K. Morita, R.A. North and T. Tokimasa- Muscarinic Agonists Inactivate Potassium Conductance of Guinea-Pig Myenteric Neurones

8/3/2019 K. Morita, R.A. North and T. Tokimasa- Muscarinic Agonists Inactivate Potassium Conductance of Guinea-Pig Myente

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J . P h y s i o l . ( 1 9 8 2 ) , 3 3 3 , p p . 1 2 5 - 1 3 9 1 2 5W i t h 1 1 t e x t - J i g u r e 8P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n

MUSCARINIC AGONISTS INACTIVATE POTASSIUM CONDUCTANCEOF GUINEA-PIG MYENTERIC NEURONES

BY K . MORITA, R . A . NORTH AND T . TOKIMASAFrom t h e N e u r o p h a r m a c o l o g y L a b o r a t o r y , D e p a r t m e n t o f N u t r i t i o n a n d F o o d S c i e n c e ,

M a s s a c h u 8 e t t s I n 8 t i t u t e o f T e c h n o l o g y , C a m b r i d g e , MA 0 2 1 9 3 , U . S . A .( R e c e i v e d 2 2 J a n u a r y 1 9 8 2 )

SUMMARY1 . T h e e f f e c t s o f m u s c a r i n i c a g o n i s t s a p p l i e d b o t h b y p e r f u s i o n a n d i o n o p h o r e s i st o m y e n t e r i c n e u r o n e s o f t h e g u i n e a - p i g i l e u m w e r e i n v e s t i g a t e d b y i n t r a c e l l u l a r

r e c o r d i n g m e t h o d s .2 . P e r f u s i o n w i t h m u s c a r i n i c a g o n i s t s ( a c e t y l c h o l i n e , o x o t r e m o r i n e , m e t h a c h o l i n e ,b e t h a n e c h o l ) i n c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 0 nm t o 1 0 , U M c a u s e d membrane d e p o l a r i z a t i o n s .B r i e f i o n o p h o r e t i c a p p l i c a t i o n s o f o x o t r e m o r i n e , o r a c e t y l c h o l i n e i n t h e p r e s e n c e o fh e x a m e t h o n i u m , e v o k e d d e p o l a r i z a t i o n s w i t h a l a t e n c y o f 1 0 0 m s t o 1 s a n d ad u r a t i o n o f 5 - 6 0 s .3 . Th e d e p o l a r i z a t i o n s w e r e c o m p l e t e l y a n t a g o n i z e d b y l o w c o n c e n t r a t i o n s( 1 - 1 0 n M ) o f t h e m u s c a r i n i c a n t a g o n i s t s h y o s c i n e o r a t r o p i n e .

4 . Th e l a t e n c y a n d t i m e c o u r s e o f t h e m u s c a r i n i c d e p o l a r i z a t i o n s w e r e a b o u t o n et h o u s a n d t i m e s l o n g e r t h a n t h o s e o f n i c o t i n i c r e s p o n s e s e v o k e d i n t h e s a m e c e l l b ya c e t y l c h o l i n e a p p l i e d f r o m t h e s a m e i o n o p h o r e s i s e l e c t r o d e .5 . T h e m u s c a r i n i c d e p o l a r i z a t i o n was a s s o c i a t e d w i t h a c o n d u c t a n c e d e c r e a s e a n dr e v e r s e d p o l a r i t y a t a membrane p o t e n t i a l c l o s e t o t h e p o t a s s i u m e q u i l i b r i u mp o t e n t i a l .6 . T h e m u s c a r i n i c d e p o l a r i z a t i o n b e c a m e s m a l l e r b u t d i d n o t d i s a p p e a r c o m p l e t e l yd u r i n g p r o l o n g e d ( u p t o 6 0 m i n ) p e r f u s i o n o r r e p e a t e d ( m o r e t h a n 0 O 0 2 H z ) i o n o p h o r e t i ca p p l i c a t i o n s o f m u s c a r i n i c a g o n i s t s .7 . L o w e r c o n c e n t r a t i o n s ( 3 - 3 0 n M ) o f o x o t r e m o r i n e , w h i c h d i d n o t c h a n g e m e m-b r a n e p o t e n t i a l , r e d u c e d t h e a m p l i t u d e a n d d u r a t i o n o f t h e c a l c i u m - d e p e n d e n ti n c r e a s e i n p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e w h i c h f o l l o w s a b u r s t o f a c t i o n p o t e n t i a l s .8 . I t i s c o n c l u d e d t h a t t h e m u s c a r i n i c d e p o l a r i z a t i o n o f m y e n t e r i c n e u r o n e s i s d u et o p o t a s s i u m i n a c t i v a t i o n .

INTRODUCTIONA c e t y l c h o l i n e ( A C h ) c a n c a u s e b o t h m u s c a r i n i c a n d n i c o t i n i c r e s p o n s e s i n a u t o n o m i c

n e u r o n e s . T h e n i c o t i n i c d e p o l a r i z a t i o n i s r e s p o n s i b l e f o r t h e g e n e r a t i o n o f t h e f a s te x c i t a t o r y p o s t - s y n a p t i c p o t e n t i a l ( e . p . s . p . ) ( N i s h i & K o k e t s u , 1 9 6 0 ) , w h e r e a s i n someg a n g l i a t h e m u s c a r i n i c r e c e p t o r m e d i a t e s much more p r o l o n g e d s y n a p t i c p o t e n t i a l so f b o t h p o l a r i t i e s ( L i b e t , 1 9 6 4 ; N i s h i & K o k e t s u , 1 9 6 8 ; H a r t z e l l , K u f f l e r , S t i c k g o l d& Y o s h i k a m i , 1 9 7 7 ; Horn & D o d d , 1 9 8 1 ) .

) by guest on October 27, 2010jp.physoc.orgDownloaded from J Physiol (
http://jp.physoc.org/http://jp.physoc.org/http://jp.physoc.org/


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K . MORITA, R . A ; NORTH AND T . TOKIMASAM y e n t e r i c n e u r o n e s o f t h e g u i n e a - p i g i l e u m a l s o h a v e n i c o t i n i c f a s t e . p . s . p . s ( N i s h i& N o r t h , 1 9 7 3 ) b u t t h e a c t i o n o f m u s c a r i n i c a g o n i s t s h a s n o t b e e n s t u d i e d . T h ep u r p o s e o f t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t s w a s t o d e t e r m i n e t h e n a t u r e a n d i o n i c m e c h a n i s mo f t h e a c t i o n o f m u s c a r i n i c a g o n i s t s o n membrane p r o p e r t i e s o f m y e n t e r i c n e u r o n e s .

A p r e l i m i n a r y r e p o r t h a s a p p e a r e d ( T o k i m a s a , M o r i t a & N o r t h , 1 9 8 1 ) .METHODS

A d u l t g u i n e a - p i g s ( 2 5 0 - 3 5 0 g ) w e r e h e a v i l y s t u n n e d a n d b l e d f r o m t h e n e c k . T h e i l e u m w a sr a p i d l y r e m o v e d a n d p l a c e d i n K r e b s s o l u t i o n o f t h e f o l l o w i n g c o m p o s i t i o n ( m M ) : N a C l , 1 1 7 ; K C l ,4 - 7 ; C a C l 2 , 2 - 5 ; , ; M g C l 2 , 1 - 2 ; N a H 2 P O 4 , 1 - 2 ; NaHCO3, 2 5 ; g l u c o s e , 1 1 ; g a s s e d w i t h 5% C O 2 a n d9 5 % 0 2 . T h e m y e n t e r i c p l e x u s - l o n g i t u d i n a l m u s c l e p r e p a r a t i o n u s e d w a s p r e p a r e d a s d e s c r i b e d b yN i s h i & N o r t h ( 1 9 7 3 ) . S i n g l e m y e n t e r i c g a n g l i a w e r e i m m o b i l i z e d b y m e a n s o f p i n n i n g t h r o u g h t h ec l o s e l y a d j a c e n t m u s c l e u s i n g s t a i n l e s s s t e e l p i n s o f 1 0 A i m i n d i a m e t e r . T h e g a n g l i o n w a s v i s u a l i z e db y d i f f e r e n t i a l i n t e r f e r e n c e c o n t r a s t o p t i c s ( t o t a l m a g n i f i c a t i o n x 5 0 0 ) . I n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g s w e r emade w i t h g l a s s m i c r o - e l e c t r o d e s c o n t a i n i n g 2 M - p o t a s s i u m c h l o r i d e ( d . c . r e s i s t a n c e 6 0 - 1 0 0 M C I ) ,u s i n g a p r e - a m p l i f i e r (WP i n s t r u m e n t s , M 7 0 1 ) w h i c h p e r m i t t e d c u r r e n t i n j e c t i o n . V a l u e s f o r r e s t i n gp o t e n t i a l w e r e d e t e r m i n e d b y s u d d e n w i t h d r a w a l o f t h e m i c r o - e l e c t r o d e . A g l a s s m i c r o - e l e c t r o d e( t i p d i a m e t e r 1 0 - . 3 0 , u m ) f i l l e d w i t h K r e b s s o l u t i o n w a s u s e d t o s t i m u l a t e n e u r o n a l e l e m e n t s w i t h i nt h e g a n g l i o n . T h e t i p o f t h i s e l e c t r o d e w a s p o s i t i o n e d o n t h e s u r f a c e o f t h e g a n g l i o n a n d movedt o d i f f e r e n t p o s i t i o n s a r o u n d t h e i m p a l e d n e u r o n e u n d e r v i s u a l c o n t r o l . S i n g l e o r r e p e a t e d c a t h o d a lc u r r e n t p u l s e s ( 1 0 0 - 5 0 0 u s d u r a t i o n ) w e r e p a s s e d t h r o u g h t h i s e l e c t r o d e .M y e n t e r i c n e u r o n e s w e r e c l a s s e d a c c o r d i n g t o t h e c r i t e r i a o r i g i n a l l y p r o p o s e d b y N i s h i & N o r t h( 1 9 7 3 ) a n d H i r s t , Holman & S p e n c e ( 1 9 7 4 ) . I f t h e n e u r o n e r e s p o n d e d t o f o c a l s t i m u l a t i o n w i t h af a s t e x c it a t o r y p o s t - s y n a p t i c p o t e n t i a l ( e . p . s . p . ) i t w a s c a l l e d a T y p e 1 ( S ) c e l l . T h o s e n e u r o n e s w h i c hh a d n o f a s t e . p . s . p . a n d w h i c h s h o w e d a p r o l o n g e d a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n f o l l o w i n g a s i n g l e s o m aa c t i o n p o t e n t i a l w e r e c a l l e d T y p e 2 ( A H ) c e l l s . T h e p r e p a r a t i o n w a s p e r f u s e d ( 1 - 4 m l / m i n ) w i t ha p r e - h e a t e d K r e b s s o l u t i o n s o t h a t t h e t e m p e r a t u r e a t t h e r e c o r d i n g s i t e w a s k e p t a t 3 6 - 3 7 T C .D i f f e r e n t s o l u t i o n s w e r e a p p l i e d t o t h e p r e p a r a t i o n b y m e a n s o f a t a p w h i c h c h a n g e d t h e i n f l o wt o t h e t i s s u e . T h e b a t h v o l u m e w a s 1 - 2 m l . S o l u t i o n s o f d i f f e r i n g i o n i c c o m p o s i t i o n w e r e m a i n t a i n e di s o - o s m o t i c b y a d j u s t i n g t h e s o d i u m c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n .A c e t y l c h o l i n e a n d o x o t r e m o r i n e w e r e a p p l i e d b y i o n o p h o r e s i s . T h e i o n o p h o r e s i s e l e c t r o d e sc o n t a i n e d ACh c h l o r i d e ( 1 0 0 mM) o r o x o t r e m o r i n e s e s q u i f u m a r a t e ( 3 0 m M ) . T h e t i p o f s u c h a ne l e c t r o d e w a s p o s i t i o n e d w i t h i n 3 - 1 0 s u m o f t h e s o m a o f t h e n e u r o n e f r o m w h i c h t h e i n t r a c e l l u l a rr e c o r d i n g w a s m a d e , a n d o u t w a r d c u r r e n t p u l s e s w e r e u s e d t o e j e c t t h e d r u g s . A s m a l l ( 3 n A ) i n w a r dc u r r e n t w a s r o u t i n e l y a p p l i e d t o r e d u c e d i f f u s i o n .D r u g s u s e d w e r e a c e t y l c h o l i n e c h l o r i d e ( S i g m a ) , o x o t r e m o r i n e s e s q u i f u m a r a t e ( A l d r i c h ) , h e x a -m e t h o n i u m b r o m i d e ( S i g m a ) , a t r o p i n e s u l p h a t e ( M S D ) , h y o s c i n e h y d r o c h l o r i d e ( S i g m a ) , m e t h a c h o -l i n e b r o m i d e ( C a l b i o c h e m ) , b e t h a n e c h o l c h l o r i d e ( S i g m a ) , a n d t e t r o d o t o x i n ( S a n k y o ) .RESULTS

M u s c a r i n i c d e p o l a r i z a t i o nA p p l i c a t i o n b y p e r f u s i o n . M e t h a c h o l i n e , o x o t r e m o r i n e , a c e t y l c h o l i n e ( A C h ) a n db e t h a n e c h o l g a v e e s s e n t i a l l y s i m i l a r r e s u l t s , b u t i n t h e m a j o r i t y o f e x p e r i m e n t sm e t h a c h o l i n e o r o x o t r e m o r i n e w e r e u s e d . T h e s e m u s c a r i n i c a g o n i s t s c a u s e d am e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n w h i c h r e a d i l y r e a c h e d t h r e s h o l d f o r a c t i o n p o t e n t i a lg e n e r a t i o n ( F i g . 1 ) . T h e d e p o l a r i z a t i o n b e g a n w i t h i n 1 0 - 3 0 s o f t h e d r u g - c o n t a i n i n gs o l u t i o n r e a c h i n g t h e t i s s u e , a n d t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l r e t u r n e d t o i t s o r i g i n a l v a l u e

w i t h i n 5 - 1 0 m i n o f w a s h i n g w i t h d r u g - f r e e s o l u t i o n . F o r a g i v e n a g o n i s t , t h ea m p l i t u d e o f t h e d e p o l a r i z a t i o n w a s d e p e n d e n t o n t h e c o n c e n t r a t i o n a p p l i e d ( F i g . 2 ) .O x o t r e m o r i n e w a s a p p r o x i m a t e l y t e n t i m e s m o r e p o t e n t t h a n m e t h a c h o l i n e .

1 2 6



3/15

MUSCARINIC EFFECTS ON O K 1 2 7A

B

a - Ta~ ~ b cd a 50mVEd_ \_ ~ f a I nA

2 5 mF i g . 1 . M e t h a c h o l i n e d e p o l a r i z a t i o n . A , d u r i n g t h e p e r i o d i n d i c a t e d b y t h e f i l l e d b a r t h ep e r f u s i n g s o l u t i o n c o n t a i n e d m e t h a c h o l i n e ( 1 0 / S M ) . A c t i o n p o t e n t i a l s ( f u l l h e i g h t n o tr e c o r d e d ) w e r e e v o k e d b y s t i m u l a t i n g p r e s y n a p t i c n e r v e s , e x c e p t d u r i n g m e t h a c h o l i n ea p p l i c a t i o n when t h e c e l l f i r e d s p o n t a n e o u s l y . Downward d e f l e c t i o n s a r e a n e l e c t r o t o n i cp o t e n t i a l s c a u s e d b y p a s s i n g a c o n s t a n t c u r r e n t p u l s e a c r o s s t h e c e l l m e m b r a n e . B ,o s c i l l o s c o p e r e c o r d s a t d i f f e r e n t t i m e s d u r i n g A . a , e . p . s . p . a n d a c t i o n p o t e n t i a l ; b , d u r i n gm e t h a c h o l i n e d e p o l a r i z a t i o n t h e e . p . s . p . i s much r e d u c e d ; c , w a s h o u t ; d , a n e l e c t r o t o n i cp o t e n t i a l ; e , d u r i n g m e t h a c h o l i n e d e p o l a r i z a t i o n t h e r e s i s t a n c e w a s i n c r e a s e d a n d a n o d eb r e a k e x c i t a t i o n o c c u r r e d ; f , w a s h o u t . R e s t i n g p o t e n t i a l w a s -60 mV.

Ec0-c oN_0 .a

/ //

-,A g o n i s t c o n c e n t r a t i o n ( l o g M )

F i g . 2 . D e p o l a r i z a t i o n i n d u c e d b y p e r f u s i o n w i t h m u s c a r i n i c a g o n i s t s a s a f u n c t i o n o fa g o n i s t c o n c e n t r a t i o n . 0, o x o t r e m o r i n e ; *, m e t h a c h o l i n e . B a r s i n d i c a t e S . E . o f mean f o rn u m b e r o f o b s e r v a t i o n s ( T y p e 1 n e u r o n e s ) i n d i c a t e d .



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K . MORITA, R . A . NORTH AND T . TOKIMASAD e p o l a r i z a t i o n s w e r e l e s s o f t e n o b s e r v e d i n Type 2 ( A H ) n e u r o n e s a n d e f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o n s w e r e g e n e r a l l y h i g h e r t h a n t h o s e d e p o l a r i z i n g Type 1 ( S ) n e u r o n e s .

A p p l i c a t i o n b y i o n o p h o r e s i s . P a s s a g e o f s m a l l c u r r e n t s ( 5 - 3 0 n A , 01-40 m s ,2 - 1 0 0 p C ) t h r o u g h t h e A C h - c o n t a i n i n g p i p e t t e i n d u c e d d e p o l a r i z a t i o n s i n Type 1 ( S )n e u r o n e s w h i c h h a d a m p l i t u d e s a n d t i m e c o u r s e s s i m i l a r t o t h e f a s t e . p . s . p . T h e s e

A

1 0 , 1 0 1 0 , 5 0 1 0 , 1 0 0 1 5 , 1 0 0 0n A , ms

2 1 5 1 0 MVn A , s 1 0 SC

0

E

0 1 0 2 0T i m e ( a )

F i g . 3 . I o n o p h o r e t i c a p p l i c a t i o n o f ( A ) a c e t y l c h o l i n e a n d ( B ) o x o t r e m o r i n e . A , i n c r e a s i n gt h e s t r e n g t h ( n A ) o r d u r a t i o n ( m s ) o f t h e i o n o p h o r e t i c c u r r e n t i n c r e a s e d t h e a m p l i t u d eo f t h e s l o w d e p o l a r i z a t i o n ( h e x a m e t h o n i u m ( 2 0 0 / M ) p r e s e n t ) . B , a s i m i l a r e x p e r i m e n t w i t ho x o t r e m o r i n e . I n b o t h c a s e s t h e d e p o l a r i z a t i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h a n i n c r e a s e i n i n p u tr e s i s t a n c e . C , t i m e c o u r s e o f p o t e n t i a l c h a n g e e v o k e d b y i o n o p h o r e t i c a p p l i c a t i o n o f A C h .A m p l i t u d e s a r e s c a l e d t o a p e a k e q u a l t o 1 : a c t u a l p e a k a m p l i t u d e w a s 1 I 7 + 26 mV( m e a n + s . E . o f m e a n , n = 1 0 ) . C o n t i n u o u s l i n e i s y = 1 - 6 9 ( e x p ( - t / 7 5)-exp ( - t / P 1 2 ) ) .

d e p o l a r i z a t i o n s , l i k e t h e f a s t e . p . s . p . , w e r e r e v e r s i b l y a b o l i s h e d b y h e x a m e t h o n i u m( 2 0 0 L M ) a n d a r e t e r m e d n i c o t i n i c . T y p e 2 ( A H ) c e l l s w e r e n o t a f f e c t e d b y t h e s e l o wi o n o p h o r e t i c c u r r e n t s o f A C h , a n d n e v e r s h o w e d a n y d e p o l a r i z a t i o n s w h i c h w e r eb l o c k e d b y h e x a m e t h o n i u m .ACh e v o k e d a d e p o l a r i z a t i o n o f much s l o w e r t i m e c o u r s e i n b o t h T y p e 1 ( S ) a n dT y p e 2 ( A H ) c e l l s . I n T y p e 1 ( S ) c e l l s , t h i s w a s o c c a s i o n a l l y o b s e r v e d w i t h a p p l i c a t i o no f a s l i t t l e a s 2 p C , a n d o c c u r r e d a f t e r t h e s u b s i d e n c e o f t h e i n i t i a l n i c o t i n i cd e p o l a r i z a t i o n ( s e e N o r t h & T o k i m a s a , 1 9 8 2 ) . H o w e v e r , i n most T y p e 1 ( S ) c e l l s a n di n a l l Type 2 ( A H ) c e l l s i t w a s n e c e s s a r y t o e j e c t a t l e a s t t e n t i m e s more i o n o p h o r e t i c

1 2 8



5/15

MUSCARINIC EFFECTS ON 9 Kc h a r g e t o e v o k e t h e s l o w d e p o l a r i z a t i o n . B o t h l o n g d u r a t i o n s i n g l e p u l s e s ( 5 - 2 0 n A ,1 0 m s t o 3 s , t y p i c a l c h a r g e 1 0 n C ) a n d r e p e a t e d p a s s a g e o f s m a l l e r p u l s e s w e r e e q u a l l ye f f e c t i v e .T h e s l o w ACh d e p o l a r i z a t i o n b e g a n a f t e r a minimum l a t e n c y o f 1 0 0 ms f r o m t h eb e g i n n i n g o f p a s s a g e o f t h e i o n o p h o r e t i c c u r r e n t ( l a t e n c y w a s 1 7 0 + 2 2 ms ( m e a n + S . E .o f m e a n ) i n t h i r t y - o n e c e l l s ) a n d r e a c h e d i t s p e a k a m p l i t u d e w i t h i n 1 - 5 s , t h e r i s et i m e b e i n g f a s t e r f o r l a r g e r e j e c t i o n c h a r g e s . T h i s l a t e n c y w a s i n c r e a s e d a t l e a s t

A B CA~~~~~~~~~~~

- ~ ~ ~ 1

1 -

s m in< 2 0 sF i g . 4 . H y o s c i n e r e v e r s i b l y p r e v e n t s t h e d e p o l a r i z a t i o n s i n d u c e d b y o x o t r e m o r i n e a n dA C h . A , o x o t r e m o r i n e p e r f u s i o n ( 1 / S M ) . T o p , c o n t r o l . T h e a r r o w down a n d t h e a r r o w u pi n d i c a t e t h e s w i t c h i n g o n a n d o f f o f d . c . p o l a r i z i n g c u r r e n t i n o r d e r t h a t t h e r e s i s t a n c ec o u l d b e m e a s u r e d a t t h e r e s t i n g l e v e l . M i d d l e , h y o s c i n e ( 1 0 n M ) . B o t t o m , w a s h . B , AChi o n o p h o r e s i s ( 1 5 n A / 5 i n s ; i n t h e p r e s e n c e o f h e x a m e t h o n i u m ( 2 0 0 4 M ) ; t h i r t y p u l s e s a t1 0 H z ) . T o p , c o n t r o l . M i d d l e , h y o s c i n e ( 3 n M ) . B o t t o m , w a s h . C , o x o t r e m o r i n e i o n o p h o r e s i s( 5 n A / 2 s ) . T o p , c o n t r o l . M i d d l e , h y o s c i n e ( 3 0 n M ) . B o t t o m , w a s h .

t w o - f o l d w h en t h e t e m p e r a t u r e o f t h e p e r f u s i n g s o l u t i o n was r e d u c e d f r o m 3 7 t o 3 0 0 C .Th e t o t a l d u r a t i o n o f t h e s l o w ACh d e p o l a r i z a t i o n w a s f r o m 5 t o 6 0 s . W h e n t h em u s c a r i n i c r e s p o n s e f r o m t e n d i f f e r e n t c e l l s was a v e r a g e d , i t s t i m e c o u r s e w a s f o u n dt o b e w e l l f i t t e d b y a d o u b l e e x p o n e n t i a l f u n c t i o n w i t h t i m e c o n s t a n t s f o r t h e r i s i n ga n d f a l l i n g p h a s e s o f 1 P 2 and 7 - 5 s ( F i g . 3 0 ) . I n a g i v e n n e u r o n e , t h e a m p l i t u d e o ft h e s l o w d e p o l a r i z a t i o n was d e p e n d e n t o n t h e i o n o p h o r e t i c c u r r e n t s t r e n g t h ( F i g . 3 ) .

S i n g l e c u r r e n t p u l s e s p a s s e d t h r o u g h i o n o p h o r e s i s p i p e t t e s c o n t a i n i n g o x o t r e m o r i n e -e v o k e d d e p o l a r i z a t i o n s s i m i l a r i n a l l r e s p e c t s t o t h e s e c a u s e d b y ACh i n t h e p r e s e n c eo f h e x a m e t h o n i u m ( F i g . 3 A , B ) . N e u r o n a l s e n s i t i v i t y t o ACh a n d o x o t r e m o r i n ea p p e a r e d t o b e s i m i l a r , r a n g i n g f r o m 0 1 t o 5 0 0 mV/nC, w i t h T y p e 1 ( S ) n e u r o n e sb e i n g s i g n i f i c a n t l y m o r e s e n s i t i v e t o o x o t r e m o r i n e ' t h a n t y p e 2 ( A R ) n e u r o n e s .T e t r o d o t o x i n ( 1 0 0 n M ) d i d n o t a f f e c t t h e d e p o l a r i z a t i o n i n d u c e d b y ACh o r o x o t r e m -o r i n e , a l t h o u g h i t a b o l i s h e d t h e a c t i o n p o t e n t i a l o f T y p e 1 ( 5 ) n e u r o n e s , a n d a l ls y n a p t i c p o t e n t i a l s . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e e f f e c t s o f t h e m u s c a r i n i c a g o n i s t s a r ep r o b a b l y n o t m e d i a t e d b y t h e r e l e a s e o f o t h e r t r a n s m i t t e r s u b s t a n c e s f r o m n e i g h -b o u r i n g n e u r o n e s .A n t a q o n i s m b y h y o s c i n e a n d a t r o p i n e . H y o s c i n e ( 1 0 n M ) p r e v e n t e d t h e d e p o l a r i z a t i o n

5 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ P H Y 3 3 3

1 2 9



6/15

K . MORITA, R . A . NORTH AND T . TOKIMASAi n d u c e d b y p e r f u s i o n w i t h o x o t r e m o r i n e , A C h , m e t h a c h o l i n e o r b e t h a n e c h o l ( F i g . 4 ) .T h i s a n t a g o n i s m r e v e r s e d 3 0 - 6 0 min a f t e r w a s h o u t o f t h e a n t a g o n i s t . A t r o p i n e a n dh y o s c i n e h a d n o e f f e c t o n t h e r e s t i n g membrane p o t e n t i a l , i n p u t r e s i s t a n c e o r t h ea c t i o n p o t e n t i a l . Th e e f f e c t s o f i o n o p h o r e s i s o f ACh o r o x o t r e m o r i n e w e r e a l s oc o m p l e t e l y p r e v e n t e d b y p e r f u s i o n w i t h h y o s c i n e ( 1 - 3 0 n M ) ( F i g . 4 ) . W h e n t h e

A k-a-/


7/15

MUSCARINIC EFFECTS ON g 1 K& 5 ) . When t h e a g o n i s t - i n d u c e d d e p o l a r i z a t i o n w as p r e v e n t e d b y p a s s i n g c u r r e n tt h r o u g h t h e r e c o r d i n g e l e c t r o d e ( m a n u a l c l a m p ) , an i n c r e a s e i n a m p l i t u d e o fe l e c t r o t o n i c p o t e n t i a l s was o b s e r v e d i n a l l n e u r o n e s ( e g . F i g s . 4 & 5 ) . A c t i o np o t e n t i a l s e v o k e d b y p a s s i n g d e p o l a r i z i n g c u r r e n t s h a d an i n c r e a s e d d u r a t i o n i n t h ep r e s e n c e o f m u s c a r i n i c a g o n i s t s ( F i g . 5 ) , a n d i t w a s n o t i c e d t h a t a c t i o n p o t e n t i a l s w e r eAB-58~~~~~~~~~~~~~~~~5

1 0

.-68 1 0 MV-83~~1 20 8-98 - 1 0

- 1 0 8 U ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 1- 1 1 8 Ale . ' in 1 o MVl i n s

F i g . 6 . R e v e r s a l o f s l o w ACh p o t e n t i a l . A , r e s p o n s e t o i o n o p h o r e s i s o f ACh ( 1 0 n A / I 0 0 m s )r e c o r d e d a t t h e membrane p o t e n t i a l s h o w n b e s i d e e a c h t r a c e . E l e c t r o t o n i c p o t e n t i a l s w e r er e m o v e d f r o m a l l b u t two t r a c e s . H e x a m e t h o n i u m ( 2 0 0 , u M ) p r e s e n t t h r o u g h o u t . B ,a m p l i t u d e o f ACh p o t e n t i a l a s a f u n c t i o n o f membrane p o t e n t i a l . R e v e r s a l o c c u r s n e a r-90 m V .r e a d i l y g e n e r a t e d a t t h e t e r m i n a t i o n o f h y p e r p o l a r i z i n g c u r r e n t p u l s e s ( a n o d e b r e a ke x c i t a t i o n ) . T h e d e p o l a r i z i n g e f f e c t o f p e r f u s e d m u s c a r i n i c a g o n i s t s w a s d e c r e a s e dwhen t h e y w e r e a p p l i e d d u r i n g p a s s a g e o f a c o n s t a n t h y p e r p o l a r i z i n g c u r r e n t .A more c o m p l e t e s t u d y o f t h e i o n i c m e c h a n i s m w as made w i t h i o n o p h o r e s i s o f ACha n d o x o t r e m o r i n e . T h e membrane r e s i s t a n c e was i n c r e a s e d d u r i n g t h e d e p o l a r i z a t i o n( F i g s . 5 & 6 ) a n d t h i s w as s t i l l o b s e r v e d w i t h t h e m a n u a l - c l a m p t e c h n i q u e ( F i g . 5 ) .T h e a m p l i t u d e o f t h e ACh d e p o l a r i z a t i o n b e c a m e s m a l l e r w h e n i t was e v o k e d d u r i n gmembrane h y p e r p o l a r i z a t i o n a n d l a r g e r d u r i n g membrane d e p o l a r i z a t i o n . A p p l i c a t i o no f ACh t o n e u r o n e s h y p e r p o l a r i z e d b e y o n d a b o u t -90 mV c a u s e d a h y p e r p o l a r i z i n gr e s p o n s e w h i c h b e c a m e l a r g e r w i t h f u r t h e r membrane h y p e r p o l a r i z a t i o n ( F i g . 6 ) . T h er e v e r s a l p o t e n t i a l i n t h i r t e e n c e l l s was - 8 8 - 0 + 1 P 5 mV ( m e a n S . E . o f m e a n ) .E f f e c t s o n a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n . An a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n l a s t i n g u p t o 2 0 sf o l l o w s a s i n g l e a c t i o n p o t e n t i a l i n T y p e 2 ( A H ) n e u r o n e s . T h i s w a s r e d u c e d i na m p l i t u d e a n d d u r a t i o n b y o x o t r e m o r i n e , e v e n i n c o n c e n t r a t i o n s ( 3 - 3 0 n M ) w h i c hh a d n o e f f e c t o n membrane p o t e n t i a l . T h e a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n w h i c h f o l l o w e d a

5 - 2

1 3 1



8/15

K . MORITA, R . A . NORTH AND T . TOKIMASAA

I AL 2 0 I

Ca C o n t r o l b O x o t r e m o r i n e c W a s h

d H y o s c i n e e H y o s c i n e a n d f H y o s c i n eo x o t r e n o p i n e X

g C o n t r o l h O x o t r e m o r i n e i Wa h

l O o sF i g . 7 . M u s c a r i n i c i n h i b i t i o n o f t h e a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n w h i c h f o l l o w s t h e a c t i o np o t e n t i a l . A , t h e t r i a n g l e i n d i c a t e s t h e t i m e o f i o n o p h o r e t i c a p p l i c a t i o n o f ACh ( 8 0 n A / 3 8 ) .T h e u p w a r d d e f l e c t i o n s a r e d e p o l a r i z i n g p u l s e s o f s u f f i c i e n t i n t e n s i t y t o e v o k e a s i n g l ea c t i o n p o t e n t i a l ( m o n i t o r e d b y o s c i l l o s c o p e ) . T y p e 2 ( A H ) c e l l , r e s t i n g p o t e n t i a l -60 m V ,i n h e x a m e t h o n i u m ( 2 0 0 p M ) . B , a n e x p e r i m e n t s i m i l a r t o t h a t i n A , e x c e p t t h a t r e p e a t e dACh i o n o p h o r e t i c p u l s e s w e r e u s e d ( 1 5 n A / 5 m s ; 1 0 H z , 3 s ) . T h e a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o nw a s e v o k e d b y t h i r t y a c t i o n p o t e n t i a l s ( 1 0 H z , 3 s ) . T y p e 1 ( S ) c e l l , r e s t i n g r e s t i n g p o t e n t i a l-45 mV, i n h e x a m e t h o n i u m ( 2 0 0 , M ) . C a l i b r a t i o n s i n B a p p l y t o A . C , a f t e r h y p e r p o l a r -i z a t i o n e v o k e d b y t h i r t y a c t i o n p o t e n t i a l s . P e r f u s i o n w i t h o x o t r e m o r i n e ( 3 0 n M ) r e d u c e dt h e a m p l i t u d e a n d d u r a t i o n o f t h e a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n w i t h o u t c h a n g i n g r e s t i n gp o t e n t i a l ( p a n e l b ) . T h i s e f f e c t w a s h e d o u t ( c ) . H y o s c i n e ( 1 0 n M ) a l o n e d i d n o t c h a n g e t h ea f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n ( d ) b u t c o m p l e t e l y p r e v e n t e d t h e e f f e c t o f o x o t r e m o r i n e ( 3 0 n M )( e ) . F o l l o w i n g w a s h o u t o f h y o s c i n e , o x o t r e m o r i n e ( 3 0 n M ) h a d i t s u s u a l e f f e c t ( g - i ) .

b u r s t o f a c t i o n p o t e n t i a l s ( p o s t - t e t a n i c h y p e r p o l a r i z a t i o n ; p . t . h . ) i n b o t h T y p e 1 ( S )a n d T y p e 2 ( A H ) n e u r o n e s wa s a l s o r e d u c e d b y o x o t r e m o r i n e ( F i g . 7 ) . I n t h o s e c e l l si n w h i c h r e s t i n g p o t e n t i a l was u n c h a n g e d , o x o t r e m o r i n e ( 3 0 n M ) r e d u c e d t h e p e a ka m p l i t u d e o f t h e p . t . h . t o 7 6 . 2 + 6 - 2 %, t h e t o t a l d u r a t i o n t o 6 2 - 6 + 8 - 7 %, a n d t h eh a l f - d e c a y t i m e t o 7 1 - 1 + 1 2 - 6 % o f t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o l v a l u e s ( m e a n + s . E . o fm e a n , n = 7 ) . T h e s e e f f e c t s o f o x o t r e m o r i n e w e r e r e v e r s i b l y a n t a g o n i z e d b y h y o s c i n e( 1 n M ) ( F i g . 7 ) . E s s e n t i a l l y s i m i l a r f i n d i n g s w e r e made w h e n e i t h e r o x o t r e m o r i n e o r

1 3 2



9/15

MUSCARINIC EFFECTS ON g KACh w e r e a p p l i e d b y i o n o p h o r e s i s . D u r i n g t h e m u s c a r i n i c d e p o l a r i z a t i o n , t h e a c t i o np o t e n t i a l a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n o r p . t . h . w e r e g r e a t l y s h o r t e n e d , a n d o f t e n r e d u c e di n a m p l i t u d e d e s p i t e t h e i n c r e a s e d d r i v i n g f o r c e f o r t h e i r g e n e r a t i o n ( F i g . 7 ) .D e s e n s i t i z a t i o nP r o l o n g e d a p p l i c a t i o n s . Th e d e p o l a r i z a t i o n c a u s e d b y p e r f u s i o n w i t h o x o t r e m o r i n ep e r s i s t e d t h r o u g h o u t p e r i o d s o f a p p l i c a t i o n u p t o 6 0 m i n . H o w e v e r , b o t h t h ep o t e n t i a l c h a n g e a n d t h e u n d e r l y i n g c o n d u c t a n c e d e c r e a s e p r o g r e s s i v e l y d i m i n i s h e di n a m p l i t u d e , r e a c h i n g h a l f t h e i r i n i t i a l v a l u e a f t e r a p p r o x i m a t e l y 2 0 m i n ( F i g . 8 ) .

A

"'tI E.11 1 1 1 j J 111 ^ t 220mV

1 5 0- 4 0

C ~ E.0~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~..

I J f ] ~ E0. 0.0 3 0 8 0 o

T i m e ( m i n )F i g . 8 . D e s e n s i t i z a t i o n d u r i n g p r o l o n g e d a p p l i c a t i o n o f o x o t r e m o r i n e . A , s a m p l e o f p e nr e c o r d i n g s t a k e n d u r i n g a 6 0 m i n a p p l i c a t i o n o f o x o t r e m o r i n e ( 1 M ) . A c t i o n p o t e n t i a l so c c u r r e d t h r o u g h o u t t h e d e p o l a r i z a t i o n . On o c c a s i o n s t h e membrane p o t e n t i a l w a s r e s t o r e dt o t h e r e s t i n g l e v e l ( m a n u a l c l a m p ) a n d i n p u t r e s i s t a n c e m e a s u r e d b y p a s s i n g a c o n s t a n tc u r r e n t p u l s e . B , i n p u t r e s i s t a n c e ( 0 ; c o n t r o l i s 1 0 0 % ) a n d r e s t i n g p o t e n t i a l ( m V , 0 ) a sf u n c t i o n s o f t i m e .

R e p e a t e d a p p l i c a t i o n s . M u s c a r i n i c d e p o l a r i z a t i o n s i n d u c e d b y i o n o p h o r e t i c a p p l i c a -t i o n o f ACh w e r e i d e n t i c a l when e v o k e d a t i n t e r v a l s e x c e e d i n g 1 m i n . A p p l i c a t i o na t i n t e r v a l s o f b e t w e e n 3 0 a n d 6 0 s w a s a s s o c i a t e d w i t h a p r o g r e s s i v e d e c l i n e i n t h er e s p o n s e a m p l i t u d e ( F i g . 1 1 ) ; s h o r t e r i n t e r v a l s c o u l d n o t b e s t u d i e d b e c a u s e o f t h el o n g t i m e c o u r s e o f t h e r e s p o n s e . M u s c a r i n i c ACh d e p o l a r i z a t i o n s e v o k e d a t i n t e r v a l so f 3 0 s d e c l i n e d t o h a l f t h e i r i n i t i a l a m p l i t u d e i n 3 - 8 m i n . W h e n t h e ACh r e s p o n s ew a s d e s e n s i t i z e d b y r e p e a t e d a p p l i c a t i o n s , i t r e c o v e r e d i t s c o n t r o l a m p l i t u d e w h e n

1 3 3



10/15

K . MORITA, R . A . NORTH AND T . TOKIMASAt h e i n t e r v a l b e t w e e n a p p l i c a t i o n s w a s a l l o w e d t o e x c e e d 1 m i n . Th e r e s p o n s e t oi o n o p h o r e t i c a p p l i c a t i o n o f ACh w a s a l s o d e p r e s s e d b y p e r f u s i o n w i t h c o n c e n t r a t i o n so f o x o t r e m o r i n e ( < 3 0 n M ) o r ACh ( < 1 0 0 n m ) w h i c h w e r e t o o l o w t o p r o d u c e d e p o l a r -i z a t i o n s ( F i g . 9 ) . T h i s d e p r e s s i o n r a p i d l y r e c o v e r e d f o l l o w i n g w a s h o u t o f t h e p e r -f u s i n g a g o n i s t s . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e m u s c a r i n i c r e s p o n s e d e s e n s i t i z e s t oh a l f i t s i n i t i a l a m p l i t u d e i n t h e o r d e r o f s e v e r a l m i n u t e s , a n d t h a t r e c o v e r yf r o m t h e d e s e n s i t i z e d c o n d i t i o n o c c u r s w i t h i n a b o u t 1 m i n .A_

- ^ Y ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~2 0 s

F i g . 9 . D e s e n s i t i z a t i o n o f m u s c a r i n i c d e p o l a r i z a t i o n . ACh w a s a p p l i e d ( 1 5 nA/5 m s , t h i r t yp u l s e s a t 1 0 H z ) a t i n t e r v a l s o f 1 0 s ( t r i a n g l e s ) a n d c a u s e d r e p r o d u c i b l e s l o w d e p o l a r i z a t i o n s .P e r f u s i o n w i t h o x o t r e m o r i n e ( 3 0 n M ) g r e a t l y r e d u c e d t h e r e s p o n s e t o A C h , e v e n t h o u g ht h i s c o n c e n t r a t i o n i s t o o l o w t o c a u s e a n y d e p o l a r i z a t i o n . H e x a m e t h o n i u m ( 2 0 0 # M )p r e s e n t t h r o u g h o u t .

C o m p a r i s o n o f n i c o t i n i c a n d m u s c a r i n i c r e s p o n s e sD e p o l a r i z a t i o n . I n many n e u r o n e s , t h e n i c o t i n i c a n d m u s c a r i n i c a c t i o n s o f ACh w e r ec o m p a r e d b e f o r e a n d a f t e r a d d i t i o n o f h e x a m e t h o n i u m . F i g . 1 0 s h o w s s u c h a r e s u l t .T h e A C h - c o n t a i n i n g p i p e t t e w a s p l a c e d c l o s e t o t h e soma m e m b r a n e , s o t h a ta p p l i c a t i o n o f 4 5 p C o f ACh e v o k e d a d e p o l a r i z a t i o n q u i t e s i m i l a r i n t i m e c o u r s e t o

t h e f a s t e . p . s . p . T h e l a t e n c y o f t h e r e s p o n s e was 3 m s , t h e t h r e s h o l d e j e c t i o n c h a r g ew a s 1 5 p C a n d t h e s e n s i t i v i t y was 2 3 0 m V / n C . T h i s r e s p o n s e r e v e r s e d i t s p o l a r i t y a ta membrane p o t e n t i a l c l o s e t o -1 5 mV. A f t e r a d d i t i o n o f h e x a m e t h o n i u m ( 2 0 0 / M ) ,a d e p o l a r i z a t i o n c o u l d o n l y b e e v o k e d b y a p p l y i n g s e v e r a l p u l s e s t h r o u g h t h ei o n o p h o r e t i c p i p e t t e . T h i s d e p o l a r i z a t i o n h a d a l a t e n c y o f 4 0 0 m s , a n d t h e s e n s i t i v i t yw a s 3 - 1 m V / n C . T h i s d e p o l a r i z a t i o n r e v e r s e d i t s p o l a r i t y a t -91 mV, a n d w a sc o m p l e t e l y e l i m i n a t e d b y h y o s c i n e ( 1 0 n M ) . T h u s , t h e s a m e n e u r o n e b e a r s b o t hn i c o t i n i c a n d m u s c a r i n i c r e c e p t o r s l i n k e d t o d i f f e r e n t i o n i c c o n d u c t a n c e s .D e s e n s i t i z a t i o n . N i c o t i n i c r e s p o n s e s e v o k e d a t f r e q u e n c i e s e x c e e d i n g 5 Hz u n d e r w e n ta p r o g r e s s i v e d e c l i n e i n a m p l i t u d e , a n d t h i s w a s more m a r k e d a t h i g h e r f r e q u e n c i e s( F i g . 1 1 ) . T h e r a t e o f d e s e n s i t i z a t i o n was g r e a t e r w i t h a l a r g e r i n i t i a l r e s p o n s ea m p l i t u d e s o r h i g h e r f r e q u e n c i e s o f a p p l i c a t i o n . Wh en t h e i n i t i a l r e s p o n s e w a s 1 5 mV,r e p e a t e d a p p l i c a t i o n s a t 5 Hz e v o k e d d e c l i n i n g d e p o l a r i z a t i o n s w h i c h r e a c h e d a na m p l i t u d e o f 7 - 5 mV a f t e r 5 - 6 + I 1 s ( m e a n + S . E . o f m e a n , n = 1 0 ) . T h e t i m e r e q u i r e d

1 3 4



11/15

MUSCARINIC EFFECTS ON 9 K

JNJN~A AACh

ACh AK 1 0 mVlos

C-10

A25_-35_A

A_

C A i 2 0 mVACh 2 0 ms

D

- 4 0

-85-7

- 1 0 56W*4-ww ~J10mVACh l o s

F i g . 1 0 . C o m p a r i s o n o f f a s t a n d s l o w e f f e c t s o f ACh on membran e p o t e n t i a l o f onem y e n t e r i c n e u r o n e . A , f a s t ACh e f f e c t s . L e f t , f a s t e . p . s . p . e v o k e d b y s i n g l e s t i m u l u s ( 1 5 0 , s s ,4 0 V ) ( n s ) . R i g h t , d e p o l a r i z a t i o n s i n d u c e d b y i o n o p h o r e t i c a p p l i c a t i o n o f ACh ( 1 5 n A ,d u r a t i o n s w e r e , f r o m l e f t t o r i g h t , 3 , 8 a n d 1 0 m s ) ( t r i a n g l e s i n d i c a t e t e r m i n a t i o n o fa p p l i c a t i o n ) . B , s l o w ACh e f f e c t s a f t e r a d d i t i o n o f h e x a m e t h o n i u m ( 1 0 0 j C / M ) . A C h ,i o n o p h o r e s i s ( 1 0 nA/40 m s; 5 H z / 3 s ) . L e f t , c o n t r o l . M i d d l e , 5 min a f t e r i n t r o d u c i n gh y o s c i n e ( 3 n M ) . R i g h t , a f t e r w a s h o u t o f h y o s c i n e . C , r e v e r s a l o f f a s t ACh responses. AChi o n o p h o r e s i s ( 1 5 nA/7 m s ) ( t r i a n g l e s ) . T h e membrane p o t e n t i a l a t w h i c h t h e r e s p o n s e wase v o k e d i s i n d i c a t e d b e s i d e e a c h r e c o r d i n g . D , R e v e r s a l o f s l o w ACh responses. ACh wasa p p l i e d r e p e a t e d l y ( a s i n B ) i n t h e p r e s e nc e o f h e x a m e t h o n i u m . R e s t i n g p o t e n t i a l was- 5 5 mV.

f o r t h e r esponse t o r e c o v e r h a l f i t s o r i g i n a l a m p l i t u d e f r o m t h e f u l l y d e s e n s i t i z e ds t e a d y s t a t e was 25 +01 s ( n =1 0 ) . T h i s r e c o v e r y t i m e c o n s t a n t was i n d e p e n d e n to f t h e m a g n i t u d e o f t h e d e s e n s i t i z a t i o n ( K a t z &T h e s l e f f , 1 9 5 7 ) .Th e n a t u r e o f t h e m u s c a r i n i c d e s e n s i t i z a t i o n was d e s c r i b e d a b o v e ; t h i s wasc o m p a r e d w i t h t h e n i c o t i n i c r e s p o n s e d e s e n s i t i z a t i o n i n t h e same n e u r o n e s , u s i n gi n i t i a l r e s p o n s e a m p l i t u d e s w h i c h were a p p r o x i m a t e l y e q u a l ( F i g . 1 1 ) . Th e d e s e n s i -t i z a t i o n t i m e c o n s t a n t f o r t h e m u s c a r i n i c response was 5 0 - 1 5 0 t i m e s g r e a t e r t h a n t h a t

5 ms]20mVA

4 nsB

2 0 m s20mV

1 3 5



12/15

K . MORITA, R . A . NORTH AND T . TOKIMASAf o r t h e n i c o t i n i c r e s p o n s e , a n d t h e t i m e c o n s t a n t s o f r e c o v e r y f r o m d e s e n s i t i z a t i o na l s o d i f f e r e d b y a f a c t o r o f a b o u t 5 0 .

DISCUSSIONI o n i c m e c h a n i m . O u r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e m u s c a r i n i c r e s p o n s e i s g e n e r a t e d by

a r e d u c t i o n i n t h e membrane p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e . Th e m a j o r e v i d e n c e f o r t h i si s t h e r e d u c t i o n i n i n p u t c o n d u c t a n c e w h i c h a c c o m p a n i e s t h e p o t e n t i a l c h a n g e , andA

%J 2 0 m V2 0 s

1 l~~~~~~- OmA n-. .ACh I ---,-. . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * i a -I , -

I s

I . I I I I AI i i I l I I . 1 I L i t L 1i I I . , 1 I , L ,jlOmVI l O n A

F i g . 1 1 . C o m p a r i s o n o f m u s c a r i n i c a n d n i c o t i n i c d e p o l a r i z a t i o n s w i t h r e p e a t e d a p p l i c a t i o n s .A , i n h e x a m e t h o n i u m ( 2 0 0 F M ) . ACh i o n o p h o r e s i s ( t r i a n g l e s ; 1 5 n A / 5 m s p u l s e s ; 1 0 H z ,3 8 ) . No d e s e n s i t i z a t i o n was a p p a r e n t w i t h a p p l i c a t i o n s s e p a r a t e d b y 5 0 s , b u t w h en t h i si n t e r v a l w a s r e d u c e d t o a p p r o x i m a t e l y 3 0 s , t h e a m p l i t u d e o f t h e r e s p o n s e p r o g r e s s i v e l yd e c l i n e d . B , u p p e r t r a c e , membrane p o t e n t i a l . L o w e r t r a c e , i o n o p h o r e t i c c u r r e n t m o n i t o r .ACh w a s a p p l i e d b y s i n g l e p u l s e s ( 1 0 n A , 7 m s ) . A t i n t e r v a l s o f a b o u t 2 8 , n o d e s e n s i t i z a -t i o n i s a p p a r e n t , b u t when t h e i n t e r v a l w a s r e d u c e d t o 2 0 0 m s , t h e n i c o t i n i c r e s p o n s ep r o g r e s s i v e l y d e c l i n e d .

t h e l i n e a r r e d u c t i o n i n r e s p o n s e a m p l i t u d e w i t h membrane h y p e r p o l a r i z a t i o n . T h er e v e r s a l o f t h e m u s c a r i n i c r e s p o n s e a t a membrane p o t e n t i a l c l o s e t o t h e p o t a s s i u me q u i l i b r i u m p o t e n t i a l w o u l d a l s o b e p r e d i c t e d f o r s u c h a p o t a s s i u m i n a c t i v a t i o n , i fo n e a s s u m e s t h a t t h o s e c h a n n e l s w h i c h a r e c l o s i n g a r e t h e o n e s t h r o u g h w h i c h t h ep o l a r i z i n g c u r r e n t p a s s e s .I n a c t i v a t i o n o f t h e p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e h a s b e e n p r o p o s e d a s t h e p r i n c i p a l e f f e c to f m u s c a r i n i c r e c e p t o r o c c u p a t i o n i n b o t h c e n t r a l ( K r n j e v i c , Pumain & R e n a u d ,

1 36



13/15

MUSCARINIC EFFECTS ON 1 K1 9 7 1 ; D o d d , D i n g l e d i n e & K e l l y , 1 9 8 1 ) a n d p e r i p h e r a l ( K o b a y a s h i & L i b e t , 1 9 7 0 ;W e i g h t & V o t a v a , 1 9 7 0 ; Brown & C o n s t a n t i , 1 9 8 0 ) s y n a p s e s . H o w e v e r , c l e a rr e v e r s a l s o f t h e r e s p o n s e h a v e g e n e r a l l y n o t b e e n d e m o n s t r a t e d . Th e d i f f i c u l t y i nr e v e r s i n g t h e m u s c a r i n i c d e p o l a r i z a t i o n h a s b e e n a t t r i b u t e d b y Brown & Adams( 1 9 8 0 ) t o t h e r e c t i f y i n g p r o p e r t i e s o f t h e m e m b r a n e , s i n c e t h e p o t a s s i u m c o n d u c t a n c ew h i c h w a s c l o s e d b y m u s c a r i n i c a g o n i s t s i n b u l l f r o g g a n g l i o n c e l l s w a s o p e n o n l y a tm e m b r a n e p o t e n t i a l s l e s s n e g a t i v e t h a n a b o u t -60 mV. S u c h a v o l t a g e - s e n s i t i v ep o t a s s i u m c o n d u c t a n c e s e e m s n o t t o p r e d o m i n a t e i n m y e n t e r i c n e u r o n e s , s i n c e l i t t l er e c t i f i c a t i o n o c c u r s i n t h e p o t e n t i a l r a n g e o f -60 t o -90 mV ( N i s h i & N o r t h , 1 9 7 3 ;p r e s e n t o b s e r v a t i o n s , e g . F i g . 6 ) . F u r t h e r m o r e , t h e c l e a r r e v e r s a l o f t h e m u s c a r i n i cd e p o l a r i z a t i o n i m p l i e s t h a t t h e p o t a s s i u m c h a n n e l s r e m a i n o p e n a n d s e n s i t i v e t om u s c a r i n i c a g o n i s t s a t e v e n m o r e n e g a t i v e p o t e n t i a l s .F u r t h e r i n s i g h t i n t o t h e i o n i c m e c h a n i s m o f t h e m u s c a r i n i c a c t i o n i s a f f o r d e d b yo u r f i n d i n g t h a t o x Q t r e m o r i n e r e d u c e d t h e a m p l i t u d e a n d d u r a t i o n o f t h e c a l c i u m -d e p e n d e n t p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e w h i c h f o l l o w s t h e a c t i o n p o t e n t i a l ( M o r i t a , N o r t h& T o k i m a s a , 1 9 8 2 a ) . T h i s m a y i n d i c a t e t h a t t h e p o t a s s i u m c h a n n e l s c l o s e d b y t h em u s c a r i n i c a g o n i s t s a r e a l s o s e n s i t i v e t o t h e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n . I ti s p o s s i b l e t h a t t h e r e d u c t i o n i n t h e a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n r e s u l t s f r o m a d i r e c td e c r e a s e i n c a l c i u m i o n e n t r y d u r i n g t h e a c t i o n p o t e n t i a l ; h o w e v e r , t h i s s e e m s a l i t t l eu n l i k e l y b e c a u s e t h e a c t i o n p o t e n t i a l d u r a t i o n was a l w a y s i n c r e a s e d a n d n e v e rs h o r t e n e d b y m u s c a r i n i c a g o n i s t s ( e g . F i g . 5 A ) .T h e minimum l a t e n c y o f 1 0 0 m s w h i c h we o b s e r v e d i s s i m i l a r t o t h a t r e p o r t e d f o rs e v e r a l o t h e r m u s c a r i n i c r e s p o n s e s t o ACh i n c l u d i n g a c t i v a t i o n o f p o t a s s i u mc o n d u c t a n c e i n f r o g p a r a s y m p a t h e t i c n e u r o n e s ( H a r t z e l l e t a t . 1 9 7 7 ) a n d c a r d i a cm u s c l e ( H i l l - S m i t h & P u r v e s , 1 9 7 8 ) o r t h e d e p o l a r i z a t i o n o f f r o g s y m p a t h e t i cg a n g l i o n c e l l s ( K o k e t s u , N i s h i & S o e d a , 1 9 6 8 ) a n d s m o o t h m u s c l e ( B o l t o n , 1 9 7 6 ) ( s e ea l s o H a r t z e l l , 1 9 8 1 ) .B e c a u s e t h e m u s c a r i n i c r e s p o n s e i s d u e t o p o t a s s i u m c h a n n e l c l o s u r e , i t s e e m sn e c e s s a r y t o i n v o k e a c l o s u r e o f c h a n n e l s o v e r t h e e n t i r e ( e l e c t r o t o n i c a l l y c l o s e ) c e l lm e m b r a n e . T h i s c o n t r a s t s w i t h a n a g o n i s t i n d u c e d c o n d u c t a n c e i n c r e a s e i n w h i c h t h ep o t e n t i a l c h a n g e i s g e n e r a t e d b y p a s s i v e f l o w a c r o s s n o n - s y n a p t i c membrane w h i c ho r i g i n a t e s i n a f e w s p e c i a l i z e d a r e a s w h e r e c h a n n e l s a r e o p e n e d . I t i s p o s s i b l e t h a tt h e l a t e n c y a r i s e s b e c a u s e o f t h e n e e d f o r ACh t o d i f f u s e o v e r a n d a f f e c t t h e e n t i r ec e l l s u r f a c e . C a l c u l a t i o n s b a s e d o n t h e d i f f u s i o n o f ACh i n f r e e s o l u t i o n s u g g e s t t h a tt h i s m i g h t n o t a c c o u n t f o r s u c h a l o n g d e l a y ( K r n j e v i c ' & M i t c h e l l , 1 9 6 0 ; H i l l - S m i t h& P u r v e s , 1 9 7 8 ) . An a l t e r n a t i v e r e a s o n f o r t h e l a t e n c y a n d s l o w t i m e c o u r s e m a y b et h e r e q u i r e m e n t f o r a n i n t r a c e l l u l a r i n t e r m e d i a t e t o b e g e n e r a t e d a n d a f f e c t p o t a s s i u mc h a n n e l s t h r o u g h o u t t h e c e l l . F u r t h e r e x p e r i m e n t s a r e r e q u i r e d t o d i s t i n g u i s h t h e s ep o s s i b i l i t i e s . I t s e e m s u n l i k e l y t h a t t h e k i n e t i c s o f t h e p o t a s s i u m c h a n n e l c o n t r i b u t et o t h e d e l a y s i n c e i n v a r i o u s p r e p a r a t i o n s t h e l a t e n c y o f t h e r e s p o n s e t o m u s c a r i n i ca g o n i s t s i s s i m i l a r w h e t h e r t h e e n d r e s u l t i s o p e n i n g o r c l o s i n g o f p o t a s s i u m c h a n n e l s( H a r t z e l l , 1 9 8 1 ) .I t m i g h t b e a s k e d w h e t h e r ACh r e l e a s e d u n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s c o u l dp r o d u c e t h e m u s c a r i n i c e f f e c t s w h i c h w e o b s e r v e d w i t h e x o g e n o u s a p p l i c a t i o n . I nf a v o u r a b l e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s , m u s c a r i n i c d e p o l a r i z a t i o n s w e r e o b s e r v e d i nr e s p o n s e t o a m o u n t s o f ACh a b o u t t e n t i m e s m o r e t h a n t h o s e n e e d e d t o m i m i c t h e

1 3 7



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K . MORITA, R . A . NORTH AND T . TOKIMASAf a s t e . p . s . p . ( 5 0 0 mV/nC c o m p a r e d w i t h 5 mV/pC; s e e N o r t h & T o k i m a s a , 1 9 8 2 ) .H o w e v e r , t h e r e s u l t i n g m u s c a r i n i c r e s p o n s e i s a h u n d r e d t o a t h o u s a n d t i m e s l o n g e rt h a n t h e n i c o t i n i c d e p o l a r i z a t i o n a n d i s a d d i t i o n a l l y e x c i t a t o r y b y v i r t u e o f t h ei n c r e a s e d i n p u t r e s i s t a n c e a n d t h e r e d u c t i o n i n t h e a f t e r h y p e r p o l a r i z a t i o n . T h ef o l l o w i n g p a p e r s d e s c r i b e e x p e r i m e n t s w h i c h s h o w t h a t ACh r e l e a s e d b y ' a s i n g l es t i m u l u s t o n e r v e s c a n i n d e e d h a v e s i g n i f i c a n t e f f e c t s o n b o t h t h e p r e s y n a p t i c ( M o r i t a ,N o r t h & T o k i m a s a , 1 9 8 2 b ) a n d t h e p o s t - s y n a p t i c ( N o r t h & T o k i m a s a , 1 9 8 2 )m e m b r a n e s .

T h i s w o r k s u p p o r t e d b y U . S . D e p a r t m e n t o f H e a l t h a n d H u m a n S e r v i c e s G r a n t s NIH NS181 1 1a n d . ADAMHA D A 0 3 1 6 0 .

REFERENCESB O L T O N , T . B . ( 1 9 7 6 ) . On t h e l a t e n c y a n d f o r m o f t h e membrane r e s p o n s e s o f t h e s m o o t h m u s c l et o t h e i o n t o p h o r e t i c a p p l i c a t i o n o f a c e t y l c h o l i n e o r c a r b a c h o l . P r o c . R . S o c . B 1 9 4 , 9 9 - 1 9 9 .BROWN, D . A . & A D A M S , P . R . ( 1 9 8 0 ) . M u s c a r i n i c s u p p r e s s i o n o f a n o v e l v o l t a g e - s e n s i t i v e K +c u r r e n t i n a v e r t e b r a t e n e u r o n e . N a t u r e , L o n d . 2 8 3 , 6 7 3 - 6 7 6 .B R O W N , D . A . & C O N S T A N T I , A . ( 1 9 8 0 ) . I n t r a c e l l u l a r o b e r v a t i o n s o n t h e e f f e c t s o f m u s c a r i n i ca g o n i s t s o n r a t s y m p a t h e t i c n e u r o n e s . B r . J . P h a r m a c . 7 0 , 5 9 3 - 6 0 8 .D O D D , J . , D I N G L E D I N E , R . & K E L L Y , J . S . ( 1 9 8 1 ) . T h e e x c i t a t o r y a c t i o n o f a c e t y l c h o l i n e o nh i p p o c a m p a l n e u r o n e s o f t h e g u i n e a - p i g a n d r a t m a i n t a i n e d i n v i t r o . B r a i n R e s . 2 0 7 , 1 0 9 - 1 2 7 .H A R T Z E L L , H . C . ( 1 9 8 1 ) . M e c h a n i s m s o f s l o w p o s t s y n a p t i c p o t e n t i a l s . N a t u r e , L o n d . 2 9 1 , 5 3 9 - 5 4 4 .H A R T Z E L L , H . C . , KUFFLER, S . W . , S T I C K G O L D , R . & Y O S H I K A M I , D . ( 1 9 7 7 ) . S y n a p t i c e x c i t a t i o na n d i n h i b i t i o n r e s u l t i n g f r o m d i r e c t a c t i o n o f a c e t y l c h o l i n e o n t w o t y p e s o f c h e m o r e c e p t o r s o ni n d i v i d u a l a m p h i b i a n p a r a s y m p a t h e t i c n e u r o n e s . J . P h y s i o l . 2 7 1 , 8 1 7 - 8 4 6 .H I L L - S M I T H , I . & P U R V E S , R . ( 1 9 7 8 ) . S y n a p t i c d e l a y i n t h e h e a r t : a n i o n o p h o r e t i c s t u d y . J .P h y 8 i o l . 2 7 9 , 3 1 - 5 4 .H I R S T , G . D . S . , HOLMAN, M . E . & S P E N C E , I . ( 1 9 7 4 ) . Tw o t y p e s o f n e u r o n e s i n t h e m y e n t e r i c p l e x u so f d u o d e n u m i n t h e g u i n e a - p i g . J . P h y s i o l . 2 3 6 , 3 0 3 - 3 2 6 .H O R N , J . & D O D D , J . ( 1 9 8 1 ) . M o n o s y n a p t i c m u s c a r i n i c a c t i v a t i o n o f K + c o n d u c t a n c e u n d e r l i e s t h es l o w i n h i b i t o r y p o s t s y n a p t i c p o t e n t i a l i n s y m p a t h e t i c g a n g l i a . N a t u r e , L o n d . 2 9 2 , 6 2 5 - 6 2 7 .K A T Z , B . & T H E S L E F F , S . ( 1 9 5 7 ) . A s t u d y o f t h e ' d e s e n s i t i z a t i o n ' p r o d u c e d b y a c e t y l c h o l i n e a t t h em o t o r e n d - p l a t e . J . P h y s i o l . 1 2 8 , 6 3 - 8 0 .K O B A Y A S H I , H . & L I B E T , B . ( 1 9 7 0 ) . A c t i o n s o f n o r a d r e n a l i n e a n d a c e t y l c h o l i n e o n s y m p a t h e t i cg a n g l i o n c e l l s . J . P h y 8 i o l . 2 0 8 , 3 5 3 - 3 7 2 .K O K E T S U , K . N I S H I , S . & S O E D A , H . ( 1 9 6 8 ) . A c e t y l c h o l i n e - p o t e n t i a l o f s y m p a t h e t i c g a n g l i o n c e l lm e m b r a n e . L i f e S c i . , O x f o r d 7 , 7 4 1 - 7 4 9 .K R N J E V I 6 , K . & M I T C H E L L , J . F . ( 1 9 6 0 ) . D i f f u s i o n o f a c e t y l ch o l i n e i n a g a r g e l s a n d i n t h e i s o l a t e dr a t d i a p h r a g m . J . P h y a i o l . 1 5 3 , 5 6 2 - 5 7 2 .K R N J E V I 6 , K . , P U M A I N , R . & RENAUD, L . ( 1 9 7 1 ) . T h e m e c h a n i s m o f e x c i t a t i o n b y a c e t y l c h o l i n ei n t h e c e r e b r a l c o r t e x . J . P h y s i o l . 2 1 5 , 2 4 7 - 2 6 8 .L I B E T , B . ( 1 9 6 4 ) . S l o w s y n a p t i c r e s p o n s e s a n d e x c i t a t o r y c h a n g e s i n s y m p a t h e t i c g a n g l i a . J .P h y 8 i o l . 1 7 4 , 1 - 2 5 .M O R I T A , K . , N O R T H , R . A . & T O K I M A S A , T . ( 1 9 8 2 a ) . T h e c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c o n d u c t a n c ei n g u i n e a - p i g m y e n t e r i c n e u r o n e s . J . P h y s i o l . 3 2 9 , 3 4 1 - 3 5 4 .M O R I T A , K . , N O R T H , R . A . & T O K I M A S A , T . ( 1 9 8 2 b ) . M u s c a r i n i c p r e s y n a p t i c i n h i b i t i o n o f s y n a p t i ct r a n s m i s s i o n i n t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f g u i n e a - p i g i l e u m . J . P h y 8 i o l . 3 3 3 , 1 4 1 - 1 4 9 .N I S H I , S . & K O K E T S U , K . ( 1 9 6 0 ) . E l e c t r i c a l p r o p e r t i e s a n d a c t i v i t i e s o f s i n g l e s y m p a t h e t i c n e u r o n e si n f r o g s . J . c e l l . c o m p . P h y 8 i o l . 5 5 , 1 5 - 3 0 .N I S H I , S . & K O K E T S U , K . , ( 1 9 6 8 ) . E a r l y a n d l a t e a f t e r d i s c h a r g e s o f a m p h i b i a n s y m p a t h e t i cg a n g l i o n c e l l s . J . N e u r o p h y 8 i o l , 3 1 , 1 0 9 - 1 2 1 .N I S H I , S . & N O R T H , R . A . ( 1 9 7 3 ) . I n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g f r o m t h e m y e n t e r i c p l e x u s o f g u i n e a - p i gi l e u m . J . P h y 8 i o l . 2 3 1 , 4 7 1 - 4 9 1 .

1 3 8



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MUSCARINIC EFFECTS ON g 9 1 3 9N O R T H , R . A . & T O K I M A S A , T . ( 1 9 8 2 ) . M u s c a r i n i c s y n a p t i c p o t e n t i a l s i n g u i n e a - p i g m y e n t e r i c p l e x u sn e u r o n e s . J . P h y g i o l . 3 3 3 , 1 5 1 - 1 5 6 .T O K I M A S A , T . , M O R I T A , K . & N O R T H , R . A . ( 1 9 8 1 ) . F a s t n i c o t i n i c a n d s l o w m u s c a r i n i c p o t e n t i a l si n m y e n t e r i c n e u r o n e s . S o c . N e u r o s c i . A b 8 t r . 7 , 7 0 3 .W E I G H T , F . F . & V O T A V A , J . ( 1 9 7 0 ) . S l o w s y n a p t i c e x c i t a t i o n i n s y m p a t h e t i c g a n g l i o n c e l l s :e v i d e n c e f o r s y n a p t i c i n a c t i v a t i o n o f p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e . S c i e n c e , N . Y . 1 7 0 , 7 5 5 - 7 5 8 .
http://jp.physoc.org/

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K. Morita, R.A. North and T. Tokimasa- Muscarinic Agonists Inactivate Potassium Conductance of Guinea-Pig Myenteric Neurones