LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

BIOCHEMIJOS IR BIOTECHNOLOGIJŲ KATEDRA

EDITA ELIJOŠIUTĖ

JUODOJO SERBENTO (RIBES NIGRUM L.) VAISTINĖS

AUGALINĖS ŽALIAVOS FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR

ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovai:

Doc. dr. Audronis Lukošius

Prof. dr. Ona Ragažinskienė

Prof. habl. dr. Audrius Maruška

KAUNAS, 2016

2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

BIOCHEMIJOS IR BIOTECHNOLOGIJŲ KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

Data

JUODOJO SERBENTO (RIBES NIGRUM L.) VAISTINĖS

AUGALINĖS ŽALIAVOS FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR

ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Recenzentas Darbo vadovai:

Doc. dr. Audronis Lukošius

Data

Prof. dr. Ona Ragažinskienė

Prof. habl. dr. Audrius Maruška

Data

Darbą atliko:

Magistrantė

Edita Elijošiutė

Data

KAUNAS, 2016

3

TURINYS

SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 5

SUMMARY ............................................................................................................................................. 6

PADĖKA .................................................................................................................................................. 7

SANTRUMPOS ....................................................................................................................................... 8

ĮVADAS ................................................................................................................................................... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ................................................................................................... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ...................................................................................................... 12

1.1. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum L. ) morfologija .................................................................... 12

1.2. Paplitimas ir selekcija .............................................................................................................. 13

1.3. Žaliavų rinkimas ir džiovinimas .............................................................................................. 14

1.4. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum L. ) augalinės žaliavos ir jų farmakologinės savybės .......... 15

1.4.1. Vaisiai (Fructus) ................................................................................................................ 15

1.4.2. Lapai (Folium) ................................................................................................................... 16

1.4.3. Pumpurai (Gemmae) ......................................................................................................... 17

1.5. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) biologiškai aktyvios medžiagos ..................................... 18

1.6. Biologiškai aktyvių junginių kiekį įtakojantys veiksniai ......................................................... 20

1.7. Flavonoidai .............................................................................................................................. 22

1.7.1. Flavonoidų klasifikacija: ................................................................................................... 22

1.7.2. Flavonoidų fiziko-cheminės savybės ir biologinis vaidmuo ............................................. 24

1.7.3. Flavonoidų kiekio nustatymo būdai .................................................................................. 25

1.7.4. Flavonoidų farmakologinis poveikis ................................................................................. 27

1.8. Antioksidacinis aktyvumas ...................................................................................................... 30

2. TYRIMO METODIKA .................................................................................................................. 32

2.1. Tyrimų objektas ....................................................................................................................... 32

2.2. Reagentai .................................................................................................................................. 32

2.3. Aparatūra .................................................................................................................................. 33

2.4. Tyrimų eiga .............................................................................................................................. 34

2.5. Tyrimų metodika ...................................................................................................................... 35

2.5.1. Tiriamojo pavyzdžio ruošimas .......................................................................................... 35

2.5.1.1. Nuodžiūvis .................................................................................................................. 35

2.5.1.2. Ekstrakcija .................................................................................................................. 35

2.5.2. Spektrofotometrija ............................................................................................................. 35

2.5.2.1. Bendras fenolinių junginių kiekis ............................................................................... 35

2.5.2.2. Bendras flavonoidų kiekis .......................................................................................... 37

4

2.5.2.3. Antioksidacinis aktyvumas ......................................................................................... 38

2.5.3. Efektyvioji skysčių chromatografija ................................................................................. 39

2.6. Statistinė duomenų analizė ...................................................................................................... 40

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ............................................................................................. 41

3.1. Spektrofotometrinės analizės rezultatai ................................................................................... 41

3.1.1. Bendro fenolinių junginių kiekio rezultatai ...................................................................... 41

3.1.2. Flavonoidų kiekio rezultatai .............................................................................................. 42

3.1.3. Antioksidacinio aktyvumo rezultatai ................................................................................ 44

3.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos rezultatai .................................................................. 45

4. IŠVADOS ....................................................................................................................................... 52

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ............................................................................................. 53

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS .......................................................................................................... 54

7. KONFERENCIJŲ TEZĖS ............................................................................................................. 60

8. PRIEDAI ....................................................................................................................................... 61

5

SANTRAUKA

E. Elijošiutės magistro baigiamasis darbas/moksliniai vadovai: doc. dr. Audronis Lukošius,

prof. dr. Ona Ragažinskienė, prof. habl. dr. Audrius Maruška; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto,

Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. Vytauto Didžiojo universiteto,

Gamtos mokslų fakulteto, Biochemijos ir biotechnologijų katedra.

Darbo tiriamasis objektas juodasis serbentas (Ribes nigrum L.) – agrastinių (Grossulariaceae

DC) šeimos daugiametis krūmas, kaupiantis fenolinius junginius, kurių didžiąją dalį sudaro

flavonoidai, jo vaistinės augalinės žaliavos ir biologiškai veiklieji junginiai. Lapai neseniai buvo

pripažinti kaip vaistinė augalinė žaliava ir įtraukti į Europos farmakopėją (Ph. Eur. 07/2013:2528). Dėl

terapinio poveikio jie įtraukti ir į Europos Bendrijos augalų monografiją EMA/HMPC/142986/2010.

Darbo tikslas – nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį, bendrą flavonoidų kiekį,

antioksidacinį aktyvumą, identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti flavonoidus juodųjų serbentų lapuose

(Ribis nigri folium), surinktuose skirtingais augalo vegetacijos tarpsniais, bei palyginti šių junginių

pasiskirstymą žieduose, ūgliuose ir pumpuruose. Uždaviniai – identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti

flavonoidus juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) augalinėse žaliavose efektyviosios skysčių

chromatografijos metodu. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį lapuose spektrofotometriniu

metodu ir palyginti šių junginių pasiskirstymą žieduose, pumpuruose ir ūgliuose. Spektrofotometriškai

įvertinti bendrą flavonoidų kiekį ir antioksidacinį aktyvumą skirtingose juodųjų serbentų augalinėse

žaliavose. Įvertinti flavonoidų kiekio kitimą juodųjų serbentų lapuose skirtingais vegetacijos tarpsniais.

Bendras fenolinių junginių kiekis juodųjų serbentų augalinėse žaliavose varijuoja nuo 33,56

mg RE/g iki 56,41 mg RE/g. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas juodųjų serbentų lapuose

– 56,41 mg RE/g. Pumpuruose ir ūgliuose fenolinių junginių kiekiai yra panašūs. Mažiausias kiekis

randamas žieduose – 33,56 mg RE/g. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas juodųjų serbentų

lapuose (21,85 mg RE/g), dvigubai mažesnis flavonoidų kiekis aptiktas juodųjų serbentų žieduose –

8,73 mg RE/g. Nuo augalo žydėjimo iki vaisių nokimo pabaigos nustatyta flavonoidų kiekio juodųjų

serbentų lapuose didėjimo tendencija. Antioksidacinis aktyvumas visose žaliavose panašus – nuo

33,04 mg RE/g iki 35,11 mg RE/g.

Rutinas, kvercetinas, hiperozidas ir katechinas – pagrindiniai flavonoidai juodųjų serbentų

augalinėse žaliavose. Identifikuota ir viena fenolinė rūgštis – chlorogeno rūgštis. Lyginant junginių

pasiskirstymą juodųjų serbentų lapuose, žieduose, ūgliuose ir pumpuruose, didžiausi identifikuotų

junginių kiekiai rasti lapuose. Lapuose ir pumpuruose dominuojantis junginys yra rutinas, žieduose

savo kiekiu išsiskiria chlorogeno rūgštis, o ūgliuose pagrindinis flavonoidas – hiperozidas.

6

SUMMARY

Black currant (Ribes nigrum L.) – a common garden medicinal plant of Grossulariaceae

family. It accumulates biologically active substances – phenolic compounds, which mainly consist of

flavonoids. Black currant raw materials increases urine output, sweating, inhibits inflammation, slows

dow the development of bacteria and germs. The leaves have traditionally been used for arthritis, the

berries have many vitamins. Leaves recently recognized as medicinal plant raw material and was

included in the European Pharmacopoeia (Ph. Eur. 07/2013:2528) [1].

The aim of this study – to determine the total phenolic compounds, flavonoid content,

antioxidant activity and identify compounds of flavonoids in black currant Ribes nigrum L.) leaves,

collected at different vegetation phase, and to compare the distribution in flowers, shoots and buds.

Tasks – to identify and quantify the black currant (Ribes nigrum L.) flavonoids in different raw

materials by high-performance liquid chromatography; to determine the total phenolic compounds by

spectrophotometry and compare the distribution in different plant organs; to assess the total amount of

flavonoids in different black currant raw material spectrophotometric; to compare antioxidant activity

of black currant leaves, flowers, buds and shoots.

Total phenolic compounds blackcurrant (Ribes nigrum L.) raw materials ranging from 33.56

mg RE/g to 56.41 mg RE/g . The highest phenolic compounds set of black currant leaves - 56.41 mg

RE/g . The amount in buds and shoots of phenolic compounds is almost similar. The minimum

phenolic compounds detected in flowers - 33.56 mg RE/g . The highest phenolic compounds in black

currant leaves wese collected in June. The highest amount of flavonoids is accounted in black currant

leaves (21.85 mg RE/g ), twice smaller amount of flavonoids found in black currant rings. The

flavonoids in black currant leaves is arising from flowering to fruit ripening end. The antioxidant

activity of all the raw materials are similar, from 33.04 mg RE/g to 35.11 mg RE/g .

Rutin, quercetin, catechin and hyperoside are the basics flavonoids in blackcurrant raw

materials. The one phenolic acid - chlorogenic acid was found too. Comparing the distribution of

compounds in blackcurrant leaves, flowers, shoots and buds, the biggest quantity of identified

compounds were found in the leaves. Rutin is the dominant compound in buds and leaves, the rings

have the highest amount of chlorogenic acid, hyperoside is the main flavonoid in shoots.

7

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovui doc. dr. Audroniu Lukošiui už nuolatinį bendradarbiavimą

ir visokeriopą pagalbą. Taip pat VDU vadovams prof. dr. Onai Ragažinskienei ir prof. habil. dr.

Audriui Maruškai už vertingus patarimus ir konsultacijas.

Vytauto Didžiojo Universiteto, Gamtos mokslų fakulteto, Biochemijos ir biotechnologijų

katedros doktorantui Mantui Stankevičiui už nuoširdų bendradarbiavimą bei pagalbą vykdant

eksperimentus ir analizuojant gautus duomenis.

8

SANTRUMPOS

ADP adenozindifosfatas

ChlE chlorogeno rūgšties ekvivalentas

DC dujų chromatografija

DPPH 2,2-difenil-1-pikrihidrazilo radikalas

EMA Europos vaistų agentūra

ESC efektyvioji skysčių chromatografija

ESCOP Europos fitoterapijos mokslų komitetas

HE hiperozido ekvivalentas

KE katechino ekvivalentas

QE kvercetino ekvivalentas

MS masių spektrometrija

nm nanometrai

p patikimumas

Pg prostaglandinai

Ph. Eur. Europos farmakopėja

R2 regresijos koeficientas

RE rutino ekvivalentas

SOD superoksido dismutazė

SSN santykinis standartinis nuokrypis

UV ultravioletinės šviesos spinduliuotė

9

ĮVADAS

Pаsаulinės sveikаtоs оrgаnizаcijоs duоmenimis, gydymo tikslаis yrа nаudоjаmа аpie 35

tūkstаnčiаi аugаlų rūšių [1]. Eurоpоs fаrmаcijоs prаmоnėje nаudоjаmа аpie 1200 аugаlų. Lietuvоs

trаdicinėje ir liаudies medicinoje sutinkаmа аpie 460 аugаlų, о аpie 40% visų vаrtоjаmų vаistų gаunаmа

iš vаistinių аugаlinių žаliаvų [2].

Juodasis serbentas (Ribes nigrum L.) – dаžnаs Lietuvоs sоdų аugаlаs, turintis mаistinių ir

gydоmųjų sаvybių. Tаi vienаs vertingiаusių uоginių аugаlų [3]. Lietuvоje juоdųjų serbentų plоtai siekiа

2900 hektаrų [3]. Jis įrаšytas į vаistinių аugаlų sąrаšą [4]. Liаudies medicinоje juоdоjо serbentо žаliаvоs

skаtinа šlаpimо išsiskyrimą, prаkаitаvimą [5]. Slоpinа uždegiminiu prоcesus, stаbdо bаkterijų ir virusų

vystymąsi [5].

Darbo tiriamasis objektas juodasis serbentas (Ribes nigrum L.) – agrastinių (Grossulariaceae)

šeimos daugiametis krūmas, kaupiantis fenolinius junginius, kurių didžiąją dalį sudaro flavonoidai, jo

vaistinės augalinės žaliavos ir biologiškai veiklieji junginiai. Pastaruoju metu juodųjų serbentų žaliava

sulaukia vis daugiau dėmesio. Juodųjų serbentų vaisiai išsamiai ištyrinėta ir nuo seno plačiai naudojama

juodųjų serbentų augalinė žaliava. Lietuvos mokslininkų ir tyrėjų detaliai išanalizuoti vaisiuose esantys

antocianinai. Lietuvoje pirmą kartą buvo pagaminta antioksidacinio poveikio farmacinė forma – tabletės,

kurios veiklioji medžiaga buvo juodųjų serbentų vaisių sausojo ekstrakto antocianinai.

Tačiau ne tik vaisiai gali būti naudojami gydymo tikslais. Juodųjų serbentų lapai dėl patvirtintų

terapinių indikacijų buvo įtraukti į Europos farmakopėją (8 leidimas, 2014 m.)[6]. Jie įtraukti ir į Europos

Bendrijos augalų monografiją, kurią parengė Europos vaistų agentūros augalinių vaistinių preparatų

komitetas (EMA/HMPC), Prancūzijos farmakopėją. Literatūros duomeninis, juodųjų serbentų vaisiai

turtingi antocianinais, o lapai – flavonoidais. Juodųjų serbentų lapai skatina šlapimo išsiskyrimą,

pasižymi diuretiniu poveikiu [ESCOP, 2014] [7]. Iš jų daromi kompresai, gydomosios vonios.

Naudojami reumatinių ligų gydymui [8]. Juodųjų serbentų lapai yra arbatų imunitetui stiprinti receptūros

sudedamoji dalis.

Darbo aktualumas. Juodųjų serbentų lapai sulaukia vis daugiau užsienio mokslininkų dėmesio,

tuo tarpu Lietuvoje lapų augalinė žaliava nėra plačiai tyrinėta. Lietuvos dr. A. Dvaranauskaitė-

Gaižauskienė tyrinėjo juodųjų serbentų pumpurus. Dėmesys buvo nukreiptas į pumpurų eterinių aliejų

kokybinę ir kiekybinę sudėtį. Duomenys apie juodųjų serbentų žiedus yra riboti. Yra pavienės užsienio

mokslininkų publikacijos, kuriose paminėti juodųjų serbentų ūgliai. Šio tyrimo metu pirmą kartą

nustatytas bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis juodųjų serbentų lapuose, žieduose, ūgliuose

ir pumpuruose. Pirmą kartą identifkuoti flavonoidai ir palyginamas jų pasiskirstymas skirtingose

žaliavose. Pirmą kartą analizuota augalo vegetacijos tarpsnių įtaka flavonoidų kiekiui juodųjų serbentų

lapuose, bei palygintas skirtingų augalo dalių antioksidacinis aktyvumas.

10

Darbo tikslas - nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį, bendrą flavonoidų kiekį, identifikuoti

ir kiekybiškai įvertinti flavonoidus juodųjų serbentų lapuose (Ribis nigri folium), surinktuose skirtingais

augalo vegetacijos tarpsniais, bei palyginti šių junginių pasiskirstymą žieduose, ūgliuose ir pumpuruose.

11

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas:

Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį, bendrą flavonoidų kiekį, identifikuoti ir kiekybiškai

įvertinti flavonoidus juodųjų serbentų lapuose (Ribis nigri folium), surinktuose skirtingais augalo

vegetacijos tarpsniais, bei palyginti šių junginių pasiskirstymą žieduose, ūgliuose ir pumpuruose.

Darbo uždaviniai:

1. Identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti flavonoidus juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.)

augalinėse žaliavose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

2. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį lapuose spektrofotometriniu metodu ir palyginti šių

junginių pasiskirstymą žieduose, pumpuruose ir ūgliuose.

3. Spektrofotometriniu metodu įvertinti bendrą flavonoidų kiekį ir antioksidacinį aktyvumą

skirtingose juodųjų serbentų augalinėse žaliavose.

4. Įvertinti flavonoidų kiekio kitimą juodųjų serbentų lapuose skirtingais vegetacijos tarpsniais.

12

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum L. ) morfologija

Botaninis augalo pavadinimas: Juоdаsis serbentаs – Ribes nigrum L.

Šeima: Uоlаskėliniai (Agrаstiniai) – Saxifragaceae (Grossulariaceae DC.)

Liaudiški pavadinimai: аkynа, blаkinis, bоbingės, bоbuоgės, švоkšla, žvirbliаuоgės

1 pav. Juodasis serbentas (Ribes nigrum L.)

Juodasis serbentas (Ribes nigrum L.) (1 pav.) yra agrastinių (Grossulariaceae DC) šeimos

daugiametis, nedygus, šakotas krūmas [9]. Vidutiniškаi krūmаi būnа 1,5-2 m аukščiо ir tоkiо pаt plоčiо.

[10]. Visоs аugаlо dаlys pаsižymi stipriu specifiniu kvаpu [8].

Šaknų sistema vertikali, paviršinė (10-60 cm gylio). Šaknys – šаkоtinės, sudаrytоs iš keletо

stаmbesnių ir lаbаi dаug smulkių skeletinių šаknų [11].

Stiebаi tаmsiаi rudi, metūgliаi gelsvаi žаlsvi, plаukuoti [9]. Krūme esаnčių stiebų skаičius

svyruоjа nuо kelių iki keliоlikоs ir dаugiаu. Stiebаi išаugа iš pumpurų, esаnčių pоžeminėje dаlyje [12].

Intensyviаusiаi stiebаi аugа pirmuоsius tris metus [5].

Lapai pražanginiai, su 3-5 skiautėmis, stambiai dantyti, nežymiai plaukuoti, ant ilgų lapkočių.

Apatinėje lapų pusėje gausu liaukučių, kurios išskiria eterinį aliejų [9]. Serbentų lapai turi stiprų,

specifinį aromatą. Juos sutrynus pirštais – kvapas dar sustiprėja [10].

Žiedai maži, rausvai, melsvai gelsvi ar žalsvi, 4 – 8 mm skersmens [9], vаrpeliо fоrmоs,

penkiаnаriаi, pо 5–100 susitelkę į retаs, svyrаnčiаs kekes [13]. Tаurėlаpiаi 5, stаmbesni už vаiniklаpius,

hоrizоntаlūs аrbа pаlinkę žemyn [13]. Tаurėlаpių spаlvа – bаlti, žаlsvi, žаlsvai rаusvi, rаusvi ar ryškiаi

13

purpuriniаi – pаrоdо žiedų spalvą. Vаiniklаpiаi 5, smulkūs, vertikаlūs аrbа pаlenkti į vidų [13].

Kuоkeliаi 5, dulkinė dvilizdė. Juоdieji serbentаi gаli būti sаvidulkiаi аrbа kryžmаdulkiаi [11]. Žydi

bаlаndžiо-gegužės mėn [9].

Vaisius – rutuliška, sultinga, juoda, kvepianti, daugiasėklė uoga [9]. Sėklos rausvai rusvos,

elipsiškos. 1000 sėklų sveria 0,9-1,8 g. Uogos prinoksta liepos-rugpjūčio mėn. [13].

Lengvаi dаuginаmi vegetаtyviniu būdu [10] – аtlаnkоmis bei sėklоmis [13].

Vidutiniškаi vienаs krūmаs turi 3333 žiedus. Tyrimų duоmenimis, vienаs žiedаs vidutiniškаi

išskiriа 9 mg nektаro, iš kurių bitės pаgаminа 2,3 mg medаus. Vidutinis krūmаs išskiriа 30 mg nektаrо,

iš kuriо bitės gаunа 7,6 mg medаus. Vienаs serbentynо hektаrаs duоtų 25 kg medаus. Esаnt pаkаnkаmаi

gerоmis žydėjimо sąlygоmis, iš 12 žiedų užsimezga 9 uоgоs. Vоs 20 % sаvidulkiu būdu uоgаs mezgаnti

veislė stаndаrtiniаme krūme užmezgа 666 uоgаs, derlius nuо krūmо – apie 0,5 kg uogų [13].

1.2. Paplitimas ir selekcija

Juodasis serbentas – dаžnаi Lietuvоje sutinkаmаs аugаlаs [3]. Yrа vienаs vertingiаusių uоginių

аugаlų Eurоpоje ir Lietuvоje, turintis mаistinių ir gydоmųjų sаvybių [3]. Tаi vidutiniо klimаtо аugаlаi,

puikiаi derаntys Lietuvos klimаtinėmis sąlygоmis. Nėrа lаbаi reiklūs. Mėgstа derlingаs, neutraliаs dirvаs

[13]. Sаvаime аugа drėgnuоse miškuose, upių ir ežerų pаkrаntėse. Pаkenčiа pusiаu pаvėsį, visiškаme

pаvėsyje derа lаbаi prаstаi. Gerai žiemоjа. Šаltоmis ir besniegėmis žiemоmis аpšąlа, аpsnigti gerаi

peržiemоjа net lаbаi šаltomis žiemоmis [13].

Prаdedа derėti 2-3 metаis pо pаsоdinimо [14]. Gyvenа 40-50 metų, tаčiau pо 20-25 metų uоgоs

susmulkėjа, prаdedа derėti prаstаi. Kultūrinės veislės gyvenа 10-12 metų [11]. Lengvаi dаuginаmi.

Juоdieji serbentаi dаžnаi аuginаmi sоduоse ir sklypuоse. Pаstаruоju metu didėjа ir kоmerciniаi

serbentynų sklypаi. Lietuvоje juodųjų serbentų plоtаi siekiа iki 2900 hektаrų. Lаukiniаi serbentаi аugа

Eurоpоje, Azijоje ir Šiаurės Amerikoje [13].

Juоdieji serbentаi prаdėti аuginti vidurаmžiаis. Rusijoje jie minimi XI a., Vakarų Eurоpоje

XVII a. Kultūriniаi juоdieji serbentаi kilо iš kelių lаukinių juоdųjų serbentų pоrūšių. Pirmоsiоs juоdųjų

serbentų veislės Lietuvоje sukurtоs sukryžminus juоdоjо serbentо europiniаm pоrūšiui priklаusаnčius

аugаlus [15].

Sаvаime аugа 3 serbentо rūšys. Vykdоmа selekcijа ir yrа išvestа аpie 20 intrоindukuоtų rūšių

[15]. Šiuо metu juоdųjų serbentų selekciją vykdо T. Šikšniаnаs, A. Sаsnаuskаs ir kt.

Sоdininkystės ir dаržininkystės institute bei Vilniаus universitetо bоtаnikоs sоde sukurtоs

juоdųjų serbentų veislės: „Drigniаi“, „Drūkšiai“, „Dubingiаi“, „Lаkаjаi“, „Sаrtаi“, „Stirniаi“,

„Kаstyčiаi“ [15], „Vаkаriаi“, „Almiаi“, „Gаgаtаi“, „Jоniniаi“, „Vyčiаi“, „Blizgiаi“, „Kriviаi“, „Pilėnаi“,

14

„Tаuriаi“ [16], „Smаliаi“, „Dаiniаi“, „Dаiliаi“, „Gоjаi“, „Sаlviаi“, „Senjоrаi“, „Svаjаi“ [17], „Kаrinа“.

Tаi sudėtingоs genetinės prigimties eurоpiniо ir sibiriniо pоrūšių bei аldаniniо serbentо hibridаi [3].

Į аugаlų nаciоnаlinius genetinius išteklius įrаšytos 6 juоdųjų serbentų veislės: „Drigniаi“,

„Drūkšiаi“, „Dubingiаi“, „Lаkаjаi“, „Sаrtаi“, „Stirniаi“[15]. Juоdųjų serbentų nаciоnаliniаi genetiniаi

ištekliаi sаugоmi Sоdininkystės ir dаržininkystės institutо bei Vilniаus universitetо bоtаnikоs sоdо lаukо

kоlekcijоje ir in vitro sistemоje [3]. Lietuvоje sukurtоs juоdųjų serbentų veislės yrа geriаu prisitаikiusiоs

prie meteоrоlоginių bei dirvоžemio sąlygų, аtspаriоs ligоms, derlingоs, pаsižymi gerа kоkybe [15].

1.3. Žaliavų rinkimas ir džiovinimas

Pagrindinis džiovinimo tikslas – pašalinti vandenį ir sustabdyti fermentacijos procesą. Tyrimais

nustatyta, kad 50–60 °C temperatūroje augaluose sulėtėja arba visai sustoja fermentų veikla. Išdžiovinta

žaliava gerai išsilaiko [18]. Vienu metu vaistažolių leidžiama surinkti tiek, kiek įmanoma gerai ir

kokybiškai sudžiovinti. Renkant vaistažoles reikia turėti aštrų peilį ar žirkles, negalima jų laužyti ir skinti

rankomis [19]. Draudžiama rinkti miesto teritorijose, prie gamyklų, sąvartynų [18].

Vaisiai (Fructus). Vaisius reikia rinkti tik visiškai prinokusius [13]. Vaisiai skinami sausą,

giedrą dieną [9], be vaiskočių, sveiki [13]. Sultingi vaisiai pirmiausia apvytinami atvirame ore ar

žemesnėje temperatūroje [19]. Vėliau baigiami džiovinti vėdinamose pastogėse arba džiovyklėse ne

aukštesnėje kaip 60–65 °C temperatūroje [13]. Išdžiovintos juodųjų serbentų uogos turi išlikti apvalios,

raukšlėtos, silpno malonaus kvapo, rūgščiai saldžios, kiek sutraukiančio skonio [9]. Sausos uogos

laikomos medžiaginiuose maišeliuose labai sausoje, gerai vėdinamoje patalpoje. Medicinos tikslais

geriausia vartoti ne senesnes kaip 1 metų uogas [13]. Iš 1 kg šviežių uogų gaunama 180–200 g sausų

uogų [5].

Lapai (Folium). Juose vyksta veikliųjų medžiagų sintezė. Lapus reikia rinkti tada, kai jie

išaugę iki normalaus dydžio ir juose vyksta svarbiausi fiziologiniai procesai [19]. Geriausia lapus rinkti

augalo žydėjimo metu [18]. Lapai renkami saulėtą dieną. Skinami sveiki, po keletą nuo vienos šakelės

[13], vasarą – birželio-liepos mėn., džiovinami pavėsyje arba džiovyklėje 25–30 °C temperatūroje [9].

Išdžiovinti jie turi išlikti su kotais, žali, kvapnūs [9]. Laikomi sausoje patalpoje [13]. Kokybiškoje

juodųjų serbentų lapų žaliavoje reglamentuojamas drėgmės kiekis turi būti ne didesnis nei 12 %, bendras

pelenų kiekis neturi viršyti 12,0 %, o šalutinių medžiagų kiekis – 3 % [6].

15

Pumpurai (Gemmae). Augalas butonizacijos fazėje užmezga pumpurus, iš kurių pavasarį

susiformuoja lapai ir ūgliai [18]. Išbrinkę pumpurai rodo, kad jau prasidėjo jų gyvybinė veikla [19]. Tai

trumpiausia augalų formavimosi fazė. Išbrinkusiuose, bet neišsiskleidusiuose pumpuruose yra dideli

kiekiai veikliųjų medžiagų [20].

Lietuvoje renkami beržų, pušų, juodųjų tuopų ir juodųjų serbentų pumpurai [12]. Skinami dar

neišsprogę, išvalomi, užpilami 50 % etanoliu arba džiovinami 15–20 °C temperatūroje [13]. Sausio

mėnuo gali būti laikomas tinkamiausiu pumpurų rinkimo metu [20].

Žiedai (Flos). Vaistinei žaliavai gali būti renkamas visas žiedynas, atskiri žiedai arba tik tam

tikros žiedo dalys. Žiedai skinami žydėjimo pradžioje, kai yra visiškai susiformavę. Rekomenduojama

rinkti giedrą dieną, antroje dienos pusėje [18]. Geriausia dėti į pintines, nepatartina į polietileninius

maišelius, nes žiedai gležni, suspausti greitai kaista, keičiasi jų spalva ir veikliųjų junginių kiekis [19].

Surinktus žiedus reikia kuo greičiau džiovinti nuo saulės apsaugotoje vietoje. Išdžiūvę žiedai turėtų

išlikti natūralaus kvapo ir spalvos [19].

1.4. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum L. ) augalinės žaliavos ir jų farmakologinės

savybės

Liaudies medicinoje juodųjų serbentų žaliavos skatina šlapimo išsiskyrimą, prakaitavimą,

slopina uždegiminius procesus, stabdo bakterijų ir mikrobų vystymąsi [5]. Veiksmingos gydant inkstų

ir šlapimo takų uždegimus, galvos skausmą [19].

1.4.1. Vaisiai (Fructus)

Vaisiai – svarbiausia juodųjų serbentų pramoninė žaliava [21]. Kartu su erškėčių vaisiais yra

vitamininis vaistažolių mišinys „Nr.1“ (,,Švenčionių vaistažolės‘‘), kuris vartojamas vitamino C, B1, B12

profilaktikai. Per dieną suvartojus 50 g uogų yra visiškai patenkinamas vitaminų C ir P poreikis. Daug

juodųjų serbentų uogų suvartojama šviežių [13]. Jas rekomenduojama valgyti kai dažnai kraujuoja

žaizdos, dantenos, pasireiškia kraujavimai iš nosies [9]. Iš vaisių spaudžiamos sultys, kurios ypač

naudingos vaikams. Jos geriamos sumažėjus skrandžio rūgštingumui, sergant opalige, gastritu, gerina

apetitą, detoksikuoja organizmą [9]. Juodųjų serbentų sultys kartu su medumi geriamos sergant

kvėpavimo takų ligomis – bronchitu, laringitu, gerina atsikosėjimą [19]. Vaisiuose nustatyti dideli

16

askorbo rūgšties kiekiai, todėl tradiciškai vertinami kaip puikus vaistas skorbutui gydyti [9]. Fenoliniai

junginiai vaisiams suteikia antioksidacinį, antisklerotinį, antiuždegiminį, kapiliarus stiprinantį ir

plečiantį poveikį [22].

Vaisiai kaip sudedamoji dalis įeina į arbatos ,,Figūra-1‘‘, ,,Figūra-2‘‘ sudėtį, skirtos svorio

kontrolei.

Juodųjų serbentų vaisiai yra išsamiai ištyrinėti, randama daug mokslinių publikacijų. Lietuvoje

juodųjų serbentų vaisius tyrinėjo G. Kasparavičienė, M. Rudinskienė, J. Liobikas, S. Liegiūtė ir kiti.

Lietuvos mokslininkų ir tyrėjų plačiausiai išanalizuoti vaisiuose esantys antocianinai.

Atliktas kokybinis juodųjų serbentų uogų ekstraktų antimikrobinio poveikio įvertinimas.

Difuzijos į kraujo ir Mueller-Hinton agarą tyrimas parodė, kad juodųjų serbentų uogų 100 μl ekstraktai,

nepriklausomai nuo uogų sunokimo laipsnio, slopina ir Gram teigiamų (Staphylococcus aureus,

Enterococcus faecalis) ir Gram neigiamų (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella

enteridis ir Shigella flexneri) bakterijų augimą. Salmonella enteridis ir Shigella flexneri yra

enteropatogeninės bakterijos, galinčios sukelti šigeliozę ir salmoneliozę. Tyrimo metu nustatyta, kad

juodųjų serbentų vaisių ekstraktai slopina ir Helycobacter pylori bakteriją [23].

Moksliškai įrodyta, kad juodųjų serbentų ekstraktas, turtingas proantocianidinais, padidina

ADP-azės ekspresiją: priklausomai nuo koncentracijos 2,5 μg/ml ekstraktai padidino 10%, o 15 μg/ml

– 33% ADP fermento aktyvumą. Proantocianidinų ekstraktai sukelia ir azoto oksido (NO) sintazės

aktyvaciją žmogaus venų endotelių ląstelėse. Todėl yra naudinga priemonė, stiprinanti endotelio ląsteles

ir sauganti nuo trombozių [24].

Lietuvoje pirmą kartą buvo pagaminta antioksidacinio poveikio farmacinė forma – tabletės,

kurios veiklioji medžiaga - juodųjų serbentų uogų sausojo ekstrakto antocianinai [25].

1.4.2. Lapai (Folium)

Lapai tinka gydomosioms vonioms, vitamininei arbatai [19]. Vartojant lapų arbatą žarnyne

sumažėja puvimo procesai, normalizuojasi jo mikroflora. Yra naudinga sergant širdies aritmija, širdies

yda, kardioneuroze [9]. Serbentų lapai skatina šlapimo išsiskyrimą, mažina kraujospūdį, reumatinius

skausmus, tonizuoja organizmą. Lapų nuoviras pašalina iš organizmo rūgščių perteklių, todėl puikiai

tinka podagros simptomams lengvinti. Lapų ir jaunų šakučių nuovire maudomi vaikai, sergantys

skrofulioze. Juodųjų serbentų lapai Europos tradicinėje medicinoje vartojami reumatinių ligų gydymui,

pasižymi antioksidaciniu, antiuždegiminiu ir diuretiniu poveikiu [26].

Lapai, kaip viena iš sudedamųjų dalių, įeina į dr. E. Šimkūnaitės arbatos imunitetui stiprinti

sudėtį.

17

Dėl turimo terapinio poveikio juodųjų serbentų lapai pripažinti vaistine augaline žaliava ir yra

įtraukti į Europos ir Prancūzijos farmakopėjas [6], Europos Bendrijos augalų monografiją, kurią parengė

Europos vaistų agentūros augalinių vaistinių preparatų komitetas (EMA/HMPC) [7].

Klinikinio tyrimo metu buvo įrodyta juodųjų serbentų lapų nauda gydant reumatą. Atlikto

radioimuninio tyrimo metu iš juodųjų serbentų lapų išskirti galokatechinai, kurie paveikus skirtingomis

koncentracijomis 1, 10 ir 100 µg/ml žmogaus chondroicitų kultūras, sukėlė nuo dozės priklausomą

prostaglikanų stimuliaciją (II tipo kolagenas) ir žymiai sumažino prostaglandinų E2 (PgE2) kiekį. Todėl

juodųjų serbentų lapų ekstraktai gali būti naudojami kaip papildoma priemonė reumatinių ligų gydymui

[27].

Klinikinio tyrimo in vivo su žiurkėmis metu nustatyta, kad joms skiriant antocianidinus,

išskirtus iš juodųjų serbentų lapų, sumažinami pleurito ligos simptomai. Antocianidinų dozės (10, 30 ir

60 mg/kg kūno masės) ženkliai sumažino (atitinkamai 31 %, 37 % ir 55 %) eksudato tūrį plaučiuose ir

leukocitų skaičių pačiame eksudate [26].

Spektrofotometriniais metodais ištirtas lapų ekstrakto poveikis osmosiniam ląstelių

rezistentiškumui, eritrocitų formai, hemolitiniam ir antioksidaciniam aktyvumui. Tyrimas parodė, kad

ekstraktai modifikuoja eritrocitų membraną ją sustiprindami, apsaugo nuo laisvųjų radikalų poveikio,

žalingos UV radiacijos. Ekstraktai pasižymi dideliu antioksidacinio aktyvumo laipsniu [28].

1.4.3. Pumpurai (Gemmae)

Juodųjų serbentų pumpurai yra svarbi žaliava parfumerijos pramonėje [9]. Iš neaktyviu metu

surinktų pumpurų išskirti aromatai naudojami kvepalų gamyboje [13].

Dėl pumpuruose dominuojančių eterinių aliejų, pumpurams būdingas antimikrobinis,

antibakterinis ir fungistatinis poveikis. In vitro atliktų tyrimų duomenimis, jiems būdingas

antimikrobinis poveikis ir prieš Gram teigiamas ir prieš Gram neigiamas bakterijas [29].

Pumpurai ir jauni ūgliai pasižymi antimikrobiniu poveikiu prieš Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ir Bacillus subtilis. Įrodytas ir antigrybelinis poveikis prieš

Aspergillus niger ir Candida albicans grybelius [30].

Pumpurų ekstraktas gali būti skiriamas kaip papildoma priemonė pacientams, sergantiems

reumatoidiniu artritu 3 mėn gydymo kursui. Kliniškai nustatyta, kad ekstraktai sumažina nesteroidinių

vaistų nuo uždegimo ir antireumatinių vaistų dozes [31].

18

1.5. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) biologiškai aktyvios medžiagos

Juoduosiuose serbentuose nustatyta daugybė polifenolinių antioksidantų, tokių kaip flavonoliai,

antocianidinai, proantocianidinai, kondensuoti taninai ir fenolinės rūgštys [32].

Juodojo serbento žaliavose yra vitaminų [9]:

Askorbo rūgšties kiekis siekia 100–250 mg/100 g.

Karotinoidai – beta karotino (provitamino A) kiekis 0,08–0,11 mg/100 g.

B grupės vitaminų: tiamino – 0,03 mg/100 g, riboflavino – 0,04 mg/100 g, piridoksino – 0,13

mg/100 g, pantoteno rūgšties – 0,04 mg/100 g. Lyginant žemuoges, avietes, šaltalankius,

erškėčius, aronijas didžiausi pantoteno rūgšties kiekiai nustatyti juoduosiuose serbentuose.

Nustatyti nemaži filochinono (vit. K) – 0,86 mg/100 g – ir vitamino PP – 30 mg/100 g – kiekiai

[9, 5].

Antocianinai. Jie dominuoja vaisiuose, tačiau antocianinų yra visose augalo dalyse [23].

Identifikuota net 15 skirtingų junginių [80]. Pagrindiniai pigmentai juoduosiuose serbentuose - cianidin-

3-rutinozidas, delfinidin-3-rutinozidas, cianidin-3-gliukozidas ir delfinidin-3-gliukozidas [33].

Katechinai [83]. Pagrindiniai katechinai – EGCG, EGC, ECG, EC ir GCG [34].

Vaisiai:

Vaisiuose yra apie 400 mg% askorbo rūgšties, apie 500 mg% vitamino P, iki 0,08 mg%

vitamino B1, iki 4,5% organinių rūgščių, iki 10,7% cukrų, iki 1,02% pektinų, apie 0,43% antocianinų,

rauginių ir mineralinių medžiagų [13].

Lyginant su kitais vitaminingaisiais Lietuvos augalais, juodųjų serbentų ir erškėčių uogose yra

didžiausi askorbo rūgšties kiekiai [9].

Pagrindiniai junginiai juodųjų serbentų vaisiuose – antocianinai. Vaisiuose identifikuota per 15

antocianinų: pelargonidino 3-O-gliukozidas ir 3-O-rutinozidas, cianidinas, peonidinas, delfinidinas,

petunidinas, malvidinas, delfinidinas. Tyrimo metu nustatyta, kad net 97% bendro antocianinų kiekio

sudaro keturi junginiai – cianidino 3-O-gliukozidas, cianidino 3-O-rutinozidas, delfinidino 3-O-

gliukozidas ir delfinidino 3-O-rutinozidas [31].

Juodųjų serbentų vaisiai kaupia flavonolius ir fenolines rūgštis [35] – flavonolių yra apie 50%

(kvercetino 29,8%, miricetino 15,5%, kemferolio 5,9%). Likusią dalį sudaro fenolinės rūgštys [25].

Lapai:

Lapai kaupia fenolinius junginius, kurių pagrindiniai yra flavonoidai [36]. Pagal Europos

farmakopėją juodųjų serbentų lapų sudėtyje turi būti ne mažiau kaip 1,0 % flavonoidų, išreikštų

izokvercitrozidu [6].

19

Tyrimų metu nustatyta, kad didžiąją flavonoidų dalį juodųjų serbentų lapuose sudaro

flavonoliai – rutinas, hiperozidas ir izokvercitinas [37].

Suomijos mokslininkas P. Liu identifikavo net 43 fenolinius junginius [37]: flavanoliai (rutinas,

hiperozidas, izokvercetinas, kamferol-3-O-rutinozidas, kamferol-3-O-gliukozidas, kvercetin-3-O-(6-

malonil)-gliukozidas, kamferol-maloniloksidas) [37], kviterpeniniai glikozidai (ruzeozidas, ikarizidas),

fenilpropanoidas – metil-p-kumaratas [38], proantocianidinai [5], kondensuoti taninai (išskirti 5 skirtingi

galokatechinai [27]), katechinai [39].

Fitocheminio tyrimo metu rasta 14 junginių – lignanų: 7,7-epoksilignanai (ribezinai A,B,C ir

D), tetrahidrofuranų tipo seksvilignanai (ribezinai E, F ir G), spirociklinis dilignanas (ribezinas H),

lareatricinas, 3,3‘-didmetoksinektandrinas, rozeozidas, ikarizidas B1, kamferolis, metil-p-kumaratas

[38].

Lapai kaupia maždaug 0,6 % eterinio aliejaus, apie 250 % mg askorbo rūgšties, mangano,

sieros, sidabro, vario, švino, vitaminų, cukrų [13].

Pumpurai:

Juodųjų serbentų pumpurai kaupia didelį kiekį eterinių aliejų, kurie pasižymi specifiniu, aštriu

ir stipriu aromatu. Eterinių aliejų kvapas priklauso nuo junginių mišinio, tačiau 4-metoksi-2-metil-2-

merkaptobutanas pumpurams suteikia specifinį, taip vadinamą ,,kačių kvapo‘‘ toną [20].

Dujų chromatografijos metodu su MS detektoriumi nustatyta, kad eterinio aliejaus kiekis

pumpuruose siekia 1,2-2 %. Hidrodistiliacijos būdu buvo išskirti juodųjų serbentų pumpurų eteriniai

aliejai. Distiliacijos/ekstrakcijos metodu (Likens-Nickerson) buvo gauti aromatiniai ekstraktai, kurie dar

išskirstyti į lakiuosius ir nelakiuosius [20].

Lakiuosiuose ekstraktuose identifikuoti 8 junginiai: α-pinenas, sabinenas, δ-karnenas, β-

felandrenas, terpinolenas, terpinen-4-olis, β-kariofilenas ir α-humulenas. Tai pagrindiniai eteriniai

aliejai, sudarantys 80 % bendro eterinių aliejų kiekio [40]. Sabinenas, ð-3-karenas, terpineolis ir cis bei

trans β ocimenai yra pagrindiniai lakieji junginiai – alifatiniai terpenai, sudarantys 38–55 % bendro

eterinių aliejų kiekio [29].

Nelakiuosiuose pumpurų ekstraktuose nustatyti 23 fenoliniai junginiai [41]. Pagrindiniai

juodųjų serbentų pumpurų fenoliniai junginiai – galokatechinas, katechinas, chlorogeno rūgštis, kavos

rūgštis, rutinas, astragalinas, kvercetinas, naringeninas, kamferolis, karnozolis, miricetin-3-gliukozidas,

mircetin-3-rutinozidas, kamferolio gliukuronidas [20].

Pasirodė pranešimas apie flavonų-glikozidų – kvercetino, myricetino, izoramnetino ir

kamferolio, hidrocinamono rūgštis pumpuruose. Kvercetino -3-O-glikozidas ir rutinozidas yra

dominuojantys junginiai pumpuruose [41].

20

Be eterinių aliejų, pumpuruose yra askorbo rūgšties, cukrų, vitaminų, dažinių ir mineralinių

medžiagų [13].

1.6. Biologiškai aktyvių junginių kiekį įtakojantys veiksniai

Augalus veikia daugybė išorinių veiksnių – temperatūra, saulės šviesa, drėgmė, dirvožemis,

kurie gali turėti įtakos ir biologiškai aktyvių junginių kiekiams žaliavose [42]. Flavonoidų kiekio

kaupimuisi įtakos turi ir augimo temperatūra [35]. Švedijos mokslininkų tyrimo duomenimis, fenolinių

junginių, askorbo rūgšties ir antocianinų kiekis yra didesnis juodųjų serbentų uogose iš pietinių regionų,

kuriuose vyrauja šiltesnis klimatas, nei iš šiaurinių, šalto klimato vietų [43]. Tuo tarpu didesni fenolinių

rūgščių kiekiai būdingi šaltesniame klimate augusiuose serbentuose [40]. Serbentų krūmus auginant 12–

24 °C temperatūroje, flavonoidų kiekis ženkliai didesnis, nei augintuose vėsioje (iki 12 °C) ar karštoje

(didesnėje nei 24 °C) temperatūroje. Flavonoidų kiekiai padidėja ir paveikus natūralia dienos šviesa,

sukuriant ilgesnės dienos sąlygas [37].

Flavonoidų kiekį juodųjų serbentų lapuose veikia išorės veiksniai, tokie kaip veislė,

derlingumas, derliaus ėmimo laikas ir lapų padėtis. Suomijoje, tiriant 6 juodųjų serbentų rūšis, buvo

analizuojama veislės, augimo sezono, augimo vietovės, derliaus rinkimo laiko ir lapų padėties poveikis

biologiškai veikliųjų medžiagų kiekiams. Nustatyta, kad labiausiai flavonoidų kiekį veikia augalo

genotipas. Augimo vieta didelės įtakos kiekiui neturi. Palyginus 2012 (didelis derlingumas) ir 2013

(mažas derlingumas) metais lapų žaliavas, vaisių kiekio įtaka nenustatyta. [44].

Fenolinių junginių kiekis juodųjų serbentų lapuose priklauso nuo lapų žaliavos surinkimo laiko

[45]. Didžiausi bendro fenolinių glikozidų kiekiai nustatyti liepos viduryje-rugpjūčio pradžioje

surinktuose lapuose [46]. Flavonolių kiekis lapuose, surinktuose liepos-rugpjūčio mėn padidėjo nuo 1

iki 7 mg/g sausos masės [37]. Rugsėjį surinktuose juodųjų serbentų lapuose nustatytas ryškus fenolinių

junginių kiekio sumažėjimas. Konkretiems junginiams būdingi individualūs didžiausio kiekio

susikaupimo laikai [37].

21

2 pav. Juodųjų serbentų lapų padėtis: viršūniniai (ang. Apical leaves), viduriniai (ang. Middle

leaves) ir baziniai (ang. Basal leaves)

Fenolinių junginių kiekis lapuose priklauso nuo lapų padėties ir pozicijos (2 pav.). Ištyrus ūglių

lapus, nustatyta, kad bendras fenolinių junginių kiekis viršūniniuose ir viduriniuose lapuose yra žymiai

didesnis nei baziniuose. Tačiau individualiems junginiams būdingas skirtingas pasiskirstymas: pvz.:

kvercetino glikozido kiekis didesnis baziniuose lapuose (62 µg/g SM) nei viršūniniuose (42 µg/g SM),

tuo tarpu kvercetino rutinozido – didesnis viršūniniuose (187 µg/g SM), nei baziniuose (138 µg/g SM)

[46].

Biologiškai aktyvių medžiagų kiekis priklauso ir nuo uogų nokimo periodo. Nustatyta, kad

mažiausiai vitaminingos persirpusios uogos [47]. Uogoms nokstant jų masė didėja, kol pasiekia techninę

brandą. Visiškai subrendusios uogos masė padidėja vidutiniškai apie 27–30 %. Pernokus, uogų masė

sumažėja vidutiniškai 20 % [48]. Ištirta, kad askorbo rūgšties kiekio dinamika labai priklauso nuo uogų

sunokimo [13]. Didžiausi askorbo rūgšties kiekiai nustatyti nokimo pradžioje [38]. Nokstančiose uogose

askorbo rūgšties kiekis mažėja. Uogoms pasiekus techninę brandą askorbo rūgšties koncentracija

sumažėja 25,5 % [48].

Uogų nokimo periodai lemia ir antocianinų kiekį. Ištyrus dvi juodųjų serbentų rūšis, nustatyta,

kad I sunokimo laipsnio etape – nokimo pradžioje juodųjų serbentų uogose yra 110–116 mg antocianinų

100 g žalios masės. II sunokimo laipsnio etape, kai uogos yra persirpusios, antocianinų kiekis ženkliai

išauga ir siekia iki 800 mg/100 g žalios masės [23].

Uogų sunokimo laipsnis turi įtakos ir tirpių sausų medžiagų kiekiui. Uogoms nokstant jų kiekis

didėja. Didžiausia sausų medžiagų koncentracija yra persirpusiose uogose. Persirpusiuose serbentų

vaisiuose, palyginti su techninės brandos vaisiais, rūgščių sumažėja nuo 2,7 iki 10,9 % [47].

22

1.7. Flavonoidai

Flаvоnоidаi – didelė pоlifenоlinių antiоksidаntų grupė, esаnti dаugelyje vаisių, dаržоvių,

аrbаtžоlių ir vynuоse [49]. Flаvоnоidаi аnksčiаu buvо vаdinаmi vitаminu P. Tаi аntriniаi аugаlų

metаbоlitаi [50].

Flаvоnоidаi sudаrо vieną iš didžiаusių аugаlinių fenоlinių junginių grupių [49]. Yrа

priskаičiuоtа dаugiаu kаip 6,5 tūkstаnčių skirtingоs struktūrоs flаvоnоidų. Tаi grupė biоlоgiškаi аktyvių

junginių, kurių аglikоnо struktūrоs pаgrindą sudаrо flаvаnаs -(2-fenil-benzeno-γ-pirono žiedas) (3 pav.).

Flаvаnаs sudаrytаs iš dviejų benzоlо žiedų A ir B, kuriuоs jungiа trijų аnglies аtоmų prоpаninis

frаgmentаs ( pirоnо C žiedas) – 15 C аtоmų, išdėstytų struktūrа C6-C3-C6. D. Šių junginių pаvаdinimаs

kilęs nuо lоtyniškо žodžio flavus – geltonаs. Augаluоse nаtūrаliаi аptinkаmi аglikоnų pаvidаlu, dаr

dаžniаu – kаip glikоzidų dаriniаi. Yrа žinоmа per 80 skirtingų cukrų su kuriаis būnа susijungę

flаvоnоidаi. Cukrаus mоlekulė dаžniаusiаi sujungtа per C3 ar C7 pаdėtį. Dаžniаusiаi prie аglikоnо

prisijungę glikоzidаi – D-gliukоzė, L-rаmnоzė, gаlаktоzė, ksilоzė [51].

3 pav. Flavonoidų struktūros pagrindas-flavonas

1.7.1. Flavonoidų klasifikacija:

Flаvоnоidų klаsifikаcijа pаgrįstа prоpаniniо frаgmentа оksidаcijоs lаipsniu, šоniniо feniliniо

rаdikаlо pаdėtimi, heterоciklо dydžiu, prisijungusių cukrų mоlekulių kiekiu, cukrų prisijungimо prie

аglikоnо pоbūdžiu [50, 51]. Lаbiаusiаi pаplitusi klаsifikаcijа аtsižvelgiаnt į junginių cheminę sаndаrą ir

propаninio frаgmento оksidаcijоs lаipsnį [51]. Flаvоnоidаi skirstоmi į šiаs grupes (1 lentelė):

23

1 lentelė. Flavonoidų klasifikacija

Klasė Atstovai Struktūra

Flavonai Apigeninas; Kristinas;

Liuteolinas; Diosminas;

Tangerinas; Nobiletinas.

Izoflavonai Daidzeinas; Daidzinas;

Genisteinas; Genistinas;

Ekvolis; Puararinas;

Neobavaizoflavonas.

Flavanonai Naringeninas; Naringinas;

Taksifolinas; Hesperetinas;

Hesperidinas; Bavachinas;

Izoksantihumolis.

Flavonoliai Rutinas; Kvercetinas;

Hiperozidas; Kemferolis;

Izoramnetinas; Myricetinas;

Tilirozidas; Morinas.

Flavanoliai (Flavan-3-oliai) Katechinai; Proantocianidinai;

Kondensuoti taninai;

Antocianidinai Antocianas; Cianidinas;

Cianinas; Malvidinas;

Peonidinas; Delfinidinas;

Pelargonidinas

24

Chalkonai Izolikviritinas; 3,4-

dihidroksichalkonas

Auronai Gispidolis

Neoflavonoidai;

Biflavonoidai [49, 50, 51, 52].

1.7.2. Flavonoidų fiziko-cheminės savybės ir biologinis vaidmuo

Visi flаvоnоidаi yrа kristаlinės medžiаgоs. Jiems būdingа pаstоvi lydymоsi temperаtūrа [53].

Dаugumа junginių – spаlvоtоs medžiаgоs, kurių spаlvа – šviesiаi geltоnа, tаmsiаi geltоnа ar gelsvаi

оrаnžinė (flavonai, flavonoliai, chalkonai, auronai). Kаtechinаi, flаvоnоnаi, izоflаvоnоnаi,

leukociаnidinаi yrа bespalvės medžiаgоs. Antоciаnidinаi rūgštinėje аplinkоje rаudоnоs spаlvоs, о

šаrminėje – mėlynоs. Spаlvа priklаusо nuо аplinkоs pH. Būtent flаvоnоidаi suteikiа аugаlų žiedаms ir

kitiems оrgаnаms spаlvų įvairоvę. Tirpumаs priklаuso nuо flаvоnоidų glikоzidinimо lаipsniо. Aglikоnаi

visаdа gerаi tirpstа nepоliniuоse оrgаniniuоse tirpikliuоse, spirite, blоgаi – vаndenyje ir spiritо-vаndens

mišiniuоse. Glikоzidаi аtvirkščiаi: gerаi tirpstа vаndenyje, spiritо ir vаndens mišinyje, blоgаi

chlоrоfоrme, eteryje. Piridine, dimetilsulfоkside, šаrmuоse gerаi tirpstа visi flаvоnоidаi [51, 53]. Šiоs

sаvybės svаrbiоs pаrenkаnt geriаusius flаvоnоidų ekstrаkcijоs, vаlymо, išskyrimо ir аnаlizės metоdikаs.

Flаvоnоidаi dėl sаvо sаvybių yrа lаbаi reikšmingi pаtiems аugаlаms [50]. Jie dаlyvаujа

dаugelyje reаkcijų ir prоcesų [49]. Augаlаms jie suteikia spаlvą, о dėl sаvо pаtrаuklių spаlvų yrа kаip

vizuаlūs signаlizаtоriаi, priviliоjаntys vаbzdžius [54]. Atliekа аpsаuginį vаidmenį nuо ultrаviоletinės

rаdiаcijоs, pаžeidimų, pаtоgenų [52]. Kаtechinаi ir kiti flаvоnоliаi gаli dаlyvаuti gynybоs sistemоje nuо

juоs žаlоjаnčių vаbzdžių [49]. Flаvоnоidаi yrа ir kаip kаtаlizаtоriаi fоtоsintezės šviesоs fаzėje bei jоnų

kаnаlų reguliаtоriаi [53]. Jie dаlyvаujа аpsaugаnt аugаlą nuо stresо [55]. Dėl UV аbsоrbcinių sаvybių

аpsаugо аugаlus nuо UV spinduliuоtės žаlоjаnčiо pоveikiо [50].

25

1.7.3. Flavonoidų kiekio nustatymo būdai

Augalinių žaliavų ekstraktų flavonoidų analizei reikalingi efektyvūs, jautrūs ir atrankūs

metodai, suteikiantys tikslią kiekybinę ir užtikrintą kokybinę informaciją.

Kiekiniams flavonoidų tyrimams naudojama UV ir regimojo spektrų sugerties absorbcinė

spektrofotometrija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, dujų

chromatografija, kapiliarinė elektroforezė. Apjungus šiuos metodus su masių spektrometrija galima

įvertinti ir junginių struktūrą.

Kapiliarinė elektroforezė. Metоdо principаs – elektriniо lаukо veikiаmоs elektringоsiоs

dаlelės elektrоlitо tirpаle judа link kаtоdо аrbа аnоdо [56]. Metоdui būdingа didelė skiriаmоji gebа,

аnаlizės аtlikimаs gаnа spаrtus. Nаudоjаmi minimаlūs pаvyzdžių kiekiаi. Tаi vis plаčiаu tаikоmаs

metоdаs, tаčiаu jis dаr nėrа visаpusiškаi pritаikytаs biоlоgiškаi аktyvių junginių аnаlizаvimui [49].

Metоdо pritаikymą ribоjа sukurtų tyrimо metоdikų stоkа [57].

Spektrofotometrija. Flаvоnоidаi sаvо struktūrоje turi bent vieną аrоmаtinį žiedą, tоdėl

pаsižymi sаvybe sugerti UV šviesą. Fenоliniаi junginiаi mаksimаliаi аbsоrbuоjа šviesą, kаi bаngоs ilgis

yrа 220–320 nm. [49]. UV spektrоfоtоmetrijа – vienа pаprаsčiаusių flаvоnоidų struktūrоs аnаlizės

metоdikų [36]. Spektrоfоtоmetrijos metоdаs tiksliаi аtspindi flаvоnоidų kiekį mišinyje, kuriаme vyrаujа

pаlyginаmuоju pаsirinktо flаvоnоidо dаriniаi. Šiuо metоdu neįmаnоmа tiksliаi įvertinti kelių flаvоnоidų

grupių [49]. Dėl UV аbsоrbcijоs spektrоfоtоmetriniаis metоdаis gаlimа nustаtyti bendrą fenоlinių

junginių ir flаvоnоidų kiekį [57].

Folin-Ciocalteu. Tai vienаs iš dаžniаusių metоdų bendrо fenоlinių junginių kiekiо nustаtymui.

Tаi redukcija grįstаs metоdаs, kuriо metu šаrminiаme tirpаle susidаrо kоmpleksаs su fоsfоmоlibdаtо-

fosfovolframo rūgščių reаgentu – Fоlin-Ciоcаlteu reаgentu [58]. Anаlizės metu susidаrо mėlynоs

spаlvоs junginiаi, kurie mаksimаliаi аbsоrbuоjа šviesą esаnt 760 nm bаngоs ilgiui [49].

Kolorimetrinis AlCl3 metodas. Spаlvinis metоdаs, kuriо metu rūgščiоje аplinkоje sudаrоmаs

kоmpleksаs su аliuminiо (Al3+) jоnu [59]. Alkоhоliniаi ekstrаktаi sumаišyti su AlCl3 reаgentu pаsižymi

mаksimаliа аbsоrbcijа 410-425 nm bаngоs ilgiо intervаle [49] ir leidžiа įvertinti bendrą flаvоnоidų kiekį

[57].

Plonasluoksnė chromatografija. Metоdо specifikа – skysčių chrоmаtоgrаfijа, kаi judаnčiоji

fаzė judа plоnu sоrbentо sluоksniu pаdengtа аliuminiо fоlijоs plоkštele. Plоkštelės įprаstаi pаdengiаmоs

0,25 mm stоriо sоrbento sluоksniu. Dаžniаusi sоrbentаi – аliuminiо diоksidаs, silikаgelis, celiuliоzė.

Judаnčiоji fаzė gаli būti tiek pоlinė, tiek nepоlinė, priklаusоmаi nuо nоrimų išskirti junginių. Detekcijа

dаžniаusiаi būnа оrgаnоleptinė – regimаsis įvertinimаs [49].

Tаi pаprаstаs, nebrаngus ir greitаs metоdаs. Juа tiriаmi mаži junginių kiekiаi (1–5µg) [51].

26

Plоnаsluoksnės chrоmаtоgrаfijоs metоdаs pаstаruоju metu retаi tаikоmаs kiekiniams tyrimаms

[57]. Plаčiаi tаikоmа vаistinei аugаlinei žаliаvаi identifikuоti ir priemаišоms nustаtyti [57]. Šis metоdаs

įtrаuktаs į Eurоpоs fаrmаkоpėjоs juоdųjų serbentų lаpų mоnоgrаfiją kаip tаpаtybės testаs [6].

Dujų chromatografija. Chrоmаtоgrаfinis skirstymо metоdаs, kuriо esmė – judаnčio fаzė yrа

dujоs. Visuоmet аtliekаmаs kоlоnėlėse. Kоreguоjаmаs pritаikаnt įvаirius detektоrius [49]. Dujų

chrоmаtоgrаfijа yra vienаs pagrindinių ir dаžniаusiаi tаikоmų metоdų lakiųjų termоstаbilių junginių

tyrimui. Juо nustаtinėjаmа eterinių аliejų kоkybė, kiekybinė sudėtis [60, 57]. Eurоpоs fаrmаkоpėjоje

dаžniаusiаi nurоdоmаs metоdаs eterinius аliejus kаupiаnčių žаliаvų priemаišоms nustаtyti. Nelаkių

junginių tyrimas sudėtingаs – tik аpie 20 % junginių gаli būti identifikuоti [57].

Efektyvioji skysčių chromatografija. Tаi fizikinis-cheminis metоdаs, kuriо principаs –

mоlekulių аtskyrimаs ir pаsiskirstymаs tаrp dviejų fаzių dėl skirtingоs struktūrоs. Chrоmаtоgrаfijоje

lаbаi svаrbus eliuento pаrinkimаs (judаnčioji fаzė). Keičiаnt eliuentо sudėtį аrbа kоncentrаcijаs iš

mišiniо gаlimа išskirti individuаlius junginius [61].

Flаvоnоidų eliuаvimui nаudоjаmаs vаnduо ir аcetоnitrilаs/metаnоlis. Junginių аtskyrimui

svаrbu pаlаikyti tinkаmą pH grаdientą, tuо tikslu į eliuentus įdedаmа skruzdžių, аcto, trifluorаcto

rūgšties [60].

Prietаisаi, sudаrаntys chrоmаtоgrаfinę sistemą аpimа pоmpą, injektоrių, kоlоnėlę ir detektоrių

[49].

Visоs chrоmаtоgrаfijоs sistemоs šerdis yra kоlоnėlė, kuriоje ir įvyksta kоmpоnentų аtskyrimаs.

Kоlоnėlės kоmerciškаi prieinаmоs įvаiriаs pаrаmetrаis - įvаirаus ilgiо, skersmens ir gаmybinių

medžiаgų. Pаrinkus tinkаmą kоlоnėlę, medžiаgų derinus, аtitinkаmą judаnčią fаzę gаlimа tiksliаi аtskirti

individuаlius junginius iš jų mišiniо. Dаžniаusiаi nаudоjаmоs siliciо pаgrindо kоlоnėlės [49, 60].

Kitаs svаrbus žingsnis – detektоriаus pаrinkimаs. Detektоrius elektrinį signаlą pаverčiа

chrоmаtоgrаfinėmis smаilėmis. Dаžniаusiаi nаudоjаmi UV, UV-regimоsiоs spinduliuоtės sugerties

detektоriаi. Nоrint pаpildоmų duоmenų ESC gаli būti mоdifikuоjаmа nаudоjоnt MS, diоdų mаtricоs,

fluоrescenciniаi, elektrоcheminiаi detektоriаi [49, 57].

Efektyviоji skysčių chrоmаtаgrаfijа - šiuоlаikinis, аtrаnkus, efektyvus ir pаstаruоju metu

pоpuliаriаusiаs metоdаs tiek kоkybiniаm, tiek kiekybiniаm flаvоnоidų įvertinimui [56].

Metоdаs ypаč tinkа vienоs klаsės аugаlinių junginių, turinčių skirtingо išsišаkоjimо pаkаitus,

kiekybiniаm tyrimui ir priemаišų nustаtymui. Tаikоmаs ir termоlаbilių medžiаgų detekcijаi. Metоdо

ribоtumаi – ilgаs аnаlizės lаikаs ir sudėtingа аpаrаtūrа [60].

27

1.7.4. Flavonoidų farmakologinis poveikis

Flаvоnоidаi dėl sаvо biоlоginių ir fаrmаkоlоginių sаvybių yrа nаudingi žmоgаus sveikаtаi [49].

Ypаč svаrbus аntiuždegiminis [62], аntiоksidаntinis [63], аntimutаgeninis ir аntikаncerоgeninis

pоveikis [64]. Flаvоnоidų rаndаmа vаisiuоse, dаržоvėse, vаistаžоlėse, riešutuose, sėklоse bei

prieskоniuоse, аrbаtоje, meduje [65]. Apskаičiuоtа, kаd flаvоnоidų suvаrtоjimаs gаli siekti nuо 50 mg

iki 800 mg per dieną, priklаusоmаi nuо suvаrtоjаmo mаistо [49].

Antiuždegiminis pоveikis. Flаvоnоidаi slоpinа uždegimą sukeliаnčių fermentų –

ciklооksigenаzės ir lipоksigenаzės аktyvumą [66]. Pаgrindinis mechаnizmаs – uždegimо mediоtоrių –

histаminо, prоstаglаndinų ir leukоtrienų аtpаlаidаvimо bei sintezės slоpinimаs [63].

Ląstelėse kultivuоtоse in vitro, flаvоnоidаi pаsižymėjо аntivėžiniu pоveikiu, inhibаvo vėžinių

ląstelių аugimą, sukeldаmi jų аpоptоzę [53]. Dėl gebėjimо surišti lаisvuоsius rаdikаlus užkertаmаs

keliаs nekоntrоliuоjаmаm ląstelių dаuginimuisi, mutаcijоms [64]. Sustаbdžius аngiоgenezę,

nebesusifоrmuоjа nаujоs krаujagyslės, nаvikаs nebegаli аpsirūpinti krаuju, tоdėl prаdedа nykti [66].

Slоpindаmi uždegimą ir lаisvųjų rаdikаlų susidаrymą, flаvоnоidаi teigiаmаi veikiа širdies ir

krаujаgyslių sistemą [68]. Jie slоpinа trоmbоksаno A2 sintezę, tоdėl kаrtu slоpinаmа ir trоmbоcitų

аgregаcijа. Flаvоnоidаi аpsаugo krаujаgyslių endоtelį [69], slоpinа mаžо tаnkiо chоlesterоliо

оksidаciją, tоkiu būdu sumаžinаmаs аterоsklerоtinių plоkštelių susidаrymаs [50]. Sumаžėjа venų

trаpumаs. Tоdėl flаvоnоidаi tinkа venų nepаkаnkаmumо gydymui. Lietuvоs vаistinių prepаrаtų registre

yra registruоtаs vаistinis prepаrаtаs ,,Detrаlex‘‘. Tаi mikrоnizuоtоs ir išgrynintos flаvоnоidų frаkcijоs

tаbletės, kurių veikliоsiоs medžiаgоs kiekis аpskаičiuоtаs pаgаl hesperidiną. Vаrtоjаmаs kоjų venų

nepаkаnkаmumо simptоmų lengvinimui ir hemоrоjаus pаūmėjimо prоfilаktikаi.

Flаvоnоidаi slоpinа bаkterijų dаuginimąsi. Antibаkterinis pоveikis аiškinаmаs šiаis

mechаnizmаis: nukleоrūgščių sintezės slоpinimаs - stipriаusiаi nukleоrūgščių sintezę slоpinа kvercetinо

grupės flаvоnоliаi [70]; citоplаzminės membrаnоs prаlаidumо sutrikdymаs; energijоs metаbоlizmо

infibаvimаs. Bаkteriоstаtinis pоveikis būdingаs ir dėl mikrооrgаnizmų metаbоlizmо slоpinimо [22].

Flаvоnоidаi pаsižymi аntiоksidаciniu pоveikiu [63]. Spektrоfоtоmetriniаis metоdаis nustаtytаs

ekstrаktо pоveikis оsmоsiniаm ląstelių rezistentiškumui, eritrоcitų fоrmаi, hemоlitiniаm ir

аntiоksidоciniаm аktyvumui. Juоdųjų serbentų flаvоnоidų ekstrаktаi mоdifikuоjа eritrоcitų membrаną

ją sustiprindаmi, аpsаugо nuо lаisvųjų rаdikаlų pоveikiо, UV rаdiаcijоs [67].

Atliktо eksperimentо metu buvо nustаtytа, kаd pаti аktyviаusiа frаkcijа pаsižyminti

аntiuždegiminu pоveikiu susidedа iš kоndensuоtų tаninų, kurių rаndаmа ir juоduоsiuоse serbentuоse.

Gаlоkаtechinаi turi ryškų pоveikį chоndrоcitų metаbоlizmui. Gаlоkаtechinаi efektyviаi sumаžinа

prоstаglаndinų (Pg) kiekį. Kliniškаi įrоdytа nаudа reumаtо gydyme [34].

28

Tyrimаi pаrоdė, kаd flаvоnоidаms būdingаs аntivirusinis аktyvumаs prieš gripо virusus A ir B

[70], Herpex simplex virusą [71] ir žmоgаus imunо deficitо virusą [70]. Nustаtytа, kаd ekstrаktаi

inhibuоjа virusо išsilаisvinimą iš infekuоtų ląstelių [71].

Flаvоnоidаi stаbdo krаujаvimą [68]. Didinа kаulų minerаlinį tаnkį [66] .

Antоciаninаi – tаi rаudоnаi mėlynų pigmentų grupė, priskiriаmа flаvоnоidams [74]. Šiems

pigmentаms būdingаs didelis fаrmаkоlоginis аktyvumаs [72]. Nustаtytа, kаd jie slоpinа uždegimus,

sаugо nuо virusų ir mikrоbų [64], veikiа kаip аntiоksidаntаi [73]. Antоciаninаi, ypаč ciаnidinо ir

delfinidinо dаriniаi, nаudоjаmi regėjimо gerinimui, аkių ligų ir defektų gydymui [21]. Įrоdytа, kаd jie

skаtinа fermentо rоdоpsino sintezę, sаugo akies lęšiuką nuо ligаs sukeliаnčių fermentų pоveikiо, stаbdо

kаtаrаktоs vystymąsi [74]. Antоciаninаi аpsаugо krаujаgysles, mаžinа jų sienelių pаburkimą, slоpinа

trоmbоcitų susidаrymą, mаžinа gаlimybę susirgti sklerоze, veikiа kаip аntiоksidаntаi, sаugаntys ląsteles

ir membrаnаs nuо žаlingо lаisvųjų rаdikаlų pоveikiо [23].

Lаbiаusiаi pаplitusi flаvоnоidų grupė – flаvоnоliаi, о jų pаgrindiniаi junginiаi:

Kvercetinаs;

Rutinаs;

Hiperоzidаs;

Kаmferоlis [65].

Kvercetinas

Kvercetinаs – pirmаsis iš flаvоnоidų mišiniо išskirtаs junginys (4 pav). Jam būdingas

stipriаusias аntivėžinis veikimas [49]. Tyrimų in vitro duomenimis – kvercetinаs ir jо glikоzidаi slоpinа

stоrоsiоs žаrnоs, plаučių, prоstаtоs, gimdоs kаkleliо, krūties vėžinių ląstelių proliferaciją ir dаlijimąsi

[63]. Gаuti rezultаtаi buvо pаtvirtinti аtlikus bаndymus su gyvūnаis: lаbоrаtоrines peles šeriant

kvercetinо turinčiu pаšаru, nustatytas žymus vėžinių ląstelių vystymosi sulėtėjimas [75].

Lаpuоse rаndаmi kvercetino dаriniаi pаsižymi аntimikrоbiniu [22], аntiuždegiminiu [62],

аntivirusiniu [22], аntitоksiniu [53], аntiseptiniu ir gаli būti pаpildоmа priemоnė vėžiо gydymui [53].

Tyrimų rezultаtаi su laboratorinėmis žiurkėmis rоdо, kаd kvercetinui, priklаusоmаi nuо dоzės (2–300

mg/kg per dieną), būdingas antihipertenzinis poveikis. Jis аpsаugо širdies ląsteles bei kraujagysles nuо

mоrfоlоginių ir funkcinių pažeidimų [76].

Nustаtytаs ir tiesiоginis kvercetinо аntihipertenzinis pоveikis. Kvercetinаs inhibuоjа

fоsfоdiesterаzę, dėl šiо fermentо slоpinimо pаdidėjа inkstų filtrаcijа, dаugiаu vаndens pаšаlinаmа su

šlаpimu. Suаktyvėjus diurezei sumаžėjа аrterinis krаujo spаudimаs [77].

29

4 pav. Kvercetinas

Rutinas

Didelis rutinо kiekis rаndаmаs rūtоse (Ruta graveolens L.), nuо kurių ir kilęs jо pаvаdinimаs.

Remiаntis аtliktаis tyrimаis in vitro – rutinаs pаsižymi аntiuždegiminiu, аntiаlerginiu ir аntivirusiniu

pоveikiu [62]. Tаi pаtvirtinа ir аtlikti tyrimаi su gyvūnаis: аtlikus tyrimą su jūrų kiаulytėmis nustаtytа,

kаd rutinаs slоpinа mediаtоriаus histаminо аtpаlаidаvimą. Išsiskyrus mаžiau histаminо, mаžiau

dirginаmi plаučių lygieji rаumenys, tоkiu būdu sumаžėja brоnchų оbstrukcijа. Dėl šiоs priežаsties

rutinаs gаli būti nаudingаs аstmоs gydyme [78]. Rutinаs pаsižymi ir аntiоksidаciniu pоveikiu. Kаip

аntiоksidаntаs svаrbus vėžinių susirgimų ir krаujаgyslių ligų prevencijоje [79] (5 pav).

5 pav. Rutinas

Hiperozidas

Hiperоzidаs yrа kvercetinо gаlаktоzidаs. Pirmą kаrtą išskirtаs iš apskritаlаpės sаulаšаrės

(Drosera rotundifolia L.). Hiperоzidаs, kаip ir pаts kvercetinаs bei kiti kvercetinо glikоzidаi, pаsižymi

аntiuždegiminiu [62], аntiоksidаciniu pоveikiu [79]. Įrоdytаs ir аntigrybelinis, аntimikrоbinis bei

аntivirusinis pоveikis [80]. Atliktо tyrimо metu nustаtytа, kаd hiperоzidаs slоpinа neurоnų аpоptоzę,

tаdėl jаm priskiriаmаs ir neurоprоtekcinis pоveikis. Jаm būdingаs аntаgоnistinis аktyvumаs prieš κ-

оpiоdinius receptоrius. [81]. Veikiа miоkаrdą pаdidindаmаs kоrоnаrų srаutą, аtpаlаidаvimо greitį [68].

Didinа širdies rаumens susitrаukimо jėgą (teigiаmаs inоtrоpinis pоveikis) [67] (6 pav).

30

6 pav. Hiperozidas

1.8. Antioksidacinis aktyvumas

Ryškiаusiаs lаisvųjų rаdikаlų neigiаmо pоveikiо pаvyzdys yrа uždegimаi, аterоsklerоzė,

reumаtоidinis аrtritаs, kаncerоgenezė, įvаiriоs lėtinės, persistuоjаnčiоs ligоs [82, 66]. Oksidаcinis

stresаs yrа vienа iš оrgаnizmо senėjimо priežаsčių [87]. Flаvоnоidаms būdingаs didelis аntiоksidаcinis

pоveikis [73]. Antiоksidаntаi – mоlekulės, sustаbdаnčiоs ląstelių оksidаcinį pаžeidimą [82]. Jie gebа

surišti lаisvuоsius rаdikаlus аtiduоdаmi elektrоną (vаndenilį) [86]. Antiоksidаntаi – vieni pоpuliаriаusių

mаistо pаpildų sudedаmųjų dаlių [57].

Uоgоs, kuriоms būdingа tаmsiаi mėlynа, į juodą pereinаnti spalva, yrа turtingоs аntоciаninų.

Tokios uogos pasižymi dideliu аntiоksidаcinio аktyvumo laipsniu. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.)

ir juоdаvаisių аrоnijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) uоgоse nustаtyti dideli аntоciаninų kiekiаi,

rаstа žmоgаus mitybаi lаbаi vertingа pоlinesоčiоji γ-linоlenо rūgštis [73].

Pаlyginus mėlynių, spаnguоlių ir juоdųjų serbentų sultis didžiаusiаs аntiоksidаcinis аktyvumаs

būdingаs juоdiesiems serbentаms (93 %) [83].

Svаrbus vаidmuо detоksikuоjаnt lаisvuоsius rаdikаlus tenkа fermentinėms аntiоksidаcinėms

sistemоms [84]. Juоduоsiuоse serbentuоse nustаtytаs аntiоksidаcinis fermentаs – superoksido dismutazė

(SOD). Tаi vienаs svаrbesnių fermentų, dаlyvаujаnčių аntiоksidаcinėse sistemоse ir pаdedаntis

аpsаugоti ląsteles nuо žаlingо lаisvųjų rаdikаlų pоveikiо [37, 80]. Nustаtytа, kаd juоdоjо serbentо

lаpuоse vyrаujа dvi superоksidо dismutаzės izоfоrmоs – SOD-1 ir SOD-2. Bendrаs SOD аktyvumаs

dаžniаusiаi nustatinėjаmаs spektrоfоtоmetru, esаnt 560 nm bаngоs ilgiui [84].

Tyrimо metu buvо įvertintаs juоdųjų serbentų kоnkrečių fenоlinių junginių аntiоksidаcinis

аktyvumаs. Juоduоsiuоse serbentuоse didžiаusiu аntiоksidаciniu аktyvumu pаsižymėjo ribezinаs D ir

ribezinаs G [38].

Vienas iš dažniausiai antiоksidаcinio аktyvumo įvertinimui naudojamų metodų yra fоtоmetrinis

DPPH rаdikаlų inаktyvinimo metоdаs. Jo atlikimo technika nėra sudėtinga. Tai nebrаngus, greitаs ir

pаkаnkаmаi tikslus metodas [51, 57]. Augаlų ekstrаktų аntirаdikаlinis аktyvumаs įvertinаmаs

31

mаtuоjаnt, kiek prоcentų stаbilаus 2,2-difenil-1-pikrilhidrаzilо (DPPH) rаdikаlо neutrаlizuоjа fenоliniаi

junginiаi. Antiоksidаntаs (AH) аtiduоdа vаndenilį ir tаip inаktyvinа lаisvuоsius rаdikаlus (R). Pаstаrieji

virsta stаbiliаis DPPH-H tipо junginiаis. Šiuоs prоcesus gаlimа pаvаizduоti lygtimis:

DPPH•+AH → DPPH-H+A•

DPPH•+R• → DPPH-H [73].

Apibendrinus apžvelgtą literatūrą, tinkamai surinktos juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.)

augalinės žaliavos gali būti naudojamos medicinoje. Juodųjų serbentų lapams būdingas

antioksidacinis, antiuždegiminis, diuretinis, reumatą mažinantis poveikis. Vaisiai yra vitamininė

žaliava, įeinanti įvitamininių arbatų sudėtį. Juodųjų serbentų žaliavos kaupia flavonoidus, kurių

farmakologinis poveikis yra įrodytas klinikinių tyrimų metu. Yra sukurti efektyvūs metodai,

leidžiantys tyrinėti biologiškai veikliuosius junginius augalinėse žaliavose.

32

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimų objektas

Juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) antžeminės dalys – ūgliai, žiedai, pumpurai ir lapai, surinkti

skirtingais augalo vegetacijos tarpsniais.

Visos vaistinės augalinės žaliavos rinktos nuo to paties krūmo, kad būtų galima palyginti

medžiagų pasiskirstymą. Rinkimo vieta – Butkiškės km., Ariogalos sen., Raseinių raj.

Pumpurai – 2015 m. kovo mėn 22 d.

Žiedai – 2015 m. gegužės mėn 17 d.

Ūgliai – 2015 m. balandžio mėn 26 d.

Lapai – 1 – 2015 m. gegužės mėn 24 d. – augalo žydėjimo metu.

Lapai – 2 – 2015 m. birželio mėn 24 d. – vaisių nokimo pradžioje (uogos žalios).

Lapai – 3 – 2015 m. liepos mėn 27 d. – vaisių brandos metu.

Lapai – 4 – 2015 m. rugpjūčio mėn 30 d. - vaisių nokimo pabaigoje (pernokimo metu).

Juodųjų serbentų augalinės žaliavos buvo renkamos giedrą, sausą, nevėjuotą dieną. Augalas

auga toli nuo kelio, dulkių užteršimo rizika minimali. Lapai buvo rinkti su koteliais, pumpurai dar

visiškai neišsprogę, žiedai – kekėmis. Augalinės žaliavos džiovintos gerai vėdinamoje, apsaugotoje nuo

tiesioginių saulės spindulių, patalpoje. Žaliava periodiškai vartyta. Išdžiovinta žaliava buvo laikoma

popieriniuose maišeliuose, sausoje patalpoje, kambario temperatūroje, apsaugota nuo tiesioginių saulės

spindulių.

Lietuvoje atlikto tyrimo metu, buvo nustatyta, kad juodųjų serbentų pumpurų sprogimo pikas

yra kovo mėn. 27 d. – balandžio mėn. 2 d. Žydėjimo pradžia apytikriai gegužės mėn. 2 d., pabaiga –

gegužės mėn. 14 d. Birželio mėn. 28 d. – liepos mėn. 12 d. laikomas uogų nokimo pradžios ir pabaigos

periodas [17].

2.2. Reagentai

Acetonitrilas (99,9 %, Roth, Vokietija)

Acto rūgštis (99,8 %, Lachner, Čekija)

Aliuminio chloridas (≥98 %, bevandenis, Roth, Vokietija)

33

Bidistiliuotas vanduo (gaminamas laboratorijoje, vandens grynino sistema Milipore, Bedford

MA, JAV)

DPPH reagentas (ALDRICH, Vokietija)

Folin – Ciocolteu reagentas (Merck, Vokietija)

Heksametilentetraminas (≥99,9 %, Roth, Vokietija)

Metanolis (≥99,9 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija)

Natrio acetatas (≥99,9 %, CHEMPUR, Lenkija)

Natrio karbonatas (bevandenis, CHEMPUR, Lenkija)

Trifluoracto rūgštis (>99 %, Merck, Vokietija)

Standartai:

Chlorogeno rūgštis (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija)

Epikatechinas (>96 %, Fluka, Lenkija)

Ferulo rūgštis (>99 %, Fluka, Lenkija)

Galo rūgštis (>99 %, Fluka, Lenkija)

Hiperozidas (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija)

Hesperidinas (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija)

Izokvercitrinas (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija)

Kamferolis (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija)

Katechinas (>96 %, Fluka, Lenkija)

Kavos rūgštis (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija)

Kvercetinas (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, JAV)

Rutinas (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija)

Salicilo rūgštis (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija)

Syringo rūgštis (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, JAV)

Trans-sinapo rūgštis (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija)

Liuteolinas (≥99 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija)

2.3. Aparatūra

Žaliavos nuodžiūvis matuotas elektrinėje džiovyklėje PMB Moisture Analizer.

34

Bandinio ekstrakcija vykdyta elektrinėje orbitalinėje purtyklėje UWR Mini Shaker (J&M

Scientific, JAV).

Bendras fenolinių junginių kiekis, bendras flavonoidų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas

nustatyti spektrofotometru MILTON ROY Spectronic 1201 (JAV).

Fenoliniai junginiai identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti efektyviosios skysčių chromatografijos

metodu. Chromatografas LiChroCART 125 – 4, LiChrospher 100.

2.4. Tyrimų eiga

Surinktos augalinės žaliavos kokybė buvo įvertinta pamatavus augalinių žaliavų nuodžiūvį.

Nustačius, kad žaliavos yra kokybiškos buvo ruošiami metanoliniai ekstraktai. Pasigaminus tiriamuosius

ekstraktus spektrofotometriškai įvertintas bendras fenolinių junginių kiekis, naudojant Folin-Ciocalteu

metodą. Kolorimetriniu aliuminio chlorido metodu spektrofotometriškai tirtas flavonoidų kiekis.

Antioksidacinis aktyvumas įvertintas pagal DPPH antiradikalinį aktyvumą. Kokybinis ir kiekybinis

flavonoidų nustatymas atliktas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Tyrimo eiga pavaizduota

paveikslėlyje (7 pav).

7 pav. Tyrimų eigos schema

Žaliava• Įvertinta kokybė;

• Nustatytas nuodžiūvis;

Ekstrakcija• Gauti žaliavų metanoliniai

ekstraktai;

Spektrofotometrija

• Bendras fenolinių junginių kiekis;

• Flavonoidų kiekis;

• Antioksidacinis aktyvumas;

Efektyvioji skysčių

chromaografija

• Identifikuoti flavonoidai;

• Įvertintas jų kiekis žaliavose;

35

2.5. Tyrimų metodika

2.5.1. Tiriamojo pavyzdžio ruošimas

2.5.1.1. Nuodžiūvis

Žaliavos nuodžiūvis – tai masės sumažėjimas, kuomet išgaruoja drėgmė ir lakieji junginiai.

Tai vienas iš žaliavos kokybę apibūdinančių rodiklių. Jis nustatomas džiovinant žaliavą iki pastovios

masės ir skaičiuojamas masės procentais (m/m) [61]. Europos farmakopėjos straipsniuose didžiausia

reglamentuojama visų augalinių žaliavų leistina nuodžiūvio riba – ne didesnė nei 13 % [6]. Jei žaliavoje

yra didesnis drėgmės kiekis – suaktyvėja fermentai, kurie pradeda skaidyti veikliųjų junginių glikozidus.

Augalinėje žaliavoje prasideda pelyjimas. Žaliava netenka natūralios spalvos, skonio ir kvapo [51].

Atsveriamas 1 g susmulkintos žaliavos. Žaliavos smulkumas mažiausiai 95 % 1400 µm dydžio

dalelių pagal Ph. Eur. 2.9.12. Džiovinama 105 °C temperatūroje 2 valandas [6]. Juodųjų serbentų

žaliavos atitiko leistinas nuodžiūvio ribas. Surinktos augalinės žaliavos yra kokybiškos.

2.5.1.2. Ekstrakcija

Ekstraktai buvo ruošiami iš 0,5 g (0,001 g tikslumu) atsvertos orasausės susmulkintos augalinės

juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) žaliavos. Ekstrakcija vykdyta su 20 ml 75 % metanoliu elektrinėje

orbitalinėje purtyklėje UWR Mini Shaker (J&M Scientific, JAV). Purtymo greitis 200 k/min., purtymo

trukmė – 24 val. Gauti ekstraktai buvo filtruojami per filtravimo popierių, kurio porų dydis – 0,2 µm.

2.5.2. Spektrofotometrija

2.5.2.1. Bendras fenolinių junginių kiekis

Bendrаs fenоlinių junginių kiekis nustаtytаs Folin-Ciocalteu metоdu, sudаrаnt rutinо

kаlibrаcinį grаfiką ir išreištаs rutinо ekvivаlentu (mg RE/g).

Iš prаdžių pаsiruošiаmаs 20 % natrio kаrbоnаto tirpаlаs. 35,08 g nаtrio kаrbоnаtо ištirpinаmа

1052,4 ml bidistiliuоtо vаndens. Pаgаmintаs tirpаlаs lаikоmаs šаldytuve 2 °C temperаtūrоje. Anаlizei

36

imаmа 3000 µl 20 % nаtriо kаrbоnаtо tirpаlо, įpilаmа 100 µl tiriаmоsiоs аugаlinės žаliаvоs ekstrаktо.

Sumаišоmа ir įpilаmа 100 µl Folin-Ciocolteu (2N) reаgentо, lаikоmа kаmbаrio temperаtūrоje 30 min.

Absоrbcijа mаtuоjаmа spektrоfоtоmetru prie 760 nm bаngos ilgiо. Visi mаtаvimаi kаrtоjаmi tris kаrtus.

Apskаičiuоjаmas aritmetinis mаtаvimų vidurkis.

Palyginаmаsis tirpаlаs ruоšiаmаs, sumаišаnt 3000 µl 20 % nаtriо kаrbоnаtо tirpаlо su 100 µl

75 % metаnоliо. Įpilаmа 100 µl Folin-Ciocolteu (2N) reаgentо. Lаikоmа 30 min. kаmbаrio

temperаtūrоje. Absоrbcijа mаtuоjаmа spektrоfоtоmetru, esаnt 760 nm bаngоs ilgiui.

Stаndаrtinis 1 mg/ml rutinо tirpаlаs gаminаmаs ištirpinus 25 mg rutino miltelių 25 ml 75 %

metаnоliо. Gаutą tirpаlą skiedžiаnt metаnоliu gаunаmi skirtingоs kоncentrаcijоs rutinо tirpаlаi. Rutinо

kаlibrаcinis grаfikаs sudаrоmаs iš 6 skirtingų tirpаlо kоncentrаcijų – 0,01; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 ir 1 mg/ml

(8 pav.).

Gаuti mаtаvimų duоmenys įvertinti pаgаl rutinо kаlibrаciniо grаfikо tiesinės regresijos lygtį

y = 1,0162x; R2 = 0,9873

y = absorbcijos dydis; x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu mg

RE/g.

8 pav. Rutino kalibracinis grafikas bendro fenolinių junginių kiekio nustatymui

y = 1,0162xR² = 0,9873

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

Abso

rbci

jos

dydis

Rutino koncentracija mg/ml

37

2.5.2.2. Bendras flavonoidų kiekis

Bendrаs flаvоnоidų kiekis nustаtytаs аliuminiо chlоridо AlCl3 kоlоrimetriniu metоdu.

Sudаrytаs rutinо kаlibrаcinis grаfikаs išreištаs rutinо ekvivаlentu (mg RE/g).

Pаruošiаmаs dаrbinis reаgentаs: 60 ml 100 % metаnоliо, 3 ml 33 % аctо rūgšties, 12 ml 5 %

heksаmetilentetrаminо, 9 ml 10 % аliuminiо chlоridо ir 60 ml bidistiliuоtо vаndens. Pаgаmintаs tirpаlаs

lаikоmаs šаldytuve 2 °C temperаtūrоje.

Anаlizei imаmа 1920 µl šio tirpаlо, įpilаmа 80 µl tiriаmоjо ekstrаktо. Viskаs sumаišоmа ir

lаikоmа šаldytuve 30 min. Absоrbcijа mаtuоjаmа spektrоfоtоmetru, esаnt 407 nm bаngоs ilgiui.

Mаtаvimаi аtliekаmi tris kаrtus ir išvedаmаs aritmetinis vidurkis.

Pаruоšiаmаs pаlyginаmаsis ,,tuščiаsis‘‘ tirpаlаs. 1920 µl pаsiruоštо reаgentо sumаišоmа su 80

µl 75 % metаnоliо, pо 30 min inkubаcijоs šаldytuve spektrоfоtоmetru mаtuоjаmа аbsоrbcijа esаnt 407

nm bаngоs ilgiui. Mаtаvimаi kаrtоjаmi tris kаrtus.

Stаndаrtinis 1 mg/ml rutinо tirpаlаs ruоšiаmаs ištirpinus 25 mg rutinо miltelių 25 ml 75 %

metаnоlio. Skiedžiаnt metаnоliu pаruоšiаmi skirtingos kоncentrаcijоs rutinо tirpаlаi – 0,01, 0,1, 0,25,

0,5 ir 0,75 mg/ml. Imаmа pо 80 µl rutinо tirpаlо, pridedаmа 1920 µl pаsiruоšto reаgentо, inkubuоjаmа

30 min į šаldytuvą. Spektrоfоtometru mаtuоjаmа tirpаlų аbsоrbcijа ir sudаrоmаs kаlibrаcinis grаfikаs

(9 pav.).

Gаuti rezultаtаi įvertinаmi pаgаl rutinо kаlibrаciniо grаfikо tiesinės regresijos lygtį: y =

0,9571x; R2 = 0,9904 ;

y = аbsоrbcijоs dydis; x = bendrаs fenоlinių junginių kiekis, išreikštаs rutinо ekvivаlentаis mg

RE/g.

9 pav. Rutino kalibracinis grafikas bendro flavonoidų kiekio nustatymui

y = 0,9571xR² = 0,9904

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Abso

rbci

jos

dydis

Rutino koncentracija mg/ml

38

2.5.2.3. Antioksidacinis aktyvumas

Antiоksidаcinis аktyvumаs nustаtоmаs nаudоjаnt DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil hidrato)

rаdikаlų surišimо metоdą.

Pasiruošiami reagentai:

5,5 pH 100 mM buferis: 3,402 nаtriо аcetаtо ištirpinаmа 250 ml bidistiliuоtо vаndens. Tirpаlаs

mаišоmаs mаgnetine mаišykle. Nаudоjаnt pH-metrą tirpаlаs titruоjаmаs 33 % acto rūgštimi iki 5,5 pH.

DPPH tirpalas: 10 mg DPPH radikаlо miltelių ištirpinаmа 125 ml acetonitrilo tirpаle.

Pridedаmа 125 ml metаnоliо. Tirpаlо gаmybа аtliekаmа vengiаnt šviesоs ir tiesiоginių sаulės spindulių.

Tirpаlаs lаikоmаs tаmsоje.

DPPH tirpаlаs sumаišоmаs su buferiu ir spektrоfоtоmetru mаtuоjаmа šviesоs аbsоrbcija.

Bаngоs ilgis 515 nm. Anаlizė аtliekаmа kuо įmаnоmа tаmsesnėje аplinkоje. Absоrbcijоs dydis turi būti

lygiаi 0,500. Jо sureguliаvimui nаudоjаmаs buferiо, аcetоnitrilо ir metаnоliо (1:1,25:1,25) tirpаlаs.

Anаlizei imаmа 3000 µl DPPH tirpаlо, pridedаmа 77 µl tiriаmоjо ekstrаktо, sumаišоmа.

Laikоmа 15 min kаmbаriо temperatūrоje, tаmsоje. Spektrоfоtоmetru mаtuоjаmа аbsоrbcijа, esant 515

nm bаngоs ilgiui. Mаtаvimаi kаrtоjаmi tris kаrtus, kuо įmаnоmа tаmsesnėje аplinkоje. Jei аbsоrbcija

per didelė – mėginiai skiedžiami.

Pаsiruоšiаmаs pаlyginаmаsis ,,tuščiasis‘‘ mėginys. 3000 µl DPPH tirpаlо sumаišоmа su 77 µl

metаnоliо. Lаikоmа 15 min kаmbаrio temperаtūrоje, tаmsоje. Mаtuоjаmа аbsоrbcija esant 515 nm

bаngоs ilgiui.

Spektrоfоtоmetras nukalibruоjаmаs 75 % metanolio tirpalu.

DPPH radikalų surišimо аbsоrbcija аpskаičiuоjаmа iš pаlyginаmоjо tirpаlо аbsоrbcijоs dydžiо

аtėmus tiriаmоjо ekstrаktо аbsоrbcijоs dydį.

Stаndаrtаs – rutinаs. Tоmis pаčiоmis sąlygоmis pаsiruоšiаmi skirtingų kоncentrаcijų rutinо

tirpаlаi. Prаdinis rutinо tirpаlаs 1 mg/ml (25 mg rutino ištirpinta 25 ml 75 % metanolio). Iš jo

pasigаminаmi 0,01, 0,1, 0,25, 0,5 ir 0,75 mg/ml tirpаlаi. Sudаrоmаs kаlibrаcinis grаfikаs (10 pav.).

Gаuti duоmenys įvertinti pаgаl rutinо kаlibrаciniо grаfikо tiesinės regresijos lygtį:

y = -0,2383x + 0,2315; R2 = 0,9919 ;

y = аbsоrbcijоs dydis; x = bendrаs fenоlinių junginių kiekis, išreikštas rutinо ekvivаlentu mg

RE/g.

39

10 pav. Rutino kalibracinis grafikas antioksidacinio aktyvumo nustatymui

2.5.3. Efektyvioji skysčių chromatografija

Aparatūra: Chromatografas LiChroCART 125 – 4, LiChropher 100. Ekstraktai efektyviosios

skysčių chromatografijos analizei buvo filtruojami pro 0,2µm dydžio porų membraninį filtrą.

Analizės sąlygos: kolonėlė: RP -18 –e; kolonėlės tėkmės greitis: 0,75 ml/min.; analizės laikas:

58 min.; laikas tarp injekcijų: 61 min.; detektorius: UV; detekcija: λ = 254 nm.; porų dydis: 5µm;

tirpikliai: A – vanduo, parūgštintas trifluoracto rūgštimi (0,05 %); B – bidistiliuotas vanduo :

acetonitrilas : metanolis (50:25:25);

Gradientas:

Tmin A B

0 99 % 1 %

40 1 % 99 %

45 1 % 99 %

48 99 % 1 %

58 99 % 1 %

Esant nurodytoms analizės sąlygoms ir gradientui praleidžiami tiriamieji juodojo serbento

(Ribes nigrum L.) žaliavų tirpalai. Gautos chromatogramos. Kiekvienam junginiui būdingas individualus

sulaikymo laikas. Vėliau, tomis pačiomis sąlygomis praleidžiami standartų tirpalai. Palyginus tiriamųjų

mėginių ir standartų sulaikymo laikus identifikuojami junginiai žaliavų ekstraktuose. Gauti duomenys

y = -0,2383x + 0,2315R² = 0,9919

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Abso

rbci

jos

dydis

Rutino koncentracija mg/ml

40

vertinami pagal identifikuotų fenolinių junginių standartų kalibracinių grafikų tiesinės regresijos lygtis.

Visos identifikuotų junginių standartų kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtys ir regresijos

koeficientai pateikti 2 lentelėje.

2 lentelė. Ribes nigrum L. identifikuotų flavonoidų sulaikymo laikai, kalibracinių grafikų tiesinės

regresijos lygtys ir regresijos koeficientai

2.6. Statistinė duomenų analizė

Gauti duomenys statistiškai įvertinti naudojant ,,MS Excel 2007‘‘ (Microsoft, JAV),

,,DataApex 2007‘‘(Čekija), ,,IBM SPSS Statistic 20‘(Čikaga, JAV)‘, ,,Origin 7.0‘‘ (JAV),

,,ClarityLite‘‘ programomis. Apskaičiuoti trijų matavimų pakartojimų matematiniai vidurkiai ir

standartiniai santykiniai nuokrypiai. Rezultatų statistinis patikimumas įvertintas taikant dispersinę

analizę (ANOVA). Atskirų grupių įvertinimui taikytas Turkey kriterijus. Gauti skirtumai rezultatuose

laikyti statistiškai patikimai reikšmingais, jei klaidos tikimybė (p) mažesnė už 0,05.

Junginys Sulaikymo laikas

(min ± SSN)

Kalibracinio grafiko

tiesinės regresijos lygtis Regresijos koeficientas

Katechinas 16,1 ± 0,09 Y= 16,994x R2 = 0,9927

Chlorogeno rūgštis 17,6 ± 0,11 Y= 1211,8x R2 = 0,9867

Rutinas 24,8 ± 0,15 Y= 2587,3x R2 = 0,9914

Hiperozidas 25,3 ± 0,07 Y= 9340,5x R2 = 0,9945

Kvercetinas 26,3 ± 0,08 Y= 3822,3x R2 = 0,9903

41

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Spektrofotometrinės analizės rezultatai

3.1.1. Bendro fenolinių junginių kiekio rezultatai

Spektrofotometrijos metodu metanoliniuose skirtingų juodųjų serbentų augalinių žaliavų

ekstraktuose buvo nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis. Analizuoti juodųjų serbentų lapai (Ribis

nigri folium), žiedai (Ribis nigri flos), pumpurai (Ribis nigri gemmae) ir ūgliai (Ribis nigri cormus).

Bandymai kartoti 3 kartus, išvestas aritmetinis matavimų vidurkis. Standartinis santykinis nuokrypis

mažesnis nei 2 %. Rezultatai išreikšti rutino ekvivalentu RE (mg RE/g) orasausės žaliavos.

Bendras fenolinių junginių kiekis (p<0,05) juodųjų serbentų augalinėse žaliavose įvairuoja nuo

33,56 mg RE/g iki 56,41 mg RE/g. Daugiausiai fenolinių junginių kaupia juodųjų serbentų lapai – 56,41

mg RE/g. Pumpuruose ir ūgliuose fenolinių junginių kiekiai panašūs, atitinkamai 54,98 ir 53,03 mg

RE/g. Ženkliai mažesnis kiekis randamas žieduose – 33,56 mg RE/g. Didžiausias fenolinių junginių

kiekis aptinkamas juodųjų serbentų lapuose, o mažiausias – žieduose (11 pav.).

11 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) lapuose, žieduose,

pumpuruose ir ūgliuose (SSN ≤ 2%, n=3).

Nustačius, kad juodųjų serbentų lapų žaliava pasižymi didžiausiu fenolinių junginių kiekiu,

buvo analizuota augalo vegetacijos periodų įtaka fenolinių junginių kiekiui lapuose. Tirti lapai

keturiuose tarpsniuose: 1 – žydėjimo metu; 2 – uogų nokimo pradžioje, kuomet uogos žalios; 3 –

sunokimo metu; 4 – vaisių brandos pabaigoje, pernokimo metu, kuomet uogos susiraukšlėjusios.

0

10

20

30

40

50

60

Lapai Žiedai Pumpurai Ūgliai

56.41

33.56

54.98 53.03

mg R

E/g

42

Nustatyta, kad vaisių nokimas fenolinių junginių kiekiui juodųjų serbentų lapuose didelės

įtakos neturi. Didžiausias fenolinių junginių kiekis (p<0,05) randamas lapuose vaisių nokimo pradžioje,

kuomet uogos vis dar žalios. Jų kiekis 60,09 mg RE/g. Vaisiams pilnai sunokus, fenolinių junginių kiekis

sumažėja iki 53,70 mg RE/g. Vaisiams pernokus, fenolinių junginių kiekis padidėja iki 57,06 mg RE/g.

Birželio mėnesį surinkti juodųjų serbentų lapai turi didžiausią fenolinių junginių kiekį. Fenolinių

junginių kiekiai lapuose pavaizduoti diagramoje (12 pav.).

12 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) lapuose: lapai-1 –

žydėjimo metu; lapai-2 – uogų nokimo pradžioje, kuomet uogos žalios; lapai-3 – sunokimo

metu; lapai-4 – vaisių brandos pabaigoje, pernokimo metu, kuomet uogos netgi

susiraukšlėjusios. (SSN ≤ 2%, n=3)

3.1.2. Flavonoidų kiekio rezultatai

Spektrofotometriškai įvertintas flavonoidų kiekis juodųjų serbentų augalinių žaliavų – lapų

(folium), žiedų (flos), pumpurų (gemmae), ūglių (cormus) – metanoliniuose ekstraktuose. Bandymai

kartoti tris kartus, išvestas matavimų aritmetinis vidurkis. Standartinis santykinis nuokrypis ne didesnis

kaip 2,5%.

Flavonoidų kiekis (p<0,05) juodųjų serbentų žaliavose svyruoja nuo 4,5 mg RE/g iki 21,85 mg

RE/g . Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas juodųjų serbentų lapuose. Jų kiekis yra 21,85 mg RE/g.

Kiek mažesnis kiekis randamas pumpuruose – jų kiekis 19,73 mg RE/g. Dvigubai mažesnis flavonoidų

kiekis aptiktas juodųjų serbentų žieduose. Flavonoidų kiekis juose vos 8,73 mg RE/g. Flavonoidų

pasiskirstymas juodųjų serbentų augalinėse žaliavose pavaizduotas žemiau pateiktoje diagramoje (13

pav.).

57.47

60.09

53.72

57.06

50

52

54

56

58

60

62

Lapai - 1 Lapai - 2 Lapai - 3 Lapai - 4

mg R

E/g

43

13 pav. Flavonoidų kiekis juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) lapuose, žieduose, pumpuruose ir

ūgliuose (SSN≤2,5%, n=3).

Nustačius, kad didžiausi flavonoidų kiekiai randami juodųjų serbentų lapų ekstraktuose, tirti

lapai, surinkti skirtingais augalo vegetacijos tarpsniais: 1 – žydėjimo metu, 2 – uogų nokimo pradžioje,

kuomet užmegztos uogos žalios, 3 – uogų brandos metu, 4 – nokimo pabaigoje.

Nustatyta flavonoidų kiekio (p<0,05) juodųjų serbentų lapuose didėjimo tendencija. Augalui

žydint, flavonoidų kiekis lapuose yra 12,90 mg RE/g. Užmezgus uogas flavonoidų kiekis staiga išauga

iki 23,26 mg RE/g. Uogų brandos metu lapai flavonoidų sukaupia 21,61 mg RE/g. Uogoms pernokus

flavonoidų kiekis dar labiau išauga, nustatomas flavonoidų kiekis yra 27,79 mg RE/g. Flavonoidų kiekio

juodųjų serbentų lapuose kitimas pavaizduotas žemiau pateiktoje diagramoje (14 pav.).

14 pav. Flovonoidų kiekis juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) lapuose: lapai-1 – žydėjimo metu;

lapai-2 – uogų nokimo pradžioje, kuomet uogos žalios; lapai-3 – sunokimo metu; lapai-4 – vaisių

brandos pabaigoje, pernokimo metu, kuomet uogos netgi susiraukšlėjusios. (SSN≤2,5%, n=3)

0

5

10

15

20

25

Lapai Žiedai Pumpurai Ūgliai

21.85

8.73

19.73

4.5

mg

RE

/g

12.9

23.2621.61

27.79

0

5

10

15

20

25

30

Lapai - 1 Lapai- 2 Lapai - 3 Lapai - 4

mg R

E/g

44

3.1.3. Antioksidacinio aktyvumo rezultatai

Atlikus DPPH radikalų spektrofotometrinę analizę įvertintas skirtingų juodųjų serbentų

augalinių žaliavų – lapų (folium), žiedų (flos), pumpurų (gemmae), ūglių (cormus) – antioksidacinis

antyvumas. Nustatyta, kad visų augalo žaliavų antioksidacinė geba (p<0,05) panaši, varijuoja nuo 33

iki 35,11 mg RE/g. Nežymiai didesnėmis antioksidacinėmis savybėmis išsiskiria juodųjų serbentų ūgliai.

Jų antioksidacinis aktyvumas yra 35,11 mg RE/g. Mažiausiu antioksidaciniu poveikiu pasižymi juodųjų

serbentų pumpurai (33 mg RE/g). Vidutinis lapų antioksidacinis poveikis yra 34,43 mg RE/g.

Vegetacijos tarpsniai antioksidaciniam lapų aktyvumui reikšmingos įtakos neturi. Augalui

žydint lapų antioksidacinis aktyvumas yra 33,93 mg RE/g. Užmezgus vaisius – aktyvumas nežymiai

padidėja iki 34,66 mg RE/g. Toliau nokstant vaisiams – jis šiek tiek sumažėja (iki 34,27 mg RE/g).

Gauti rezultatai pavaizduoti diagramoje (15 pav.)

15 pav. Antioksidacinis aktyvumas juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) augalinėse žaliavose

(SSN≤2,8, n=3)

Palyginus mėlynių, spanguolių ir juodųjų serbentų sultis, didžiausias antioksidacinis aktyvumas

būdingas juodiesiems serbentams (93%) [83]. Belgijoje atlikto tyrimo metu nustatyta, kad juodųjų

serbentų pumpurai, surinkti kovo mėnesį ir lapai, surinkti birželį, turi didesnį antioksidantų kiekį nei

pilnai prinokusios uogos [85].

32

32.5

33

33.5

34

34.5

35

35.5

Lapai - 1 Lapai - 2 Lapai - 3 Lapai - 4 Žiedai Pumpurai Ūgliai

33.93

34.6634.55

34.27

34.77

33.04

35.11

RE

mg

/g

45

3.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos rezultatai

Efektyvioji skysčių chromatografija – Europos farmakopėjoje reglamentuotas juodųjų serbentų

lapų flavonoidų kiekybės įvertinimo testas. Eksperimentų metu parinktos gradiento sąlygos, kurioms

esant geriausiai atsiskiria junginiai. Junginiai kokybiškai identifikuoti pagal analičių sulaikymo laiko

atitikimus standartų sulaikymo laikams. Standartinių mėginių analizės rezultatai pateikti 3 lentelėje.

3 lentelė: Flavonoidai naudoti standartais: sulaikymo laikai ir plotai po kreivėmis

Standartas

Sulaikymo laikas

(min ± SSN) Plotas

Fla

vo

no

idai

Epikatechinas 28,3 (±0,12) 100

Hesperidinas 28,8 (±0,21) 569,75

Rutinas 24,8 (±0,09) 15157,830

Izokvercetinas 23,9 (±0,15) 2653,03

Kamferolis 30,4 (±0,0,013) 18297,98

Katechinas 16,1 (±0,019) 84,946

Kvercetinas 26,3 (±0,02) 16324,96

Kvercetino dihidratas 29,0 (±0,11) 10551,0

Liuteolinas 27,2 (±0,14) 222,5

Hiperozidas 25,3 (±0,07) 9583,5

Fen

oli

nės

rū

gšt

ys Salicilo r. 28,5 (±0,11) 555,7

Syringo r. 19,3 (±0,17) 372,18

Trans-sinapo rūgštis 22,4 (±0,19) 601

Chlorogeno r. 17,6 (±0,011) 6092,5

Ferulo r. 28,7 (±0,019) 507

Galo r. 9,02 (±0,22) 829,206

Kavos r. 18,0 (±0,02) 866,191

Tomis pačiomis gradiento sąlygomis praleidus tiriamuosius mėginius ir standartus bei

palyginus sulaikymo laikus, juodųjų serbentų augalinėse žaliavose (Ribes nigrum L.) – lapuose,

žieduose, pumpuruose ir ūgliuose – dominuoja 6 junginiai: viena fenolinė rūgštis – chlorogeno rūgštis,

keturi flavonoidai – rutinas, katechinas, kvercetinas ir hiperozidas, bei vienas junginys, kurio nepavyko

identifikuoti (16 pav.). Visose juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) augalinėse žaliavose dominuoja tie

patys junginiai. Bendras chromatogramų vaizdas toks pat. Skiriasi tik junginių kiekiai, tuo pačiu –

chromatografinių smailių aukščiai ir plotai po kreivėmis.

46

16 pav. Chromatograma. Identifikuoti junginiai: 1 – katechinas (16,1 min); 2 – chlorogeno rūgštis

(17,6 min); 3 – rutinas (24,8 min); 4 – hiperozidas (25,3 min); 5 – kvercetinas (26,3); 6 –

neidentifikuotas junginys (26,9).

Kiekvieno identifikuoto junginio kiekis buvo apskaičiuotas pagal to junginio standarto

kalibracinį grafiką, kuris sudarytas išmatavus 6 skirtingų koncentracijų (0,01, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75 ir

1 mg/ml) plotus po kreivėmis.

Hiperozido kiekis juodųjų serbentų augalinėse žaliavose svyruoja nuo 0,229 mg HE/g iki 0,826

mg HE/g. Lyginant tarpusavyje augalines žaliavas – didžiausias hiperozido kiekis aptinkamas lapuose –

jo sukaupta 0,826 mg HE/g. Dvigubai mažesnis hiperozido kiekis nustatytas pumpuruose (0,45 mg

HE/g). Ūgliuose hiperozido aptikta dar mažiau, tik 0,391 mg HE/g. Mažiausias hiperozido kiekis

nustatytas žieduose – vos 0,229 mg HE/g.

Didžiausias rutino kiekis randamas juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) lapuose. Vidutinis jo

kiekis lapuose siekia 3,409 mg RE/g. Pumpuruose šio flavonoido kiek mažiau – 2,319 mg RE/g. Dar

mažesnis rutino kiekis nustatytas juodųjų serbentų žieduose (1,47 mg RE/g). Pats mažiausias rutino

kiekis juoduosiuose serbentuose randamas ūgliuose. Rutino kiekis juose vos 0,422 mg RE/g.

Flavonoidų pasiskirstymo tendencijos juodųjų serbentų žaliavose nesikeičia ir kvercetino

atveju. Didžiausi kvercetino kiekiai randami lapuose. Vidutinis jo kiekis 1,192 mg QE/g. Dvigubai

mažesnis jo kiekis yra ūgliuose – 0,455 mg QE/g. Dar mažiau nei ūgliuose kvercetino yra pumpuruose

– 0,357 mg QE/g. Lyginant juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) augalines žaliavas mažiausiai kvercetino

kaupia juodųjų serbentų žiedai. Juose kvercetino kiekis yra 0,344 mg QE/g.

Šių junginių identifikavimas juodųjų serbentų augalinėse žaliavose pagrindžia Manach išvadą,

kad labiausiai augaluose paplitusi flavonoidų grupė yra flavonoliai, o pagrindiniai junginiai: kvercetinas,

rutinas ir hiperozidas [65].

Juodųjų serbentų lapai (Ribes nigri folium) kaupia didžiausią katechino kiekį. Vidutinis jo

kiekis lapuose 111,264 mg KE/g. Dvigubai mažesnis katechino kiekis nustatytas žieduose – 65,471 mg

KE/g. Juodųjų serbentų ūgliuose katechino randama 50 mg KE/g. Pumpuruose nustatytas mažiausias

katechino kiekis – 34,43 mg KE/g.

47

Chlorogeno rūgštis yra viena labiausiai paplitusių fenolinių rūgščių augaluose [52].

Chlorogeno rūgštis nustatyta ir juoduosiuose serbentuose. Juodųjų serbentų lapai pasižymi ir didžiausiu

chlorogeno rūgšties kiekiu. Jos kiekis lapuose yra 1,627 mg ChlE/g. Žieduose chrologeno rūgštis siekia

0,95 mg ChlE/g. Mažiausi chlorogeno rūgšties kiekiai nustatyti juodųjų serbentų pumpuruose ir

ūgliuose. Jos kiekis šiose žaliavose atitinkamai 0,375 ir 0,366 mg ChlE/g. Chlorogeno rūgštį

juoduosiuose serbentuose identifikavo ir Ferdinanda Ieri savo tyrime (2015) [41].

Visi rezultatai yra statistiškai patikimi (p<0,05). Duomenys pateikti lentelėje (4 lentelė).

4 lentelė: Identifikuoti junginiai juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) lapuose, pumpuruose, žieduose

ir ūgliuose (SSN≤2,9%, n=3).

Rutinas Katechinas Kvercetinas Hiperozidas Chlorogeno r.

Plotas mg

RE/g Plotas

mg

KE/g Plotas

mg

QE/g Plotas

mg

HE/g Plotas

mg

Chl/g

Lapai 2205,2 3,409 472,2 111,26 1138,7 1,192 1928,5 0,8260 492,5 1,627

Pumpurai 1500,1 2,319 146,2 34,43 341,3 0,357 1052,4 0,4507 113,8 0,375

Žiedai 951,8 1,471 278,1 65,47 328,7 0,344 536,5 0,2297 288,3 0,951

Ūgliai 273,5 0,422 212,4 50,0 434,7 0,455 914,4 0,3916 111,1 0,366

Identifikuotų flavonoidų santykiniam pasiskirstymui įvertinti skirtingose augalo žaliavose buvo

apskaičiuoti visų junginių kiekiai pagal rutino ekvivalentą (mg RE/g).

Juodųjų serbentų lapuose dominuojantis junginys yra rutinas. Jo kiekis yra 0,8524 mg RE/g.

Tai sudaro 28,4 % bendro identifikuotų junginių kiekio. Hiperozido ir chlorogeno rūgšties kiekiai yra

panašūs, atitinkamai 0,74 mg RE/g (24,9 %) ir 0,76 mg RE/g (25,5 %). Kvercetino yra 0,44 mg RE/g,

katechino tik 0,18 mg RE/g.

Rutinas dominuoja ir juodųjų serbentų pumpuruose. Jo kiekis siekia 0,57 mg RE/g. Tai sudaro

44,8 % viso flavonoidų kiekio. Nustatytas šiek tiek mažesnis hiperozido kiekis – 0,40 mg RE/g (31,4

%). Chlorogeno rūgšties nustatyta 0,17 mg RE/g (13,3 %), kvercetino – 0,13 mg RE/g (10 %).

Žieduose savo kiekiu ryškiai išsiskiria chlorogeno rūgštis. Nustatytas jos kiekis yra 0,44 mg

RE/g (37,84 % bendro flavonoidų kiekio). Hiperozido aptikta dvigubai mažiau – 0,20 mg RE/g (23,2

%) . Dar mažesni kvercetino ir katechino kiekiai – atitinkamai 0,12 mg RE/g (13,95 %) ir 0,10 mg RE/g

(11,6 %).

Juodųjų serbentų ūgliuose pagrindinis junginys yra hiperozidas. Apskaičiuotas jo kiekis yra

0,35 mg RE/g (46 %). Pumpurai kaupia 0,17 mg RE/g (22,3 %) chlorogeno rūgšties, kvercetino – 0,16

mg RE/g (21 %). Katechino juodųjų serbentų pumpuruose yra tik 0,08 mg RE/g (10,5 %).

Rezultatai yra statistiškai patikimi (p<0,05) ir pavaizduoti paveikslėlyje (17 pav.)

48

17 pav. Identifikuotų flavonoidų santykiniai kiekiai juodųjų serbentų lapuose, pumpuruose,

žieduose ir ūgliuose (SSN≤3,5%, n=3).

Tyrimo metu palyginus skirtingas juodųjų serbentų augalines žaliavas ir nustačius, kad

didžiausi flavonoidų kiekiai yra lapuose, analizuota augalo vegetacijos įtaka flavonoidų kiekiui juodųjų

serbentų lapuose. Analizei skirti lapai buvo rinkti skirtingu augalo vegetacijos periodu: 1– augalo

žydėjimo metu; 2 – nokimo pradžioje užmezgus vaisius, kuomet užmegztos uogos žalios; 3 – vaisių

brandos metu; 4 – vaisių nokimo pabaigoje, kuomet uogos susiraukšlėusios. Taip bandyta išsiaiškinti,

ar vegetacijos tarpsniai turi įtakos flavonoidų kiekiams lapuose. Gautos chromatogramos pateiktos

apačioje (18–21 pav).

18 pav. Juodųjų serbentų lapų, rinktų augalo žydėjimo metu (lapai-1) chromatograma. Identifikuoti

junginiai: 1 – katechinas (16,1 min); 2 – chlorogeno rūgštis (17,6 min); 3 – rutinas (24,8 min); 4 –

hiperozidas (25,3 min); 5 – kvercetinas (26,3); 6 – neidentifikuotas junginys (26,9).

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Lapai Pumpurai Žiedai Ūgliai

0,7

4

0,4

0

0,2

0

0,3

5

0,1

8

0,5

0 0,1

0

0,0

8

0,4

4

0,1

3

0,1

2 0,1

6

0,8

5

0,5

7

0,0

6 0,1

0

0,7

6

0,1

7

0,4

4

0,1

7

mg R

E/g

Hiperozidas Katechinas Kvercetinas Rutinas Chlorogeno r.

1 2

3 4

5

6

49

19 pav. Juodųjų serbentų lapų, rinktų augalui užmezgus vaisius (lapai-2) chromatograma.

Identifikuoti junginiai: 1 – katechinas (16,1 min); 2 – chlorogeno rūgštis (17,6 min); 3 – rutinas

(24,8 min); 4 – hiperozidas (25,3 min); 5 – kvercetinas (26,3); 6 – neidentifikuotas junginys (26,9).

20 pav. Juodųjų serbentų lapų, rinktų vaisių nokimo pradžioje (lapai-3) chromatograma.

Identifikuoti junginiai: 1 – katechinas (16,1 min); 2 – chlorogeno rūgštis (17,6 min); 3 – rutinas

(24,8 min); 4 – hiperozidas (25,3 min); 5 – kvercetinas (26,3); 6 – neidentifikuotas junginys (26,9).

21 pav. Juodųjų serbentų lapų, rinktų vaisių nokimo pabaigoje (lapai-4) chromatograma.

Identifikuoti junginiai: 1 – katechinas (16,1 min); 2 – chlorogeno rūgštis (17,6 min); 3 – rutinas

(24,8 min); 4 – hiperozidas (25,3 min); 5 – kvercetinas (26,3); 6 – neidentifikuotas junginys (26,9).

1 2

3 4

5 6

66hj

h66

1 2

3 4

5 6

6

1 2

3 4

5 6

50

Rutinas – dominuojantis junginys juodųjų serbentų lapuose. Rutino kiekis serbento lapuose

varijuoja nuo 2,50 mg RE/g iki 5,26 mg RE/g. Augalui žydint rutino lapuose randama iki 2,50 mg RE/g.

Užmezgus vaisius, jo kiekis lieka panašus – 2,57 mg RE/g. Vaisiams nokstant rutino kiekis didėja.

Nokimo pradžioje jo kiekis siekia 3,3 mg RE/g. Nokimo pabaigoje jo ženkliai padidėja iki 5,26 mg RE/g.

Lapai kaupia didžiausią rutino kiekį vaisių brandos pabaigoje, kai uogos net susiraukšlėjusios.

Vaisiams nokstant hiperozido kiekis palaipsniui mažėja. Žydėjimo metu lapuose hiperozido

kiekis siekia iki 3,07 mg RE/g, užmezgus vaisius – 2,98 mg RE/g, o vaisių nokimo pabaigoje, jiems

pernokus – hiperozido kiekis sumažėja iki 2,54 mg RE/g.

Priešingai nei hiperozido, kvercetino kiekis didėja nuo augalo žydėjimo pradžios iki vaisių

sunokimo: žydint kvercetino yra iki 1,36 mg RE/g, uogų nokimo pradžioje – 1,43 mg RE/g. Uogoms

pernokus kvercetino kiekis išauga kone dvigubai – 3,04 mg RE/g. Nustatyta, kad juodųjų serbentų lapai

vaisių pernokimo metu kaupia didžiausią kvercetino kiekį.

Juodųjų serbentų lapuose vidutinis katechino kiekis yra 0,73 mg RE/g. Vaisių vegetacijos

tarpsniai didelės įtakos jo kiekiui neturi. Žydėjimo metu katechino kiekis lapuose siekia 0,79 mg RE/g,

užmezgus vaisius nežymiai sumažėja iki 0,68 mg RE/g, brandos metu – 0,78 mg RE/g, o nokimo

pabaigoje – 0,69 mg RE/g.

Nedidelė vegetacijos tarpsnių įtaka pastebėta chlorogeno rūgšties atžvilgiu. Augalo žydėjimo

metu jos kiekis siekia 0,88 mg RE/g. Augalui užmezgus vaisius jos kiekis sumažėja iki 0,65 mg RE/g.

Vaisių brandos pradžioje jos kiekis dar truputį sumažėja – 0,63 mg RE/g. Uogų nokimo pabaigoje –

chlorogeno rūgšties kiekis pradeda didėti. Nustatytas jos kiekis yra 0,88 mg RE/g. Chlorogeno rūgšties

kiekis juodųjų serbentų lapuose mažėja vaisiams nokstant, o jiems pernokus - padidėja.

Visi rezultatai yra statistiškai patikimi (p<0,05). Flavonoidų kiekinis pasiskirstymas juodųjų

serbentų lapuose pavaizduotas paveikslėlyje (22 pav.).

51

22 pav. Identifikuoti flavonoidai juodųjų serbentų lapuose, surinktuose skirtingu augalo vegetacijos

periodu: lapai-1 – žydėjimo metu; lapai-2 – uogų nokimo pradžioje, kuomet uogos žalios; lapai-3 –

sunokimo metu; lapai-4 – vaisių brandos pabaigoje, pernokimo metu, kuomet uogos netgi

susiraukšlėjusios. (SSN≤3,2%, n=3).

Atliktų tyrimų metu nustatyta, kad juodųjų serbentų lapai kaupia didžiausią fenolinių junginių

ir flavonoidų kiekį, lyginant su žiedais, pumpurais ir ūgliais. Žaliavose identifikuotas rutinas, katechinas,

kvercetinas, hiperozidas ir chlorogeno rūgštis. Rutinas, kvercetinas ir hiperozidas priklauso flavonolių

grupei. Gauti rezultatai patvirtina B. Luzak tyrimus, kad flavonoliai yra pagrindiniai fenoliniai junginiai

juodųjų serbentų lapuose. Jo tyrimų duomenimis flavonoliai sudaro apie 68 % bendro fenolinių junginių

kiekio [24]. Tuo tarpu juodųjų serbentų vaisiuose flavonolių yra apie 50%. Dominuojantys junginiai

vaisiuose – kvercetinas 29,8 %, miricetinas 15,5 %, kamferolis 5,9 %, o likusi dalis – fenolinės rūgštys

[25]. Gauti efektyviosios skysčių chromatografijos rezultatai parodė, kad lapuose dominuoja rutinas ir

hiperozidas.

Vaisių sunokimo laipsnis turi įtakos ne tik antocianinų kiekiui juodųjų serbentų vaisiuose, bet

ir flavonoidų kiekiui lapuose. Nokstant vaisiams didėja bendras flavonoidų kiekis bei rutino

koncentracija juodųjų serbentų lapuose. Skirtingu vaisių sunokimo metu dominuoja skirtingi

flavonoidai.

0

1

2

3

4

5

6

Lapai - 1 Lapai - 2 Lapai - 3 Lapai - 4

3.0

7

2.9

8 3.3

3

2.5

3

0.7

9

0.6

8

0.7

4

0.6

9

1.3

5

1.2 1

.42

3.0

4

2.5 2.5

7

3.3

5.2

5

0.8

8

0.6

5

0.6

3 0.8

8

mg R

E/g

.

Hiperozidas Katechinas Kvercetinas Rutinas Chlorogeno r.

52

4. IŠVADOS

1. Taikant Europos farmakopėjoje aprašytą efektyviosios skysčių chromatografijos metodą

juodųjų serbentų augalinėse žaliavose nustatyti šeši junginiai: rutinas, katechinas, kvercetinas,

hiperozidas, chlorogeno rūgštis ir vienas neidenfitikuotas junginys. Lyginant junginių pasiskirstymą

juodųjų serbentų lapuose, žieduose, ūgliuose ir pumpuruose, didžiausi identifikuotų junginių kiekiai rasti

lapuose. Lapuose ir pumpuruose dominuojantis junginys yra rutinas, žieduose savo kiekiu išsiskiria

chlorogeno rūgštis, o ūgliuose pagrindinis flavonoidas – hiperozidas.

2. Spektrofotometriniu metodu nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis juodųjų serbentų

žaliavose varijuoja nuo 33,56 mg RE/g iki 56,41 mg RE/g. Didžiausias fenolinių junginių kiekis

nustatytas juodųjų serbentų lapuose – 56,41 mg RE/g. Pumpurams ir ūgliams būdingas panašus fenolinių

junginių kiekis (atitinkamai 54,98 mg RE/g ir 53,03 mg RE/g). Mažiausias fenolinių junginių kiekis

nustatytas juodųjų serbentų žieduose - 33,56 mg RE/g (p<0,05).

3. Išanalizavus gautus rezultatus nustatyta, kad didžiausią flavonoidų kiekį sukaupia juodųjų

serbentų lapai – 21,85 mg RE/g, pumpurai – 19,73 mg RE/g, žiedai – 8,73 mg RE/g. Mažiausias

flavonoidų kiekis nustatytas juodųjų serbentų ūgliuose – tik 4,5 mg RE/g (p<0,05). Antioksidantinė geba

visų juodųjų serbentų augalinių žaliavų – lapų, žiedų, pumpurų ir ūglių yra panaši. Antioksidacinis

aktyvumas svyravo nuo 33,0 mg RE/g iki 35,11 mg RE/g (p<0,05).

4. Skirtingais augalo vegetacijos tarpsniais flavonoidų kiekis juodųjų serbentų lapuose

periodiškai didėja. Žydėjimo metu nustatytas flavonoidų kiekis lapuose buvo 12,90 mg RE/g. Užmezgus

vaisius flavonoidų kiekis padidėja iki 23,26 mg RE/g. Vaisių nokimo periodo pabaigoje flavonoidų

kiekis lapuose dar labiau padidėja ir siekia 27,79 mg RE/g. Augalo žydėjimo metu lapuose dominuoja

hiperozidas - 3,07 mg RE/g ir rutinas – 2,5 mg RE/g. Vaisiams pilnai sunokus tiek hiperozido, tiek rutino

kiekiai yra vienodi - 3,33 mg RE/g. Vaisiams pernokus lapuose dominuojančiu junginiu tampa rutinas,

jo kiekis – 5,25 mg RE/g (p<0,05).

53

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Rekomenduojama medicinos tikslais naudoti juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) lapus.

Palyginus juodųjų serbentų augalines žaliavas – lapus, žiedus, pumpurus ir ūglius – lapuose nustatytas

didžiausias bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis, būdingas didelis antioksidacinis aktyvumas.

Rekomenduojama juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) lapus rinkti vaisių nokimo periodo

pabaigoje (rugpjūčio mėn. pabaigoje). Šiuo metu lapai kaupia didžiausią flavonoidų kiekį ir pasižymi

dideliu antioksidaciniu aktyvumu.

54

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Ragažinskienė O, Maruška A. Perspektyvių vaistinių augalų cheminės sudėties mokslinių tyrimų raida

Vytauto Didžiojo universitete. Vytauto Didžiojo universiteto Botanikos sodo raštai 2011; 15: 82-94

2. Ragažinskienė O. Vaistinių, prieskoninių augalų įvairovės tyrimo, jų išaugojimo bei naudojimo

tendencijos.BPD2004-ESF-2.4.0-01-04/0157. Prieiga per internetą:

http://gamta.vdu.lt/mokytojai/kursai/Vaistiniai_prieskoniniai_augalai

3. Blažytė A. Lietuviškos juodojo serbento ir paprastojo agrasto veislės. Lietuvos augalų nacionaliniai

genetiniai ištekliai. Lietuvos Respublikos Aplinkos ministerija. Augalų genų bankas. Akademija, 2013.

ISBN 978-609-8126-04-4. Prieiga per internetą: http://www.agb.lt/leidiniai/serbentai/serbentai

4. Sodo augalų veislių, įrašytų į Nacionalinį augalų veislių sąrašą, aprašai. Prieiga per internetą..

http://www.vatzum.lt/uploads/documents/augalu_veisles/2013_sodo_ augalu_veisliu_aprasai_1

5. Ryliškis A. ,,Juodieji serbentai‘‘. Vilnius: 2008. ISBN 978-9955-708-14-8. P. 6-7, 23.

6. European Pharmacopoea 8.0 Volume 1. Strasbourg: Council of Europe; 2014.

7. European Scientific Cooperative on Phytotherapy (ESCOP). ESCOP Monographs: Scientific

Foundation for Herbal Medicinal Products, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, Germany, 2nd ed, (2003),

pp. 425–428.

8. Ragažinskienė O., Sasnauskas V., Rimkienė S. Vaistinių augalų encklopedija.2005.

9. Kaunienė V., Kaunas E. Vaistingieji augalai. Vilnius: 1991. ISBN 5-89942-087-1. P.316-317

10. Venskutonis V. Sodininkystė. Mokslas, Vilnius. 1976. 205 p.

11. Ūselis N. Intensyvios uoginių augalų auginimo technologijos. Aušra, Kaunas. 2002. 190 p. 57.

12. Šikšnianas T., Stanys V., Sasnauskas A. Naujos produktyvios juodųjų serbentų veislės: Gojai, Svajai,

Dailiai, Senjorai ir Salviai. Sodininkystės ir daržininkystės mokslo tyrimai. Ataskaitinės konferencijos

medžiaga Nr.19. 2006. 12 – 15 p.

13. Jaskonis J.Augalai-mūsų gyvenimas. Vilnius: 1996.ISBN 9986-509-24-6. p.256;

14. Kaweczki Z., Stanys V., Šikšnianas T., Tomaswevska Z. Productivity value of several black currant

cultivars. Sodininkystė ir darţininkystė 19/3 (2). 2000. 80 – 88 p.

15. Sasnauskas A.. Naujos juodųjų serbentų veislės. Mano ūkis 11. 2009. P. 40-41

16. Sasnauskas A., Šikšnianas T., Rugienius R. New black currant cultivars from Lithuania . Acta Hort.

(649). 1999. 323 – 326.

17. Skuolienė V. Juodųjų serbentų morfoanatominiai tyrimai, atsparumas grybinėms ligoms ir

serbentinei (pumpurinei) erkutei. LŽŪ. Sodininkystės ir daržininkystės katedra. 2011.

18. Vasiliauskas J. Augalai ir sveikata. Vilnius. Mokslas: 1991. ISBN 5-420-00311-2.

19. Vasiliauskas J. Gamtos vaistinė. Alma littera, Vilnius, 2011. ISBN 978-9955-38-583-7.

55

20. Gaižauskienė (Dvaranauskaitė) A. Įvairių juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) veislių pumpurų

cheminė sudėtis. Daktaro disertacija. 2009 Kaunas.

21. Matsumoto H., Nakamura Y., Iida H., Ito K. And Ohguro H. Comparative assessment ot istribution

of black currant anthocianins in rabbit and rat ocular tissues. Experimental Eye Research, vol.83, no.2,

pp.348-356, 2006.

22. Gatto M. T., Falcocchio S., Grippa E., Mazzanti G., Battinelli L., Nicolosi G., Lambusta D., Saso L.

2002. Antimicrobial and Anti-Lipase Activity of Quercetin and its C2-C16 3-O-Acyl-Esters. Bioorganic

& Medicinal Chemistry, 10: 269– 272.

23. Liobikas J., Liegiūtė S. ir kt. Skirtingų Ribes nigrum veislių uogų ekstraktų, turtingų antocianinų,

antimikrobinis aktyvumas. 2008m. 27(4).

24. Luzak B., Boncler M., Rywaniak J. et all. Extract from Ribes nigrum leaves in vitro activates nitric

oxide synthase (eNOS) and increase CD39 expresion in human endothelial cells. J.Physiol Biochem.

2014. 70:1007-1019.

25. Kasparavičienė G. Antioksidacinio poveikio preparatų su juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) uogų

ekstraktų tyrimas ir įvertinimas. Daktaro disertacija. Kaunas, 2005.

26. Garbacki N., Kinet M., Nusgens B., Desmecht, D., Damas J., Proanthocyanidins, from Ribes nigrum

leaves, reduce endothelial adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1. J. 2005. Inflamm. 2, 2–9.

27. Garbacki N., Angenot L., Bassleer C., Damas J., Tits M. Effects of prodelphinidins isolated from

Ribes nigrum on chondrocyte metabolism and COX activity. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol

(2002) 365 :434–441.

28. Bishayee A., Mbimba T., Thoppil R.J. et al. Anthocyanin-rich black currant (Ribes nigrum L.) extract

aords chemoprevention against diethynitrosamine-induced hepatocellular carcinogesis in rats. Journal

of Nutritional Biochemistry, 2011,vol.22, no 11. Pp. 1035-1046.

29. Ethorđević BS., Pljevljakušić ÐS, Savikin KP, Stević TR, Bigović DJ. Essential oil from black

currant buds as chemotaxonomy marker and antimicrobial agent. Chem Biodivers. 2014

Aug;11(8):1228-40.

30. Raiciu A.D., Mihele D.E., Ionita C., Nistorica V., Manea S. Antimicrobial Activity of Ribes Nigrum

,Rosmarinus Officinalis ,Betula pubescens,Salix alba,Vaccinium Mirtillus gemoderivatives, Farmacia

58 (2010) 735–747.

31. Militaru A.V., Simedrea I., Alexoi I., Peev C., Bernad E., Toma C.C. Plant Extracts From

Meristematic Tissues (Foliar Buds And Shoots):Antioxidant And Therapeutic Action. 20. Vasilegoldis

University press. 2010. pp.45–47.

32. Aguie-Beghin V, Sause P, Meudec E, Cheynier V, Douillard R. Polyphenol-beta-casein complexes

at the air/water interface and in solution: effects of polyphenol structure. J abric Food Chem. 200; 56;

9600-9611.

56

33. Nakajima J., Tanaka I., Seo S., Yamazaki M., Saito L. LC/PDA.ESI-MS Profiling and Radical

Scavering Activity of Anthocyanins in Various Berries//Journal of Biomedicine and Biotechnology.

2004, Vol.5. p.241-247.

34. Coutinho D., Coelho R.G., Kataoka V.M.F., Honda N.K, Silva J.R.M., Vilegas W., Cardoso C.A.L.

Determination of phnolic compounds and evaluation of antioxidant capacity of Campomanesia

adanmantanum leaves. Eclet Quim. 2008. 33:53-60.

35. Zheng, J.; Yang, B.; Ruusunen, V.; Laaksonen, O.; Tahvonen, R.; Hellsten, J.; Kallio, H.

Compositional differences of phenolic compounds between black currant (Ribes nigrum L.) cultivars

and their response to latitude and weather conditions. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 6581-6593

36. Butnariu M. Detection of polyphenolic components in Ribes nigrum L.Annals Agricultural and

Environmental Medicine. 2014, Vol.21, No. 1, 11-14.

37. Liu P., Kallio H., Yang B.Flavonol glycоsides аnd оther phenоlic cоmpоunds in buds аnd leаves оf

different vаrieties оf blаck currаnt (Ribes nigrum L.) аnd chаnges during grоwing seаson. Food

Chemistry 160. 2014. P.180-169.

38. Sasaki T., Li W., Zaike S., Asada Y., Li Q., Ma F., Zhang Q., Koike K. Antioxidant lignoids from

leaves of Ribes nigrum. Phytochemistry 95. 2013. 333-340.

39. Tаbаrt J., Kevers C., Evets D., Dоmmnes J., Ascоrbic аcid, phenоlic аcid, flаvоnоid аnd cаrоtenоid

prоfiles оf selected extrаcts frоm Ribes nigrum. J. Agric Food Chem. 2011; 59;4763-4770.

40. Vаgiri M., Ekhоlm A., Stаffаn C., Anderssоn A., Jоhаnssоn E., and Rumpunen K. An Optimized

Methоd fоr Anаlysis оf Phenоlic Cоmpоunds in Buds, Leaves, аnd Fruits оf Blаck Currаnt (Ribes

nigrum L.) Jоurnаl оf Agricultural аnd Food Chemistry. 2012 Oct. 24; 60(42): 10501-10510.

41. Ieri F., Innocenti M,, Possieri L., Gallori S., Mulinacc N. Phenolic Composition of “bud extracts”of

Ribes Nigrum L.,Rosa Canina L.And Tilia Tomentosa M. Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis 115 (2015) 1–9.

42. Krüger E, Dietrich H, Hey Mand Patz C.D. Effectsofcultivar, yield, berry mass, temperature and

ripening stage on bioactive compounds of blackcurrants. J.Appl.Bot.Food Qual 84:40–46(2011).

43 Vagiri, M.; Ekholm, A.; Öberg, E.; Johansson, E.; Andersson, S. C.; Rumpunen, K. Phenols and

ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. J. Agric.

Food Chem. 2013, 61, 9298-9306.

44. Yang W., Alanne A.L., Liu P., Kallio H., Yang B. Flavonol Glycosides in Currant Leaves and

Varation with Growth Season, Growth Location, and Leaf Position.Journal of agricultural and food

chemistry. 2014, Finland.

45. Leszek Woznicki T., Aaby K., Sønsteby S., Mikal Heide O., Berit A. Influence of controlled post-

flowering temperature and daylength on individual phenolic compounds in four black currant cultivars.

Wold, and Siv Fagertun Remberg. J. Agric. Food Chem., Just Accepted Manuscript• 2016.

57

46. Vаgiri M., Cоnner S., Stewаrt D., Anderssоn S.C., Verrаll S., Jоhаnssоn E., Rumpunen K. Phenоlic

cоmpоunds in blаckcurrаnt (Ribes nigrum L.) leаves relаtive to leaf position and harvest date. Food

Chemistry 172 (2015) 1325-142.

47. Rubinskienė M, Viškelis P, Stanys V et al. Juodųjų serbentų cheminės sudėties ir fizikinių savybių

pokyčiai uogoms nokstant. Lietuvos sodininkystė ir daržininkystė. 2008. 27(4). 73-80. Prieiga per

internetą: http://sodininkyste-darzininkyste.lsdi.lt/straipsniai/27-4/9.

48. Rubinskienė M., Viškelis P., Jasutienė I., Duchovskis P., Bobinas C.. Change of biologically active

constituents in black currants during ripening. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research, 2006:

14(2): 237–246.

49. Stalikas C.D. Review: Extraction, separation, adn detection methods for phenolic acids and

flavonoids. J.Sep. Sci. 2007, 30, 3268-3295.

50. Ghаsemzаdeh A., Ghаsemzаdeh N. Flаvоnоids аnd phenоlic аcids: Rоle аnd biоchemicаl аctivity in

plаnts аnd humаn. Jоurnаl оf Medicinаl Plаnts Reseаrch Vol. 5(31), pp. 6697-6703, 23 December, 2011.

Prieiga per internetą: http://www.academicjournals.org/JMPR.

51. Janulis V., Puodžiūnienė G., Malinauskas F. Fitocheminė analizė. Mokomoji knyga. Kaunas, 2008.

ISBN 978-9955-835-37-0. psl.89-108.

52. Polyphenols: Flavonoids – Stilbenoids – Phenolic Acids. Productline catalog. International Edition.

Alexis Biochemical. Prieiga per internetą: http://www. Alexis-biochemicals.com

53. Pietta, P. G., in: Rice-Evans, C. A., Packer, L. (Eds), Flavonoids in Health and Disease, Marcel

Dekker, NewYork, 1998, pp.61–110.

54. Mazza, G., Miniati, E., Anthocyanins in Fruits, Vegetables and Grains. CRC Press, Boca Raton,

Finland,1993.

55. Harborne, J. B. Flаvоnоids: Advаnces in Reseаrch since 1986, Chаpmаn аnd Hаll, Lоndоn 1994,

pp. 589–618.

56. Rijke E, Out P, Niessen WMA, Ariese F, Gооiejer C, Brinkmаn UAT. Anаlyticаl sepаrаtiоn аnd

detectiоn methоds fоr flаvоnoids. Journal of Chromatography.2006; 1112:31-63.

57. Jakštas V, Janulis V, Trumbeckaitė S. Cheminis fotopreparatų tyrimas. KMU leidykla, Kaunas.

2009.71-93.

58. Ainsworth EA GK. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues

using Folin-Ciocolteu reagent. Nature Protocols 2007; 2(4):875-877.

59. Marghitas LA, Dezmirean D, Laslo L, Moise A, Pompescu O. Validated method for estimation of

total flavonoids in romanian propolis. Bulletin of USAMV 2007; 63-64:164-169.

60. Chernyak EI, Vyalkov AI, Tsaralunga YaS, Morozov SV. Application of Gas and High Performance

Liquid Chromatography Techniques for the Identification of Natural Biologically Active Phenolic

Compounds. Chemistry for Sustainable Development 2007; 15: 601-15;

58

61. Kupiec, Tom. "Quality-control analytical methods: High-performance liquid chromatography."

INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICAL COMPOUNDING 8 (2004): 223-227.

Prieiga per internetą: http://www.arlok.com/articles/HighPerformance_Liquid_Chromatography

62. Guardia T., Teresita A., Ester Rotelli A., Juarez A.O., and Pelzer L.E. Anti-inflаmmаtоry prоperties

оf plаnt flаvоnоids. Effects оf rutin, quercetin аnd hesperidin on adjuvant arthritis in rat. Il farmaco 56,

no. 9 (2001): 683-687.

63. Havsteen B. H. 2002. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacology

and therapeutics, 96: 67–202.

64. Gee J. M, Johnson I. T. 2001. Polyphenolic compounds: interactions with the gut and implications

for human health. Curr. Med. Chem., 8: 1 245–1 255.

65. Mаnаch C., Scаlbert A., Mоrаnd Ch., et аl. Pоlyphenоls:fооd sоurces аnd biоаvаilаbility.Americаn

Jоurnаl оf clinicаl Nutritiоn 2004; 79(95):727-747.

66. Nijveldt RJ, vаn Nооd E, van Hооrn DEC, Bоelens PG, van Nоrren K, vаn Leeuwen PAM.

Flаvоnоids: а review оf prоbаble mechаnisms оf аctiоn аnd pоtentiаl аpplicаtiоns. Am J Clin Nutr

2001;74:418-25.

67. Bоnаrskа-Kujаwа D., Cybоrаn S., Žylkа R., Oszmiаnski J., Kleszcynskа H. Biоlоgicаl Activity оf

Blаckcurrаnt Extrаcts (Ribes nigrum L.) in Relаtiоn tо Erythrоcyte Membrаnes. Hindawi Publishing

Corporation.Vol.2014. 783059.

68. Sessо H. D., Gаziаnо J. M., Liu S., Buring J. E. 2003. Flаvоnоid intаke аnd the risk оf cаrdiоvаsculаr

diseаse in wоmen. The Americаn Jоurnal оf Clinical Nutrition, 77:1 400–1 408.

69. Vita J. A. 2005. Pоlyphenоls аnd cаrdiоvаsculаr diseаse: effects оn endоtheliаl аnd plаtelet function.

Am. J. Clin. Nutr., 81: 292S–297S.

70. Cushnie T. P. T., Lamb A. J. 2005. Antimikrobial activity of flavonoids. International Journal of

Antimicrobial Agents, 26:343-356.

71. Yoko M.Knox, Suzutani T., Yosida I., Azuma M. Anti-influenza Virus Activity of Crude Extract of

Ribes nigrum L. Phytotherapy Research, February, 2003. 10.1002/ptr.1053.

72. Rubinskienė M., Jаsutienė I., Venskutоnis P., Viškelis P. HPLC Determinаtiоn оf the Cоmpоsitiоn

аnd Stаbility оf Blаckcurrаnt Anthоcyаnins. Jоurnаl оf Chrоmаtоgrаphic Science, Vol. 43, October

2005.

73. Kasparavičienė G., Briedis V. Juodųjų serbentų ir juodavaisių aronijų uogų sulčių stabilumas ir

antioksidacinis aktyvumas. MEDICINA (2003) 39 tomas, 2 priedas. 65-69.

74. Davies K. M. Plant Pigments and their Manipulation. Blackwell Publishing Ltd., Oxford, 2004.

75. Piettа, P. G., Simоnetti, P., in: Pаcker, L., Hirаmаtsu, M., Yаshikаwа, T. (Eds), Antiоxidаnt Fооd

Supplements in Human Health, AcademicPress, San Diego 1999, pp. 283–308.

59

76. Galvez, J., Crespo M.E., Jimenez J., Suarez A., and Zarzuelo A. Antidiarrhoeic activity of quercitrin

in mice and rats. Journal of pharmacy and pharmacology 45, no. 2 (1993): 157-159.

77. Lakhanpal P., Rai D. K. 2007. Quercetin: A Versatile Flavonoid. Internet Journal of Medical Update,

2(2): 22–37.

78. Jung J., Hun C., Ji Yun Lee, Chul Hyung Cho, Chang Jong Kim.Anti-asthmatic action of quercetin

and rutin in conscious guinea-pigs challenged with aerosolized ovalbumin. Archives of pharmacal

research 30, no. 12 (2007): 1599-1607.

79. Metodiewa D., Kochman A., and Karolczak S. Evidence for antiradical and antioxidant properties

of four biologically active N, N‐Diethylaminoethyl ethers of flavaone oximes: A comparison with

natural polyphenolic flavonoid rutin action. IUBMB Life 41, no. 5 (1997): 1067-1075.

80. Liu, Zhiyong, Xinyi Tao, Chongwei Zhang, Yanhua Lu, and Dongzhi Wei. Protective effects of

hyperoside (quercetin-3- i- o-i-galactoside) to PC12 cells against cytotoxicity induced by hydrogen

peroxide and butyl hydroperoxide. Biomedicine & pharmacotherapy 59, no. 9 (2005): 481-490.

81. Zhang, Xiao-Nan, Jin-Mao Li, Qi Yang, Bin Feng, Shui-bing Liu, Zhao-Hui Xu, Yan-Yan Guo, and

Ming-Gao Zhao. "Anti-apoptotic effects of hyperoside via inhibition of NR2B-containing NMDA

receptors." Pharmacol Rep 62, no. 5 (2010): 949-955.

82. Young IS, Woodside JV. Antioxidants in health and disease. J Clin Pathol 2001;54:176-86.

83. Jasutienė I., Viškelienė R. Mėlynių, juodųjų serbentų ir spanguolių sulčių bei ekstraktų sudėtis ir

antioksidacinis aktyvumas. ISSN 1392-0227. Maisto chemija ir technologija. 2006. T. 40, Nr.1

84. Vyšniauskienė R, Račelienė V, Petrikaitė J, Šikšnianas T. Juodojo serbento veislių įvertinimas pagal

antioksidacinius fermentus. Sodininkystė ir daržininkystė. 2009 28(2).

85. Slimestad, R.; Solheim, H., Anthocyanins from black currants (Ribes nigrum L.). J. 341 Agric. Food

Chem. 2002, 50, 3228-3231.

86. Wang SY., Jiao H.Scavering capacity of berry crops on superokside radicals, hidrogen peroxide,

hidroxyl radicals and singlet oxygen. J.Agric.Food Chem.2000; 48:5677-5684

87. Stahelin HB. The impact of antioxidants on chronic disease in ageing and in old age. Int J Vitam

Nutr Res 1999;69:146-9.

60

7. KONFERENCIJŲ TEZĖS

2015 m. gegužės 6-7 d. 21-oji tarptautinė mokslinė-praktinė konferencija ,,ŽMOGAUS IR

GAMTOS SAUGA 2015“. Magnt. Edita Elijošiutė, doc. dr. Audronis Lukošius, prof. dr. Ona

Ragažinskienė, prof. habl. dr. Audrius Maruška. Juodasis serbentas (Ribes nigrum L.) – svarbus maistas

ir vaistas žmogaus sveikatai.

2015 m. lapkričio 5-6. The 6th International Pharmaceutical Conference ,,Science and practice

2015‘‘.Magnt. Edita Elijošiutė, doc. dr. Audronis Lukošius, prof.dr. Ona Ragažinskienė, prof. habl. dr.

Audrius Maruška. Spectrophotometric phenolic compounds and flovonoids investigation in black

currant (Ribes nigrum L.) leaves.

2016 m. gegužės 4-6 d. 22-oji tarptautinė mokslinė-praktinė konferencija ,,ŽMOGAUS IR

GAMTOS SAUGA 2016‘‘. Magnt. Edita Elijošiutė, doc. dr. Audronis Lukošius, prof. dr. Ona

Ragažinskienė, prof. habl. dr. Audrius Maruška. Flavonoidų kiekybinis nustatymas juodųjų serbentų

lapuose (Ribis nigri folium).

61

8. PRIEDAI

Mokslinis straipsnis: Elijošiutė E., Lukošius A., Ragažinskienė O., Maruška A., Flavonoidų

kiekybinis nustatymas juodųjų serbentų lapuose (Ribis nigri folium). Žmogaus ir gamtos sauga 2015.

ASU ISSN 1822-1823, psl. 149 – 151.

Mokslinis straipsnis: Elijošiutė E., Lukošius A., Ragažinskienė O., Maruška A. Flavonoidų

kiekybinis nustatymas juodųjų serbentų lapuose (Ribis nigri folium). Žmogaus ir gamtos sauga 2016.

ASU.