uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar

buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı

uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel

fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil

kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak

buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait

ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml

peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek

1 GİRİŞ

18

verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının

uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer

olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize

edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)

Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler

alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik

olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda

kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren

biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı

maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml

bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)

SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar

kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu

pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır

unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar

kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark

2009)

Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF

genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir

SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların

SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite

goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan

mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli

avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece

ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte

ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin

kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet

ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla

biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi

oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek

kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)

Sedat KAYA

19

SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum

koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH

inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen

azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)

Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda

SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat

olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin

SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)

SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır

1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir

2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak

kullanılır (Nigam ve Singh 1994)

1 GİRİŞ

20

Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)

ABİYOLOJİK UYGULAMALARI

MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı

Hz İsa‟nın doğumundan

oumlnce Asya‟da

Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den

yararlanılmıştır

MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma

MOuml 1500 Koji işlemi

7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi

18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı

18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit

kullanımı

1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri

1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit

1920-1940

Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal

enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin

gerccedilekleştirilmesi

1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen

olağanuumlstuuml gelişme

1950-1960

Steroid transformasyonu

1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan

yemlerinin uumlretimi

1980-1990

Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi

column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri

ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar

1990-Guumlnuumlmuumlze kadar

SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler

biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki

ilerlemeler

Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım

enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu

biyotranformasyonlar

Sedat KAYA

21

B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER

Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon

ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin

oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin

Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit

Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-

ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik

noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz

feruloil para-kaumaroil esteraz

Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit

Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol

aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar

biyopestisitlerbiyoherbisitler

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları

SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre

belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır

SSF‟in daha fazla verime sahip olması

SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır

Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır

Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-

Guerra ve ark 2003)

Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar

Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)

Koumlpuumlklenmenin olmaması

Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik

Daha basit fermantasyon ortamı

Daha kolay havalandırma

1 GİRİŞ

22

Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım

Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)

Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği

Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası

Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet

Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren

yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması

Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda

otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya

gereksinim yoktur

Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir

Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)

SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş

mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha

guumlvenilirdir

Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile

karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar

Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon

Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması

Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması

Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar

Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi

Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması

Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması

Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi

Sedat KAYA

23

Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama

homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)

Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması

zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin

tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)

Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur

Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk

oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-

Guerra ve ark 2003)

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler

Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)

1 Biyolojik faktoumlrler

2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

1321 Biyolojik Faktoumlrler

Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve

uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli

tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)

Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir

Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan

uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler

1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli

faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi

sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon

kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein

sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme

işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin

eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

24

Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde

gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi

protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin

induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi

şeklindedir

Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu

nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak

nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir

Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır

SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan

biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile

sağlanabilir

Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey

alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok

kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok

mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme

meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller

kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha

etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan

oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml

belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Sedat KAYA

25

2 KAYNAK OumlZETLERİ

Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den

elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH

aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH

85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır

Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı

duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen

Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini

uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk

molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln

inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak

kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir

Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik

bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler

Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz

mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1

NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı

kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr

kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda

elde edilmiştir

Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından

izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719

suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın

azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği

belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+

ve

Cu2+

iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir

Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali

proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini

karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı

olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir

2 KAYNAK OumlZETLERİ

26

Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini

baskıladığını tespit etmişlerdir

Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis

Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi

mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip

proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH

60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir

Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip

ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek

amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki

izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit

etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir

Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak

belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir

Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday

kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini

buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum

enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu

05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC

250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite

goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de

goumlzlenmiştir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve

buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir

Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim

aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak

buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık

başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm

hacmi 20 olarak rapor etmişler

Sedat KAYA

27

Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya

proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak

bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin

proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu

kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini

20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70

olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla

iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir

Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin

alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC

olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir

Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil

olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler

Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz

uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı

Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak

proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi

kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi

gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen

enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı

olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum

436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak

belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu

kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak

belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF

youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir

Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından

izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı

substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona

bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen

2 KAYNAK OumlZETLERİ

28

karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır

Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve

sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini

goumlstermektedir

Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde

yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda

kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada

katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar

ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF

youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde

etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini

olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2

ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve

maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu

etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr

Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi

aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya

ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla

artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot

kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim

uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon

suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir

Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve

kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit

etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz

uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta

ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve

amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır

Sedat KAYA

29

Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan

ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize

edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite

(2560 U ml-1

) değeri 48 saatten sonra (g-1

) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4

1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin

proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında

stabilite goumlstermiştir

Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum

kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir

Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas

aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin

bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir

(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz

aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟

da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz

uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak

pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz

aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu

sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken

yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir

Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis

DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak

atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı

patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin

hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi

patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve

Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da

yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve

maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz

uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi

2 KAYNAK OumlZETLERİ

30

37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen

enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu

goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu

sonuccedillar alınacağı umulmaktadır

Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis

N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3

K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında

gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve

yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren

ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz

uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları

96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10

mM Ca2+

iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini

korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve

pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween

65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda

muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135

ve 126 oranlarında koruyabilmiştir

Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1

tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin

optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin

proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı

test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur

Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite

goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde

oumlzellikle Ca2+

Mg2+

ve Cu2+

bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan

inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden

olduğunu tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

31

Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar

katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma

ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda

enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug

ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil

nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi

22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot

kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug

yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide

bulunduğunu belirlemişlerdir

Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum

aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu

ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+

Mg2+

ve

Mn2+

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+

‟nin olumsuz

etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan

derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini

yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20

Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol

ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden

olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini

goumlzlemlemişlerdir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık

materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı

substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla

uumlretim gerccedilekleştirmiştir

Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi

ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday

kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil

olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca

+2

2 KAYNAK OumlZETLERİ

32

ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg

+2 Cu

+2 Fe

+2 Co

+2 ve Zn

+2 iyonları ise

aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe

ederken Cu+2

iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın

metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir

Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi

iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi

iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim

uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla

uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk

olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti

Ca2+

ve Mg2+

kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin

optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin

pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+

ve Ca2+

iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa

olarak tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

33

3 MATERYAL ve METOT

31 Materyal

311 Kullanılan kimyasal maddeler

Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum

dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit

(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat

sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de

Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir

3111 Azot kaynakları

Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract

MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir

3112 Karbon kaynakları

Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den

temin edilmiştir

3113 Deterjanlar

Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan

temin edilmiştir

3114 Metal tuzları

FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de

Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir

3115 Besi yeri maddeleri

Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone

ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir

3 MATERYAL ve METOD

34

312 Kullanılan aletler

İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)

Steril Kabin ( Telstar AV-100)

Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)

Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)

Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)

Vorteks (Stuart) (VWR International )

Magnetik Karıştırıcı (Stuart)

Deep-Freeze (Haris -70ordmC)

Etuumlv (Heraus)

Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)

Otoklav (HIRAYAMA)

Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)

pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)

Sterilizatoumlr (Heraus)

Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)

313 Biyolojik materyal

Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis

ATCC 14580 suşu kullanılmıştır

314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması

Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine

ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda

kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı

Sedat KAYA

35

315 Substrat seccedilimi

Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday

kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi

kullanılmıştır

316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml

Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil

kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı

elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı

substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı

317 Kullanılan Besiyerleri

Sıvı besiyeri

Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf

suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi

sağlandıktan sonra otoklavlandı

Katı besiyeri

10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya

tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

SmF besiyeri

02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler

iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı

016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

3 MATERYAL ve METOD

36

318 SSF besiyeri

Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki

eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde

substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer

iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi

121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye

gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona

bırakıldı

Sedat KAYA

37

32 METOT

321 Mikroorganizma Uumlretimi

Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi

katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona

bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve

NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı

İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı

Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik

erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek

mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi

Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de

150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin

sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan

arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı

322 Ccediloumlzeltiler

Ccediloumlzeltilerin hazırlanması

Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması

pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml

01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan

sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

3 MATERYAL ve METOD

38

pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

Alkalin Ccediloumlzeltisi

4 Na2CO3

4 Na-K tartarat

2 CuSO4

Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde

hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları

sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı

Azo-kazein hazırlanması

005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi

sağlanarak hazırlandı

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu

Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri

ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre

sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5

dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant

uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı

324 Proteaz Aktivite Tayini

Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein

(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu

suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de

bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi

1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile

gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)

Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan

enzim miktarı olarak tanımlandı

Sedat KAYA

39

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi

Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu

arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu

substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave

edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı

NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave

edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar

inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce

oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF

besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı

santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı

(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı

326 Protein Miktar Tayini

Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak

Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen

(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin

protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı

Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl

saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra

uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek

30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm

yapıldı (Lowry ve ark 1951)

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin

Etkisi

SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek

iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri

yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı

3 MATERYAL ve METOD

40

İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika

santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere

aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı

Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml

ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim

kaynağı olarak kullanıldı

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin

Etkisi

Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere

konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha

sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra

37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96

120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi

belirlendi

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml

bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi

uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat

sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon

(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan

1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)

eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril

sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst

sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Sedat KAYA

41

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35

37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten

sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı

pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı

Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav

sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF

besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g

2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak

inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından

aktivite tayini yapıldı

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı

besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi

yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda

ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak

eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen

materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp

proteaz aktivite tayini yapıldı

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

3 MATERYAL ve METOD

42

Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki

atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası

her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra

farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan

oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat

Karışımının Belirlenmesi

Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24

saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır

kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g

2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların

her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi

yapıldı

Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda

SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı

olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki

Substratın Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu

subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra

inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki

substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat

kullanıldı

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının

Etkisi

Sedat KAYA

43

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon

kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten

sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp

100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine

eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı

Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun

ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde

edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot

kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp

hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF

ortamlarına eklenerek otoklavlandı

Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim

yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının

Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01

olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2

001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip

otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi

yapıldı

Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

3 MATERYAL ve METOD

44

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon

başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki

sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık

belirlenmeye ccedilalışıldı

Sedat KAYA

45

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı

arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de

goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Pirinccedil

Kab

uğu

Mer

cim

ek K

abuğ

u

Mıs

ır K

uumlspe

si

Arp

a K

abuğ

u

Buğ

day

Kab

uğu

Pam

uk K

abuğ

u

Sp

esif

ik A

ktiv

ite(

Um

g

24

48

72

96

120

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF

ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz

uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu

ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite

değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk

kabuğunda elde edilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

46

42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk

oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg

olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte

goumlre azaldığı belirlenmiştir

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

12 24 48 72 96 120

Zaman

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

um

g)

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Sedat KAYA

47

43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı

substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl

1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme

suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı

olarak kullanıldı

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Saf su

Ccedileş

me

suyu

NaC

I

Tris-

HCl p

H9

SDS

Tw

een-

80

Trit

onX

100

Ekstraksiyon ortamı (10 ml)

Sp

esif

ik A

kti

vit

e (U

mg

)

Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon

ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana

getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk

proteaz uumlretimine rastlanıldı

44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı

SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin

SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz

aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)

olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

48

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 30 35 37 40 45 50 55

İnkubasyon sıcaklıgı (degC)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin

mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan

ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80

(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

4 5 6 7 8 9 10pH

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi

Sedat KAYA

49

46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi

iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı

ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı

arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde

edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

10 20 30 40 50 60 70

Nem seviyesi ()

Sesi

fik

ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi

47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

50

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1 2 3 4 5 6 8

İnokulum (ml)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında

(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi

iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

60 100 120 150 180 200

Ccedilalkalama hızı (rpm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Sedat KAYA

51

49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının

Belirlenmesi

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil

kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında

maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 g pk +

05 g mk

20 g pk + 10

g mk

15 g pk + 15

g mk

10 g pk + 20

g mk

05 g pk+ 25

g mk

Mısır

Kuumlspesi 3 g

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi

mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu

410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın

Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı

partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da

goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta

1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

52

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

500 1000 1500

Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi

411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz

suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda

(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz

Karbon Kaynakaları (1)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Sedat KAYA

53

412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton

maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave

edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Kon

trol

Et oumlzuuml

tuuml

Kaz

ein

Pepto

n

Tripto

n

May

a oumlz

uumltuuml

Am

onyu

m n

itrat

Am

onyu

m suumll

fat

Am

onyu

m k

lorid

Azot Kaynakları (1)

Spes

ifik

Akti

vit

e (U

mg)

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi

413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen

01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen

Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)

ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi

Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe

edilmiştir (Şekil 43)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

54

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum

suumllfat

Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat

Metal Tuzları ( 01)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi

414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini

belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50

60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı

Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te

goumlsterilmiştir

0

20

40

60

80

100

120

15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90

Sıcaklık (degC)

Roumlla

tif

Akti

vit

e

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Sedat KAYA

55

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda

oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal

formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler

azaldığından dolayı da avantajlıdır

Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat

olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller

enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde

olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de

kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)

Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde

gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal

olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal

bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)

SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir

faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi

atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda

da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel

olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)

Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz

uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr

edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca

zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri

mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış

olabilir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF

youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En

iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

56

Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı

ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde

elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde

etmişlerdir

Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam

bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon

suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon

ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda

enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan

kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi

sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)

Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte

1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki

ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)

Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında

enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark

(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle

kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir

Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve

bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk

solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi

fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)

Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli

bir farktoumlrduumlr

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı

substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi

ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme

suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme

yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te

Sedat KAYA

57

amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila

oumlnemlidir

Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz

aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)

Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada

proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından

elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan

ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark

1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile

45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996

Gangadharan ve ark 2006)

SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın

gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından

ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat

fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve

mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık

aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)

Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık

literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır

İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder

metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol

accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı

ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve

Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda

kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri

besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık

biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak

kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

58

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil

pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak

tespit edilmiştir (Şekil 45)

pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen

bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması

gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar

Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını

oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de

etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı

değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol

oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir

Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla

kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine

başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik

goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)

Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor

edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit

edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek

pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan

enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde

kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)

Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz

aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit

etmişlerdir

Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil

pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit

edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği

yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak

goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)

Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-

110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite

Sedat KAYA

59

goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği

alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır

Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH

değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi

GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu

belirtmişlerdir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat

olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin

yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat

miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor

edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark

2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda

nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar

Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve

metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını

optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de

değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk

olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve

enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında

ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi

nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve

substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)

bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz

sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

60

İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile

ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin

azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm

hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen

uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar

(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak

yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve

katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi

azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005

Chutmanop ve ark 2008)

Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun

inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus

sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit

etmşlerdir

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)

olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile

paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda

60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin

azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı

substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta

yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde

etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma

fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama

yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir

Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları

farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm

olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon

sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri

huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava

Sedat KAYA

61

akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan

enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim

denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı

fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan

zayıf havalandırma oranına neden olabilir

Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler

alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin

mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF

koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm

ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil

kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum

enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)

Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak

SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve

Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark

2009 Tanyıldızı ve ark 2007)

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk

partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil

410)

Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel

olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar

ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat

parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum

havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay

goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk

partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk

parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

62

iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği

ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay

metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde

etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları

bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim

sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup

bulunmaması ile ilişkilidir

Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle

formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel

tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı

tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların

beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en

buumlyuumlk besin kaynağıdır

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite

değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış

goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005

Mukherjee ve ark 2009)

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından

kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)

Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde

bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr

etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az

olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki

fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

Sedat KAYA

63

aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de

goumlsterilmiştir

Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel

suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade

edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi

azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin

besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini

vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili

ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki

ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve

ark 1995)

Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et

ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır

Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)

ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları

bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini

olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların

substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir

Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim

maliyetini azaltmaktadır

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01

konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis

ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)

iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal

tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır

Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında

eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik

ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)

Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin

bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak

kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

64

B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti

azalabilir

Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde

edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+

ve Hg2+

iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır

Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2

Mg+2

ve Mn+2

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu

etkilerken Cu+2

nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir

Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr

ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim

uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)

İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten

dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir

Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme

ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye

başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve

ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal

atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında

enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha

fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların

kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir

SEDAT KAYA

65

6 KAYNAKLAR

Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi

Science 43(4) 257-262

Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis

Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156

Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a

soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to

soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136

Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması

Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır

Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının

oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Ankara

Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-

Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-

glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110

Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource

Technology 64 175ndash183

Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548

Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase

from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food

Engineering 79 950-955

Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre

dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen

Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara

Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing

Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology

Advances 11 539ndash547

6 KAYNAKLAR

66

Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-

amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry

38 1665ndash1668

Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu

nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik

Enstituumlsuuml Kocaeli

Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-

tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus

licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768

Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable

Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial

Thecnology 32 294-304

Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A

Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process

Biochemistry 42 1150-1154

Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5

Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme

production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering

26 100-106

Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995

Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis

PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243

ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic

Bacteriology 1105ndash1141

Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid

protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial

Biotechnology 10 17ndash30

Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran

M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine

Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-

961

SEDAT KAYA

67

Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease

production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates

Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018

Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on

laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302

Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal

inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2

iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans

Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5

Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)

Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel

Konular ve Uygulamalar 14-15

Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003

Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal

Cleaner Production 11 533ndash611

Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid

state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil

Bioresource Technology 101 1385-1388

El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the

ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production

scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593

Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease

production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation

Process Biochemistry 40 1951ndash1956

Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice

spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402

Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra

cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544

Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996

Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and

characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332

Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry

69 18-28

6 KAYNAKLAR

68

Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of

Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132

Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid

Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology

Biotechnology 44 (2) 269ndash274

George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of

protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess

Engineering 16 381-382

Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara

Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-

amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616

Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular

approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32

Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva

R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition

2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22

Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable

enzymes Bioresource Technology 89 17-34

Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM

1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435

Biotechnology Letters 19 675ndash712

He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-

like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326

Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline

proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1

Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical

Engineering 4771-79

Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic

bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36

415- 424

Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231

SEDAT KAYA

69

John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16

Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate

for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in

a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144

Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant

alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula

leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447

Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis

of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65

150ndash153

Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile

ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Diyarbakır

Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and

characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal

Microbiology Biotechnology 32 335-344

Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms

aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785

Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995

Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and

stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri

Apply Environment Microbiology 61 3098-3104

Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase

Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial

Biotechnology 46 106-111

Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial

viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594

Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For

Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729

Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease

From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-

1705

6 KAYNAKLAR

70

Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and

Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672

Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State

Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr

Bioengineering 100 168ndash17

Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a

bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422

Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical

Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus

subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39

Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various

chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229

Turkish Journal of Biology 99-103

Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined

Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular

Biology 235 1560-1584

Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and

optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp

CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537

Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine

Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis

Journal Moleculer Biology 76 103-122

Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic

enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14

Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A

in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and

Purification 57 01ndash107

Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production

of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661

Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for

improvement Trends in Food Science and Technology 8 339

SEDAT KAYA

71

Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin

phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275

Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase

production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and

Microbial Technology 39 56ndash59

Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5

Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent

tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as

substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735

Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel

substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF

Process Biochemistry 45 47-53

Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an

alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654

Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline

protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203

Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83

Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a

thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate

Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of

enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361

Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under

solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and

Biotechnology 84 (8) 1246-1249

Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices

Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78

Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium

composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis

N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394

Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular

α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203

6 KAYNAKLAR

72

Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state

fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90

Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995

Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264

Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their

applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423

Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by

Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab

shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10

Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash

performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal

Microbiology Biotechnology 17 493ndash497

Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from

Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779

Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen

proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara

Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul

Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State

Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169

Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84

Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in

solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology

16 578-584

Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid

substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource

Technology 97 (1) 171-177

Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization

of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state

Fermentation 33-183-189

IX

KISALTMA VE SİMGELER

SSF Katı faz fermantasyonu

SmF Submerged fermentasyonu

YE Maya Oumlzuumltuuml

NB Nutrienth Broth

LB Laura Broth

IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği

RGPW Red Gram Plant Waste

TCA Trikloroasetikasit

CSL Corn Speed Luquor

pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı

aw Su aktivite faktoumlruuml

SDS Sodyum dodesil suumllfat

BSA Bovim serum albuumlmin

CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr

CuCl2 Bakır kloruumlr

MgCl2 Magnezyum kloruumlr

ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr

FeCl2 Demir kloruumlr

MnCl2 Mangan kloruumlr

NaCl Sodyum kloruumlr

Na2CO3 Sodyum karbonat

CuSO4 Bakır suumllfat

MgSO4 Magnezyum suumllfat

NaOH Sodyum hidroksit

(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat

Sedat KAYA

1

1GİRİŞ

11 Enzimler

Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve

organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere

enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların

yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten

şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir

molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)

Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar

farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil

olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783

yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek

kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere

doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden

elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını

saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları

hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini

ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili

Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz

enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)

Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim

piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı

beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini

karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır

Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda

organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan

2008)

Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan

bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel

katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

2

Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve

enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen

enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark

2005)

Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı

Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan

bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine

yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik

accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim

uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip

Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim

şartları belirlenecektir

112 Proteazlar

Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını

katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir

Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik

2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı

fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde

hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee

ve ark 2008)

İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok

uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)

Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin

proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler

10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde

bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin

edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere

yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark

1994 Schrerier 1997)

Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak

sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik

Sedat KAYA

3

oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan

ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve

ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları

deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık

arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde

peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir

kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)

Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde

edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında

kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim

pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları

ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir

Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)

Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri

Bakteriler

Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan

Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan

Bacillus firmus Alkalin Deterjan

Bacillus megaterium Alkalin Deterjan

Bacillus pumulis Alkalin Deterjan

Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan

Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan

Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda

Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda

Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda

Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda

Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda

Mantarlar

Aspergillus niger Alkalin Deterjan

Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda

Aspergillus flavus Alkalin Deterjan

Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda

Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda

Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda

Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda

1 GİRİŞ

4

1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri

Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein

sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir

yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır

Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları

katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar

saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile

proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip

olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)

Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel

gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu

enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda

karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek

değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)

Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre

duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar

Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin

sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin

gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000

Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı

enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli

metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)

1122 Proteazların Sınıflandırılması

Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve

adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere

iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr

Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve

endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark

1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir

Sedat KAYA

5

Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel

gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein

proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar

(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)

Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral

proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)

1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri

Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca

peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha

sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)

1- Reaksiyon katalizi

2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı

3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler

Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir

Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)

1 GİRİŞ

6

Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml

katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin

proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)

ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak

bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar

11231 Ekzopeptidazlar

Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit

bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden

ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler

ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk

peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının

hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler

Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek

karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil

karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid

bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)

11232 Endopeptidazlar

Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan

peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana

ve ark 1995)

Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve

histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde

serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve

ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları

nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH

değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll

ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)

Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein

(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile

karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif

Sedat KAYA

7

merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside

edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir

Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin

katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH

değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır

Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara

goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar

aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların

yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2

) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat

yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali

miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve

ark 1998)

1124 Proteazların Etki Mekanizması

İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında

bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir

su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına

Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana

gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların

etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır

Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)

1 GİRİŞ

8

1125 Proteaz Kaynakları

Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda

bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik

goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları

olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları

birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri

kazanımları kolaydır (Pandey 2006)

Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve

ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği

belirtilmektedir

1126 Proteaz Uumlretimi

Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun

(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim

uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir

Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama

alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)

Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri

gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim

gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda

membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik

uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına

youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve

ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz

fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler

(Haki ve Rakshit 2003)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve

durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların

uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi

kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun

Sedat KAYA

9

şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize

edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma

inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz

sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)

1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar

Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli

kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla

kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli

ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks

hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri

tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca

Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar

uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli

oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu

enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)

Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri

belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal

kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla

değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi

alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge

12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri

goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların

varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli

kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)

1 GİRİŞ

10

Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve

uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)

Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal

Kaynak

Uygulama Alanı

Novo Nordisk

Danimarka

Alcalase

Savinase

Esparase

Biofeed pro

Durazym

Novozyme47 1MP

Novozyme 243

Nue

B licheniformis

Bacillus sp

B lentus

B licheniformis

Bacillus sp

Belirtilmiyor

B licheniformis

Bacillus sp

Deterjan ipek

Deterjan tekstil

Deterjan gıda ipek

Yem

Deterjan

Fotoğraf

Deri

Genencor

International

ABD

Purafact

Primatan

B lentus

Bakteriyel

Kaynaklı

Deterjan

Deri

Gist-Brocades

Hollanda

Subtilisin

Maxacal

Maxatase

B alcalophilus

Bacillus sp

Bacillus sp

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Solvay Enzymes

Almanya

Opticlean

Optimase

Maxapem

HT-proteolytic

Protease

B alcalophilus

B licheniformis

Bacillus spnin

Protein

muumlhendisliği ile

uumlretilmiş varyantı

B sublilis

B licheniformis

Deterjan

Deterjan

Deterjan

Alkol iccedilki ekmek

yem gıda deri

fotoğrafik atık

Gıda atık

Amano

Pharmaceuticals

Japonya

Proleather

Collagenas

Amano protease S

Bacillus sp

Clostrodium sp

Bacillus sp

Gıda

Teknik

Gıda

Enzyme

Development

ABD

Enzeco alkaline

protease-L FG

Enzeco high

alkaline protease

B licheniformis

B licheniformis

Bacillus sp

Teknik

Gıda

Enduumlstriyel

Nagase

Biochemicals

Japonya

Bioprase

concantrate

Ps Protease

Ps Elastase

CrystProtease

CrystProtease

Bioprase

Bioprase SP-10

B sublilis

P aeruginoso

P aeruginoso

B subtilis(K2)

Bsubtilis(bioteus)

B sublilis

B sublilis

Kozmetik

farmasoumltik

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Araştırma

Deterjan temizlik

Gıda

Jodo Shusei Japonya Codo Bap

B licheniformis Deterjan gıda

Rohm Almanya Corolase 7089

B sublilis Gıda

Sedat KAYA

11

1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları

Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir

Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002

Pandey 2004)

Enduumlstri

Proteaz Uygulama

Ekmek yapımı Noumltral proteaz

Hamur kalitesini arttırma

İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme

iccedileceklerde bulanıklığın

giderilmesi

Mandıra

Fungal proteazlar simozin

diğer proteazlar

Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt

suyunun işlenmesi modifiye

peynir enzim uumlretimi

Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin

uzaklaştırılması

Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday

gluteni gibi zengin protein

metaryallerinin modifikasyonu

Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden

tuumlylerin uzaklaştırılması

Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve

balık atıklarından protein eldesi

Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması

kan pıhtısını ccediloumlzme doku

iltihaplarının azaltılması tıbbı

uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt

lensler ve takma dişlerin

temizlenmesi

Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf

filmlerinden guumlmuumlş eldesi

Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers

Hidroliz

Enduumlstriyel ve Evsel

Atıkların İşlenmesi

Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel

faaliyetler sonucu meydana gelen

atıkların işlenmesi

1 GİRİŞ

12

11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde

patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960

yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar

guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus

alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar

uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı

madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır

(Dağaşan 1997)

Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı

maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta

ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı

maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları

ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler

kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki

kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her

tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi

protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)

11282 Fırında Pişirme Uygulamaları

Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave

edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması

sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun

makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri

ve ark 2002)

Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik

olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır

Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak

bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil

giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun

yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini

sağlamaktadır (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

13

11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar

Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin

olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin

ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim

suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından

tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine

ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara

sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar

sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada

yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)

Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok

oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin

salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin

pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri

peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln

lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin

fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da

kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri

meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin

1998)

11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml

Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol

miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla

kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik

aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu

etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır

Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla

atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir

1 GİRİŞ

14

11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı

Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri

uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki

guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol

accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre

dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından

parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film

sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)

11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı

En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında

olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis

denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen

fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen

damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri

sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama

yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan

derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve

Saleemuddin 1998)

11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı

Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik

ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı

verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini

sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin

proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak

1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi

yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)

Sedat KAYA

15

11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı

Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal

proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik

enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden

olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku

boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma

şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm

sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak

bulunan ve Ca+2

tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir

(Claus ve ark 1986)

Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde

edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların

accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve

meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan

yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)

11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı

Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az

duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu

amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır

Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da

yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa

rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik

olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde

kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)

12 Bacillus Cinsi

Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde

endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek

başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan

huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998

Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir

1 GİRİŞ

16

ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış

goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı

enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda

kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum

37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli

enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi

duumlşuumlnuumllmektedirler

Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak

tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen

karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun

basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin

duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde

olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık

donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik

tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)

Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil

aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı

bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının

dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler

(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla

sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus

bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak

amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst

kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda

olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)

121 Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli

enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen

saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram

pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)

Sedat KAYA

17

Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip

amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan

oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın

olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis

kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen

diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri

(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu

2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)

Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel

farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında

değişmektedir (Akcan 2009)

13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği

Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda

katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır

(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde

umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu

nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan

mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında

bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole

edilmiştir (Singhania ve ark 2009)

Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri

uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar

buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı

uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır

(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel

fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil

kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak

buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait

ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml

peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek

1 GİRİŞ

18

verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının

uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer

olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize

edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)

Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler

alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik

olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda

kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren

biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı

maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml

bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)

SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar

kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu

pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır

unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar

kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark

2009)

Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF

genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir

SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların

SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite

goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan

mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli

avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece

ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte

ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin

kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet

ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla

biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi

oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek

kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)

Sedat KAYA

19

SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum

koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH

inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen

azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)

Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda

SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat

olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin

SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)

SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır

1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir

2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak

kullanılır (Nigam ve Singh 1994)

1 GİRİŞ

20

Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)

ABİYOLOJİK UYGULAMALARI

MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı

Hz İsa‟nın doğumundan

oumlnce Asya‟da

Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den

yararlanılmıştır

MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma

MOuml 1500 Koji işlemi

7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi

18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı

18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit

kullanımı

1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri

1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit

1920-1940

Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal

enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin

gerccedilekleştirilmesi

1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen

olağanuumlstuuml gelişme

1950-1960

Steroid transformasyonu

1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan

yemlerinin uumlretimi

1980-1990

Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi

column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri

ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar

1990-Guumlnuumlmuumlze kadar

SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler

biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki

ilerlemeler

Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım

enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu

biyotranformasyonlar

Sedat KAYA

21

B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER

Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon

ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin

oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin

Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit

Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-

ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik

noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz

feruloil para-kaumaroil esteraz

Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit

Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol

aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar

biyopestisitlerbiyoherbisitler

131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları

SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre

belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır

SSF‟in daha fazla verime sahip olması

SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır

Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır

Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-

Guerra ve ark 2003)

Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar

Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)

Koumlpuumlklenmenin olmaması

Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik

Daha basit fermantasyon ortamı

Daha kolay havalandırma

1 GİRİŞ

22

Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım

Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)

Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği

Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası

Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet

Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren

yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması

Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda

otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya

gereksinim yoktur

Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir

Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)

SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş

mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha

guumlvenilirdir

Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile

karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar

Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon

Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması

Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması

Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar

Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi

Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması

Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması

Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi

Sedat KAYA

23

Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama

homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)

Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması

zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin

tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)

Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur

Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk

oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-

Guerra ve ark 2003)

132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler

Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)

1 Biyolojik faktoumlrler

2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

1321 Biyolojik Faktoumlrler

Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve

uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli

tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)

Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir

Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan

uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler

1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler

Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli

faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi

sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon

kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein

sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme

işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin

eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir

1 GİRİŞ

24

Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde

gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi

protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin

induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi

şeklindedir

Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu

nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak

nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir

Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır

SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan

biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile

sağlanabilir

Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey

alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok

kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok

mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme

meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller

kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha

etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan

oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml

belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Sedat KAYA

25

2 KAYNAK OumlZETLERİ

Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den

elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH

aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH

85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır

Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı

duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen

Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini

uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk

molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln

inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak

kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir

Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik

bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler

Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz

mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1

NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı

kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr

kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda

elde edilmiştir

Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından

izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719

suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın

azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği

belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+

ve

Cu2+

iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir

Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali

proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini

karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı

olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir

2 KAYNAK OumlZETLERİ

26

Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini

baskıladığını tespit etmişlerdir

Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis

Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi

mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip

proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH

60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir

Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip

ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek

amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki

izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit

etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir

Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak

belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir

Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday

kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini

buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum

enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu

05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC

250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite

goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de

goumlzlenmiştir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve

buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir

Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim

aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak

buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık

başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm

hacmi 20 olarak rapor etmişler

Sedat KAYA

27

Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya

proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak

bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin

proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu

kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini

20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70

olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla

iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir

Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin

alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC

olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir

Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil

olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler

Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz

uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı

Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak

proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi

kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi

gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen

enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı

olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum

436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak

belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu

kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak

belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF

youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir

Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından

izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı

substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona

bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen

2 KAYNAK OumlZETLERİ

28

karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır

Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve

sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini

goumlstermektedir

Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde

yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda

kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada

katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar

ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF

youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde

etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini

olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2

ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve

maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu

etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr

Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle

alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi

aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya

ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla

artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot

kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim

uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon

suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir

Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve

kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit

etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz

uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta

ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve

amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır

Sedat KAYA

29

Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan

ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize

edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite

(2560 U ml-1

) değeri 48 saatten sonra (g-1

) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4

1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin

proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında

stabilite goumlstermiştir

Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum

kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir

Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas

aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin

bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir

(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz

aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟

da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz

uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak

pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz

aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu

sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken

yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir

Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis

DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak

atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı

patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin

hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi

patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve

Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da

yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve

maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği

goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz

uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi

2 KAYNAK OumlZETLERİ

30

37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen

enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu

goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu

sonuccedillar alınacağı umulmaktadır

Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis

N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3

K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında

gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve

yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin

proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren

ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz

uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları

96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10

mM Ca2+

iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini

korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve

pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween

65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda

muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135

ve 126 oranlarında koruyabilmiştir

Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1

tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin

optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin

proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı

test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur

Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite

goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde

oumlzellikle Ca2+

Mg2+

ve Cu2+

bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan

inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden

olduğunu tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

31

Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar

katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma

ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda

enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug

ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil

nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi

22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot

kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug

yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide

bulunduğunu belirlemişlerdir

Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum

aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu

ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+

Mg2+

ve

Mn2+

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+

‟nin olumsuz

etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan

derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini

yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20

Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol

ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden

olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini

goumlzlemlemişlerdir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık

materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı

substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla

uumlretim gerccedilekleştirmiştir

Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi

ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday

kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil

olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca

+2

2 KAYNAK OumlZETLERİ

32

ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg

+2 Cu

+2 Fe

+2 Co

+2 ve Zn

+2 iyonları ise

aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe

ederken Cu+2

iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın

metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir

Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi

iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi

iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim

uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla

uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk

olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti

Ca2+

ve Mg2+

kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin

optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin

pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+

ve Ca2+

iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa

olarak tespit etmişlerdir

Sedat KAYA

33

3 MATERYAL ve METOT

31 Materyal

311 Kullanılan kimyasal maddeler

Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum

dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit

(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat

sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de

Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir

3111 Azot kaynakları

Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract

MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir

3112 Karbon kaynakları

Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den

temin edilmiştir

3113 Deterjanlar

Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan

temin edilmiştir

3114 Metal tuzları

FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de

Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir

3115 Besi yeri maddeleri

Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone

ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir

3 MATERYAL ve METOD

34

312 Kullanılan aletler

İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)

Steril Kabin ( Telstar AV-100)

Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)

Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)

Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)

Vorteks (Stuart) (VWR International )

Magnetik Karıştırıcı (Stuart)

Deep-Freeze (Haris -70ordmC)

Etuumlv (Heraus)

Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)

Otoklav (HIRAYAMA)

Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)

pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)

Sterilizatoumlr (Heraus)

Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)

313 Biyolojik materyal

Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis

ATCC 14580 suşu kullanılmıştır

314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması

Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine

ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda

kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı

Sedat KAYA

35

315 Substrat seccedilimi

Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday

kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi

kullanılmıştır

316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml

Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil

kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı

elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı

substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı

317 Kullanılan Besiyerleri

Sıvı besiyeri

Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf

suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi

sağlandıktan sonra otoklavlandı

Katı besiyeri

10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya

tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

SmF besiyeri

02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler

iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı

016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp

ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı

3 MATERYAL ve METOD

36

318 SSF besiyeri

Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki

eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde

substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer

iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi

121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye

gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona

bırakıldı

Sedat KAYA

37

32 METOT

321 Mikroorganizma Uumlretimi

Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi

katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona

bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve

NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı

İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı

Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik

erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek

mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi

Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de

150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin

sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan

arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı

322 Ccediloumlzeltiler

Ccediloumlzeltilerin hazırlanması

Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması

pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml

01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan

sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M

HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

3 MATERYAL ve METOD

38

pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M

NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra

hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı

Alkalin Ccediloumlzeltisi

4 Na2CO3

4 Na-K tartarat

2 CuSO4

Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde

hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları

sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı

Azo-kazein hazırlanması

005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi

sağlanarak hazırlandı

323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu

Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri

ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre

sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5

dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant

uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı

324 Proteaz Aktivite Tayini

Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein

(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu

suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de

bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi

1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile

gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)

Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan

enzim miktarı olarak tanımlandı

Sedat KAYA

39

325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi

Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu

arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu

substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave

edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı

NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave

edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar

inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce

oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF

besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı

santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı

(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı

326 Protein Miktar Tayini

Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak

Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen

(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin

protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı

Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl

saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra

uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek

30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm

yapıldı (Lowry ve ark 1951)

327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi

3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin

Etkisi

SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek

iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri

yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı

3 MATERYAL ve METOD

40

İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika

santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı

3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve

mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere

aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı

Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml

ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim

kaynağı olarak kullanıldı

3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin

Etkisi

Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere

konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha

sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra

37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96

120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi

belirlendi

3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml

bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi

uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat

sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon

(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan

1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)

eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril

sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst

sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Sedat KAYA

41

3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35

37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten

sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı

3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı

pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı

Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav

sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı

3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF

besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g

2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak

inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından

aktivite tayini yapıldı

3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml

ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı

besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi

yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda

ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak

eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen

materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp

proteaz aktivite tayini yapıldı

3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

3 MATERYAL ve METOD

42

Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki

atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası

her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra

farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan

oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı

32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat

Karışımının Belirlenmesi

Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24

saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır

kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g

2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların

her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu

eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi

yapıldı

Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda

SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı

olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki

Substratın Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu

subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra

inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki

substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat

kullanıldı

32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının

Etkisi

Sedat KAYA

43

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon

kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten

sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp

100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine

eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı

Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun

ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti

Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde

edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot

kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum

klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp

hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF

ortamlarına eklenerek otoklavlandı

Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim

yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının

Etkisi

Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01

olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2

001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip

otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi

yapıldı

Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda

aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya

3 MATERYAL ve METOD

44

devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim

kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı

32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon

başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki

sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık

belirlenmeye ccedilalışıldı

Sedat KAYA

45

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi

SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı

arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de

goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Pirinccedil

Kab

uğu

Mer

cim

ek K

abuğ

u

Mıs

ır K

uumlspe

si

Arp

a K

abuğ

u

Buğ

day

Kab

uğu

Pam

uk K

abuğ

u

Sp

esif

ik A

ktiv

ite(

Um

g

24

48

72

96

120

Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF

ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz

uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu

ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite

değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk

kabuğunda elde edilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

46

42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk

oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC

14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı

Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg

olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte

goumlre azaldığı belirlenmiştir

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

12 24 48 72 96 120

Zaman

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

um

g)

Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi

Sedat KAYA

47

43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı

substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl

1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme

suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı

olarak kullanıldı

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Saf su

Ccedileş

me

suyu

NaC

I

Tris-

HCl p

H9

SDS

Tw

een-

80

Trit

onX

100

Ekstraksiyon ortamı (10 ml)

Sp

esif

ik A

kti

vit

e (U

mg

)

Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon

ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana

getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk

proteaz uumlretimine rastlanıldı

44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı

SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin

SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz

aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)

olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

48

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 30 35 37 40 45 50 55

İnkubasyon sıcaklıgı (degC)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin

mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan

ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80

(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

4 5 6 7 8 9 10pH

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi

Sedat KAYA

49

46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi

iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı

ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı

arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde

edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

10 20 30 40 50 60 70

Nem seviyesi ()

Sesi

fik

ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi

47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

50

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1 2 3 4 5 6 8

İnokulum (ml)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi

48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında

(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi

iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

60 100 120 150 180 200

Ccedilalkalama hızı (rpm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi

Sedat KAYA

51

49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının

Belirlenmesi

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil

kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında

maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

25 g pk +

05 g mk

20 g pk + 10

g mk

15 g pk + 15

g mk

10 g pk + 20

g mk

05 g pk+ 25

g mk

Mısır

Kuumlspesi 3 g

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi

mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu

410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın

Etkisi

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı

partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da

goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta

1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

52

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

500 1000 1500

Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi

411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz

suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda

(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz

Karbon Kaynakaları (1)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi

Sedat KAYA

53

412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının

Etkisi

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton

maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave

edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Kon

trol

Et oumlzuuml

tuuml

Kaz

ein

Pepto

n

Tripto

n

May

a oumlz

uumltuuml

Am

onyu

m n

itrat

Am

onyu

m suumll

fat

Am

onyu

m k

lorid

Azot Kaynakları (1)

Spes

ifik

Akti

vit

e (U

mg)

Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi

413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen

01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen

Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)

ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi

Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe

edilmiştir (Şekil 43)

4 ARAŞTIRMA BULGULARI

54

000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum

suumllfat

Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat

Metal Tuzları ( 01)

Sp

esi

fik

Ak

tiv

ite (

Um

g)

Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi

414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak

kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini

belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50

60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı

Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te

goumlsterilmiştir

0

20

40

60

80

100

120

15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90

Sıcaklık (degC)

Roumlla

tif

Akti

vit

e

Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi

Sedat KAYA

55

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda

oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal

formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler

azaldığından dolayı da avantajlıdır

Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat

olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller

enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde

olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de

kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)

Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde

gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal

olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal

bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)

SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir

faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi

atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda

da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel

olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)

Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz

uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr

edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca

zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri

mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış

olabilir

Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF

youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En

iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

56

Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı

ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde

elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde

etmişlerdir

Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam

bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon

suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon

ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda

enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan

kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi

sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)

Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin

bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte

1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki

ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)

Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında

enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark

(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle

kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir

Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve

bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk

solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi

fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)

Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli

bir farktoumlrduumlr

Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı

substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi

ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme

suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme

yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te

Sedat KAYA

57

amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila

oumlnemlidir

Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz

uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz

aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)

Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada

proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından

elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan

ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark

1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile

45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996

Gangadharan ve ark 2006)

SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın

gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından

ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat

fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve

mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık

aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)

Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık

literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır

İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder

metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol

accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı

ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve

Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda

kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri

besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık

biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak

kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

58

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil

pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak

tespit edilmiştir (Şekil 45)

pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen

bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması

gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar

Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını

oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de

etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı

değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol

oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir

Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla

kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine

başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik

goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)

Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor

edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit

edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek

pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan

enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde

kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)

Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz

aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit

etmişlerdir

Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil

pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit

edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği

yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak

goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)

Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-

110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite

Sedat KAYA

59

goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği

alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır

Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH

değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi

GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu

belirtmişlerdir

Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat

olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin

yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat

miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor

edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark

2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda

nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar

Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve

metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını

optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de

değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk

olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve

enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında

ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi

nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir

Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan

ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun

inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)

Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve

substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)

bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz

sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

60

İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile

ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin

azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm

hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen

uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar

(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak

yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve

katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi

azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005

Chutmanop ve ark 2008)

Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun

inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus

sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit

etmşlerdir

Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den

maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)

olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile

paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda

60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin

azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı

substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta

yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde

etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma

fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama

yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir

Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları

farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki

ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm

olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon

sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri

huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava

Sedat KAYA

61

akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan

enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim

denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı

fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan

zayıf havalandırma oranına neden olabilir

Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler

alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin

mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF

koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm

ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir

SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile

yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil

kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum

enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)

Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak

SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve

Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark

2009 Tanyıldızı ve ark 2007)

Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten

sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk

partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil

410)

Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel

olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar

ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat

parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum

havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay

goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk

partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk

parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

62

iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila

buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)

Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve

kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği

ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay

metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde

etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları

bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim

sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup

bulunmaması ile ilişkilidir

Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle

formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel

tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı

tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların

beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en

buumlyuumlk besin kaynağıdır

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite

değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış

goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005

Mukherjee ve ark 2009)

Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz

uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından

kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)

Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde

bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr

etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az

olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki

fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)

Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF

ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz

Sedat KAYA

63

aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de

goumlsterilmiştir

Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel

suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade

edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi

azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin

besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini

vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili

ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki

ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve

ark 1995)

Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et

ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır

Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)

ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları

bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini

olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların

substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir

Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim

maliyetini azaltmaktadır

Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01

konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis

ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)

iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal

tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır

Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında

eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik

ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)

Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin

bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak

kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle

5 TARTIŞMA VE SONUCcedil

64

B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti

azalabilir

Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde

edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+

ve Hg2+

iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır

Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini

gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2

Mg+2

ve Mn+2

gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu

etkilerken Cu+2

nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir

Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr

ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim

uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)

İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten

dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir

Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme

ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye

başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve

ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal

atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında

enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha

fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların

kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir

SEDAT KAYA

65

6 KAYNAKLAR

Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi

Science 43(4) 257-262

Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis

Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156

Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a

soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to

soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136

Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması

Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır

Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının

oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Ankara

Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-

Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-

glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110

Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource

Technology 64 175ndash183

Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548

Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase

from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food

Engineering 79 950-955

Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre

dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen

Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara

Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing

Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology

Advances 11 539ndash547

6 KAYNAKLAR

66

Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-

amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry

38 1665ndash1668

Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu

nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik

Enstituumlsuuml Kocaeli

Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-

tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus

licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768

Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable

Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial

Thecnology 32 294-304

Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A

Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process

Biochemistry 42 1150-1154

Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5

Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme

production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering

26 100-106

Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995

Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis

PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243

ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic

Bacteriology 1105ndash1141

Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid

protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial

Biotechnology 10 17ndash30

Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran

M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine

Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-

961

SEDAT KAYA

67

Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease

production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates

Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018

Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on

laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302

Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal

inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2

iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans

Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5

Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)

Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel

Konular ve Uygulamalar 14-15

Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003

Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal

Cleaner Production 11 533ndash611

Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid

state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil

Bioresource Technology 101 1385-1388

El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the

ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production

scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593

Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease

production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation

Process Biochemistry 40 1951ndash1956

Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice

spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402

Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra

cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544

Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996

Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and

characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332

Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry

69 18-28

6 KAYNAKLAR

68

Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of

Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132

Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid

Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology

Biotechnology 44 (2) 269ndash274

George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of

protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess

Engineering 16 381-382

Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara

Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-

amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616

Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular

approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32

Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva

R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition

2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22

Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable

enzymes Bioresource Technology 89 17-34

Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM

1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435

Biotechnology Letters 19 675ndash712

He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-

like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326

Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline

proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1

Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical

Engineering 4771-79

Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic

bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36

415- 424

Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231

SEDAT KAYA

69

John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16

Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate

for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in

a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144

Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant

alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula

leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447

Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis

of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65

150ndash153

Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile

ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml

Diyarbakır

Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and

characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal

Microbiology Biotechnology 32 335-344

Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms

aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785

Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995

Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and

stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri

Apply Environment Microbiology 61 3098-3104

Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase

Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial

Biotechnology 46 106-111

Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial

viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594

Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For

Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729

Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease

From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-

1705

6 KAYNAKLAR

70

Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and

Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672

Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State

Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr

Bioengineering 100 168ndash17

Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a

bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422

Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical

Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus

subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39

Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various

chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229

Turkish Journal of Biology 99-103

Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined

Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular

Biology 235 1560-1584

Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and

optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp

CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537

Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine

Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis

Journal Moleculer Biology 76 103-122

Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic

enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14

Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A

in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and

Purification 57 01ndash107

Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production

of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661

Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for

improvement Trends in Food Science and Technology 8 339

SEDAT KAYA

71

Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin

phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275

Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase

production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and

Microbial Technology 39 56ndash59

Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5

Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent

tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as

substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735

Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel

substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF

Process Biochemistry 45 47-53

Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an

alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654

Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline

protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203

Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83

Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a

thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate

Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of

enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361

Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under

solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and

Biotechnology 84 (8) 1246-1249

Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices

Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78

Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium

composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis

N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394

Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular

α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203

6 KAYNAKLAR

72

Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state

fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90

Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995

Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264

Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their

applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423

Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by

Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab

shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10

Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash

performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal

Microbiology Biotechnology 17 493ndash497

Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from

Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779

Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen

proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara

Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul

Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State

Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169

Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84

Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in

solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology

16 578-584

Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid

substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource

Technology 97 (1) 171-177

Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization

of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state

Fermentation 33-183-189