Kapitoly z bioorganické chemie OCH/KBCH · 2017-04-26 · 2 1. Úvod •Holý, A. Principy bioorganické chemie ve vývoji antivirotik a cytostatik, UP Olomouc, 2004 •Blackburn

1

Kapitoly z bioorganické chemie

OCH/KBCH

RNDr. Lucie Brulíková, Ph.D.LS 2016/2017

[email protected]

2

1. Úvod

• Holý, A. Principy bioorganické chemie ve vývoji antivirotik a cytostatik, UP Olomouc, 2004

• Blackburn et al. Nucleic Acids in Chemistry and Biology, RSC Publishing, UK, 3rd edition, 2006

• Alberts et al. Molecular Biology of the Cell, Garland Science, New York, 5th edition, 2008

3

Cíle předmětu

Přednáška podává přehled molekulárně-bioologických a chemických principů

moderního vývoje léčiv, cíleně působících proti nádorovým onemocněním,

leukémii a virovým chorobám.

http://www.ordinace.cz/clanek/mechanismus-ucinku-

nove-generace-antivirotik/

http://www.novinky.cz/zena/zdravi/313516-cesti-vedci-objevili-

dalsi-gen-jenz-muze-za-metastazy-nadoru.html

4

Sylabus předmětu

1. Úvod – Vymezení základních pojmů, souvislostí, přehled nejdůležitějších

virových a nádorových onemocnění, antimetabolity a jejich použití v léčbě.

Buněčný cyklus, regulace buněčného cyklu, mikrotubuly. Chemoterapie

nádorových onemocnění. Centrální dogma a genová regulace, replikace,

transkripce, translace, stručný náhled do genové regulace. 15. 2. 2017

2. Struktura a funkce nukleových kyselin – RNA, DNA, Interakce malých

molekul s nukleovými kyselinami, reakce s nukleofily, reakce s elektrofily, malé

molekuly s reverzibilní vazbou na dvoušroubovici DNA. 22. 2. 2017

3. Biosyntéza a metabolismus nukleových kyselin - biosyntéza nukleosidů de

novo. Katabolismus nukleových kyselin a nukleosidů. Poruchy metabolizmu

purinů. Přehled základních enzymů biosyntézy a katabolizmu nukleových kyselin

a jejich složek, které mohou být cíleny terapeutiky. Inhibitory biosyntézy

prekurzorů bází a anabolismu nukleosidů. Enzymy katabolismu nukleových

kyselin. 8. 3. 2017

5

Sylabus předmětu

4. Chemie nukleosidů, nukleotidů a oligonukleotidů – syntéza nukleosidů,

tvorba glykosidické vazby, syntéza a transformace nukleobází, modifikace

cukerné složky. Syntéza nukleotidů. Syntéza oligonukleotidů. 15. 3. 2017

5. Viry – Principy stavby virů, jejich taxonomie, klasifikace virů. Životní cyklus

virů, rozmnožování jednotlivých typů virů, jednotlivé fáze životního cyklu virů,

cesty infekce organizmu viry, některé pojmy související s viry. Viry a nádorová

onemocnění. Vakcíny, typy vakcín. Viry způsobující závažná onemocnění a

epidemie u lidí. Terapie onemocnění člověka způsobených viry. Virové infekce,

které v minulosti způsobily závažné epidemie. 22. 3. 2017

6. Inhibitory jednotlivých stupňů rozmnožování virů – látky ovlivňující

adsorpci virionu na buněčnou membránu. Látky interagující s povrchovou

strukturou virionu. Inhibitory syntézy virových nukleových kyselin (analoga

substrátu, analoga produktu, inhibitory herpesvirové helikázy-primázy, inhibitory

RNA-dependentní-RNA polymerázy, inhibitory DNA-dependentní RNA-

polymerázy). Inhibitory HBV. Inhibitory HCV. Inhibitory serinové HCMV proteázy.

Inhibitory cysteinové rhinovirové proteázy. 29. 3. 2017

6

Sylabus předmětu

7. Inhibitory jednotlivých stupňů rozmnožování virů – Inhibitory viru HIV

(inhibitory průniku do buňky, nukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy

(NRTIs), nukleotidové inhibitory reverzní transkriptázy (NtRTIs),

nenukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy (NNRTIs), inhibitory HIV

integrázy a transkripce virové RNA, inhibitory HIV proteázy. Současná

antiretrovirová terapie pacientů s HIV infekcí. 5. 4. 2017

8. Acyklické nukleosidy a nukleotidy – acyklické nukleosidy, acyklické

nukleosidfosfonáty, nové cyklické fosfonáty. 12. 4. 2017

9. Protinádorová a antileukemická chemoterapie – Alkylační léčiva.

Mechanizmus účinku DNA alkylačních cytostatik. Skupiny alkylačních léčiv. Pt-

komplexy. Cytostatika založená na selektivním účinku v hypoxických buňkách.

19. 4. 2017

10. Protinádorová a antileukemická chemoterapie – Inhibitory

topoisomeras, specifické inhibitory topoizomerázy I, inhibitory topoisomerasy II.

Inhibitory angiogeneze. Inhibitory thymidin fosforylázy. Látky

s radiomimetickým účinkem. Telomeráza a její inhibitory. 26. 4. 2017

7

Sylabus předmětu

11. Protinádorová a antileukemická chemoterapie – Antimitotické látky

interagující s tubulinem. Inhibitory proteinkináz. Inhibitory prenylace proteinů.

Inhibice nežádoucích účinků androgenů a estrogenů. 3. 5. 2017

12. Opakování. 10. 5. 2017

Prof. RNDr. Antonín Holý, DrSc., Dr.h.c. (1.9.1936 – 16.7.2013)

8

1976 – DuviragelTM antiherpetikum

1996 – VistideTM virový zánět oční sítnice

2001 – VireadTM HIV, 2008 – hepatitida B

2002 – HepseraTM virová hepatitida typu B

Historie výuky předmětu na PřF UP

9

1. Vymezení základních pojmů, souvislostí

Chemoterapie

➢ podávání léků (drugs) pacientům s cílem zastavit onemocnění či

zmírnit jeho průběh, omezit doprovodné jevy

➢ léčba onkologických, virových, bakteriálních, plísňových,

parazitárních onemocnění

➢ v onkologii – protinádorová chemoterapie - podávání léků s

cytostatickým účinkem

10

Antiinfektiva

Respirační

Endokrinologie

Lékové skupiny 2002

Gastrointest.

Dermatologika

Respirační

Revmatologie

Endokrinologie

Kardiologie

CNS

Cytostatika

Antiinfektiva

Cytostatika

CNS Kardiologika


11

Preklinická fáze zkoušek

Fáze I Fáze II

Fáze III Schvalování

Fáze IV (postmarketing

testy)

6.5 roku

1.5 roku

2 roky

3.5 roku

1.5 roku

Klinické zkoušky

Vývoj nového léku trvá asi 15 let

A STOJÍ DNES ~ 800 MILIONŮ DOLARŮ

Objev účinku Nový lék

V SOUČASNÉ DOBĚ SE PROJEVUJÍ SNAHY PO ZJEDNODUŠENÍ, ZKRÁCENÍ A ZLEVNĚNÍ TOHOTO PROCESU MAJÍ-LI VŠAK ZŮSTAT ZACHOVÁNA KRITERIA BEZPEČNOSTI PACIENTA, JE SMYSL TAKOVÝCH SNAH PONĚKUD SPORNÝ.


12

90% všech úmrtí ve věkové skupině < 44 let bylo v roce 1998 způsobeno šesti infekčními chorobami:

• AIDS• SPALNIČKY• PRŮJMOVÁ ONEMOCNĚNÍ• PNEUMONIE• MALÁRIE• TBC

Čtyři z nich mají zcela nebo převážně virový původ. (WHO Health Report 1999)

World health organization (WHO) - The world health reports


13

Stav epidemie HIV v roce 2006:➢ 39,5 miliónů lidí je infikováno virem HIV➢ 4,3 miliónu lidí bylo nově infikováno virem HIV jen v 2006➢ 2,9 miliónu lidí zemřelo na AIDS v roce 2006

Stav epidemie HIV v roce 2011:➢ průměrně 34 miliónů lidí je infikováno virem HIV (31.4 - 35.9) na konci roku 2011 ➢2,5 miliónu lidí bylo nově infikováno virem HIV v roce 2011 (o 20% méně než v roce 2001)➢1,7 miliónu lidí zemřelo na AIDS v roce 2011

Stav epidemie HIV v roce 2015:➢ 36,9 miliónů lidí je infikováno virem HIV (konce roku 2014) ➢ 2 milióny lidí bylo nově infikováno virem HIV jen v 2014➢ 1,2 miliónu lidí zemřelo na AIDS v roce 2014➢ 15,8 million lidí je léčeno ART (June 2015)


World health organization (WHO) - The world health reports

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

2. Přehled nejdůležitějších virových a

nádorových onemocnění

1. Virová onemocnění

2. Rakovinná onemocnění

27



Virová onemocnění

„Virus is a piece of nucleic acid surrounded by

bad news“(Peter Medawar, nositel Nobelovy ceny 1960 za medicínu a fyziologii)

➢ Vakcíny sice předcházejí vzniku epidemií, ale nezabraňují vzniku

jednotlivých případů onemocnění.

➢ Ty musí řešit farmakoterapie. Proto je třeba vyvíjet léky účinné i

proti těm virovým infekcím, pro které je dostupná vakcína.

28



Virová onemocnění - závažná virová onemocnění vyvolávají:

• Chřipkové viry (influenzaviry)

• Rotaviry – patogeny vyvolávající gastroeneritidu u kojenců

• Varicella zoster virus – plané neštovice

• Lidské cytomegaloviry (HCMV) – kolitida, zánět oční sítnice, pneumonie

• Enteroviry – napadají CNS

• Rhinoviry (rýmové viry)

• Virus lidské žloutenky typu A („infekční žloutenky“) – nedostatečná

hygiena

• Virus lidské žloutenky typu B (HBV) – specificky lidský virus

• Virus lidské žloutenky typu C (HCV) – chronické onemocnění

29

• Virus varioly

• Virus neštovic opic (monkeypoxvirus) – příbuzný variole, mortalita

však „jen“ 1-2%

• Viry vyvolávající hemoragické horečky (Lassa, Ebola, argentinská

hemoragická horečka, bolivijská hemoragická horečka, krymská

hemoragická horečka a další)

• Hantaviry – virus Sin Nombre – plicní pneumonie

• Retroviry HIV – původci onemocnění AIDS



Virová onemocnění - závažná virová onemocnění vyvolávají:

30

Vakcina dostupná

Účinná chemoterapie Žádná terapie dostupná ve vývoji

Polioviry - obrna

Rýma - rhinoviry

Enterovirové průjmy

Hepatitis A

Hepatitis C

Zarděnky

Žlutá zimnice

Dengue

Klíšťová encefalitida

Vzteklina

Exotické viry (Lassa,Sandfly,West Nile…)

Ebola

Hemoragické horečky

Příušnice

Spalničky

Subakutní sklerotizující panencefalitida

Respirační syncitiální virus - pneumonie

Chřipka

Parainfluenza

AIDS – HIV-1, HIV-2

Vakcina dostupná

Účinná chemoterapie Žádná terapie dostupná ve vývoji

Hepatitis B

Papillomaviry

Progresivní leukoencefalopatie

Adenovirové pneumonie, konjunktivitidy

Herpes simplex typ 1 a 2

Varicella zoster

Cytomegalovirové infekce

Mononukleosa, Burkittův lymfom

Variola

Monkeypox

Molluscum contagiosum

Terapie onemocnění člověka způsobených DNA viry

Terapie onemocnění člověka způsobených RNA viry

31

pandemie 1918 “španělská chř.” 20 mil. úmrtí

pandemie 1957 “Asia” 100 tisíc úmrtí

pandemie 1968 “Hong-Kong” 100 tisíc úmrtíChřipka

USA 20-40 mil. ročně 10 tisíc úmrtíroč.

Enteroviry USA 5-10 mil. ročně

Kaliciviry USA 600 tisíc ročně 3000 úmrtí

Hepatitis C Francie 1998 1,8% obyvatel.

Rotaviry Irsko 1998 1700 ročně

HSV-1 Francie 65% seroprev.

HSV-2 Francie 15% seroprev.

Horečka Lassa 1000 ročně smrtnost 20-60%

Čína 100 tisíc ročně smrtnost 5-10%Hantaviry – Sin Nombre,Muerto Canyon USA 1993 42 případů smrtnost 70%

Ebola Zair smrtnost 90%

Epidem. polyartritida Fidži 1979 50 tisíc ročně

Texas 1964 0.052% obyv. smrtnost 3-4%WEE

Kalifornie 1952 0.25% obyv. smrtnost 3-4%

VEE Venezuela 1964 32 tisíc smrtnost 0.6%

Čína 1960 700 tisíc

Kuba 1981 344 tisíc smrtnost 0.05%Dengue

S.&J.Amerika 1986 88 tisíc

Nigerie 1969 100 tisíc

Nigerie 1986 10 tisíc smrtnost 56%Západonilskáencefalitida

New York 1999 ? 5 úmrtí

Čína 10 tisíc ročněJaponská encefalitida

Indie 10 tisíc ročně

smrtnost 70%(při léčení 11%)

Pandemie a epidemie virových chorob ve 20. století

32

(World health report 2007)

An English doctor, Edward Jenner, carries out the first vaccinationagainst smallpox in 1796 by inoculating a boy with cowpox virus.

Variola (virus pravých neštovic)

- 700 n.l. – Indie, Čína, Japonsko, Evropa- 1520 – Mexiko- 1524 – Peru- 1555 – Brazílie- 1617 – Severní Amerika- 1713 – Jižní Afrika- 1789 – Austrálie

První „vakcinace“ :- 1798 – Jenner, Anglie

1967-1977 - eradikace



Virová onemocnění

33(World health report 2007)


nádorových onemocněníVirová onemocnění – ptačí chřipka

34


nádorových onemocněníVirová onemocnění – HIV/AIDS

35

➢ Nakažených může být desetkrát tolik, než vykazují statistiky.

➢ Mnoho lidí totiž nechodí na testy.

➢ V roce 2007 přišlo na testy hodně lidí, kteří už byli v pokročilém stadiu

nemoci AIDS.

➢ Podle OSN se na světě virem HIV denně nakazí 6800 lidí a 5700 lidí

na AIDS každý den zemře.

➢ Nejvíce doléhá nemoc na Afriku, kde žije 22,5 milionu lidí s virem HIV.

V Asii je nakaženo 4,9 milionu lidí a za poslední sledovaný rok se tam

virem HIV nakazilo 440.000 lidí.

➢ Celkový počet lidí infikovaných virem HIV po celém světě OSN

odhaduje na 33 miliónů, vloni hovořily odhady o 40 miliónech.

(World health report 2007)


nádorových onemocněníVirová onemocnění – HIV/AIDS

36

Nádor = Tumor = Neoplazma – maligní nebo benigní hmota tkáně, která

nemá fyziologickou funkci, vzniká z buněk existující tkáně a nevyvolává

zánětlivou reakci, někdy lokálně expanduje invazí nebo metastázami

Karcinom – maligní tumor epiteliálního původu

Sarkom – maligní neoplazma vznikající v mesodermální tkáni (kosti,

chrupavky, pojivová tkáň, příčně pruhované svaly)

Osteosarkom – sarkom odvozený od kostní tkáně

Chondrosarkom – sarkom odvozený od pojivové tkáně

Hemoblastom – maligní tumor odvozený z embryonálních ganglií

Embryonální karcinom – maligní nádor varlat nebo vaječníků

Adenokarcinom – maligní nádor odvozený od žlázové tkáně

Metastáza – sekundární růst maligního tumoru – obecně přenos nádorové

tkáně na jiné místo těla


nádorových onemocněníRakovinná onemocnění – vymezení pojmů

37



Lymfom – maligní tumor lymfatické tkáně

Myelom – primární tumor kostní dřeně obvykle zahrnující několik různých

kostí (mnohočetný myelom)

Leukemie – akutní nebo chronické onemocnění krvetvorných orgánů,

charakterizované vzrůstem počtu bílých krvinek, tj.: lymfocytů,

lymfoblastů, myeloblastů, monocytů, promyelocytů, keratinocytů, T-buněk

(retrovirální leukemie)

Myelodysplastický syndrom (preleukemie) – onemocnění krvetvorby,

které postihuje kmenové buňky, funkční poruchy všech krvetvorných řad,

hlavně u starších lidí

Myeloproliferační syndrom (primární proliferace kmenových buněk)

– porucha kmenových buněk v kostní dřeni, nadměrná tvorba buněk

krevních řad vede k polycytémii – nadprodukci červených krvinek;

esenciální trombocytémii – nadprodukci krevních destiček; primární

myelofibróze – nadprodukci krevních destiček a vaziva v kostní dřeni;

chronické myeloidní leukémii – nadprodukci bílých krvninek (granulocytů)

38

Akutní leukémie se projevuje rychlým vzrůstem nezralých krevních

buněk; kostní dřeň není schopná produkovat normální buňky; je nutná

okamžitá léčba (jinak rozšíření do krve, ostatních orgánů, CNS) častěji u

dětí

Chronická leukémie se projevuje zvýšenou tvorbou defektních krevních

buněk; většinou trvá měsíce až roky, než se projeví; většinou se neléčí

okamžitě – monitorování a snaha o efektivní léčbu „v pravý čas“

Lymfoblastická leukémie je leukémie buněk kostní dřeně, ze kterých

vznikají lymfocyty, léčí se chemoterapií

Myeloidní leukémie je leukémie buněk kostní dřeně, ze kterých vznikají

červené krvinky (erytrocyty) a některé typy bílých krvinek (leukocytů) a

destiček (trombocytů), léčba transplantací kostní dřeně



39

3. Antimetabolity a jejich použití v léčbě

Chemicky obměněné přirozené metabolity (analoga metabolitů), které

ovlivňují metabolické procesy, probíhající v buňce.

Jejich působení je vždy spojeno s ovlivněním průběhu enzymové reakce

nebo jejího produktu.

Jejich účinek je založen na principu podobnosti struktury modifikované

látky k látce přirozené, na jejím rozpoznání enzymem.

Výsledkem může být :

• Pevná vazba s enzymem a jeho inaktivace

• Inhibice enzymem katalyzované reakce

• Vznik modifikovaného produktu neschopného další metabolické přeměny

• Vznik modifikovaného produktu inhibujícího průběh této nebo další

reakce

• Vznik modifikovaného produktu jiných fyzikálně-chemických parametrů

nebo molekulárně biologických vlastností

• Terminace růstu polymerního řetězce (proteiny, nukleové kyseliny)

40

Antimetabolity jsou vždy spojeny s pochody v buňce (jejich

kompartmentech) a mohou ovlivňovat základní životní procesy buňky či

životní cyklus jejích parazitů.

Na principu antimetabolitů jsou založena:

• cytostatika

• protivirové preparáty

• antiprotozoální preparáty

Na stejných principech působí také preparáty regulující průběh některých

metabolických onemocnění, vyvolaných hyperfunkcí nebo dysfunkcí

enzymů.

Antimetabolity mohou působit přímo nebo až po předchozí aktivaci na

aktivní antimetabolity.

Jejich účinek v buňce je podmíněn postupně:

• transportem přes buněčnou membránu

• aktivací

• působením na cílový enzym


41

Jejich relativní účinek v buňce je charakterizován tzv.

chemoterapeutickým indexem nebo indexem selektivity účinku (poměr

toxické externí koncentrace k účinné externí koncentraci na buňku).

Ideální situace nastává, je-li kterýkoli z těchto tří kroků specifický pro

transformovanou nebo infikovanou buňku:

• specifický transport pouze do těchto buněk

• aktivace pouze v infikovaných nebo transformovaných buňkách

• interakce pouze nebo převážně s enzymy transformované buňky

nebo enzymy buněčného parazita

• zábrana procesů klíčových pro buněčného parazita, ale málo

podstatných pro buňku.

Ke zlepšení farmakologických parametrů či zvýšení selektivity účinku se

používají profarmaka, t.j. deriváty antimetabolitů, které se lépe

transportují nebo jen omezeně degradují, a poskytují antimetabolit teprve

působením specifických enzymů v buňce.


42

Syntéza a funkce prekurzorůSyntéza a maturace nukleových kyselinSyntéza a maturace proteinů, …

Zásahy na DNA:➢ALKYLACE, TOPOISOMERASY, MENŠÍ A VĚTŠÍ ŽLÁBEK, ŠTĚPENÍ, RADIOMIMETIKABuněčná mitosa:➢ PROTEINKINASY, TUBULIN, VŘETÉNKOZásahy na membráněFyzikálně-chemické zásahy:➢ FOTOSENSIBILIZACE, HYPOTHERMIEOvlivnění angiogeneseOvlivnění receptorůOstatní antibiotické účinky


Možné zásahy:

43

Příklady antimetabolitů

NH2

COOH

NH2

SO3H

NH2

COOH

OH

PAB PASkyselina sulfanilová


44

N

N N

NNH

NH

O COOH

COOHOH

H2N

N

N N

NN

NH

O COOH

COOHNH2

H2NR

R = H

R = CH3

kyselina listová

aminopterinmethotrexat

N

N N

N

NH

O COOH

COOHNH2

H2N

edetrexat



45

N

N

R

NH2

O

N

NN

R

NH2

O

N

N

N

R

NH2

O N

R

NH2

O

HN

N

R

O

O

HN

NN

R

O

O

HN

N

R

O

O

HN

N

R

O

O

F I

HN

N

R

O

O

CH3HN

N

R

O

O

HN

N

R

O

O

BrHN

N

R

O

O

N

N

R

NH2

O

F

N

N

R

O

12

3 45

6



46

HN

N N

N

R

S

HN

N N

N

R

Se

HN

N N

N

R

S

H2N

N

N N

N

R

NH2

1

2

34

56 7

8

9

N

N NN

N

R

NH2

N N

N

R

NH2

N

N

N

R

NH2

HN

N N

R

O

N N

N

R

HN

N

N

R

O

H2NH2N H2N

OH

HN

N NN

N

R

O

H2N



47

4. Buněčný cyklus

1. Regulace buněčného cyklu

2. Mikrotubuly

48

➢ Buněčný cyklus je definován obdobím od vzniku buňky (která vznikla

dělením mateřské buňky) až do stadia, kdy dojde opět k rozdělení na dvě

buňky dceřiné (cytokineze)

➢ 2 stadia:

▪ M-fáze (mitotická fáze)

▪ Interfáze – G1, S a G2-fáze

➢ Některé buňky přechází po mitóze do klidové fáze, takzvané G0. Odtud

mohou po různě dlouhé době opět vstoupit do buněčného cyklu – aktivace

– nebo v klidovém stavu zůstat.

➢ G1-fáze – postmitotická fáze, 1. přípravná

- buňka zvětšuje svůj objem, vytváří se zásoba nukleotidů a syntetizují

se enzymy pro budoucí replikaci jaderné DNA

- leží zde hlavní kontrolní uzel cyklu

➢ S-fáze – syntetická fáze

- replikace jaderné DNA, současná syntéza histonů, aby se mohly

tvořit nové nukleosomy a chromatinové vlákno


49

➢G2-fáze - 2. přípravná

- závislá na dokončení replikace DNA v S fázi

-Jedná se o 2. generační fázi (premitotickou), při níž dochází ke

zvýšené syntéze a aktivaci proteinů (ke kondenzaci chromozomů,

ke tvorbě mitotického aparátu a destrukci jaderného obalu), končí

zahájením mitózy

➢ Mitóza

- jaderné dělení, poslední etapa buněčného cyklu

- chromozomy reduplikované do konce S fáze jsou ohraničeny,

sesterské chromatidy odděleny a přemístěny k protilehlým pólům

buňky (vlastní mitóza)

- dceřiné buňky obdrží 2 kompletní sady chromosomů a shodnou

výbavu cytoplazmatických organel


50

..\Videa\Cell Division and the Cell Cycle.mp4

..\Videa\Mitosis.mp4


../Videa/Cell Division and the Cell Cycle.mp4

../Videa/Mitosis.mp4

51

4. Buněčný cyklus - základní stadia

mitotického dělení u živočišných buněk

➢ Profáze - počáteční stádium mitózy, dochází ke kondenzaci

chromatinu, zaniká jadérko – místo, kde během interfáze dochází k

mohutné transkripci ribozomální RNA, vzniká dělící vřeténko. Každý

chromozom se nyní skládá ze dvou identických molekul DNA

(chromatid) spojených v místě centromery.

➢ Prometafáze - zaniká jaderná membrána a kondenzované

chromozomy se nyní nacházejí v cytoplazmě, zápětí přicházejí

chromozomy do kontaktu s mikrotubuly dělícího vřeténka, na něž se

svými kinetochory připojí. Za pomoci molekulárních motorů začínají

chromozomy postupovat směrem k ekvatoriální rovině buňky

➢ Metafáze – chromosomy se přesunují ke středu vřeténka do tzv.

ekvatoriální roviny. Pohyb chromozomů po mikrotubulech dělícího

vřeténka je zprotředkován kinetochory, proteinovými komplexy

nacházejícími se v oblasti centromery každého z chromozomů.

52

➢Anafáze – sesterské chromatidy se od sebe oddělí po

mikrotubulech dělícího vřeténka k opačným pólům, zároveň se od

sebe tyto póly (zpravidla tvořené centrozomy) vzdalují, jak se vůči

sobě posouvají polární mikrotubuly z opačných pólů vřeténka

➢ Telofáze – chromatidy se přesunou k opačným pólům vřeténka,

kde dekondenzují, výsledkem je vznik dvou dceřiných buněčných

jader a oddělení cytoplazmy, dochází k obnově jadérka, chromatinu a

jaderného obalu. V ekvatoriální rovině se zatím tvoří konstrikční rýha

pro rozdělení cytoplasmy a organel.



53

➢ Cytokineze - dochází k postupnému zaškrcení rýhy mezi 2

dceřinými buňkami, proběhne rekonstrukce buněčného jádra a

cytoplazmy obou buněk do interfázové podoby, je rekonstruován i

jaderný obal a napojení jeho zevní membrány na ER, chromosomy

jsou ve svých euchromatinových úsecích rozvolněny a využity k

transkripci, jadérko je obnoveno a tím jsou zahájeny procesy G1 fáze



54



55


Regulace buněčného cyklu

➢ Existují dva typy molekul, které hrají zásadní roli při regulaci buněčného

cyklu - cykliny a cyklin dependentní kinázy (CDK)

➢ tyto kinázy jsou v buňce přítomné neustále, ale jsou neaktivní

➢ v přítomnosti cyklinů se aktivují a začnou fosforylovat (a tím aktivovat

nebo deaktivovat) cílové proteiny, které buňku navedou do další fáze

buněčného cyklu

➢ aktivací různých CDK se ovlivní různé proteiny tak, jak buňka postupuje

fázemi buněčného cyklu

➢ jedná se o kaskádovitý děj - po obdržení extracelulárního pro-

mitotického signálu se aktivuje G1 cyklin-CDK a připraví buňku na přechod

do S fáze. Zahájí syntézu transkripčních faktorů, které jsou nutné pro

expresi S cyklinů a enzymů potřebných pro replikaci DNA. Také způsobí

degradaci molekul, které inhibují přechod buňky do S fáze

56


➢ aktivní S cyklin-CDK fosforylují proteiny prereplikačních komplexů

a tím je jednak aktivují a jednak zabrání vzniku nových

prereplikačních komplexů

➢ důvodem je, aby jich bylo správné množství a celý genetický

materiál byl zkopírován právě jednou

➢ aktivací dalších cyklin-CDK a proteinů dojde k přechodu do G2

fáze

➢ během S a G2 fáze se syntetizují neaktivní mitotické cyklin-CDK, ty

se aktivují na přechodu do M fáze


57


Kontrolní uzly

➢ Během buněčného cyklu existuje několik kontrolních bodů, kdy buňka

zjišťuje připravenost na další fázi buněčného cyklu a pokud zjistí, že

připravena není, pak přechod zablokuje, případně zahájí apoptózu.

➢ Prvním kontrolním uzlem je přechod G1/S. Pokud jsou vnější podmínky

nepříznivé pro děleni a nebo existuje poškození buňky, zablokuje se přechod

z G1 do S fáze.

➢ Druhým kontrolním uzlem je přechod G2/M. Zde se buněčný cyklus

zastaví v případě poškození DNA. Buňky zůstanou v G2 fázi, dokud není

DNA plně replikovaná, případně pokud je jinak poškozená.

➢ Třetím kontrolním uzlem je přechod M/G1. Buněčný cyklus se zastaví při

přechodu z metafáze do anafáze, pokud nejsou chromozómy dokonale

připojené k dělícímu vřeténku.


58


Narušení cyklu buněčného dělení nádorových buněk nebo

transformovaných buněk hemopoetického systému je cílem

antineoplastické chemoterapie.


59

4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly

Mikrotubuly

➢ jsou jedny z vláken cytoskeletu, která slouží především k transportu

různých struktur a látek uvnitř buňky

➢ umožňují pohyb chromosomů při buněčné mitóze

➢ dlouhé rovné válcovité struktury o průměru 180-250 Å

➢ mikrotubuly jsou rozloženy po celé buňce a jsou víceméně

zodpovědné za rozmístění organel

➢ po rozvolnění jaderné membrány v prometafázi vnikají mikrotubuly do

prostoru jádra a prostřednictvím motorických proteinů (kinesin a dynein)

vážou chromosomy, které pak transportují do ekvatoriální roviny vřeténka

a k jeho pólům

60

4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubulyMikrotubuly

➢ Mikrotubuly mají dvě vazebná místa pro GTP nebo GDP a na tom, zda

v těchto místech je GDP nebo GTP, závisí jejich stabilita.

➢ V případě, že je tam navázáno GTP, jsou stabilnější a proces

depolymerizace je pomalejší než proces polymerizace, mikrotubuly tedy

rostou.

➢ V případě, že je tam navázán GDP, depolymerizace převáží a

mikrotubuly se zkracují. Samotná polymerizace tubulinu do mikrotubulů

probíhá na úkor štěpení GTP.

➢podél osy jsou rozloženy subjednotky proteinu – tubulinu

➢ uměle můžeme způsobit jejich rozpad alkaloidem kolchicinem (z

ocúnu) a stabilizovat jejich polymeraci můžeme alkaloidem taxolem

(který se získává z tisu)

➢ oba tyto alkaloidy inhibují mitózu!

61

Tubulin

➢ kyselý protein s GTPasovou aktivitou

➢ uspořádán do dimerových jednotek složených z α-tubulinu a β-

tubulinu

➢ každá molekula alfa i beta-tubulinu obsahuje vazebné místo pro GTP,

jehož štěpením se uvolňuje energie - vazba je silně ovlivněna Ca2+ a

Mg2+

➢ v jejich blízkosti jsou vazebná místa charakterizovaná vazbou

kolchicinu nebo vinca alkaloidů

➢ polymerizace tubulinu probíhá na úkor štěpení GTP --- GDP

➢ při nedostatku GTP se váže jen vzniklý GDP, vazba je výrazně slabší,

proto dochází k depolymerizaci – dynamická nestabilita

➢ dimery tubulinů spolu tvoří dlouhé řetězce, v nichž na sebe navazují

vždy alfa-tubulin na beta-tubulin

➢ nikdy se dimery na sebe nemohou navázat souhlasnými typy tubulinů

➢ jeden řetězec se nazývá protofilament


62


63


64

Schematické znázornění struktury

mikrotubulu

➢ Tubulinové dimery jsou seřazeny do

13 protofilament, která jsou vzájemně

posunuta o 9 nm a vytváří tak levotočivou

šroubovici.

➢ Nahoře je tzv. plus-konec

mikrotubulu, na němž polymerace

tubulinu probíhá rychleji (vystavuje β-

podjednotku tubulinu s E-vazebným

místem pro nukleotid)

➢ K polymeraci (přidávání) a disociaci

(odebírání) dimerů bude docházet jen na

koncích mikrotubulu. Ten konec

mikrotubulu, který je zakončen beta-

tubulinem, má schopnost růstu a proto se

nazývá plus konec. Naopak mínus konec

bude zakončen alfa-tubulinem a bude tam

docházet k disociaci.

➢ Mikrotubulus má průměr 25 nm.


65

Dynamická nestabilita

➢ Polymerace a disociace neprobíhá najednou, ale samostatně

➢ závisí to na existenci tzv. GTP čepičky, která je posazená na plusovém

konci mikrotubulu

➢ jedná se o připojené beta-tubuliny, které na sobě mají navázané GTP

➢ později, až odroste tato nově navázaná část blíže ke středu

mikrotubulu, tak se GTP rozštěpí na GDP a tento beta-tubulin s GDP, již

nebude patřit do GTP čepičky

➢ GTP způsobuje to, že mikrotubul roste rovně, GDP má tendenci se

ohýbat

➢ když nastane situace, že se přestanou polymerovat beta-tubuliny s

GTP do GTP čepičky, dojde k disociaci mikrotubulu na mínusovém konci


http://cs.wikipedia.org/wiki/Soubor:Kinesin_cartoon.png

66

V rámci mitózy fungují mikrotubuly následujícím způsobem:

➢ po rozvolnění jaderné membrány mikrotubuly narostou od pólů buňky k

jednotlivým chromozómům, připojí se k jejich centrálním částem pomocí

motorových proteinů a transportují je do rovníkové oblasti buňky

➢ ke každé kopii chromozómu je připojen mikrotubul z opačné strany buňky

➢ mikrotubuly připojené k centromerám se začnou zkracovat, motorové

proteiny po nich posouvají chromatidy každou k jinému pólu buňky

➢ v každé polovině dělící se buňky tak zůstane jeden kompletní set

chromozomů.


67

Mitotické vřeténko při metafázi:

➢Při metafázi se chromozómy seřadí v rovníkové oblasti dělícího vřeténka.

➢ Z centrozomů, které jsou umístěné na pólech vřeténka, vyrostou

mikrotubuly směrem k chromozómům a obě sesterské chromatidy každého

chromozómu se připojí k těmto mikrotubulům (zelené) prostřednictvím

svých kinetochorů.

➢ Kromě těchto mikrotubulů jsou v dělícím vřeténku přítomné dva další typy

mikrotubulů – polární mikrotubuly (červené), které vybíhají z obou

centrozomů a v ekvatoriální oblasti se překrývají a astrální mikrotubuly

(modré), které rostou z centrozomů směrem k okraji buňky.

➢ Všechny tři typy mikrotubulů mají (-) konec u centrozomů a (+) konec

směrem od centrozomů.


68


Mitotické vřeténko při metafázi:

69


Mitotické vřeténko při anafázi:

➢ Při anafázi se oddělí sesterské chromatidy a pohybují se směrem

k pólům buňky.

➢ Děje se tak prostřednicvím mikrotubulů připojených ke

kinetochorům.

➢ Tyto mikrotubuly se zkracují na svých (+) koncích a současně

motorové proteiny připojené ke kinetochorům posouvají chromatidy

podél zkracujícího se vlákna směrem k (-) konci, sesterské

chromatidy tak zůstávají připojeny ke zkracujícím se mikrotubulům.

70


Mitotické vřeténko při anafázi:

71

➢ v blízkosti vazebných míst pro GTP jsou vazebná místa charakterizovaná

vazbou kolchicinu nebo vinca alkaloidů

➢ charakteristika je náhodná , v systému přirozené polymerizace tubulinu

nehraje žádnou roli

➢ všechny látky, které se mohou vázat do těchto center, však silně narušují

tvorbu komplexu s GTP a bráni tak polymerizaci tubulinu

➢ proto dochází k jeho spontánní depolymerizaci, zastavuje se pohyb

motorických proteinů, zprotředkovaný mikrotubuly (včetně pohybu

chromosomů), a tím se zastaví i buněčná mitóza

➢ látky narušující polymerizaci tubulinu mají proto obecně antineoplastický

účinek a mnohé z nich se používají v terapii nádorů a malignit

hemopoietického systému


72

5. Chemoterapie nádorových onemocnění

Chemoterapie nádorových onemocnění může být rozdělována do

následujících typů:

•Primární – základní metoda léčby

•Adjuvantní – doplňuje primární metodu léčby, většinou se podává po

operaci nebo po radioterapii s cílem podpořit účinek

•Neoadjuvantní – tato chemoterapie bývá podávána před operací nebo

radioterapií s cílem zlepšit operabilitu a usnadnit vlastní výkon

nebo také na:

•Kurativní - podání chemoterapie s cílem vyléčit. Někdy též radikální.

Běžné jsou vysoké dávky a tedy i vyšší nežádoucí účinky.

•Paliativní – udržovací či doplňková podávána pro zlepšení stavu pacienta

po operačním výkonu s cílem zamezit opětnému růstu nádoru nebo

dokonce dosáhnout různě dlouhé remise.

73

Typy nádorů v souvislosti s chemoterapií dělíme na:

•chemosenzitivní – nádor je citlivý na chemoterapii

•chemokurabilní – nádor je citlivý na chemoterapii a navíc je podání

cytostatik pro pacienta přínosné

•chemorezistentní – nádor není citlivý na chemoterapii


74

Chemoterapeutika dělíme do několika základních skupin, které jsou

popsány níže spolu s významnými zástupci z každé skupiny:

•Alkylační cytostatika - dusíkatá analoga yperitu (Chlorambucil,

Chlormethine, Cyklofosfamide, Ifosfamide, Melphalan), Busulfan,

Dacarbazine, Mechlorethamine, Procarbazine, Temozolomide,

ThioTEPA, Uramustine

•Antimetabolity - deriváty kyseliny listové (Aminopterin, Methotrexate,

Pemetrexed, Raltitrexed), purinová analoga (Cladribine, Clofarabine,

Fludarabine, Mercaptopurine, Thioguanine), pyrimidinová analoga

(Capecitabine, Catarabine, Fluorouracil, Gemcitabine)

•Rostlinné alkaloidy - Taxol (Docetaxel, Paclitaxel), vinca alkaloidy

(Vinblastine, Vincristine, Vindesine, Vinorelbine)

•Cytotoxická/protinádorová antibiotika - anthracykliny (Daunorubicin,

Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Mitoxandrone, Valrubicin),

Bleomycin, Hydroxyurea, Mitomycin


75

•Inhibitory topoizomeráz - Topotecan, Irinotecan, podophyllotoxiny

(Etoposide, Teniposide)

•Monoklonální protilátky - Alemtuzumab, Bevacizumab, Cetuximab,

Gemtuzumab, Panitumumab, Rituximab, Tositumomab, Trastuzumab

•Photosenzitizéry – Aminolevulová kysleina, Methyl aminolevulinát,

Porfimer sodium, Verteporfin

•Inhibitory kináz - Dasatinib, Erlotinib, Gefitinib, Imatinib, Lapatinib,

Milotinib, Sorafenib, Sumitimib, Vandetamib

•Ostatní - Alitretinoin, Altretamine, Amsacrine, Anagrelide, Arsenic

trioxide, Asparaginase, Bexarotene, Bortezomib, Denileukin diftitox,

Wstramustine, Hydrxycarbamide, Pentostatin, Masoprocol, Mitotane,

Pegaspargase, Tretinoin


76

1948 Metotrexát Farber 1967 Carmustine

1953 Mitomycin C Yamamoto 1969 Fludarabin

1954 6-merkaptopurin Hitchings, Elion 1969 Doxorubicin Dimarco

1954 Actinomycin Yamamoto 1971 Mithramycin A

1957 5-fluorouracil Heidelberger 1972 Streptozotocin

1958 cyklofosfamide Arnold 1972 Lomustine

1958 Busulfane 1976 Ftorafur Hiller

1960 Cytarabin 1978 Misonidazol

1961Vinkristin,

VinblastinSvoboda 1980 Doxyfluridin

1963 Hydroxyurea 1981 Mitaxanthron Cheng

1963 Nitrosomočoviny Montgomery 1985 Karboplatin Smith

1963 Daunorubicin Dimarco 1986Topotecan

(Camptothecin)

1965 Cisplatina Rosenberg 1988 Gemcitabin Ukeda

1966 Bleomycin Ume Zawa 1992 Taxol


77

1. Replikace

2. Transkripce

3. Translace

4. Stručný náhled do genové regulace

6. Centrální dogma a genová regulace

..\Videa\YouTube - From DNA to Protein.flv

../Videa/YouTube - From DNA to Protein.flv

78


79

Replikace

➢ Proces, kterým se kopíruje genetická informace z mateřské DNA do

nové, dceřiné molekuly.

➢ Jednotlivé řetězce v dvoušroubovici DNA jsou vzájemně

komplementární, vytváří kanonické páry bází A-T, G-C.

➢ Při replikaci se vlákna od sebe oddělí a ke každému vláknu

dosyntetizují polymerázy vlákno nové, opět komplementární.

➢ Přesnost při přenosu informací způsobuje to, že dceřiné organizmy

fungují podobně nebo stejně jako organizmus mateřský.

➢ Nepřesnosti při replikaci pak vedou k mutacím.

➢ Replikace je součástí buněčného cyklu, na základě vnějšího nebo

vnitřního signálu buňka spustí proces, během něhož kromě mnoha

dalších věcí začne replikovat DNA.


80

Replikace

➢ V určitém místě vznikne replikační vidlička - DNA helikáza (často

spojená s primázou) zruší Watson-Crickovy vodíkové vazby a rozvolní

vlákna DNA od sebe.

➢ V určitém úseku tak vzniknou dva úseky jednovláknové DNA a

vzhledem k tomu, že jsou antiparalelní a DNA polymerázy umí pracovat

jen v jednom směru (syntéza probíhá ve směru 5´-3´ tedy templát musí

být orientován opačně, 3´-5´), probíhá replikace každého z nich odlišně.

➢ Jedno vlákno se nazývá vedoucí (leading) a druhé opožďující se

(lagging).

➢ Na vedoucím vlákně probíhá syntéza nové DNA kontinuálně.

➢ Na opožďujícím se vlákně musí replikační mašinérie počkat, až je

rozpletený dostatečně dlouhý úsek (obvykle několik set bází dlouhý), a

pak začne syntéza RNA primeru, který poskytne požadovaný 3‘ konec, a

následně vlastní DNA, která proběhne až k původnímu místu vzniku

vidličky.

➢ Tomuto vzniklému úseku se říká Okazakiho fragment.


81

Replikace

➢Mezitím probíhá dále rozplétání dvoušroubovice a syntéza na vedoucím

vlákně.

➢ Až se odhalí další dostatečně dlouhý úsek opožďujícího se vlákna,

zopakuje se celá syntéza RNA primeru a DNA.

➢ Tímto způsobem vznikne proti vedoucímu vláknu nové vlákno DNA a

proti opožďujícímu se vláknu řada krátkých vláken DNA, každé začínající

RNA primerem.

➢ V tento okamžik přistoupí znovu DNA polymeráza (pol u eukaryot),

která odstraní primery a nahradí je DNA.

➢ Nakonec enzym ligáza přerušené úseky DNA spojí do jednoho vlákna.

➢ Vznik RNA primeru pomocí primáz je nezbytný, protože DNA

dependentní DNA polymerázy neumí syntetizovat oligonukleotidový

řetězec de novo, umí pouze prodlužovat již existující vlákno.


82

Replikace

Pro replikaci jsou potřebné tyto enzymy a proteiny:

➢ Helikáza - odděluje komplementární vlákna DNA, zdrojem energie je

ATP.

➢ DNA vazebný protein - protein, který se váže na jednoduché vlákno

DNA po oddělení helikázou, aby zabránil opětovnému spojení do

dvoušroubovice.

➢ RNA primáza - začne de novo syntetizovat RNA vlákno komplementární

k DNA vláknu.

➢ Poté, co je RNA primer cca 7-14 nukleotidů dlouhý, vystřídá RNA

primázu DNA polymeráza (pol ), která vytvoří DNA primer, cca 35

nukleotidů dlouhý.

➢ Nakonec jiná DNA polymeráza (pol a pol ) dokončí syntézu řetězce

(až několik tisíc bází).

➢ Ligáza - spojuje kratší úseky DNA do delších.


83

Replikace

➢ Replikace celého genomu eukaryotické buňky probíhá na mnoha

místech současně.

➢ Replikační vidlička se obvykle vytváří jedna na úsek o několika tisících

nukleotidů.

➢ Při replikaci vznikají z jedné dvoušroubovice DNA dvě dvoušroubovice

a v obou nových dvoušroubovicích pochází jedno vlákno z původní DNA

a druhé je nově syntetizované, jedná se tedy o semikonzervativní proces.

➢ Specifické DNA polymerázy jsou v bakteriích a virech a jsou tak

zajímavým cílem pro selektivní inhibici, jejich inhibováním je někdy

možno zpomalit replikaci patogenů, v jiných případech je

mikroorganizmus schopen využít replikačního mechanizmu hostujících

buněk.

➢ DNA polymerázy jsou obecně vhodné cíle léčby nádorových

onemocnění, protože v nádorové tkáni probíhá replikace v daleko větším

měřítku než v normální tkáni a její inhibice tak poškodí více nádor než

zdravou tkáň.


84

Transkripce

➢ proces přenosu genetické informace z DNA na mRNA

➢ mRNA potom slouží jako matrice pro syntézu proteinů

➢ transkripce probíhá v jádře, kde DNA dependentní RNA polymerázy

syntetizují řetězec RNA, který je komplementární k jaderné DNA

➢ tato RNA se označuje jako pre-mRNA a obsahuje tzv. introny a exony

➢ exony nesou vlastní genetickou informaci, introny jsou oblasti primárního

transkriptu, jež nejsou translatovány do struktury proteinu

➢ finální mRNA vznikne z pre-mRNA odstraněním intronů a připojením

polyA konce a 5‘-čepičky

➢ toto jsou charakteristiky, podle kterých buňka pozná, že se jedná o

mRNA, tedy matrici pro syntézu proteinů a mRNA je těmito částmi

chráněna před degradací nukleázami


85

6. Centrální dogma a genová regulaceTranskripce

86

Transkripce

➢ je regulována pomocí tzv. transkripčních faktorů (TF), které se váží na

promotorové oblasti cílových genů

➢ celá řada signálních cest ovlivňuje chování TF – jejich schopnost vázat

se na cílové sekvence, stabilitu a lokalizaci

➢ vzniklá mRNA je transportována z jádra do cytoplazmy, kde dochází

k dalšímu procesu – translaci


87


Translace

➢ přepis informace z mRNA do primární struktury proteinu

➢ probíhá na ribozómech

➢ ribozóm se skládá z malé a velké podjednotky a tvoří jej RNA s funkcí

katalyzátoru a podpůrné proteiny

➢ molekula mRNA slouží jako matrice

➢ k ribozómu dále přistupuje tRNA, nesoucí na jedné své části příslušné

aminokyseliny a obsahující sekvenci tří nukleotidů (kodonů) specifických

pro každou aminokyselinu v jiné části

➢ nukleotidová sekvence tRNA je komplementární k sekvenci v mRNA a

tedy pořadí trojic nukleotidů (tripletů, kodonů) v mRNA určuje pořadí

aminokyselin ve vznikajícím proteinu

Documents

Kapitoly z bioorganické chemie OCH/KBCH · 2017-04-26 · 2 1. Úvod •Holý, A. Principy bioorganické chemie ve vývoji antivirotik a cytostatik, UP Olomouc, 2004 •Blackburn