Upload
mariel
View
78
Download
0
Tags:
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Identification of Adenovirus, Influenza Virus, ParainfluenzaVirus, and Respiratory Syncytial Virus by Two Kinds of Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) and a Shell Vial Culture in Pediatric Patients with Viral Pneumonia. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Identification of Adenovirus, Influenza Virus, ParainfluenzaVirus, and Respiratory Syncytial Virus by Two Kinds of Multiplex Polymerase
Chain Reaction (PCR) and a Shell Vial Culture in Pediatric Patients with Viral Pneumonia
Jong-Han Lee, Jin-Kyong Chun, Dong Soo Kim,Yongjung Park, Jong Rak Choi and Hyon-Suk Kim
Seoul, Korea.
Yonsei Med J 51(5):761-767, 2010
VİRAL PNÖMONİLİ ÇOCUKLARDA ADENOVİRÜS, İNFLUENZA VİRÜS,
PARAİNFLUENZA VİRÜS VE RESPİRATUVAR SİNSİTYAL VİRÜSÜN İKİ
FARKLI MULTİPLEKS PCR KİTİ VE SHELL VİAL KÜLTÜRÜYLE
TANIMLANMASI
Araş.Gör.Dr.Oya AKKAYA
Prof.Dr.Bülent BAYSAL
GİRİŞ
Akut viral kökenli solunum yolu hastalıkları çocuklarda morbiditeye yol açan en sık nedenlerdir
Üst solunum yolunda sınırlanmalarına rağmen yine de alt solunum sistemi komplikasyonlarına yol açar
Bu nedenle viral infeksiyonların erken ve hızlı tanısı, virüsün yayılımının engellenmesi için önemlidir
GİRİŞ
Respiratuvar virüslerin PCR ile tespit edildiği birkaç çalışma vardır
Bu çalışmalara göre toplumsal kaynaklı ve nasokomiyal solunum sistemi infeksiyonlarından en sık IFV, HPIV, AdV ve RSV izole edilmiştir
IFV, enterovirüs ve AdV antiviral tedaviden faydalanabilecek virüslerdir
Bu çalışmanın amacı, çocuklardaki şiddetli viral pnömoni sebeplerinin 2 farklı PCR kiti kullanılarak tespit edilmesidir
GEREÇ VE YÖNTEM
ÖRNEK TOPLAMA: 2009 yılında Seul’de, 6 aylık bir periyodda, viral pnömoni
semptomları olan 220 çocuk hasta pediyatri servisine yatırıldı Fizik muayene bulguları, akciğer röntgeni, kan testleri,
sedimentasyon hızı ve CRP ile bakteriyel pnömoni ekarte edilip viral pnömoni tanısı kondu
Bu hastalardan nasofarengeal sürüntü örneği alındı Bu örnekler çalışılıncaya kadar -75˚C’de saklandı
NÜKLEİK ASİT EKSTRAKSİYONU
QIAamp viral RNA Mini Kit ( QIAGEN,Hilden, Germany ) ticari kiti kullanılarak 220 nükleik asit ekstraksiyonu yapıldı ve -70˚C’de donduruldu
Multipleks PCRSeeplex RV detection kiti
A setinde; AdV HMPV HCoV 229E/NL63 HPIV 1-2-3
B setinde; IFV A-B RSV A-B RhV HCoV OC43/HKU1
Labopass RV detection kiti
AdV HboV (bocavirüs) HCoV EnV HPIV 1-2-3 RhV RSV A-B IFV A-B
Seeplex RV detection kiti protokolü
3 µL cDNA 3 μL of 8-methoxypsoralen (MOP) solution 4 μL of 5×RV Primer 10 μL of 2×master mix.
Toplam 20 µL final solusyonu elde edilir
94C’de 30 saniye 60C’de 1.5 dakika 35 siklus 72C’de 1.5 dakika
Çoğaltılan ürünler etidyum bromürle boyanıp %2 agarose jelde yürütüldü
Her virüsün markırı ve internal kontroller de yürütüldü
Seeplex RV detection kiti protokolü
Labopass RV Detection kiti protokolü
2 farklı PCR kit protokolü kullanıldı:
95C’de 3 dakika 95C’de 1dakika 35 siklus 72C’de 1 dakika 72C’de 5 dakika bekleme ve uzama evresi
42C’de 60 dakika 95C’de 3dakika 95C’de 1 dakika 35 siklus 55C’de 1dakika 72C’de 1 dakika 72C’de 5dakika final bekleme
Bu protokol de ; HCoV, EnV, HPIV 1-2-3, RhV, RSV A-B içindir.
Çoğaltılan ürünler etidyum bromürle boyanıp %2 agarose jelde yürütüldü
VİRÜS KÜLTÜRÜ
Multipleks PCR kitleriyle pozitif sonuç veren ve AdV, IFV, HPIV ve RSV taşıyan örneklere R-Mix Ready Cells ( Diagnostic Hybrids,USA ) ticari kitinin prosedürlerine uygun olarak shell vial kültürü yapıldı
DİZİ ANALİZİ
Kültür negatif, PCR pozitif olan 10 örnek için dizi analizi yapıldı
Otomatize sekanslama analizörü olan Applied Biosystems, USA ile çalışıldı
Sonuçlar Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) verileri kullanılarak verildi
BULGULAR
BULGULAR Virüsler Seeplex RV-12 Labopass RV
AdV 14 14
HCoV 229E 5 1
HCoV OC 43 4 2
IF-A 8 2
IF-B 9 1
HMPV 22
PIV- 1 0 2
PIV- 2 0 0
PIV- 3 4 1
RhV 18 6
RSV- A 39 60
RSV-B 33
BULGULAR
Seeplex RV-12 kitinde 220 örnekte 116 pozitif bulundu(%52.7)Labopass RV kitinde ise 220 örnekte 102 pozitif bulundu (%46.4)
Seeplex RV-12 kitinde koinfeksiyon oranı 15/220 (%6.8)Labopass RV kitinde ise 13/220 (%5.9) bulundu
BULGULAR
PCR’ın pozitif verdiği 103 örneğe shell vial kültürü yapıldı ve bunların 95 tanesinde üreme görüldü (Oran %90.3)
3 örnekte ise ikişer virüs üredi 95 örneğin
15’i AdV 6’sı IFV-A 9’u IFV-B 2’si PIV 63’ü RSV çıktı
Pozitif viral kültürün Seeplex RV-12 kitine oranı 99/103=%96
Pozitif viral kültürün Labopass kitine oranı 80/103=%78
BULGULAR
103 örneğin 50’si tutarlı sonuç verdi, her 3 yöntemde de aynı virüs bulundu
53 örnekte ise sonuçlar tutarsızdı, her 3 testte de farklı sonuçlar bulundu
Bu 53 sonucun 17 tanesinde sonuç belirsizdi. Her testle farklı ve birden çok virüs bulundu
Multiplex PCR pozitif, viral kültür negatif
Multiplex PCR pozitif, viral kültür negatif olan 10 örnek için dizi analizi yapıldı
Sonuçlar PCR ile %91-100 uyumlu çıktı Sadece 1 örnek PCR’da IFV-A iken, dizi analizinde rinovirüs
çıktı
TARTIŞMA
Pediyatrik hastalarda, viral pnömoni tanısını erken koymak tedavi için önemlidir
Hem gereksiz antibiyotik kullanımından kaçınılmış olur hem de IFV, EnV, AdV gibi bazı viral infeksiyonlarda özel antiviral tedavilerden faydalanılmış olur Bu çalışma da, kliniklere bu konuda faydalı olmak için 2 multipleks
PCR kiti ve shell vial kültür yöntemi karşılaştırılmış ve hangisinin klinik olarak daha etkin olduğunu göstermek için yapılmış prospektif bir çalışmadır.
TARTIŞMA
Respiratuvar virüslerin tanısı için en yaygın kullanılan yöntemler viral kültür ve sonrasında yapılan immunfloresan boyama yöntemleridir
ELISA ise hızlıdır ama sensitivitesi daha azdır Örneğin kalitesi, virüsün tipi, çalışan kişinin teknik hataları
bu yöntemlerde önemlidir Virüslerin teşhisinde virüs kültürü hala altın standarttır ama
kültür yapımında, solunum yolu örneğinin transportu ve depolama koşulları önemlidir üremeyi etkileyen faktörlerdendir
TARTIŞMA
Choi ve ark.2006’da yaptığı bir çalışmada direkt antijen testini, viral kültürü ve multipleks PCR yöntemini karşılaştırmış ve AdV,IFV ve RSV için tespit oranını sırasıyla %28.4, 36.2, 44.8 bulmuştur
Son zamanlarda en yaygın metot ise shell vial kültürü sonrası immunfloresan boyama olmuştur
Ama bu metot kolay değildir ve rutin laboratuvarlar için uygun değildir
TARTIŞMA
PCR yöntemleri iyi yöntemlerdir ama yanlış pozitiflik ve yanlış negatiflik dezavantajları vardır
Kültürden daha hızlı ve daha sensitiftir
Ayrıca HMPV gibi kültürde üretilmeleri zor olan bazı virüsler için de bu test bir avantajdır
TARTIŞMA
Bu çalışmada 2 multipleks PCR kiti ve viral kültür arasındaki uyum oranı %49 bulundu ( 50/103)
Viral kültürü yapılabilen sadece 4 virüs vardı: IFV, RSV, AdV, PIFV
2 multipleks PCR kiti arasında da uyumsuzluk vardı Seeplex RV kitinin pozitiflik oranı, Labopass PCR kitinden
daha yüksek bulundu Buna rağmen , Labopass PCR kitinin HMPV tespit etme oranı
Seeplex RV kitinden daha yüksek bulundu 2 PCR kiti arasındaki uyumsuzluk oranı %51 bulundu (53/103)
TARTIŞMA
Multipleks PCR kitleri arasındaki bu uyumsuzluk, kitlerin limitasyonlarından kaynaklanabilir
Bu sebeplerden biri, ekstraksiyon aşamasında PCR inhibitörlerinin temizlenememesi olabilir Böylece yanlış negatif sonuç çıkmış olabilir
Bir başka sebep te, kullanılan primerin nükleotid varyasyonu nedeniyle virüsü tespit edememesi olabilir Böyle bir durum varsa direkt antijen testi ve virüs kültürü PCR’ın
yerine kullanılabilir
TARTIŞMA
Seepleks RV’de koinfeksiyon oranı %7 (15/220) iken Labopass RV’de %6(13/220) bulundu
Daha önceki çalışmalarda da, şiddetli infeksiyonlarda double-virüs infeksiyonu görülmüştür (Bu çalışmada infeksiyonun şiddeti araştırılmamıştır)
Kültür negatif ve PCR pozitif 10 vaka direkt dizi analizi metoduyla değerlendirilmiş ve bu sonuçlar PCR ile karşılaştırılmıştır
Sonuç olarak
Solunum yolu virüslerinin PCR ile tesbiti hızlı ve kolaydır
Pozitiflik oranı virüs kültüründen yüksektir
Bu nedenle klinik laboratuvarlarda solunum yolu infeksiyonlarında ilk seçenek olmalıdır
Virüs kültürü ve dizi analizi ise sadece seçilen vakalarda yapılmalıdır