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1/7
V o l . 1 4 6 , N o . 2OURNAL O F B A C T E R I O L O G Y , May
1 9 8 1 , p . 5 6 4 - 5 7 00 0 2 1 - 9 1 9 3 / 8 1 / 0 5 0 5 6 4 -
0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0
T r a n s f o r m a t i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i :
S t a g e s i n t h e P r o c e s sH . E . N . BERGMANS,* I . M.
VAN D I E , AND W. P . M. HOEKSTRAD e p a r t m e n t o f M o l e c
u l a r C e l l B i o l o g y , S t a t e U n i v e r s i t y o f U
t r e c h t , 3 5 8 4 C H , U t r e c h t , T h e N e t h e r l a n
d s
R e c e i v e d 3 0 O c t o b e r 1 9 8 0 / A c c e p t e d 1 1
F e b r u a r y 1 9 8 1T r a n s f o r m a t i o n e x p e r i m e
n t s w i t h E s c h e r i c h i a c o l i r e c i p i e n t c e l
l s a n d l i n e a rc h r o m o s o m a l d e o x y r i b o n u c
l e i c a c i d (DNA) a r e r e p o r t e d . E . c o l i c a n b e
r e n d e r e dc o m p e t e n t f o r DNA u p t a k e b y a t e m
p e r a t u r e s h o c k ( 0 C - * 4 2 ' C 0 C ) o f t h er e c i
p i e n t c e l l s i n t h e p r e s e n c e o f a h i g h c o n c
e n t r a t i o n o f e i t h e r C a 2 + o r M g 2 + i o n s .U p
t a k e o f DNA i n t o a d e o x y r i b o n u c l e a s e - r e s
i s t a n t f o r m , f o r w h i c h t h e p r e s e n c eo f C a
2 " i s e s s e n t i a l , was p o s s i b l e d u r i n g t h e t
e m p e r a t u r e s h o c k b u t a p p e a r e d t oo c c u r m
o s t r e a d i l y a f t e r t h e h e a t s h o c k d u r i n g i
n c u b a t i o n a t 0 C . When DNA
w a s a d d e d t o c e l l s t h a t h a d b e e n h e a t s h
o c k e d i n t h e p r e s e n c e o f d i v a l e n t c a t i o n
so n l y , DNA u p t a k e a l s o o c c u r r e d . T h i s s u g
g e s t s t h a t c o m p e t e n c e i n d u c t i o n a n du p t
a k e may b e r e g a r d e d a s s e p a r a t e s t a g e s . U n
d e r c o n d i t i o n s u s e d t o i n d u c ec o m p e t e n c
e , w e o b s e r v e d a n e x t e n s i v e r e l e a s e o f p e
r i p l a s m i c e n z y m e s , p r o b a b l yr e f l e c t i n
g membrane d a m a g e i n d u c e d d u r i n g d e v e l o p m e
n t o f c o m p e t e n c e . A f t e rt h e c o n v e r s i o n o
f d o n o r DNA i n t o a d e o x y r i b o n u c l e a s e - r e s
i s t a n t f o r m , t r a n s f o r m -a n t s c o u l d b e s e
l e c t e d . I t a p p e a r e d t h a t i n c u b a t i o n , b e
f o r e p l a t i n g , o f t h e t r a n s -f o r m a t i o n m i
x t u r e i n a medium c o n t a i n i n g h i g h C a 2 ' a n d M
g 2 + c o n c e n t r a t i o n sa n d s u p p l e m e n t e d w i
t h a l l g r o w t h r e q u i r e m e n t s i n c r e a s e d t h
e t r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c y . T h i s i n c u b
a t i o n p r o b a b l y c a u s e s r e c o v e r y o f p h y s i
o l o g i c a l l y l a b i l ec e l l s .U p t a k e o f f r e e
DNA b y E s c h e r i c h i a c o l i c a no n l y b e a c h i e v
e d when t h e r e c i p i e n t c e l l s h a v eb e e n made " c
o m p e t e n t , " e i t h e r b y t u r n i n g t h e mi n t o s
p h e r o p l a s t s ( u s e f u l o n l y i n t r a n s f e c t i
o n , s e er e f e r e n c e 2 ) o r b y a h e a t s h o c k i n t
h e p r e s e n c eo f C a 2 " i o n s , a s f i r s t r e p o r t
e d b y M a n d e l a n dH i g a ( 1 4 ) . S e v e r a l m o d i f
i c a t i o n s o f t h e l a t t e rm e t h o d a r e now w i d e
l y u s e d f o r t r a n s f o r m a t i o no f E . c o l i w i t
h p l a s m i d DNA ( 4 , 7 , 1 1 , 1 2 ) . I t h a sb e e n s h o
w n t h a t C a 2 + - t r e a t e d c e l l s c a n b e t r a n s
-f o r m e d a l s o w i t h c h r o m o s o m a l DNA ( 1 7 , 2 9
) . I n
t h a t c a s e , a s i g n i f i c a n t n u m b e r o f t r a
n s f o r m a n t sw e r e o b t a i n e d o n l y when r e c i p i
e n t c e l l s w e r eu s e d t h a t l a c k e d r e c B C n u c
l e a s e a c t i v i t y a n dh a d b e e n r e n d e r e d r e c
o m b i n a t i o n p r o f i c i e n t b ya n s b c m u t a t i o
n . The f a c t t h a t R e c + ( r e c B Cn u c l e a s e - p r o
f i c i e n t ) c e l l s y i e l d v e r y f e w t r a n s -f o r
m a n t s i s p r o b a b l y d u e t o e f f e c t s t h a t o c c
u ra f t e r DNA a d s o r p t i o n a n d u p t a k e . T h e r e
i s g e -n e t i c e v i d e n c e t h a t p a r t i a l d e g r a
d a t i o n o f d o n o rc h r o m o s o m a l DNA b y r e c B C n
u c l e a s e i s r e s p o n -s i b l e f o r t h e r e d u c t i
o n o f t r a n s f o r m a t i o n f r e -q u e n c i e s i n R e
c + c e l l s ( 9 ) .The o r i g i n a l p r o t o c o l s f o r t
r a n s f o r m a t i o n o fE . c o l i w i t h c h r o m o s o m
a l DNA ( 1 7 , 2 9 ) e s s e n -t i a l l y i n v o l v e d C a 2
+ p r e t r e a t m e n t o f E . c o l i c e l l sa t 0 C a n d h
e a t s h o c k o f t h e c e l l s i n t h e p r e s e n c eo f C
a 2 " a n d p u r i f i e d d o n o r D N A . T r a n s f o r m a n
t sw e r e s u b s e q u e n t l y s e l e c t e d o n p l a t e s
c o n t a i n i n gs o d i u m c i t r a t e t o b i n d e x c e s
s C a 2 + i o n s .
W e r e c e n t l y d e s c r i b e d a m o d i f i e d p r o c
e d u r et h a t y i e l d s a s i g n i f i c a n t l y h i g h e
r t r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c y ( 2 0 ) . The m a i
n m o d i f i c a t i o n s a r e : ( i )n o e x t e n s i v e p r
e t r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h C a 2 " ,( i i ) t
h e p r e s e n c e o f M g 2 " i o n s a s w e l l a s C a 2 +d u
r i n g t h e w h o l e t r a n s f o r m a t i o n p r o c e d u r
e , a n d( i i i ) t h e u s e o f s e l e c t i v e p l a t e s t
h a t c o n t a i n C a 2 "a n d M g 2 + i o n s , a l o w c o n c
e n t r a t i o n o f p h o s p h a t e ,a n d n o s o d i u m c i
t r a t e . I t i s n o t c l e a r w h y t h e s em o d i f i c a
t i o n s i n c r e a s e t h e t r a n s f o r m a t i o n f r e
-q u e n c y . I n t h i s r e p o r t w e d e s c r i b e a s e r
i e s o fe x p e r i m e n t s t h a t g i v e more i n s i g h t i
n t o t h e com-p l i c a t e d E . c o l i t r a n s f o r m a t i
o n s y s t e m .
MATERIALS AND M E TH O D SB a c t e r i a . A l l s t r a i n s
w e r e E . c o l i K - 1 2 d e r i v a t i v e s .P C 0 0 3 1 i s
a p r o t o t r o p h i c s t r a i n . AM1095 ( l e u p d x Aa r a
c a r t h i h i s t r p r e c B 2 1 r e c C 2 2 s b c B 1 5 ) i s a
t r a n s -f o r m a b l e s t r a i n , d e s c r i b e d p r e v
i o u s l y ( 1 0 ) . AM1283 i sa d e r i v a t i v e o f AM1170 (
A M 1 0 9 5 r p o B ) c a r r y i n g p l a s -m i d R l d r d - 1
9 ( A p r ) ( 1 ) .Media and b u f f e r s . P h o s p h a t e - b
a s e d m i n i m a ls a l t s medium w a s a s d e s c r i b e d p
r e v i o u s l y ( 3 0 ) . I n t h eT r i s - b a s e d m i n i m
a l s a l t s m e d i u m , p h o s p h a t e b u f f e rw a s r e
p l a c e d b y T r i s - h y d r o c h l o r i d e b u f f e r ( 1
. 2 x 1 0 - '
M , pH 7 . 0 ) . I n m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o
n i c a c i d( M O P S ) - b a s e d m i n i m a l s a l t s m e d
i u m , t h e p h o s p h a t eb u f f e r was r e p l a c e d b y
M OPS b u f f e r ( 1 . 2 x 1 0 - ' M ,pH 7 . 0 ) . M e d i a w e r
e s o l i d i f i e d w i t h 1 . 6 % a g a r .G r o w t h r e q u
i r e m e n t s w e r e a d d e d i n t h e f o l l o w i n gc o n
c e n t r a t i o n s ( m i l l i g r a m s p e r l i t e r ) : D L
- l e u c i n e , 4 0 ;D L - a r g i n i n e , 4 0 ; u r a c i l ,
2 0 ; p y r i d o x i n e , 1 0 ; D L - t r y p t o -5 6 4
-
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T R A N S F O R M A T I O N I N E . COLI 565p h a n , 4 0 ; t h
i a m i n e , 5 ; L - h i s t i d i n e , 2 0 ; g l u c o s e , 2 ,
0 0 0 . I nMOPS- o r T r i s - b a s e d m e d i u m , p h o s p h
a t e w a s a d d e d( f i n a l c o n c e n t r a t i o n , 2 x 1
0 - 4 M ) .F o r i n d u c t i o n o f , B - g a l a c t o s i d a
s e , i s o p r o p y l - f - t h i o -g a l a c t o s i d e , i n
a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 3 x 1 0 - 4 M , w a sa d
d e d t o t h e m e d i u m .DNA i s o l a t i o n . D o n o r DNA
w a s i s o l a t e d f r o ms t r a i n P C 0 0 3 1 a s d e s c r
i b e d b y C o s l o y a n d O i s h i ( 5 ) .R o u t i n e l y i
s o l a t e d DNA h a s a m o l e c u l a r w e i g h t o fa b o u
t 4 x 1 0 7 , a s i n f e r r e d f r o m s e d i m e n t a t i o n
o ns u c r o s e g r a d i e n t s w i t h X DNA a s a r e f e r e
n c e .T r a n s f o r m a t i o n p r o c e d u r e . T h e t r a
n s f o r m a t i o np r o c e d u r e u s e d i s a m o d i f i c
a t i o n o f t h e p r o c e d u r e o fR e i j n d e r s e t a l
. ( 2 0 ) . An o v e r n i g h t c u l t u r e o f t h er e c i p i
e n t c e l l s i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d m i n i m a
l s a l t sm e d i u m w a s d i l u t e d 1 : 2 0 i n t o f r e s
h m i n i m a l mediuma n d i n c ub a t e d w i t h s h a k i n g
a t 3 7 0 C u n t i l t h e c e l ld e n s i t y m e a s u r e d i
n a K l e t t - S u m m e r s o n p h o t o m e t e r( 6 5 0 - n m
f i l t e r ) r e a c h e d a v a l ue o f 3 0 . The c u l t u r e
w a sc h i l l e d , k e p t a t 0 C f o r 1 5 mm, w a s h e d o n
c e w i t h 0 . 2 5v o l u m e o f 1 0 mM N a C l , a n d s u s p e
n d e d i n 0 . 0 5 v o l u m eo f 2 0 mM HEPES ( N - 2 - h y d r o
x y e t h y l p i p e r a z i n e - N ' -e t h a n e s u l f o n i
c a c i d ) b u f f e r ( p H 6 . 0 ) a t 0 0 C . A p o r t i o n(
0 . 3 m l ) o f t h e c e l l s u s p e n s i o n ( 1 0 W v i a b l
e c e l l s ) w a sm i x e d w i t h 0 . 1 m l o f d o n o r DNA (
f i n a l DNA c o n c e n -t r a t i o n , 6 0 , u g / m l ) , a f
t e r w h i c h 0 . 1 m l o f a s o l u t i o nc o n t a i n i n g
1 5 0 mM C a C l 2 a n d 1 3 0 mM M g C l 2 w a sa d d e d . T h e
m i x t u r e w a s t h e n c a r e f u l l y m i x e d o n aV o r
t e x m i x e r a n d i n c u b a t e d f o r 1 0 m i n a t 0 C , f
o l l o w e db y 6 m i n a t 4 2 0 C a n d 6 0 m i n ( o r a d i f
f e r e n t p e r i o dw h e n i n d i c a t e d ) a t 0 0 C . When
i n d i c a t e d , u p t a k e o fd o n o r DNA w a s t e r m i n
a t e d b y i n c u b a t i n g t h e m i x t u r ew i t h 4 0 0 u
g o f p a n c r e a t i c DNase I ( E C 3 . 1 . 2 1 . 1 ; B o e h
-r i n g e r Mannheim C o r p . ) p e r m l f o r 3 0 m i n a t 0 0
C . I ns o m e e x p e r i m e n t s , t h e t r a n s f o r m a t
i o n m i x t u r e w a sf u r t h e r i n c u b a t e d f o r 1 0
m i n a t 3 7 0 C , o r t h e t r a n s f o r -m a t i o n m i x t
u r e w a s d i l u t e d 1 : 1 0 i n t o M O P S - b u f f e r e
dm i n i m a l m e d i u m c o n t a i n i n g g r o w t h r e q u
i r e m e n t s a n dw i t h C a C 1 2 a n d M g C l 2 a d d e d a
s i n d i c a t e d . P o r t i o n s o ft h e t r a n s f o r m a
t i o n m i x t u r e w e r e p l a t e d o n s e l e c t i v eT r
i s m i n i m a l m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 0
1 MC a C 1 2 a n d 0 . 0 1 M M g C l 2 . I n a l l e x p e r i m e
n t s , L e u +t r a n s f o r m a n t s w e r e s e l e c t e d .
The l e u m a r k e r u s e dr e v e r t s a t a r a t e y i e l d
i n g l e s s t h a n 1 0 - 8 r e v e r t a n t s p e rv i a b l e
c e l l . F o r e a c h s a m p l e f r o m w h i c h t r a n s f o
r m a n t sw e r e s e l e c t e d , t h e n u m b e r o f v i a b
l e c e l l s w a s d e t e r -m i n e d b y p l a t i n g s u i t
a b l e d i l u t i o n s o n t r y p t o n e a g a rp l a t e s .
D u r i n g s e v e r a l s t e p s i n t h e t r a n s f o r m a t
i o np r o c e d u r e , t h e r e i s a l o s s o f v i a b l e c
e l l s . D u r i n g t h eh e a t s h o c k i n t h e p r e s e n
c e o f C a 2 ' a n d M g 2 ' i o n s t h e r ei s a 2 5 % d e c r
e a s e . I n c u b a t i o n a f t e r t h e h e a t s h o c k f o
r9 0 m i n a t 0 0 C c a u s e s a n o t h e r 3 0 % d e c r e a s
e . T r a n s f o r -m a t i o n f r e q u e n c y was e x p r e s
s e d a s n u m b e r s o f t r a n s -f o r m a n t s p e r v i a
b l e r e c i p i e n t c e l l ., - L a c t a m a s e a s s a y .
S u s p e n s i o n s o f A M 1 2 8 3[ A M 1 0 9 5 ( R l d r d - 1
9 A p r ) ] a t t h e s a m e c e l l d e n s i t y a su s e d i n
o u r t r a n s f o r m a t i o n p r o c e d u r e c o n t a i n a
v e r yh i g h l e v e l o f , B - l a c t a m a s e a c t i v i t
y . F o r a n a s s a y u s i n g3 3 - p l s a m p l e s a n d a n
i n c u b a t i o n p e r i o d o f 5 m i n ( s e eb e l o w ) , t
h e c e l l s u s p e n s i o n s h o u l d b e d i l u t e d 1 0 -
f o l ds o a s t o c o n t a i n a m e a s u r a b l e e n z y m e
a c t i v i t y . As w ed i d n o t want t o i n c l u d e a d d i
t i o n a l d i l u t i o n s t e p s i n t h ea s s a y , b u t w
a n t e d t o k e e p t h e c e l l d e n s i t y d u r i n g t h
ea s s a y s s i m i l a r t o t h a t u s e d i n t r a n s f o r
m a t i o n e x p e r i -m e n t s , w e a s s a y e d / 8 - l a c
t a m a s e a c t i v i t i e s i n A M 1 2 8 3 -
AM1095 m i x t u r e s ( 1 : 1 0 r a t i o ) .C u l t u r e s o
f AM1283 a n d AM1095 w e r e g r o w n s e p -a r a t e l y , h a
r v e s t e d , s u s p e n d e d i n HEPES b u f f e r i n t h es
a m e manner a s i n t h e t r a n s f o r m a t i o n p r o c e d
u r e a n dt h e n m i x e d . P a r t o f t h e m i x e d - c e l
l s u s p e n s i o n wasc o n v e r t e d i n t o s p h e r o p l
a s t s b y a m o d i f i c a t i o n ( 1 3 ) o ft h e E D T A - l
y s o z y m e m e t h o d o f O s b o r n e t a l . ( 1 8 ) . , 8
-L a c t a m a s e w a s a s s a y e d a s d e s c r i b e d b y N
i k a i d o e t a l .( 1 6 ) . The r e a c t i o n m i x t u r e (
1 m l ) c o n t a i n e d 1 0 mMs o d i u m p h o s p h a t e b u f
f e r ( p H 7 . 0 ) , 0 . 8 mM a m p i c i l l i n( E n z y f a r m
) , a n d 3 3 - p l s a m p l e s f r o m s u s p e n s i o n s o
fw h o l e c e l l s , s u p e r n a t a n t s o f t h e s e a f t
e r c e n t r i f u g a t i o n ,o r s p h e r o p l a s t s . The
r e a c t i o n o c c u r r e d f o r 5 m i n a t2 8 C a n d w a s
s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f 1 m l o f as o l u t i
o n c o n t a i n i n g 1 M a c e t i c a c i d , 0 . 2 M s o d i u
mt u n g s t a t e , 0 . 2 % s o l u b l e s t a r c h , 0 . 1 8 M
I 2 , a n d 7 . 2 MK I . A f t e r 2 0 m i n o f i n c u b a t i o
n a t 2 8 C , t h e a b s o r b a n c ea t 6 2 3 nm w a s m e a s u
r e d i n a B a u s c h & Lomb S p e c -t r o n i c 7 0 0 s p e
c t r o p h o t o m e t e r . A r e a c t i o n m i x t u r e t ow
h i c h t h e " s t o p p i n g " s o l u t i o n w a s a d d e d b
e f o r e t h et e s t s a m p l e s e r v e d a s a c o n t r o l
f o r e a c h i n c u b a t i o n ., B - L a c t a m a s e a c t i
v i t i e s a r e e x p r e s s e d i n a r b i t r a r yu n i t s
, b e i n g t h e d i f f e r e n c e i n e x t i n c t i o n a t 6
2 3 nmb e t w e e n t h e c o n t r o l a n d t e s t i n c u b a t
i o n s .P - G a l a c t o s i d a s e a s s a y . , - G a l a c t
o s i d a s e was a s -s a y e d i n t o l u e n e - t r e a t e d
s a m p l e s o f s u s p e n s i o n s o fw h o l e c e l l s o r
d i r e c t l y i n s a m p l e s o f s u p e r n a t a n t s a f t
e rc e n t r i f u g a t i o n , e s s e n t i a l l y a s d e s c
r i b e d b y M i l l e r ( 1 5 ) .
R E S U L T SI n o u r b a s i c t r a n s f o n n a t i o n p r
o c e d u r e , s a l i n e -w a s h e d c e l l s f r o m a n e a
r l y - l o g a r i t h m i c c u l t u r eo f A M 1 0 9 5 , a m u
l t i a u x o t r o p h i c r e c B 2 1 r e c C 2 2s b c B 1 5 s t
r a i n , w e r e m i x e d a t 0 0 C w i t h DNAi s o l a t e d f
r o m a p r o t o t r o p h i c s t r a i n ; C a C 1 2 a n dM g C
l 2 w e r e a d d e d , a n d t h e m i x t u r e w a s s h o c k e
da t 4 2 C f o r 6 m i n , f o l l o w e d b y a 1 5 - m i n i n c
u b a -t i o n a t 0 0 C . W e o b s e r v e d t h a t t h e f r e
q u e n c y o fL e u + t r a n s f o r m a n t s w a s e n h a n c
e d b y a f a c t o r o f1 0 when t h e t r a n s f o r n a t i o n
m i x t u r e w a s p l a t e do n s e l e c t i v e T r i s - b a
s e d m i n i m a l s a l t s mediumc o n t a i n i n g 1 0 mM C a
2 " a n d 1 0 mM M g 2 " i n s t e a do f o n c o n v e n t i o n a
l p h o s p h a t e - b a s e d m i n i m a lm e d i u m . S i n c
e i n t h i s c a s e u p t a k e o f DNA wasn o t t e r m i n a t
e d w i t h D N a s e , t h e o b s e r v a t i o nc o u l d mean t
h a t t r a n s f o r n a t i o n p r o c e e d s o r maye v e n s
t a r t a f t e r t h e h e a t s h o c k . F i g u r e 1 a n d 2s
h o w i n i t i a l e x p e r i m e n t s w h i c h f u r t h e r e
l u c i d a t et h e p r o c e s s e s a f t e r t h e h e a t s h
o c k . I n F i g . 1 , t h ef r e q u e n c y o f t r a n s f o r
m a n t s r e s i s t a n t t o DNaset r e a t m e n t i s p l o t
t e d v e r s u s t h e i n c u b a t i o n t i m ea t 0 0 C a f t
e r t h e h e a t s h o c k . The DNase t r e a t -ment i f a p p l
i e d b e f o r e t h e h e a t s h o c k was s u f f i -c i e n t
t o r e d u c e t h e t r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n c y
t ol e s s t h a n l o - 7 t r a n s f o r m a n t s p e r r e c i
p i e n t c e l l .The r e s u l t s p r e s e n t e d i n F i g .
1 s u g g e s t t h a td u r i n g i n c u b a t i o n a t 0 0 C ,
DNA was s t i l l c o n -v e r t e d i n t o a D N a s e - r e s i
s t a n t f o r m , p r e s u m a b l yb y u p t a k e o f DNA i n
t o r e c i p i e n t c e l l s r e n d e r e dc o m p e t e n t b
y t h e h e a t s h o c k . I n c u b a t i o n o f t h et r a n s
f o r n a t i o n m i x t u r e a t 0 0 C f o r a d d i t i o n a
l
V O L . 1 4 6 , 1 9 8 1
-
8/6/2019 jbacter00270-0138
3/7
5 6 6 BERGMANS, VAN D I E , A N D HOEKSTRAL o 5go,4
w 2 - 0C - )c3c o
4 - ' 6 0 1 2 0 iom i n i n c . a t 0 CF I G . 1 . F r e q u e n
c y o f t r a n s f o r m a n t s r e s i s t a n t t oD N a s e ,
a t v a r i o u s t i m e s a f t e r t h e h e a t s h o c k . C e
U s o f
AM1095 w e r e c u l t i v a t e d , w a s h e d , and s u s p e
n d e d i nHEPES b u f f e r ( 0 C ) ; D N A , C a 2 + , a n d M g
2 + w e r ea d d e d a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . T h
e m i x t u r e w asi n c u b a t e d a t 4 2 0 C f o r 6 m i n a n
d t h e n f u t h e r i n c u -b a t e d a t 0 C . T i m e z e r o
i s t h e t i m e o f t r a n s f e r f r o m4 2 t o 0 C . A t t i
m e s i n d i c a t e d , p o r t i o n s o f t h e t r a i t s -f
o r m a t i o n m i x t u r e w e r e i n c u b a t e d w i t h
DNase ( 3 0m i n , 0 C ) , a f t e r w h i c h t h e f r e q u e n
c y o f L e u 4 t r a n s -f o r m a n t s p e r v i a b l e c e l
l w as d e t e r m i n e d .p e r i o d s l o n g e r t h a n 1 8 0
m i n ( u p t o 2 4 h ) e l i c i t e dn o c o n s i s t e n t i n
c r e a s e i n t h e y i e l d o f t r a n s f o r m -a n t s . F
o r p r a c t i c a l p u r p o s e s , w e u s e d an i n c u -b a
t i o n p e r i o d o f 6 0 m i n a t 0 0 C i n f u r t h e r e x p
e r -i m e n t s .I f o n e p o s t u l a t e s t h a t t r a n s f
o r m a t i o n p r o c e e d so n s u i t a b l e s e l e c t i v
e p l a t e s , i t f o l l o w s t h a t p l a t -i n g o f a t r
a n s f o r m a t i o n m i x t u r e i m p l i e s o n e moreh e a
t s h o c k , s i n c e t h e m i x t u r e k e p t a t 0 0 C i s t
h e ni n c u b a t e d a t 3 7 0 C . F i g u r e 2 i l l u s t r a
t e s t h e e f f e c to f a d e l i b e r a t e l y a p p l i e d
s e c o n d h e a t s h o c k 6 0m i n a f t e r t h e f i r s t h
e a t s h o c k a n d b e f o r e p l a t i n g .T h i s s e c o n
d h e a t s h o c k was a p p l i e d t o m i x t u r e st h a t e
i t h e r h a d o r h a d n o t b e e n t r e a t e d w i t hD N a
s e . I n b o t h c a s e s , t h e s e c o n d h e a t s h o c k h
a da s t i m u l a t i n g e f f e c t .W e c a n n o t e x c l u d
e s t i m u l a t i o n o f DNA u p -t a k e b y t h e s e c o n d
h e a t s h o c k w h e n D N a s et r e a t m e n t was o m i t t
e d ; h o w e v e r , t h e s t i m u l a t i n ge f f e c t o b s
e r v e d i n t h e e x p e r i m e n t w i t h DNaset r e a t m e
n t s h o w s t h a t t h e r e was a t l e a s t a n a d -d i t i
o n a l e f f e c t on some p r o c e s s ( e s ) a f t e r t h e c
o n -v e r s i o n o f DNA t o a D N a s e - r e s i s t a n t f o
r m . T h es t i m u l a t i n g e f f e c t w a s r a t h e r s m
a l l b u t r e p r o -d u c i b l e . I n s e v e n s e p a r a t
e e x p e r i m e n t s , we o b -s e r v e d s u c h a n e f f e c
t . The a v e r a g e s t i m u l a t i o nf a c t o r w a s 2 . 2
+ 0 . 6 .
A s p e c t s o f DNA u p t a k e . I f DNA i s t a k e nu p b y
c o m p e t e n t c e l l s i n t h e p e r i o d a f t e r t h eh
e a t s h o c k , i t s h o u l d b e p o s s i b l e t o o b t a i
n t r a n s -f o r m a n t s w h e n DNA i s a d d e d t o c e l l
s a f t e r t h eh e a t s h o c k . T h e r e s u l t s p r e s e
n t e d i n T a b l e 1( l i n e s A a n d B ) p r o v e t h a t i
n d e e d t r a n s f o r m a n t s
w e r e f o r m e d when DNA w as a d d e d a f t e r t h eh e a
t s h o c k . The h i g h t r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n
c i e so b t a i n e d when DNA w as a d d e d a f t e r t h e h e
a ts h o c k c l e a r l y s h o w t h a t c e l l s were r e n d e
r e d com-p e t e n t f o r DNA u p t a k e b y a h e a t s h o c k
i n t h ea b s e n c e o f DNA. L i n e s C t h r o u g h I o f T a
b l e 1s h o w f u r t h e r a s p e c t s o f c o m p e t e n c e
d e v e l o p -m e n t . W i t h o u t a h e a t s h o c k , t h e
r e was n o d e -t e c t a b l e amount o f t r a n s f o r m a n t
s ( l i n e C ) . Thep r e s e n c e o f e i t h e r M g 2 e o r C
a 2 ` i o n s was r e -q u i r e d d u r i n g t h e h e a t s h o
c k ( l i n e s E a n d F ) ,s i n c e a h e a t s h o c k i n t h
e a b s e n c e o f d i v a l e n tc a t i o n s w as n o t e f f e
c t i v e ( l i n e D ) . From t h er e s u l t s p r e s e n t e d
i n l i n e s F a n d G , i t a p p e a r st h a t C a ` + s h o u
l d a t l e a s t b e p r e s e n t d u r i n g t h ep o s t - h e
a t s h o c k p e r i o d . F i n a l l y , t h e r e s u l t s p r
e -s e n t e d i n l i n e s A , B , H , a n d I s h o w t h a t t
h e c e l l swere b e t t e r f i t f o r DNA u p t a k e when a c
o l ds h o c k w as a p p l i e d a f t e r t h e h e a t s h o c k
.E f f e c t o f t h e c o m p e t e n c e r e g i m e n onmembrane
i n t e g r i t y . What c o u l d b e t h e r o l eo f t h e t e m
p e r a t u r e s h o c k i n t h e p r e s e n c e o fd i v a l e
n t c a t i o n s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f c o m p e
-t e n c e ? O n e p o s s i b i l i t y i s t h a t s u c h a c o
n d i t i o na f f e c t s t h e i n t e g r i t y o f t h e i n n
e r m e m b r a n e o ro u t e r m e m b r a n e o r b o t h o f E
. c o l i . W e t e s t e dt h e e f f e c t o f o u r c o m p e t
e n c e r e g i m e n o n o u t e r
40 ,20 -
40 -2 0
E540_2 0 DNase. s ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~2 0 O J
t r a n s f .f r e q u e n c y1 1 x 1 0 5
4 x 1 0 5
K 3 x 1 0 51 x 1 0N a s eI
3 0 6 0 9 0 1 2 0m i n .F I G . 2 . E f f e c t o f a s e c o n
d i n c u b a t i o n a t h i g h t e m -p e r a t u r e o n t r a
n s f o r m a t i o n f r e q u e n c y . T h e f i g u rs h o w s
g r a p h i c d i s p l a y s o f t h e t r a n s f o r m a t i o n
p r o c e -d u r e s f o l l o w e d . Tw o t r a n s f o r m a t i
o n m i x t u r e s , c o m -p o s e d a s d e s c r i b e d i n t
h e t e x t , w e r e h e a t s h o c k e d a n ds u b s e q u e n
t l y i n c u b a t e d a t 0 C f o r 6 0 m i n . I n t h ee x p e
r i m e n t d i a g r a m m e d i n t h e u p p e r t w o g r a p h
s , o n em i x t u r e w as s p l i t and t h e n e i t h e r b r o
u g h t t o 3 7 C f o r1 0 m i n o r f u r t h e r i n c u b a t e
d a t 0 C . I n t h e e x p e r i m e n tp r e s e n t e d i n t h
e l o w e r t w o g r a p h s , DNase w a s a d d e dt o t h e o t
h e r m i x t u r e , f o U o w e d b y a 3 0 - m i n i n c u b a t
i o na t 0 C . T h e m i x t u r e w a s s p l i t a n d t h e n i
n c u b a t e de i t h e r a t 3 7 0 C f o r I D m i n o r a t 0 C
. A f t e r t h e i n c u -b a t i o n s , t h e f r e q u e n c y
o f L e u 4 t r a n s f o r m a n t s p e rv i a b l e c e U w a s
d e t e r m i n e d .
J . B A C T E R I O L .
-
8/6/2019 jbacter00270-0138
4/7
V O L . 1 4 6 , 1 9 8 1membrane i n t e g r i t y b y a s s a y
i n g t h e a p p a r e n ta c t i v i t y o f / 3 - l a c t a m a
s e i n s u s p e n s i o n s o fA M 1 2 8 3 , a d e r i v a t i v
e o f AM 1095 carrying p l a s -m i d R l d r d - 1 9 c o d i n g f
o r a p e r i p l a s m i c / 3 - l a c t a -ma se . D e g r a d a
t i o n o f a m p i c i l l i n b y s a m p l e s o ft h e s h o c
k e d c e l l s u s p e n s i o n was a s s a y e d as am e a s u r
e f o r , 8 - l a c t a m a s e a c t i v i t y . A s t h e perme-a
b i l i t y o f t h e o u t e r membrane i s t h e r a t e - d e t
e r -m i n i n m g s t e p i n t h e f t - l a c t a m a s e a s s
a y o f w h o l ec e l l s ( 1 6 , 2 8 ) , t h i s assay c a n b e
u s e d t o m e a s u r ec h a n g e s i n o u t e r membrane p e r
m e a b i l i t y . How-e v e r , i f l e a k a g e o f p e r i p l
a s m i c enzymes, i n c l u d -i n g , B - l a c t a m a s e o c c
u r s , t h i s w o u l d o b v i o u s l ye n h a n c e t h e a p
p a r e n t , B - l a c t a m a s e a c t i v i t y . Wec h e c k e
d f o r l e a k a g e o f , B - l a c t a m a s e b y a s s a y i n
gt h e , t - l a c t a m a s e a c t i v i t y i n t h e s u p e r
n a t a n t a f t e rc e n t r i f u g a t i o n o f t e m p e r a
t u r e - s h o c k e d c e l l sus-p e n s i o n s . T a b l e 2 s
h o w s t h e d r a m a t i c i n c r e a s ei n f l - l a c t a m
a s e a c t i v i t y in c e l l s u s p e n s i o n s t h a
tweretreated byacold -s heat -s cold shock int h e presence o f d i
v a l e n t c a t i o n s c o m p a r e d w i t h
T R A NSFORM AT IO N I N E . COLI 5 6 7c e l L s t h a t w e r e
n o t s h o c k e d or w e r e s h o c k e d o n l yf r o m 0 t o 4
2 0 C . S h o r t l y a f t e r t h e t e m p e r a t u r es h o c
k , t h e i n c r e a s e was m a i n l y d u e t o i n c r e a s e
dp e r m e a b i l i t y o f t h e o u t e r m e m b r a n e , b u
t a f t e r6 0 m i m o f f u r t h e r i n c u b a t i o n a t 0 0
C , t h e t o t a li n c r e a s e i n a p p a r e n t 8 6 - l a c
t a m a s e a c t i v i t y wasd u e t o enzyme t h a t h a d l e a
k e d o u t o f t h e p e r i -p l a s m .A p p a r e n t l y , m a
j o r d a m a g e o c c u r r e d t o t h eo u t e r m e m b r a n
e . T h e a p p a r e n t f l - l a c t a m a s e ac-t i v i t y a
s s a y e d 6 0 m i n a f t e r t h e c o l d - h e a t - c o l ds
h o c k a m o u n t e d t o 3 1 % ( r a n g i n g f r o m 3 0 t o 3
6 %i n d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s ) o f t h e t o t a
l B i - l a c t a -mase a c t i v i t y ( a s s a y e d i n s a m p
l e s o f t h e sames u s p e n s i o n b u t a f t e r t h e c e l
l s w e r e c o n v e r t e di n t o s p h e r o p l a s t s ) . L
e a k a g e o f c y t o p l a s m i c en-zymes d i d n o t o c c u
r u n d e r t h e s e c i r c u m s t a n c e s ,as t h e f 8 - g a
l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n t h e superna-t a n t s o
f t h e s u s p e n s i o n s o f i s o p r o p y l - f t - D - t h
i o -g a l a c t o p y r a n o s i d e - i n d u c e d c e l l s v
a r i e d f r o m 0 . 5t o 1 % o f t h e t o t a l a c t i v i t y
( a s s a y e d i n t o l u e n e -
T A B L E 1 . I n f l u e n c e o f v a r i o u s c o m p e t e
n c e r e g i m e n s o n t r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n
c yS p e c i f i c a t i o n o f t h e t r a n s f o r m a t i o n
p r o c e d u r e a
Temp t r e a t m e n t ' A d d i t i o n , r e l a t i v e o f s
h o c k , o f : R e l a t i v e t r a n s f o r m -( O C ) DNAd c a
2 + d M g e + d( A ) 0 4 2 0 B e f o r e B e f o r e B e f o r e 1
. 0( B ) 0 - 4 2 - 0 A f t e r B e f o r e B e f o r e 1 . 1( C ) 0
- 0 - s 0 B e f o r e B e f o r e B e f o r e < 0 . 0 0 1( D ) 0
42 0 B e f o r e A f t e r A f t e r < 0 . 0 0 1( E ) 0 4 2 0 A
f t e r B e f o r e A f t e r 1 . 0( F ) 0 - . 4 2 -O A f t e r A f
t e r B e f o r e 0 . 6( G ) 0 - 4 2 - s 0 A f t e r N o n e B e f
o r e 0 . 0 0 1( H ) 0 4 2 - 3 7 B e f o r e B e f o r e B e f o r
e 0 . 1( I ) 0 - 4 2 3 7 A f t e r B e f o r e B e f o r e 0 . 0 1a
D e t a i l s o f t h e b a s i c t r a n s f o r m a t i o n p r o
c e d u r e ( l i n e A ) a r e p r e s e n t e d i n t h e t e x t
.b T h e f r e q u e n c i e s a r e b a s e d o n a t l e a s t t
w o d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . T h e a b s o l u t e
f r e q u e n c y i n ( A ) a m o u n t e dt o 4 x 1 0 - 5 .' C e l
l s k e p t a t 0 0 C w e r e i n c u b a t e d a t 4 2 C f o r 6 m
i n a n d t h e n b r o u g h t a t 0 0 C o r 3 7 0 C a s i n d i c
a t e d . A f t e r 6 0m i n a t t h e l a t t e r t e m p e r a t
u r e , D N a s e w a s a d d e d , a n d t h e m i x t u r e w a s
i n c u b a t e d f o r a n o t h e r 3 0 - m i n p e r i o d .d
DNA, C a 2 + , a n d M g 2 e w e r e a d d e d e i t h e r b e f o
r e t h e t r a n s f e r t o 4 2 C o r 3 m i n a f t e r t h e t r
a n s f e r f r o m 4 2 Ct o t h e l o w e r t e m p e r a t u r e
i n l d i c a t e d i n t h e t e x t .
T A B L E 2 . I n f l u e n c e o f h e a t s h o c k o n a p p
a r e n t / 3 - l a c t a m a s e a c t i v i t y i n s u s p e n s
i o n s o f A M 1 2 8 3 0, 8 - L a c t a m a s e a c t i v i t y
b
T r e a t m e n t t 0 r m i n C t = 6 0 m i l lC e l l s u s p e
n s i o n S u p e r n a t a n t C e l l s u s p e n s i o n S u p e
r n a t a n t
1 0 m i n , 0 0 0 - 6 m i n , 4 2 0 0C 6 0 m i n , O O C 0 . 7 8
6 0 . 2 8 9 1 . 1 8 5 1 . 0 0 51 0 m i n , O 0 C 6 m i n , 4 2 C -
6 0 m i n , 3 7 0 C 0 . 1 1 1 0 . 0 4 3 0 . 1 3 6 0 . 0 3 31 6 m i
n , 0 0 C 6 0 m i n , o 0 C 0 . 1 1 6 0 . 0 2 8 0 . 1 2 6 0 . 0 3
8
a S u s p e n s i o n s ( i n HEPES b u f f e r ) o f AM1283 c e
l l s m i x e d w i t h AM1095 c e l l s were p r e p a r e d a s d
e s c r i b e d i nt h e t e x t ; 0 . 4 m l o f s u s p e n s i o
n was n i i x e d w i t h 0 . 1 m l o f C a C l 2 o r M g C l 2 ( f
i n a l c o n c e n t r a t i o n s , 3 0 a n d 2 6 mM,r e s p e c
t i v e l y ) a n d h e a t s h o c k e d a s i n d i c a t e d .E
x p r e s s e d i n a r b i t r a r y u n i t s , a s d e s c r i b
e d i n t h e t e x t .c t - 0 , T i m e o f c h i l l i n g a f t
e r i n c u b a t i o n a t 4 2 0 C ( o r t h e c o m p a r a b l e
t i m e i f no h e a t s h o c k w as a p p l i e d ) .
-
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5/7
5 6 8 BERGMANS, VAN D I E , A N D HOEKSTRAt r e a t e d c e l l
s ) i r r e s p e c t i v e o f s h o c k t r e a t m e n t .L e a
k a g e o f f l - l a c t a m a s e d e p e n d e d o n t h e p r e
s -e n c e o f e i t h e r C a 2 " o r M g 2 e i o n s o r a m i x
t u r e o ft h e s e ( T a b l e 3 ) . I n t h e a b s e n c e o f
d i v a l e n t c a t -i o n s , o n l y m i n o r l e a k a g e o
c c u r r e d . L e a k a g e o fp e r i p l a s m i c e n d o n u
c l e a s e w a s a l s o o b s e r v e d ( d e -t a i l s n o t p
r e s e n t e d ) , w h i c h s h o w s t h a t t h e e f f e c to
f t h e c o m p e t e n c e r e g i m e n i s n o t r e s t r i c t
e d t o, f - l a c t a m a s e .T h u s , t h e r e i s a c l e a r
, a l t h o u g h n o t p e r f e c t ,p a r a l l e l b e t w e e
n t h e e f f e c t o f t h e c o m p e t e n c er e g i m e n o n
t r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n c y a n d o nl e a k a g
e o f p e r i p l a s m i c e n z y m e s .P r o c e s s e i i a f
t e r DNA u p t a k e . F i g u r e 2 p r e -s e n t s a n i n i t
i a l e x p e r i m e n t i n w h i c h t h e i n c r e a s eo f t
r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n c y a f t e r a s e c o n d
h e a ts h o c k w a s d e m o n s t r a t e d . The i n c r e a s
e o b s e r v e da f t e r a s e c o n d h e a t s h o c k i n t h
e c a s e i n w h i c hDNase t r e a t m e n t h a d b e e n a p p
l i e d , i m p l i e s t h a tp r o c e s s e s o c c u r r i n g
a f t e r DNA a d s o r p t i o n a n du p t a k e a r e s t i m u
l a t e d . F i g u r e 3 g i v e s t h e r e s u l t so f a n e x
p e r i m e n t i n w h i c h t h e p a r a m e t e r s o fp o s t
- D N a s e i n c u b a t i o n w e r e e x a m i n e d i n d e t a
i l .T r a n s f o r m a t i o n w a s p e r f o r m e d a s d e s
c r i b e di n T a b l e 1 , l i n e A . A f t e r DNase t r e a t
m e n t , p o r -t i o n s o f t h e t r a n s f o r m a t i o n m
i x t u r e w e r e d i l u t e d1 : 1 0 i n t o M O P S - b u f f
e r e d m i n i m a l m e d i u m s u p -p l e m e n t e d w i t h
g r o w t h r e q u i r e m e n t s o r i n t o t h es a m e medium
a d d i t i o n a l l y s u p p l e m e n t e d w i t h1 0 mM C a C
l 2 a n d 1 0 mM M g C l 2 . A f t e r d i l u t i o n ,t h e m i x
t u r e was f u r t h e r i n c u b a t e d a t 3 7 0 C . D u r -i
n g t h e i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C i n t h e p r e s e n c e
o fC a 2 ' a n d M g 2 e i o n s , t h e n u m b e r o f v i a b l
e c e l l sr e m a i n e d c o n s t a n t , b u t t h e n u m b e
r o f t r a n s -f o r m a n t s i n c r e a s e d b y a f a c t o
r o f 2 t o 3 , r e s u l t i n gi n a r i s e i n t h e t r a n s
f o r m a t i o n f r e q u e n c y . D u r i n gt h e i n c u b a
t i o n a t 3 7 0 C i n t h e a b s e n c e o f C a 2 "a n d M g 2
e i o n s , t h e n u m b e r o f v i a b l e c e l l s d o u -b l
e d , w h e r e a s t h e n u m b e r o f t r a n s f o r m a n t s
r e -T A B L E 3 . I n f l u e n c e o f d i v a l e n t c a t i o
n s on a p p a r e n tf , - l a c t a m a s e a c t i v i t y i n s
u s p e n s i o n s o f A M 1 2 8 3 1
, B - L a c t a m a s e a c t i v i t y bt =0 m i n c t = 6 0 m
i nD i v a l e n t c a t i o n s C e l l Sue- C e l le - S u p e r
- s en S u p e r -s w e - n a t a n t u 8 e - n a t a n t
3 0 mM C a C l 2 + 2 6 0 . 4 2 8 0 . 1 3 2 0 . 7 8 6 0 . 5 4 8mM
M g C 1 2N o n e 0 . 2 1 8 0 . 0 0 8 0 . 3 3 4 0 . 0 8 65 6 mM C a
C l 2 0 . 5 0 8 0 . 1 3 6 0 . 8 0 8 0 . 6 0 25 6 mM M g C l 2 0 . 3
6 8 0 . 1 3 2 0 . 6 7 2 0 . 4 9 0a C e l l s u s p e n s i o n s (
i n HEPES b u f f e r ) o f AM1283 m i x e dw i t h AM1095 w e r e
p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t ; 0 . 4 - m
la m o u n t s o f c e l l s w e r e m i x e d w i t h 0 . 1 m l o
f C a C l 2 o r M g C l 2 o r0 . 1 m l o f b o t h t o t h e f i n
a l c o n c e n t r a t i o n s i n d i c a t e d a n d h e a ts h
o c k e d ( 1 0 mi n 0 C - 6 m i n 4 2 C -- 6 0 m i n 0 C ) .b E x
p r e s s e d i n a r b i t r a r y u n i t s , a s d e s c r i b e
d i n t h e t e x t .c t - 0 , T i m e o f c h i l l i n g a f t e
r i n c u b a t i o n a t 4 2 C .
L O 5 -
c )3m70c r 2X ~ ~ 3 ' 0 6 0 9 0 1 2 0
m i n . i n c . a t 3 7 CF I G . 3 . E f f e c t o f p o s t i n
c u b a t i o n a t h i g h t e m p e r a -t u r e o n t r a n s f
o r m a t i o n f r e q u e n c y . A t r a n s f o r m a t i o nm
i x t u r e , c o m p o s e d a s d e s c r i b e d i n t h e t e x
t , was h e a ts h o c k e d , i n c u b a t e d a t 0 C f o r 6 0
m i n , and t h e nt r e a t e d w i t h DNase ( 3 0 m i n , 0 C )
. P o r t i o n s o f t h i sm i x t u r e w e r e d i l u t e d i
n t o M O PS b u f f e r e d m i n i m a lm e d i u m t h a t was n
o t s u p p l e m e n t e d o r was s u p p l e -m e n t e d w i t
h 1 0 mM C a C l 2 and 1 0 mM M g C l 2 . T i m ez e r o i s t h e
t i m e o f d i l u t i o n i n t o M O P S - b u f f e r e d m e
-d i u m . A t t i m e s i n d i c a t e d , t h e n u m b e r o f
L e u + t r a n s -f o r m a n t s i n s a m p l e s o f t h e d i
l u t e d m i x t u r e s w a sa s s a y e d e i t h e r o n T r i
s - b u f f e r e d s e l e c t i v e p l a t e s c o n -t a i n i
n g 1 0 mM C a C l 2 a n d 1 0 mM M g C l 2 o r o n T r i s -b u f
f e r e d p l a t e s w i t h o u t a d d i t i o n a l d i v a l e
n t c a t i o n s .T r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n c i e
s a r e e x p r e s s e d a s L e u +t r a n s f o r m a n t s o b
s e r v e d p e r v i a b l e c e l l . (-@*) I n -c u b a t i o n
w i t h a d d e d C a 2 ' a n d M g 2 + ; t r a n s f o r m a n t
sw e r e p l a t e d o n m e d i u m w i t h C a 2 ' a n d M g 2 +
.(v - - ) I n c u b a t i o n w i t h C a 2 + a n d M g 2 + ; t r a
n s -f o r m a n t s w e r e p l a t e d o n medium w i t h o u t C
a 2 + a n dM g 2 + . ( A A ) I n c u b a t i o n w i t h o u t a d
d e d C a 2 + andM g 2 + ; t r a n s f o r m a n t s w e r e p l a
t e d o n medium w i t hC a 2 + a n d M g 2 + . ( A ---A ) I n c u
b a t i o n w i t h o u t C a 2 +a n d M g 2 + ; t r a n s f o r m
a n t s w e r e p l a t e d o n m e d i u mw i t h o u t C a 2 + a
n d M g 2 + .m a i n e d c o n s t a n t , r e s u l t i n g i n a
d e c r e a s e i n t r a n s -f o r m a t i o n f r e q u e n c y
. When o n e o f t h e g r o w t hr e q u i r e m e n t s ( l e u c
i n e ) w a s o m i t t e d , we o b s e r v e dn o i n c r e a s e
o f t r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n c y ( d a t an o t s
h o w n ) . A f t e r a 1 2 0 - m i n i n c u b a t i o n o f t h
et r a n s f o r m a t i o n m i x t u r e i n medium w i t h C a 2
+a n d M g 2 + , i t made n o d i f f e r e n c e w h e t h e r o r
n o tt h e p l a t i n g medium c o n t a i n e d t h e s e i o n s
.The s e c o n d h e a t s h o c k a n d t h e p o s t i n c u b a
t i o np e r i o d p r o b a b l y s e r v e a s a r e c o v e r y
s t a g e , g i v i n gt h e t r a n s f o r m e d c e l l s a n o
p t i m a l c h a n c e t o s u r -v i v e .
DISCUSSIONThe m a i n c o n c l u s i o n o f o u r s t u d y i
s t h a t i t i sp o s s i b l e t o r e n d e r E . c o l i c e l
l s c o m p e t e n t f o rDNA u p t a k e i n t h e a b s e n c e
o f DNA b y t r a n s -f e r r i n g t h e m f r o m 0 t o 4 2 0 C
, p r e f e r e n t i a l l y f o l -l o w e d b y a c o l d s h o
c k . T h i s d e v e l o p m e n t o fc o m p e t e n c e i s d e
p e n d e n t o n t h e p r e s e n c e o fC a 2 + o r M g 2 + i o
n s . DNA s u b s e q u e n t l y a d d e d t ot h e c o m p e t e
n t c e l l s i s t a k e n u p i n t o a D N a s e -
J . B A C T E R I O L .
-
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6/7
T R A N S F O R M A T I O N IN E . C O L I 569r e s i s t a n t
f o r m d u r i n g a n e x t e n d e d p e r i o d a t 0 0 C .T h
e p r e s e n c e o f C a 2 " i o n s i s e s s e n t i a l d u r i
n gDNA u p t a k e . T h i s f i t s w i t h t h e i d e a s a b o
u t t h er o l e o f C a 2 " i o n s i n t h e t r a n s f o r m a
t i o n p r o c e s s( 2 0 - 2 2 , 2 4 ) .I t s h o u l d b e m e n
t i o n e d t h a t h o m o g e n e o u sd i l u t i o n o f DNA i
n t o a s o l u t i o n c o n t a i n i n g C a 2 "i o n s , e . g
. , a d d i t i o n o f DNA t o C a 2 + - h e a t - s h o c k e dc
e l l s , i s d i f f i c u l t . W e o b s e r v e d a t e n d e n
c y o fDNA m o l e c u l e s t o " c l u m p " i n t h e p r e s e
n c e o fC a 2 " a n d i n t h e a b s e n c e o f c e l l s . I n
o u r e x p e r i -m e n t s , c a r e was t a k e n t o e n s u r
e q u i c k a n d t h o r -o u g h m i x i n g o f t h e t r a n s
f o r m a t i o n m i x t u r e . O n l yu n d e r t h e s e c o n
d i t i o n s c a n r e p r o d u c i b l e r e s u l t sb e o b t
a i n e d .S e p a r a t i o n o f a c o m p e t e n c e i n d u c
t i o n s t a g ea n d a DNA u p t a k e s t a g e c a n b e a c h
i e v e d b y t h ea d d i t i o n o f DNA a f t e r t h e h e a t
s h o c k . S u c hs e p a r a t i o n m i g h t b e a d v a n t a
g e o u s t o s t u d y d e -t a i l e d q u e s t i o n s a b o u
t E . c o l i t r a n s f o r m a t i o n ,e . g . , t h e r o l e
o f d i v a l e n t c a t i o n s i n t h e i n d u c t i o no f c
o m p e t e n c e a n d i n DNA a d s o r p t i o n a n d u p -t a
k e ( c f . t h e h y p o t h e s i s p u t f o r w a r d b y G r i
n i u s[ 8 ] ) .I n e x p e r i m e n t s i n w h i c h DNA i s a d
d e d b e f o r et h e h e a t s h o c k , t h e s e p a r a t i o
n o f c o m p e t e n c ei n d u c t i o n a n d DNA u p t a k e i
s n o t c o m p l e t e . I nt r a n s f o r m a t i o n w i t h p
l a s m i d DNA, u p t a k e o fDNA o c c u r s d u r i n g t h e h
e a t s h o c k ( O - . 4 2 0 0 )( 1 1 ) . P r e l i m i n a r y e
x p e r i m e n t s i n o u r t r a n s f o r -m a t i o n s y s t
e m s h o w e d t h a t u p t a k e o f c h r o m o -s o m a l DNA
a t a l o w c o n c e n t r a t i o n ( < 5 , u g / m l ) ,s u c
h a s i s t y p i c a l l y u s e d i n p l a s m i d t r a n s f o
r m a -t i o n , c o u l d n o t b e e n h a n c e d b y i n c u b
a t i o n a t0 0 C a f t e r t h e h e a t s h o c k . A s i m i l
a r s m a l l a m o u n to f DNA w a s t a k e n u p d u r i n g t
h e h e a t s h o c kw h e n DNA w a s a d d e d a t t h e h i g h
c o n c e n t r a t i o nu s e d i n t h e e x p e r i m e n t d e
s c r i b e d h e r e . I n t h i sc a s e , h o w e v e r , m o s
t c o n v e r s i o n o f DNA i n t o aD N a s e - r e s i s t a n
t f o r m o c c u r r e d d u r i n g i n c u b a -t i o n a t 0 0
C a f t e r t h e h e a t s h o c k ( T a b l e 1 , l i n e sA a n
d H ) . D u r i n g t h e i n d u c t i o n o f c o m p e t e n c e
,c e l l s a r e s u b j e c t e d t o t e m p e r a t u r e c h a
n g e s a n dt r e a t e d w i t h d i v a l e n t c a t i o n s .
S u c h t r e a t m e n t smay c a u s e c h a n g e s i n l i p i
d c o n f o r m a t i o n a n di n f l u e n c e t h e f u n c t i
o n a l r o l e o f l i p i d s i n t h eb i o l o g i c a l m e m
b r a n e ( 6 , 1 9 , 2 6 , 2 7 ) . The c o m b i -n a t i o n o f
t e m p e r a t u r e c h a n g e s a n d a h i g h c o n -c e n t
r a t i o n o f e i t h e r C a 2 " o r M g 2 e c o u l d l e a d t
os p e c i f i c c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n m e
m b r a n e s ,a l l o w i n g DNA u p t a k e . W h e t h e r o t
h e r c a t i o n st h a t a r e r e p o r t e d t o b e e f f e c
t i v e i n t r a n s f o r m a -t i o n , s u c h a s B a 2 " ( 2
5 ) , c a n r e p l a c e C a 2 " o r M g 2 eh a s n o t b e e n t
e s t e d i n o u r e x p e r i m e n t s .W e o b s e r v e d l e
a k a g e o f p e r i p l a s m i c e n z y m e sd u r i n g c o m
p e t e n c e i n d u c t i o n , p r o b a b l y a s a c o n -s e
q u e n c e o f o u t e r membrane d a m a g e . T h e r e i sa r e
m a r k a b l e p a r a l l e l b e t w e e n c o m p e t e n c e i
n -d u c t i o n a n d l e a k a g e o f p e r i p l a s m i c e n
z y m e s .
The r e s u l t s o f , B - l a c t a m a s e a s s a y s s h o
w e d t h a ta b o u t 3 0 % o f t h e t o t a l f , - l a c t a m
a s e a c t i v i t y wass e t f r e e f r o m t h e p e r i p l a
s m . T h i s i m p l i e s e i t h e rt h a t e a c h c e l l i s
r e n d e r e d p a r t i a l l y l e a k y o r t h a ta b o u t 3
0 % o f t h e c e l i s r e l e a s e a l l f 8 - l a c t a m a s
ea c t i v i t y i n t o t h e m e d i u m , w h e r e a s t h e r
e s t s t i l lc o n t a i n a l l , 8 - l a c t a m a s e a c t i
v i t y . The p a r a l l e l i s mb e t w e e n c o m p e t e n c
e i n d u c t i o n a n d l e a k a g e o fp e r i p l a s m i c e
n z y m e s c o u l d b e v e r y i n d i r e c t . I f3 0 % o f t
h e c e l l s r e l e a s e a l l f , - l a c t a m a s e a c t i v
i t y ,t h e y may h a v e b e e n s e v e r e l y d a m a g e d b
y t h ec o m p e t e n c e r e g i m e n . The c o m p e t e n t -
c e l l f r a c -t i o n c o u l d i n c l u d e c e l l s i n w h
i c h d a m a g e t o t h eo u t e r membrane i s more s u b t l e
t h a n i n t h e c e l l st h a t l e a k p e r i p l a s m i c e
n z y m e s . The c o m p e t e n t -c e l l f r a c t i o n i s p
r o b a b l y much s m a l l e r t h a n 3 0 % ;f r o m c o t r a n
s f o r m a t i o n d a t a o f t w o d i f f e r e n t p l a s -m
i d s ( 1 1 ) o r p l a s m i d DNA a n d c h r o m o s o m a lDNA
( 3 ) , a c o m p e t e n t f r a c t i o n o f a b o u t 1 % c o u
l db e i n f e r r e d . W e o b s e r v e d t h a t p e r i p l a
s m i c e n -d o n u c l e a s e a l s o l e a k e d f r o m c o m
p e t e n t c e l l s . A st h e r e s u l t s ( n o t s h o w n )
o f t r a n s f o r m a t i o n o f a ne n d o n u c l e a s e - d
e f i c i e n t s t r a i n w e r e s i m i l a r t o t h er e s u
l t s s h o w n f o r t h e e n d o n u c l e a s e - p r o f i c i
e n ts t r a i n , t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f e n
d o n u c l e a s ea p p a r e n t l y d o e s n o t s e e m t o i
n f l u e n c e t h e t r a n s -f o r m a t i o n p r o c e s s .
A l t h o u g h we f a v o r t h e i d e at h a t o u t e r
membrane d i s r u p t i o n i s e s s e n t i a l f o ri n d u c t
i o n o f c o m p e t e n c e i n E . c o l i , i t i s q u i t ec
l e a r t h a t t h e o u t e r m e m b r a n e i s n o t t h e o n
l yb a r r i e r f o r u p t a k e o f c h r o m o s o m a l D N A
. I ne x p e r i m e n t s i n w h i c h r e v e r t i b l e E . c
o l i s p h e r o -p l a s t s w e r e u s e d f o r t r a n s f o
r m a t i o n w i t h c h r o -m o s o m a l DNA, t h e t r a n s f
o r m a t i o n e f f i c i e n c i e sw e r e s i m i l a r t o t
h e ( r e l a t i v e l y l o w ) f r e q u e n c i e so b t a i n
e d w i t h C a 2 " - t r e a t e d c e l l s ( 2 3 ) . I f t h e c
e l l st h a t e f f i c i e n t l y t a k e u p DNA h a v e s u f
f e r e d s o m emembrane d a m a g e , i t c o u l d b e e x p e c
t e d t h a tt h e y a r e more f r a g i l e t h a n n o r m a l c
e l l s . W e h a v es h o w n t h a t p o s t i n c u b a t i o n
o f t h e t r a n s f o r m a t i o nm i x t u r e a t 3 7 0 C i n
t h e p r e s e n c e o f C a 2 ' a n dM g 2 e i o n s e n h a n c
e s t h e t r a n s f o r m a t i o n f r e -q u e n c y . T h i s
s t r o n g l y s u g g e s t s , a s s t a t e d b yK u s h n e r
( 1 2 ) , t h a t s o m e c e l l s t h a t h a v e t a k e nu p
DNA a r e n o t y e t r e a d y f o r o u t g r o w t h o ns e l e
c t i v e s o l i d m e d i u m , e s p e c i a l l y when t h e m
e -d i u m d o e s n o t c o n t a i n C a 2 ' a n d M g 2 " i o n
s .W e p r o p o s e t h a t i n o u r t r a n s f o r m a t i o n
s y s t e mt h r e e s t a g e s c a n b e d i s t i n g u i s h e
d : ( i ) i n d u c t i o no f c o m p e t e n c e b y a h e a t s
h o c k f o l l o w e d b y ac o l d s h o c k ; d u r i n g t h i
s s t a g e , l i m i t e d a m o u n t s o fDNA c a n b e t a k e
n u p ; ( i i ) DNA u p t a k e i n t o aD N a s e - r e s i s t a
n t f o r m w h i c h c a n s t a r t o r p r o c e e dd u r i n g
f u r t h e r i n c u b a t i o n a t 0 0 ; ( i i i ) p r o c e s s
e sa f t e r DNA u p t a k e ( t e n t a t i v e l y c o n s i d e
r e d r e c o v -e r y p r o c e s s e s ) .
ACKNOWLEDGMENTST h i s w o r k was s u p p o r t e d b y t h e N
e t h e r l a n d s F o u n d a t i o nf o r C h e m i c a l R e s
e a r c h ( S O N ) w i t h f i n a n c i a l a i d f r o m t h
e
V O L . 1 4 6 , 1 9 8 1
-
8/6/2019 jbacter00270-0138
7/7
570 BERGMA NS, VAN D I E , AND HOEKST R AN e t h e r l a n d s O
r g a n i z a t i o n f o r t h e A d v a n c e m e n t o f P u r e
R e -s e a r c h ( Z W O ) .E . J . J . L u g t e n b e r g i s a c
k n o w l e d g e d f o r a d v i c e a b o u t m e a -s u r e m e
n t o f p e r i p l a s m i c l e a k a g e .
L I T E R A T U R E CITED1 . B e a r d , J . P . , T . G . B . H
o w e , a n d M. H . R i c h m o n d .1 9 7 2 . P u r i f i c a t i
o n o f s e x p i l i f r o m E s c h e r i c h i a c o l ic a r r
y i n g a d e r e p r e s e d F - l i k e R - f a c t o r . J . B a
c t e r i o l .1 1 1 : 8 1 4 - 8 2 0 .2 . B e n z i n g e r , R . 1
9 7 8 . T r a n s f e c t i o n o f E n t e r o b a c t e r i a c e
a ea n d i t s a p p l i c a t i o n s . M i c r o b i o l . R e v
. 4 2 : 1 9 4 - 2 3 6 .3 . Bergman, H . E . N . , D . H . K o o i j
m a n , and W . P . M .H o e k s t r a . 1 9 8 0 . C o t r a n s f
o r m a t i o n o f l i n e a r c h r o m o -s o m a l DNA a n d p
l a s m i d DNA i n E s c h e r i c h i a c o l i .FEMS M i c r o b
i o l . L e t t . 9 : 2 1 1 - 2 1 4 .4 . C o h e n , S . N . , A .
C . Y . C h a n g , and L H s u . 1 9 7 2 . N o n -c h r o m o s o
m a l a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e i n b a c t e r i a .
G e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n o f E s c h e r i c h i a
c o l i b y R - f a c t o r DNA.P r o c . N a t l . A c a d . S c i
. U . S . A . 6 9 : 2 1 1 0 - 2 1 1 4 .5 . C o s l o y , S . D . ,
a n d M L O i s h i . 1 9 7 3 . The n a t u r e o f t h et r a n s
f o r m a t i o n p r o c e s s i n E s c h e r i c h i a c o l i K
1 2 . M o l .G e n . G e n e t . 1 2 4 : 1 - 1 0 .6 . C u l l i s ,
P . R . , a n d B . d e K r u d j f f . 1 9 7 9 . L i p i d p o l y
m o r -p h i s m a n d t h e f u n c t i o n a l r o l e s o f l i
p i d s i n b i o l o g i c a lm e m b r a n e s . B i o c h i m .
B i o p h y s . A c t a 5 5 9 : 3 9 9 - 4 2 0 .7 . D a g e r t , M
. , and S . D . E h r l i c h . 1 9 7 9 . P r o l o n g e d i n c u
b a -t i o n i n c a l c i u m c h l o r i d e i m p r o v e s t h
e c o m p e t e n c e o fE s c h e r i c h i a c o l i c e l l s .
G e n e 6 : 2 3 - 2 8 .8 . G r l n u s , L . 1 9 8 0 . N u c l e i
c a c i d t r n s p o r t d r i v e n b y i o ng r a d i e n t a c
r o s s c e l l m e m b r a n e . FEBS L e t t . 1 1 3 : 1 - 9 .9 .
H o e k s t r a , W . P . I L , J . E . N . B e r g m a n s , and E
. M LZ u i d w e g . 1 9 8 0 . R o l e o f r e c B C n u c l e a s
e i n E a c h e r i c h i ac o l i t r a n s f o r m a t i o n . J
. B a c t e r i o l . 1 4 3 : 1 0 3 1 - 1 0 3 2 .
1 0 . H o e k s t r a , W . P . M L , P . G . d e H a a n , J .
E . N . B e r g m a n D ,a n d E . I L Z u i d w e g . 1 9 7 6 . T
r a n s f o r m a t i o n i n E . c o l iK 1 2 : r e l a t i o n o
f l i n k a g e t o d i s t a n c e b e t w e e n m a r k e r s .M
o l . G e n . G e n e t . 1 4 5 : 1 0 9 - 1 1 0 .1 1 . H u m p h r
e y s , G . O . , A . W e s t o n , M . G . M . B r o w n , andJ .
R . S a u n d e r s 1 9 7 9 . P l a s m i d t r a n s f o r m a t i
o n i n E s c h -e r i c h i a c o l i , p . 2 5 4 - 2 7 9 . S . W.
G l o v e r a n d L . 0 . B u t l e r( e d . ) , T r a n s f o r m
a t i o n 1 9 7 8 . C o t s w o l d P r e s s , O x f o r d .1 2 .
K u s h n e r , S . R . 1 9 7 8 . A n i m p r o v e d m e t h o d f
o r t r a n s f o r -m a t i o n o f E a c h e r i c h i a c o l i
w i t h c o l E l d e r i v e d p l a s -m i d s , p . 1 7 - 2 3 .
I n H . W. B o y e r a n d S . N i c o s i a ( e d . ) ,G e n e t i
c e n g i n e e r i n g . E l s e v i e r / N o r t h - H o l l a n
d B i o m e d -i c a l P r o s , A m s t e r d a n L1 3 . L u g t e
n b e r g , E . J . J . , a n d R . P e te r s. 1 9 7 6 . D i s t r
i b u t i o no f l i p i d s i n c y t o p l a s m i c a n d o u t
e r m e m b r a n e s o f E s c h -e r i c h i a c o l i K 1 2 . B
i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 4 1 : 3 8 - 4 7 .1 4 . M a
n d e l , I L , and A . H i g a . 1 9 7 0 . C a l c i u m - d e p e
n d e n t b a c -t e r i o p h a g e DNA i n f e c t i o n . J . M
o l . B i o l . 5 3 : 1 5 9 - 1 6 2 .1 5 . M i l l e r , J . H . 1
9 7 2 . E x p e r i m e n t s i n m o l e c u l a r g e n e t i c s
, p .3 5 2 - 3 5 5 . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t
o r y , C o l d S p r i n gH a r b o r , N . Y .1 6 . N i k a i d o
, H . , S . A . S o n g , L . S h a l t i e l , and M. N u r m i n
e n .1 9 7 7 . O u t e r membrane o f S a l m o n e l l a . X I V .
R e d u c e dt r a n a m e m b r a n e d i f f u s i o n r a t e s
i n p o r i n - d e f i c i e n t m u -
t a n t s B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 7 6 :
3 2 4 - 3 3 0 .1 7 . O i s h l , M . , a n d S . D . C o s l o y .
1 9 7 2 . The g e n e t i c a n db i o c h e m i c a l b a s i s o
f t h e t r a n s f o r m a b i l i t y o f E s c h e r i c h i ac
o l i K 1 2 . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n .
4 9 : 1 5 6 8 -1 5 7 2 .1 8 . O s b o r n , J . , J . E . G a n d e
r , E . P a r i s i , and J . C a r s o n .1 9 7 2 . M e c h a n i
s m o f a s s e m b l y o f t he o u t e r m e m b r a n eo f S a l
m o n e l l a t y p h i m u r i u m . I s o l a t i o n a n d c h a
r a c t e r i -z a t i o n o f c y t o p l a s m i c a n d o u t e
r m e m b r a n e s . J . B i o l .C h e m . 2 4 7 : 3 9 6 2 - 3 9
7 2 .1 9 . P a p a h a d j o p u l o s , D . , W . J . V a i l , C
. N e w t o n , S . N i r , K .J a c o b s o n , G . P o s t e , a
n d R . L a z o . 1 9 7 7 . S t u d i e s o nm e m b r a n e f u s
i o n . I m . The r o l e o f c a l c i u m i n d u c e dp h a s e
c h a n g e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 6 5 : 5 7
9 - 5 9 8 .2 0 . R e i b n d e r s , B . , W. P . M . H o e k s t r
a , J . E . N . B e r g m a n s ,and I . M. van D i e . 1 9 7 9 . T
r a n s f o r m a t i o n i n E s c h e -r i c h i a c o l i , p .
1 1 3 - 1 2 1 . I n S . W. G l o v e r a n d L . 0 . B u t l e r( e
d . ) , T r a n s f o r m a t i o n 1 9 7 8 . C o t s w o l d P r e
s s , O x f o r d .2 1 . S a b e l n l k o v , A . G . , A . V . A
r d e e v a , and B . N . I l y a s h -e n o . 1 9 7 5 . E n h a n
c e d u p t a k e o f d o n o r DNA b y C a 2 "t r e a t e d E s c
h e r i c h i a c o i l c e l l s . M ol . G e n . G e n e t . 1 3
8 :3 5 1 - 5 8 .2 2 . S a b e i l d k o v , A . G . , a n d I . V .
D o m a r a d s a y . 1 9 7 9 . P r o t o nc o n d u c t o r v s c
o l d i n i n d u c t i o n o f C a " + d e p e n d e n t c o m -p
e t e n c e i n E s c h e r i c h i a c o l i . M o l . G e n . G e
n e t . 1 7 2 : 3 1 3 -3 1 7 .2 3 . S u z u k i , M . , and A . A .
S z a l a y . 1 9 7 9 . B a c t e r i a l t r a n d o r -m a t i o
n u s i n g t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n t s
d e f i c i e n ti n p e p t i d o g l y c a n s y n t h e s i s .
M e t h o d s E n z y m o l . 6 8 : 3 3 1 -3 4 2 .2 4 . T a k e t o
, A . 1 9 7 4 . S e n s i t i v i t y o f E s c h e r i c h i a c o
l i t o v i r a ln u c l e i c a c i d . V I I I . I d i o s y n c
r a s y o f C a s 2 d e p e n d e n t c o m -p e t e n c e f o r
DNA. J . B i o c h e m . 7 5 : 8 9 5 - 9 0 4 .2 5 . T a k e t o , A
. 1 9 7 5 . S e n s i t i v i t y o f E s c h e r i c h i a c o l i
t o v i r a ln u c l e i c a c i d . X . Ba2 i n d u c e d c o m p
e t e n c e f o r t r a n s f e c t -i n g DNA. Z . N a t u r f o r
s c h 3 0 b : 5 2 0 - 5 2 2 .2 6 . V an A l p h e n , L , A . V e r
k l e i j , E . B u r n e l l , a n d B . L u g -t e n b e r g . 1
9 8 0 . 3 1 P n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e a n
df r e e z e - f r a c t u r e e l e c t r o n m i c r o s c o p y
s t u d i e s o n E s c h e -r i c h i a c o l i . I I . L i p o p
o l y s a c c h a r i d e a n d l i p o p o l y s a c c h a -r i d
e - p h o s p h o l i p i d s c o m p l e x e s . B i o c h i m . B
i o p h y s . A c t a5 9 7 : 5 0 2 - 5 1 7 .2 7 . Van A l p h e n ,
L, A . V e r k l e y , J . L e u n i s s e n - B i j v e l t ,a n d
B . L u g t e n b e r g . 1 9 7 8 . A r c h i t e c t u r e o f t h
e o u t e rm e m b r a n e o f E s c h e r i c h i a c o l i . I m
. P r o t e i n - l i p o p o l y s a c -c h a r i d e c o m p l e
x e s i n i n t r a m e m b r a n e o u s p a r t i c l e s . J .B
a c t e r i o l . 1 3 4 : 1 0 8 9 - 1 0 9 8 .2 8 . V an A l p h e n
, W . , R . van B o x t e l , N . van S e l m , and B .I u g t e n
b e r g . 1 9 7 8 . P o r e s i n t h e o u t e r m e m b r a n e o
fE s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 . I n v o l v e m e n t o f p
r o t e i n s b a n d ci n t h e p e r m e a t i o n o f c e p h a
l o r i d i n e a n d a m p i c i l l i n .FEMS L e t t . 3 : 1 0 3
- 1 0 6 .2 9 . W a c k e r n a g e l , W . 1 9 7 3 . G e n e t i c
t r a n s f o r m a t i o n i n E .c o i : t h e i n h i b i t o r
y r o l e o f t h e r e c B C D N A a s e . B i o c h e m .B i o p
h y s . R e s . Commun. 5 1 : 3 0 6 - 3 1 1 .3 0 . W i n k l e r ,
K . C . , and P . G . d e H a a n . 1 9 4 8 . On t h e a c t i o no
f s u l f a n i l a m i d e . X I I . A s e t o f n o n - c o m p e
t i t i v e s u l f a n i l -a m i d e a n t a g o n i s t s f o r
E s c h e r i c h i a c o i l . A r c h . B i o c h e m .1 8 : 9 7
- 1 0 7 .
J . B A C T E R I O L .
