John S.Wolfson, Gail L.McHugh, David C.Hooper and Morton N.Swartz- Knotftng of DNA molecules isolated from deletion mutants of intact bacteriophage P4

8/3/2019 John S.Wolfson, Gail L.McHugh, David C.Hooper and Morton N.Swartz- Knotftng of DNA molecules isolated from del

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V o l u m e 1 3 N u m b e r 1 8 1 9 8 5 N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h

K n o t f t n g o f DNA m o l e c u l e s i s o l a t e d f r o m d e l e t i o n m u t a n t s o f i n t a c t b a c t e r i o p h a g e P 4

J o h n S . W o l f s o n * , G a i l L . M c H u g h , D a v i d C . H o o p e r a n d M o r t o n N . S w a r t z

I n f e c t i o u s D i s e a s e U n i t , M e d i c a l S e r v i c e s , M a s s a c h u s e t t s G e n e r a l H o s p i t a l , B o s t o n , MA 0 2 1 1 4 , USA

R e c e i v e d 1 8 J u l y 1 9 8 5 ; R e v i s e d a n d A c c e p t e d 2 7 A u g u s t 1 9 8 5

ABSTRACTD N A m o l e c u l e s i s o l a t e d f r o m t a i l l e s s p h a g e p a r t i c l e s ( c a p s i d s ) o fb a c t e r i o p h a g e P 4 v i r l d e l l O a r e k n o w n t o b e k n o t t e d . We h a v e f o u n d b ye l e c t r o n m i c r o s c o p y t h a t 8 0 Z o f DNA m o l e c u l e s i s o l a t e d f r o m i n t a c t p h a g ep a r t i c l e s o f P 4 v i r l d e l l O a l s o c o n t a i n e d k n o t s . T h i s o b s e r v a t i o ni n d i c a t e s t h a t t h e p r e d o m i n a n t f o r m o f P 4 v i r l d e l l O DNA w i t h i n t h e i n t a c tp h a g e p a r t i c l e i s e i t h e r k n o t t e d o r i n a c o n f i g u r a t i o n t h a t p e r m i t sk n o t t i n g u p o n i s o l a t i o n . I n c o m p a r i s o n t o P 4 v i r l d e l l O ( d e l e t e d 1 0 0 0b a s e p a i r s ) , DNA m o l e c u l e s i s o l a t e d f r o m i n t a c t P 4 v i r l del2 ( d e l e t e d 6 5 0b a s e p a i r s ) a n d P 4 v i r l ( n o n - d e l e t e d ) c o n t a i n e d 5 0 % a n d 1 5 Z k n o t sr e s p e c t i v e l y , s h o w i n g a n a s s o c i a t i o n o f d e c r e a s e d s i z e o f d e l e t i o n o f DNAwith a d e c r e a s e d f r a c t i o n o f knotted g e n o m e s .

I N T R O D U C T I O NT h e g e n o m e o f t h e i c o s a h e d r a l b a c t e r i o p h a g e P 4 i s a n 1 1 . 5 k i l o b a s e

( k b ) n o n - p e r m u t e d d u p l e x l i n e a r DNA m o l e c u l e with 1 9 b a s e s i n g l e - s t r a n d e dc o h e s i v e e n d s ( 1 , 2 ) . L y t i c g r o w t h o f P 4 i s d e p e n d e n t u p o n b a c t e r i o p h a g e P 2( 3 ) , w h i c h c o n t a i n s a 3 5 k b d u p l e x l i n e a r DNA m o l e c u l e ( 1 ) t h a t e n c o d e s a l lo f t h e r e s o l v e d s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n t h e P 4 p h a g e p a r t i c l e ( 4 ) . DNAm o l e c u l e s i s o l a t e d f r o m t a i l l e s s p h a g e p a r t i c l e s ( c a p s i d s ) o f e i t h e r t h e P 4d e l e t i o n m u t a n t P 4 v i r l d e l l O ( 5 ) o r n o n - d e l e t e d P 2 ( 6 ) a r e u n u s u a l i n t h a ta l a r g e f r a c t i o n e x i s t s a s h i g h l y k n o t t e d c i r c l e s . I n c o n t r a s t , DNAm o l e c u l e s i s o l a t e d f r o m i n t a c t p h a g e p a r t i c l e s o f P 4 v i r l d e l l O , t h o u g hl e s s t h o r o u g h l y c h a r a c t e r i z e d , h a v e a s m a l l e r f r a c t i o n with k n o t s ( 5 ) ; a n dm o l e c u l e s i s o l a t e d f r o m i n t a c t P 2 p h a g e p a r t i c l e s a r e u n k n o t t e d ( 6 ) . Wer e p o r t here e x p e r i m e n t s u s i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y t o q u a n t i t a t e i n d e t a i lt h e f r a c t i o n o f k n o t t e d DNA m o l e c u l e s i s o l a t e d f r o m i n t a c t p h a g e p a r t i c l e so f P 4 v i r l d e l l O . We h a v e f o u n d t h a t t h e majority o f i s o l a t e d P 4 v i r ld e l l O DNA m o l e c u l e s a r e k n o t t e d a n d t h a t t h e f r a c t i o n o f k n o t t e d m o l e c u l e si s s u b s t a n t i a l l y l e s s f o r a P 4 g e n o m e with a s m a l l e r or n o d e l e t i o n . Thesef i n d i n g s are d i s c u s s e d i n relation t o p a c k a g i n g o f DNA i n b a c t e r i o p h a g e s .

I R L P r e s s L i m i t e d , O x f o r d , E n g l a n d . 6 6 9 5


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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c hMATERIALS AND ME TH ODSB a c t e r i a l s t r a i n s a n d b a c t e r i o p h a g e

P 4 p h a g e s w ere p r o p a g a t e d o n E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s C - 1 1 7 ( P 2 ) ( 7 )a n d C - 1 7 9 2 ( P 2 l g c c ) ( 8 ) . E . c o l i C - 1 0 5 5 a n d C - 1 7 9 2 ( P 2 1 g c c ) w ere used a si n d i c a t o r s t r a i n s ( 9 ) . P 4 v i r l d e l l O ( 1 0 ) w as p r e p a r e d w i t h t h e followingm o d i f i c a t i o n o f t h e p r o t o c o l o f L i u e t a l . ( 5 ) . P h a g e s w ere a d d e d a t am u l t i p l i c i t y o f i n f e c t i o n o f 0 . 0 2 t o c e l l s grow i ng i n e a r l y l o g a r i t h m i cp h a s e . When c e l l g r o w t h r e a c h e d a p l a t e a u a s d et ermi ned by o p t i c a l d e n s i t y( A 5 9 5 ) , EGTA ( e t h y l e n e g l y c o l - b i s - ( b e t a - a m i n o e t h y l e t h e r ) N , N ' - t e t r a c e t i ca c i d , S i g m a C h e m i c a l C o . ) was a d d e d t o 5 m M , a n d i n c u b a t i o n was c o n t i n u e df o r 1 h o u r . P h a g e s w ere p r e c i p i t a t e d w i t h p o l y e t h y l e n e g l y c o l ( P E G - 6 0 0 0 ) ,a n d t h e p e l l e t was e x t r a c t e d t w i c e with P 4 buffer ( 1 1 ) . T h e p h a g e s weret h e n c o n c e n t r a t e d b y cesium c h l o r i d e e q u i l i b r i u m c e n t r i f u g a t i o n ( a s t e pwhich s e p a r a t e s i n t a c t p h a g e s f r o m b o t h c a p s i d s a n d i n t r a c e l l u l a r D N A ) a n dd i a l y z e d a g a i n s t P 4 b u f f e r . P u r i f i c a t i o n t y p i c a l l y g e n e r a t e d p h a g e t i t e r so f 1 - 5 x 1 0 1 2 p l a q u e - f o r m i n g u n i t s p e r m l . S i n g l e p l a q u e s o f P 4 v i r l a n dP 4 v i r l d e l 2 ( 1 2 , 1 3 ) were u s e d t o i n f e c t c u l t u r e s o f C - 1 7 9 2 ( P 2 l g c c ) . T h ev i r l mutation o f P 4 v i r l c a u s e s p a r t i a l i n s e n s i t i v i t y t o P 4 i m m u n i t y( 3 , 1 4, 1 5 ) , p r o b a b l y b y e n h a n c i n g e x p r e s s i o n o f t h e a l p h a a n d e p s i l o n g e n e s( 1 6 ) , a n d t h u s f a v o r s l y t i c g r o w t h . T h e i d e n t i t i e s o f P 4 v i r l , P 4 v i r ld e l 2 , a n d P 4 v i r l d e l l O were c o n f i r m e d b y r e s t r i c t i o n e n z y m e a n a l y s e s .I s o l a t i o n o f DNA

P h a g e DNA w a s i s o l a t e d f r o m p h a g e p a r t i c l e s b y extractio n t h r e e t i m e sw i t h r e d i s t i l l e d p h e n o l ( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , I n c . ) a n d onc ewith d i e t h y l e t h e r a n d wa s t h e n d i a l y z e d a g a i n s t P 4 b u f f e r . T 4 DNA l i g a s e( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , I n c . ) w a s u s e d a c c o r d i n g to t h er e c o m m e n d a t i o n s o f t h e m a n u f a c t u r e r .E l e c t r o n m i c r o s c o p y

F o r e l e c t r o n microscopy o f p h a g e p a r t i c l e s , a p h a g e s t o c k o f 1 - 5 x1 0 1 2 p l a q u e - f o r m i n g units p e r m l wa s d i l u t e d 1 : 2 0 i n P 4 b u f f e r a n d a p p l i e di n a 2 0 4 l d r o p t o a Parl od i an-c oat ed 2 0 0 m e s h c o p p e r g r i d . After t h e d r o pwas b l o t t e d , t h e g r i d was s t a i n e d w i t h 0 . 0 5 M u r a n y l a c e t a t e ( F i s h e rS c i e n t i f i c ) i n 0 . 0 5 M H C 1 , a n d t h e s pe cim en wa s e x a m i n e d i m m e d i a t e l y i n a ne l e c t r o n m i c r o s c o p e ( J E O L l O O B , 8 0 k V , 6 0 mi c ron a p e r t u r e ) . DNA w a sp r e p a r e d f o r e l e c t r o n microscopy u s i n g t h e f o r m a m i d e t e c h n i q u e o f D a v i s ,S i m o n , a n d Davidson ( 1 7 ) , s t a i n e d with 0 . 0 5 M u r a n y l a c e t a t e i n 0 . 0 5 M H C 1 ,a n d e x a m i n e d i n t h e d a r k - f i e l d m o d e .G e l e l e c t r o p h o r e s i s

G e l e l e c t r o p h o r e s i s p r o c e e d e d f o r f o u r h o u r s a t 4 . 2 V / c m i n 0 . 8 %6696


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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c ha g a r o s e ( S i g m a C h e m i c a l C o . ) a n d b u f f e r c o n t a i n i n g 8 9 mM T r i s - 2 . 8 m ME D T A - 8 9 m M b o r i c a c i d i n a h o r i z o n t a l g e l a p p a r a t u s ( D a n K a r , I n c . ) . DNAwas s t a i n e d a n d ph ot ograph ed a s previously d esc ri bed ( 1 8 ) .

R E S U L T SS t u d i e s with P 4 v i r l d e l l O

A preparation o f b a c t e r i o p h a g e P 4 v i r l d e l l O wa s e x a m i n e d i n t h ee l e c t r o n mi c rosc ope a n d f o u n d t o c o n t a i n 8 4 % i n t a c t p h a g e p a r t i c l e s a n d 1 6 %c a p s i d s . DNA m o l e c u l e s e x t r a c t e d f r o m t h e s a m e p h a g e s t o c k w e r e e x a m i n e db y e l e c t r o n microscopy u s i n g 5 0 % f o r m a m i d e i n t h e s p r e a d i n g s o l u t i o n a n d2 0 % f o r m a m i d e i n t h e h y p o p h a s e . O f 6 4 2 m o l e c u l e s s c o r e d , 6 2 % w e r e k n o t t e df o r m s , 1 2 % w e r e h i g h l y c o n d e n s e d d o t - l i k e s t r u c t u r e s ( t h o u g h t t o b ek n o t t e d , p o o r l y e x t e n d e d m o l e c u l e s ) , 2 2 % w ere u n k n o t t e d c i r c u l a r o r l i n e a rm o l e c u l e s , a n d 4 % c o u l d n ot b e c a t e g o r i z e d . F o r t h e k n o t t e d m o l e c u l e s ,t w o - t h i r d s h a d n o e n d s p r o t r u d i n g f r o m t h e k n o t , a n d o n e - t h i r d h a d t w o e n d sp r o t r u d i n g . T h e t w o p r o t r u d i n g e n d s l i k e l y r e p r e s e n t e d s e p a r a t i o n o f t h ec o h e s i v e e n d s d u r i n g p r e p a r a t i o n f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y .

T o d e t e r m i n e i f b o t h t h e k n o t t e d m o l e c u l e s a n d t h e d o t - l i k e structuresw ere c o m p o s e d o f a s i n g l e m o l e c u l a r s p e c i e s , t h e DNA preparation wa s h e a t e dt o 6 5 C f o r 1 0 m i n u t e s , t h e r e b y s e p a r a t i n g t h e c o h e s i v e e n d s a n d a l l o w i n gu n k n o t t i n g . T h i s h e a t treatment r e s u l t e d i n t h e c o n v e r s i o n o f t h e DNA t o as i n g l e p o p u l a t i o n o f u n i t - s i z e d u n k n o t t e d l i n e a r m o l e c u l e s a s a n a l y z e d b o t hb y e l e c t r o n microscopy a n d b y a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( d a t a n o t s h o w n ) .

T o s u b s t a n t i a t e t h a t t h e h i g h l y c ond ensed d o t - l i k e st ruc t ures ( F i g u r e1 , a r r o w ) were k n o t t e d m o l e c u l e s , e x t r a c t e d DNA wa s p re pa re d f o r e l e c t r o nmicroscopy u s i n g e n h a n c e d d e n a t u r i n g c o n d i t i o n s ( 6 0 % f o r m a m i d e i n t h es p r e a d i n g s o l u t i o n a n d 3 0 % f o r m a m i d e i n t h e h y p o p h a s e ) t o enc ourage b e t t e re x t e n s i o n o f c o n d e n s e d D N A . P r i o r t o p r e p a r a t i o n o f DNA f o r e l e c t r o nm i c r o s c o p y , t h e c o h e s i v e e n d s o f m ol ec ul es w er e s e a l e d with T 4 DNA l i g a s et o i n h i b i t s e p a r a t i o n o f t h e e n d s a n d u n k n o t t i n g ; s u c c e s s o f l i g a t i o n w asc o n f i r m e d b y t h e f a i l u r e o f h e a t t r e a t m e n t t o p r o d u c e l i n e a r m o l e c u l e s a sa n a l y z e d b y agarose g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( d a t a not s h o w n ) . When t h e l i g a t e dDNA w a s e x a m i n e d b y e l e c t r o n microscopy ( F i g u r e 1 ) , f o r 5 5 9 moleculess c o r e d , 7 6 % w e r e knot t ed with no e n d s p r o t r u d i n g , 1 8 % w e r e c i r c u l a r o rl i n e a r u n k n o t t e d m o l e c u l e s , 4 % w ere c o n d e n s e d s t r u c t u r e s , a n d 2 % c o u l d notb e c a t e g o r i z e d . N o knot t ed m o l e c u l e s had l i n e a r e n d s p r o t r u d i n g . Knottedm o l e c u l e s a p p e a r e d in a c o n t i n u o u s spec t ru m f r o m c o n d e n s e d s t r u c t u r e s w i t hone s m a l l l o o p o f DNA p r o t r u d i n g t o w e l l - d i s p l a y e d m o l e c u l e s . T h e s e

6697


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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h

F i g u r e 1 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f P 4 v i r l d e l l O D N A . DNA was e x t r a c t e d f r o mp u r i f i e d p h a g e p a r t i c l e s a n d l i g a t e d p r i o r t o p r e p a r a t i o n f o r e l e c t r o nm i c r o s c o p y . T h e arrow p o i n t s t o a d o t - l i k e s t r u c t u r e o f h i g h l y c o n d e n s e d D N A .

r e s u l t s p r o v i d e e v i d e n c e t h a t t h e c o n d e n s e d d o t - l i k e s t r u c t u r e s a r e knottedm o l e c u l e s .

T h u s h i g h l y k n o t t e d DNA m o l e c u l e s w e r e t h e p r e d o m i n a n t f o r m ( 8 0 % ) o fg e n o m e s i s o l a t e d f r o m a p h a g e s t o c k w i t h 8 4 % i n t a c t p a r t i c l e s .S t u d i e s with P 4 v i r l a n d P 4 v i r l d e l 2

T o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e k n o t t i n g o f DNA i s o l a t e d f r o m t h e i n t a c t P 4p h a g e p a r t i c l e m i g h t b e a g e n e r a l c h a r a c t e r i s t i c o f a l l P 4 p h a g e s orr e p r e s e n t a s p e c i a l p r o p e r t y o f P 4 v i r l d e l l O , t h e p a r e n t p h a g e P 4 v i r l wass t u d i e d . P 4 v i r l d e l l O h a s a d e l e t i o n o f 1 0 0 0 b a s e p a i r s ( 1 9 ) , a n d P 4 v i r lh a s no d e l e t i o n . F i f t e e n p e r c e n t o f p h e n o l - e x t r a c t e d DNA m o l e c u l e s f r o m ap h a g e s t o c k c o n t a i n i n g 9 0 % i n t a c t P 4 v i r l p a r t i c l e s w ere k n o t t e d bye l e c t r o n m i c r o s c o p y . T h u s t h e f r a c t i o n o f k n o t t e d DNA m o l e c u l e s i s o l a t e df r o m t h e p a r e n t p h a g e w a s s u b s t a n t i a l l y l e s s t h a n t h a t o f DNA moleculesi s o l a t e d f r o m t h e d e l e t e d d e r i v a t i v e .

S i m i l a r e x p e r i m e n t s were p e r f o r m e d u s i n g p h a g e P 4 v i r l d e l 2 , a P 4 v i r ld e r i v a t i v e which c o n t a i n s a 6 5 0 b a s e p a i r deletion t h a t d o e s n o t o v e r l a p t h ed e l e t i o n i n P 4 v i r l d e l l O ( 1 2 , 1 9 ) . F i f t y p e r c e n t o f t h e D N A m o l e c u l e s6698


5/8

N u c l e i c A c i d s R e s e a r c he x t r a c t e d f r o m a p h a g e s t o c k c o n t a i n i n g 8 8 % i n t a c t p a r t i c l e s w e r e k n o t t e da s v i e w e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y . T h u s p h a g e s with a d e l e t i o n t h a t w a si n t e r m e d i a t e i n s i z e b e t w e e n P 4 v i r l d e l l O a n d t h e p a r e n t P 4 v i r l h a d a ni n t e r m e d i a t e f r a c t i o n o f k n o t t e d m o l e c u l e s .

A l l e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d a b o v e were p e r f o r m e d a t l e a s t t w i c e . A g e o fa p h a g e p r e p a r a t i o n d i d not a l t e r t h e f r a c t i o n o f k n o t t e d m o l e c u l e s .C o n c u r r e n t a n a l y s e s o f p h a g e DNA b y a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s s u g g e s t e dt h a t t h e d i f f u s e s m e a r o f k n o t t e d DNA p r e v i o u s l y r e p o r t e d ( 5 ) i n c r e a s e d i nc o n j u n c t i o n w i t h t h e i n c r e a s e d f r a c t i o n o f k n o t t e d m o l e c u l e s s e e n b ye l e c t r o n m i c r o s c o p y , b u t t h e s e f i n d i n g s were n o t f u r t h e r q u a n t i t a t e d .

DISCUSSIONO u r s t u d i e s i n d i c a t e t h a t t h e p r e d o m i n a n t f o r m o f DNA i s o l a t e d f r o mi n t a c t P 4 v i r l d e l l O p h a g e p a r t i c l e s i s a c o m p l e x k n o t . T h e m a j o r i t y o fD N A m o l e c u l e s i s o l a t e d f r o m p a r t i c l e s o f o n e o t h e r v i r u s , t h e c a u l i f l o w e rm o s a i c v i r u s , a r e a l s o k n o w n t o b e k n o t t e d ( 2 0 , 2 1 , 2 2 , 2 3 ) .

We f o u n d t h e f r a c t i o n o f k n o t t e d P 4 v i r l d e l l O DNA m o l e c u l e s e x t r a c t e df r o m i n t a c t p h a g e p a r t i c l e s t o b e s u b s t a n t i a l l y h i g h e r t h a n t h e 2 0 % t h a tw a s e s t i m a t e d p r e v i o u s l y ( 5 ) . T h i s d i f f e r e n c e l i k e l y r e s u l t e d f r o md i f f e r e n c e s e i t h e r i n m e t h o d s o f q u a n t i t a t i o n ( f o r m a m i d e v s . a q u e o u sp r e p a r a t i o n o f DNA f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y ; e l e c t r o n m i c r o s c o p y v s . a g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ) o r i n m e t h o d s o f DNA i s o l a t i o n . T h e i n c r e a s e df r a c t i o n o f k n o t t e d m o l e c u l e s s e e n w i t h t h e f o r m a m i d e m e t h o d o f p r e p a r a t i o nf o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y m i g h t r e p r e s e n t p r e f e r e n t i a l ret ent i on o f k n o t t e df o r m s i n t h e p r o t e i n f i l m ; t h i s p o s s i b l i t y s e e m s u n l i k e l y , h o w e v e r , b e c a u s el i n e a r m o l e c u l e s g e n e r a t e d b y h e a t t r e a t m e n t o f t h e DNA p r i o r t o s p r e a d i n ga p p e a r e d t o b e p r e s e n t i n t h e s a m e h i g h c o n c e n t r a t i o n a s t h e k n o t t e d f o r m sseen p r i o r t o h e a t t r e a t m e n t .

How a n d w h y k n o t t e d v i r a l DNA i s f o r m e d i s u n k n o w n . F o r P 4 v i r ld e l l O , w h e t h e r t h e DNA m o l e c u l e within t h e p h a g e p a r t i c l e i s k n o t t e d o r i sp a c k a g e d s u c h t h a t k n o t t i n g o c c u r s u p o n i s o l a t i o n i s a l s o n ot k n o w n . I fo n e a s s u m e s t h a t i n f e c t i o u s P 4 p a r t i c l e s c o n t a i n k n o t t e d D N A , u n k n o t t i n gm i g h t occur e i t h e r d u r i n g i n j e c t i o n o f DNA o r , f o l l o w i n g i n j e c t i o n , b y t h ea c t i o n o f an u n k n o t t i n g e n z y m e s u c h a s DNA g y r a s e ( 2 4 ) . A l t e r n a t i v e l y ,p h a g e p a r t i c l e s c o n t a i n i n g k n o t t e d DNA may not b e i n f e c t i o u s . H o w e v e r ,b e c a u s e P 4 v i r l d e l l O a n d P 4 v i r l d e l 2 g i v e l a r g e r a v e r a g e p h a g e b u r s ts i z e s i n a s h o r t e r p e r i o d o f t i m e t h a n P 4 v i r l , i t w o u l d s e e m l e s s l i k e l yt h a t k n o t t i n g i s a s s o c i a t e d w i t h n o n - v i a b l e p h a g e ( R i c h a r d G o l d s t e i n ,

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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c hp e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) .

How m i g h t k n o t t i n g r e l a t e t o c u r r e n t u n d e r s t a n d i n g o f t h e a r r a n g e m e n to f DNA i n s i d e t h e h e a d o f P 4 ? P a c k i n g o f DNA i n t h e h e a d s o f i s o m e t r i cp h a g e s s u c h a s l a m b d a , P 2 2 , P 2 , P 4 , a n d T 4 a p p r o x i m a t e s t h a t o f a s t r i n gt i g h t l y w o u n d i n a c o n c e n t r i c s p o o l with a d j a c e n t s t r a n d s i n a p a r a l l e lo r i e n t a t i o n ( 2 5 , 2 6 , 2 7 , 2 8 ) . I n a d d i t i o n , f o r l a m b d a , P 2 , a n d P 4 , a u n i q u ee n d o f t h e DNA m o l e c u l e i s i n p r o x i m i t y t o t h e p h a g e t a i l ( 2 9 , 3 0 , 3 1 , 3 2 , 3 3 ) .H a r r i s o n ( 3 4 ) h a s i n c o r p o r a t e d t h e s e o b s e r v a t i o n s i n t o a m o d e l f o r p a c k i n go f DNA i n a n u n k n o t t e d f o r m w h i c h mi ni mizes t h e c h a n c e o f e n t a n g l e m e n td u r i n g u n p a c k i n g . C e n t r a l t o h i s m o d e l i s t h e a n c h o r i n g o f t h e l e a d i n g e n do f t h e l i n e a r DNA m o l e c u l e near t h e e n t r y p o i n t i n t o t h e h e a d . T h e DNAm o l e c u l e t h e n e n t e r s t h e p h a g e h e a d p a r a l l e l t o t h e l o n g a x i s o f t h ep a r t i c l e a n d a d d s s u c c e s s i v e w i n d i n g s t o t h e d i s t a l e n d o f t h e g r o w i n gs p o o l . T h i s m o d e l c o u l d account f o r f o r m a t i o n o f c o m p l e x k n o t s s u c h a st h o s e i s o l a t e d f r o m t a i l l e s s p a r t i c l e s o f P 4 a n d P 2 , i f o n e p o s t u l a t e ss p a t i a l p r o x i m i t y o f t h e l e a d i n g a n d t r a i l i n g e n d s o f t h e DNA m o l e c u l ep a c k e d i n t h e p h a g e h e a d ; d u r i n g e x t r a c t i o n o f t h e DNA f r o m t h e p h a g ep a r t i c l e , c o h e s i v e e n d s c o u l d p a s s t h r o u g h t h e DNA s p o o l a n d p r o d u c e a k n o tupon b a s e p a i r i n g ( a p o s s i b i l i t y o r i g i n a l l y p o i n t e d out b y R . S t r o u d ( 3 5 ) ] .A s i m i l a r s e q u e n c e o f event s c o u l d g e n e r a t e our f i n d i n g s f o r i n t a c t P 4 v i r ld e l l O p h a g e s . I t h a s b e e n n o t e d ( 6 ) t h a t t h e a n c h o r i n g o f a n e n d o f t h eDNA m o l e c u l e i n t h e P 2 p h a g e p a r t i c l e ( 3 0 ) m a y b l o c k j o i n i n g o f t h ec o h e s i v e e n d s a n d t h u s p r e v e n t t h e f o r m a t i o n o f k n o t t e d m o l e c u l e s .

F o r t h e t h r e e P 4 p h a g e m u t a n t s s t u d i e d , a n a l y s i s b y e l e c t r o nm i c r o s c o p y r e v e a l e d t h a t a d e c r e a s e i n t h e f r a c t i o n o f k n o t t e d DNAm o l e c u l e s i s o l a t e d w a s a s s o c i a t e d w i t h a d e c r e a s e i n s i z e o f d e l e t i o n .S u c h a c o r r e l a t i o n m i g h t b e e x p e c t e d . DNA mol ec ul es o f p h a g e s l a m b d a a n dP 2 2 , a n d p r e s u m a b l y P 2 a n d P 4 , are k n o w n t o b e t i g h t l y p a c k e d i n s i d e t h ep h a g e h ead ( 2 7 , 2 8 ) . For p a c k a g e d deleted g e n o m e s o f l a m b d a , h o w e v e r , thed i s t a n c e b e t w e e n a d j a c e n t DNA h e l i c e s i s i n c r e a s e d ( 2 8 ) , a n d t h e m o t i o n o fDNA i s g r e a t e r ( 3 6 , 3 7 ) t h a n t h a t o f p a c k a g e d w i l d - t y p e g e n o m e s , i n d i c a t i n gl e s s c o n s t r a i n t o f d e l e t e d DNA w i t h i n t h e p h a g e p a r t i c l e . S u c h r e d u c e dc o n s t r a i n t . i f p r e s e n t i n d e l e t e d P 4 DNA within p a r t i c l e s , m i g h t f a c i l i t a t ee n t a n g l e m e n t o f s t r a n d s a n d t h u s l e a d t o i n c r e a s e d k n o t t i n g . Ana l t e r n a t i v e e x p l a n a t i o n f o r v a r i a t i o n s i n k n o t t i n g i s t h a t d e l e t e ds e q u e n c e s e i t h e r c o d e f o r f a c t o r s o r p r o v i d e f o r b i n d i n g o f f a c t o r s whichd e c r e a s e k n o t f o r m a t i o n ; t h i s e x p l a n a t i o n s e e m s l e s s l i k e l y , h o w e v e r ,b e c a u s e s e q u e n c e s d e l e t e d i n P 4 v i r l d e l l O a n d P 4 v i r l d e l 2 d o n o t o v e r l a p

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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c hb u t s t i l l w ere assoc i at ed w i t h a n i nc re as ed f ra ct io n o f knot t ed m o l e c u l e s .

An i m p o r t a n t q ue st io n r ai se d i n rec ent s t u d i e s o f l ambd a a n d otherp h a g e s i s w h et h er i n t e r p a r t i c l e variation i n pac kagi ng o f DNA m o l e c u l e se x i s t s within a popul at i on o f genet i c al l y h om og en eo us p ha ge p ar ti cl es( 3 5 , 3 6 , 3 8 , 3 9 ) . I t s e e m s p o s s i b l e t h a t t h e m a rk e d h e te r og e ne i ty i nextension o f h i g h l y k n o t t e d P 4 DNA m o l e c u l e s o b s e r v e d b y electronmi c rosc opy ( F i g u r e 1 ) represent s vari at i on a m o n g DNA molecules i ncomplexity o f k n o t t i n g , a n d t h a t s u c h vari at i on i s a refl ec t i on o fh et erogenei t y a m o n g p h a g e p a r t i c l e s i n pac kagi ng o f D N A .

ACKNOWLEDGEMENTSWe w i s h t o t h a n k R i c h a r d Goldstein a n d D a v i d Kurni t f o r helpfuld i s c u s s i o n s a n d c r i t i c a l r e v i e w s o f t h e m a n u s c r i p t , Roger C . Levesque f o r

a s s i s t a n c e with r e s t r i c t i o n e n z y m e a n a l y s e s , a n d R i c h a r d G o l d s t e i n , RosalbaL a g o s , T a d G o t o , a n d J a m e s C . Wang f o r b a c t e r i o p h a g e s a n d bacterials t r a i n s . We a r e g r a t e f u l t o R o m a i n e R . B r u n s a n d J e r o m e G r o s s o f t h eLovett Memorial G r o u p D e v e l o p m e n t a l B i o l o g y L a b o r a t o r y , MassachusettsG e n e r a l H o s p i t a l , f o r t h e u s e o f t h e i r e l e c t r o n microscope f a c i l i t y( s u p p o r t e d i n p a r t b y P r o g r a m P r o j e c t Am 3 5 6 4 f r o m t h e National Instituteo f A r t h r i t i s , D i a b e t e s , D i g e s t i v e , a n d Kidney D i s e a s e s ) . E mm a T en ie re ll op r o v i d e d v a l u a b l e t e c h n i c a l a s s i s t a n c e . J S W was a Fel l ow o f t h e Ch arl es A .K i n g T r u s t , B o s t o n , M a s s a c h u s e t t s . T h i s work wa s s up po rte d i n part b y Ne wI n v e s t i g a t o r R e s e a r c h Award 1 R 2 3 A I 1 9 4 5 2 f r o m t h e Na t io n a l I ns t it ut e s o fA l l e r g y a n d I n f e c t i o u s D i s e a s e s t o J S W .

* T o whom c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e a d d r e s s e dREFERENCES

1 . I n m a n , R . B . , S c h n o s , M . , S i m o n , L . D . , S i x , E . W . a n d W a l k e r , D . H .( 1 9 7 1 ) V i r o l o g y 4 4 , 6 7 - 7 2 .2 . W a n g , J . C . , M a r t i n , K . V . a n d C a l e n d a r , R . ( 1 9 7 3 ) B i o c h e m i s t r y 1 2 ,2 1 1 9 - 2 1 2 3 .3 . S i x , E . W . a n d K l u g , C . A . C . ( 1 9 7 3 ) V i r o l o g y 5 1 , 3 2 7 - 3 4 4 .4 . S i x , E . W . ( 1 9 7 5 ) V i r o l o g y 6 7 , 2 4 9 - 2 6 3 .5 . L i u , L . F . , D a v i s , J . L . a n d C a l e n d a r , R . ( 1 9 8 1 ) N u c l e i c Acids Res. 9 ,3 9 7 9 - 3 9 8 9 .6 . L i u , L . F . , P e r k o c h a , L . , C a l e n d a r , R . a n d W a n g , J . C . ( 1 9 8 1 ) P r o c .N a t l . A c a d . S c i . USA 7 8 , 5 4 9 8 - 5 5 0 2 .7 . B e r t a n i , L . E . ( 1 9 6 4 ) B i o c h i m . B i o p h y s . Acta 8 7 , 6 3 1 - 6 4 0 .8 . L a g o s , R . a n d G o l d s t e i n , R . ( 1 9 8 4 ) J . B a c t e r i o l . 1 5 8 , 2 0 8 - 2 1 4 .9 . W i m a n , M . , B e r t a n i , G . , K e l l y , B . a n d S a s a k i , I . ( 1 9 7 0 ) Molec. G e n .G e n e t . 1 0 7 , 1 - 3 1 .

6 7 0 1


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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h1 0 . K a h n , M . , O w , D . , S a u e r , B . , R a b i n o w i t z , A . a n d C a l e n d a r , R . ( 1 9 8 0 )M o l e c . G e n . G e n e t . 1 7 7 , 3 9 9 - 4 1 2 .1 1 . S h o r e , D . , D e h o , G . , Tsipis, J . a n d G o l d s t e i n , R . ( 1 9 7 8 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 7 5 , 4 0 0 - 4 0 4 .1 2 . K a h n , M . a n d H o p k i n s , A . ( 1 9 7 8 ) V i r o l o g y 8 5 , 3 5 9 - 3 6 3 .1 3 . S o u z a , L . , G e i s s e l s o d e r , J . , H o p k i n s , A . a n d C a l e n d a r , R . ( 1 9 7 8 )V i r o l o g y 8 5 , 3 3 5 - 3 4 2 .1 4 . C a l e n d a r , R . , L j u n d q u i s t , E . , D e h o , G . , U s h e r , D . , G o l d s t e i n , R . ,Y o u d a r i a n , P . , S i r o n i , G . a n d S i x , E . ( 1 9 8 1 ) V i r o l o g y 1 1 3 , 2 0 - 3 8 .1 5 . G o l d s t e i n R . , S e d i v y , J . a n d L j u n d q u i s t , E . ( 1 9 8 2 ) P r o c . N a t l . A c a d .S c i . USA 7 9 , 5 1 5 - 5 1 9 .1 6 . L i n , C . (184) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 2 , 8 6 6 7 - 8 6 8 4 .1 7 . D a v i s , R . W . , S i m o n , M . a n d D a v i d s o n , N . ( 1 9 7 1 ) In M e t h o d s i nE n z y m o l o g y , e d s . , G r o s s m a n , L . a n d M o l d a v e , L . , V o l . 2 1 , p p . 4 1 3 - 4 2 8 ,A c a d e m i c P r e s s , Ne w Y o r k .1 8 . H o o p e r , D . C . , W o l f s o n , J . S . , M c H u g h , G . L . , W i n t e r s , M.B. a n d S w a r t z ,

M . N . ( 1 9 8 2 ) A n t i m i c r o b . Agents C h e m o t h e r . 2 2 , 6 6 2 - 6 7 1 .1 9 . R a i m o n d i , A . , D o n g h i , R . , M o n t a g u t i , A . , P e s s i n a , A . a n d D e h o , G .( 1 9 8 5 ) J . V i r o l . 5 4 , 2 3 3 - 2 3 5 .2 0 . M e n i s s i e r , J . , d e M u r c i a , G . , L e b e u r i e r , G . a n d H i r t h , L . ( 1 9 8 3 ) E M B OJ . 2 , 1 0 6 7 - 1 0 7 1 .2 1 . C i v e r o l o , E . L . a n d Lawson, R . H . ( 1 9 7 8 ) P h y t o p a t h o l o g y 6 8 , 1 0 1 - 1 0 9 .2 2 . V o l o v i t c h , M . , D r u g e o n , G . a n d Y o t , P . ( 1 9 7 8 ) N u c l e i c s A c i d R e s . 5 ,2 9 1 3 - 2 9 2 5 .2 3 . R i c h i n s , R . D . a n d S h e p h e r d , R . J . ( 1 9 8 3 ) V i r o l o g y 1 2 4 , 2 0 8 - 2 1 4 .2 4 . G e l l e r t , M . ( 1 9 8 1 ) A n n . R e v . B i o c h e m . 5 0 , 8 7 9 - 9 1 0 .2 5 . R i c h a r d s , K . E . , W i l l i a m s , R . C . a n d C a l e n d a r , R . ( 1 9 7 3 ) J . M o l . B i o l .7 8 , 2 5 5 - 2 5 9 .2 6 . E a r n s h a w , W . C . , K i n g , J . , H a r r i s o n , S . C . a n d E i s e r l i n g , F . A . ( 1 9 7 8 )C e l l 1 4 , 5 5 9 - 5 6 8 .2 7 . E a r n s h a w , W . C . , C a s j e n s , S . R . a n d H a r r i s o n , S . C . ( 1 9 7 6 ) J . M o l . B i o l .1 0 4 , 3 8 7 - 4 1 0 .2 8 . E a r n s h a w , W . C . a n d H a r r i s o n , S . C . ( 1 9 7 7 ) Nature ( L o n d o n ) 2 6 8 , 5 9 8 - 6 0 2 .2 9 . P a d m a n a b h a n , R . , W u , R . a n d B o d e , V . C . ( 1 9 7 2 ) J . M o l . B i o l . 6 9 ,2 0 1 - 2 0 7 .3 0 . C h a t t o r a j , D . K . a n d I n m a n , R . B . ( 1 9 7 4 ) J . M o l . B i o l . 8 7 , 1 1 - 2 2 .3 1 . S a i g o , K . a n d U c h i d a , H . ( 1 9 7 4 ) V i r o l o g y 6 1 , 5 2 4 - 5 3 6 .3 2 . T h o m a s , J . 0 . ( 1 9 7 4 ) J . M o l . B i o l . 8 7 , 1 - 9 .3 3 . T h o m a s , J . 0 . , S t e r n b e r g , N . a n d W e i s b e r g , R . ( 1 9 7 8 ) J . M o l . B i o l . 1 2 3 ,1 4 9 - 1 6 1 .3 4 . H a r r i s o n , S . C . ( 1 9 8 3 ) J . M o l . B i o l . 1 7 1 , 5 7 7 - 5 8 0 .

3 5 . H a a s , R . , M u r p h y , R . F . a n d C a n t o r , C . R . ( 1 9 8 2 ) J . M o l . B i o l . 1 5 9 ,7 1 - 9 2 .3 6 . W i d o m , J . a n d B a l d w i n , R . L . ( 1 9 8 3 ) J . M o l . B i o l . 1 7 1 , 4 1 9 - 4 3 7 .3 7 . A s h i k a w a , I . , F u r u n o , T . , K i n o s i t a , K . I k e g a m i , A . , T a k a h a s h i , H . andA k u t s u , H . ( 1 9 8 4 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 8 3 3 8 - 8 3 4 4 .3 8 . H a l l , S . B . a n d S c h e l l m a n , J . A . ( 1 9 8 2 ) Bio p oly m ers 2 1 , 1 9 9 1 - 2 0 1 0 .3 9 . H a l l , S . B . a n d S c h e l l m a n , J . A . ( 1 9 8 2 ) B i o p o l y m e r s 2 1 , 2 0 1 1 - 2 0 3 1 .

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John S.Wolfson, Gail L.McHugh, David C.Hooper and Morton N.Swartz- Knotftng of DNA molecules isolated from deletion mutants of intact bacteriophage P4