Biologia Molecular :

Carga alélica baja JAK2V617F – Mutaciones non-driver

Beatriz Bellosillo, Hospital del Mar, Barcelona

Carga alélica baja de JAK2V617F

Caso clínico • Enero 2015

• Paciente varón de 36 años, derivado desde Anestesia por objetivarse trombocitosis en analítica del preoperatorio

• Auxiliar de clínica No hábitos tóxicos

• Antecedentes patológicos: - SAHS severo. Portador de CPAP nocturna

• Antecedentes quirúrgicos: - Fractura de fémur por accidente de coche el 18/10/1999. Colocación clavo endomedular. Actualmente pendiente de extracción del clavo. El paciente refiere que la primera vez que le comentaron que tenia trombocitosis fue en el verano de 2014. Aporta analíticas previas: - 23/06/2014: Hb 135g/L, Hto 0,41L/L, leucocitos 8,9 x109/L, plaquetas 735x109/L. - 03/12/2014: Hb 136g/L, Hto 0,41L/L, leucocitos 7,7x109/L, plaquetas 706x109/L,

• Refiere cefalea habitual (2-3 días/set) y parestesias en dedos EESS.

• No alteraciones visuales atípicas.

• No antecedentes hemorrágicos ni trombóticos.

• No esplenomegalia.

• Estudio molecular :

– JAK2V617 – carga alélica 0,2%

• - Ecografía abdominal: no esplenomegalia - BMO: celularidad disminuida (20-30%). Serie eritroide normal, serie granulocítica normal, sin evidencia de formas inmaduras. Serie megacariocítica aumentada, con megacariocitos grandes con núcleos hiperlobulados y formación de agregados laxos. Fibrosis reticulínica grado 1.

Caso clínico

• CALR mutado (mutación tipo 2 – inserción 5 pb) – carga alélica 52% • MPL no mutado

Dx final :

TROMBOCITEMIA ESENCIAL

CALR-mutada tipo 2 + JAK2V617F 0,2%

Se realiza citorreduccción temporal con hidroxiurea por motivo de la cirugía ortopédica

Caso clínico

Gen PV TE MF

JAK2V617F 95-97 60 60

CALR 0 15-30 23-35

MPL 0 3-5 5-10

JAK2 exón12 1-2 0 0

¿Qué mutaciones génicas se deben determinar en

los pacientes con NMPs en la rutina diagnóstica?

¿Qué consideramos JAK2V617F positivo?

Lippert et al, Haematologica 2014

Existen pacientes con NMP con una carga

mutacional JAK2V617F 0,1-1%

• El diagnóstico diferencial implica:

– Analizar otros genes (CALR-MPL)

– Descartar mutaciones adicionales que puedan infraestimar

la carga alélica (PCR aleloespecífica)

• Establecer diagnóstico final integrado en base a otros

hallazgos sugestivos de NMP

Wild type

V617F

V617F C618R

C616C V617F

Mutaciones diferentes/adicionales a c.1849 G>T

Lippert et al, Haematologica 2014

Mansier et al, Leuk Lymphoma 2016 ; Usseglio et al, J Mol Diag 2016

Hallazgos Usseglio

Coexistencia de mutaciones driver en 8/103 pacientes con TE : JAK2V617F & CALR en 4 casos (% V617F: 0,06-1,96%) JAK2V617F & MPL en 4 casos (% V617F: 0,08-3,69%) JAK2V617F<4% Plaquetas > que casos con una única mutación

Coexistencia de JAK2V617F y CALR : JAK2V617F>5% 2/412 (0,5%) JAK2V617F <5% 19/133 (14%)

• 136 pacientes con JAK2V617F < 5% – 15 casos CALR mutados (11%); MAF 9-44%:

• 10 TE • 3 MFP • 2 NMP inclasificables

• No asociación con edad • Fenotipo asociado a mutación CALR

Mansier et al, Am J Hematol 2018; Haunstrup et al, Exp Hematol 2018 ;

47 pacientes con dos mutaciones driver 28 /47 (60%) JAK2V617F < 1% 17/47 (35%) JAK2V617F 1-5% 2/47 (5%) JAK2V617F > 5% Fenotipo asociado a la mutación dominante

Wu et al, Appl Immunohistochem Mol Morphol 2015

1697 estudios JAK2V617F 45 casos JAK2V617F< 5% 26 casos < 1%

Método Sensibilidad Cualitativo Cuantitativo

PCR –Alelo-específica (AS) 1-5% + ─

PCR AS Cuantitativa 0.01-0.1% + +

PCR digital 0.01% ─ +

Análisis de curvas de melting 5-10% + ─

Secuenciación Sanger 15-20% + ─

Paneles NGS 2-5% + +

Métodos para la detección de la mutación JAK2V617F

Maslah et al, Ann Hematol 2018

4,65%

0,63%

0

24

39

24

9 3

0 0 0 0 2

24

10

33

0

10

20

30

40

50

60

70

80

No mutado 0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100

CALR

MPL

UNMUTATED

JAK2 V617F

n=207

Carga alélica de JAK2V617F en TE

Experiencia del Hospital del Mar

Porcentaje de alelos JAK2V617F en granulocitos

Carga alélicas JAK2V617F <5% : 13 2 casos coexistencia mutación CALR 1 caso MPL mutado

Caso 1 : JAK2 V617 carga alélica baja Se puede hallar coexistencia de mutaciones en genes driver asociadas a la presencia de una neoplasia mieloproliferativa Esta coxistencia de mutaciones en más frecuente en paciente con carga alélica de JAK2V617 menor del 5% El fenotipo de la enfermedad suele estar asociado a la mutación predominante

Take-home messages

Mutaciones non-driver

34,32%

2,12% 05,62%

4,81%6,14%

7,96%

00

20,45%

14,42%

25,28%

00,37%

37,73%

0

06.02.06 08.11.12 15.10.13 06.05.15

JAK2V617F SRSF2 TET2 RUNX1

SMD LADX:PV

HU+AAS

AraCsc100mg/m2x5díasx4ciclosAzaci dinax32cicloshasta14.11.16

EXITUS

JAK2V617F

SRSF2

TET2

RUNX1

Varon, 68 años Dx : Policitemia vera

Mutaciones non-driver en NMP Ph-neg

Nangalia et al, NEJM 2013

Mediana número de mutaciones:

- PV: 6.5 mut/paciente

- TE: 6.5 mut/paciente

- MFP: 13 mut/paciente

N = 151

Frecuencia de mutaciones non-driver en las Neoplasias Mieloproliferativas

GEN Frec

TET2 12%

ASXL1 5%

DNMT3A 5%

TP53 4%

EZH2 4%

IDH1 3%

CBL 2%

SH2B3 ~1-2%

Lundberg et al, Blood, 2014; Tefferi et al, Blood advances, 2016

n=197 94 PV, 69 TE, 34 MF •5MFpNMP y 7 LAMs •Panel de 104 genes •37% pacientes presentaban mutaciones non-driver •Baja adquisición de mutaciones

Frecuencia de Mutaciones non-driver en las NMPs

PV TE MFP LAMpNMP

TET2 10-22% 5-16% 10-20% 20-30%

IDH 1/IDH2 1-2% 1% 3-6% 9-22%

DNMT3A 2-7% 1-6% 2-15% 3-15%

EZH2 1-3% 1-3% 5-10% 15%

ASXL1 2-12% 2-11% 13-32% 20-47%

SRSF2 3% 2% 8-15% 9-20%

SF3B1 1-2% 3-5% 4-7% 4-7%

U2AF1 <1% 1-2% 15% 5%

TP53 1% 2% 2-4% 16-27%

RUNX1 2% 1% 1-2% 17-30%

SH2B3 1-2% 1-6% 3-5% 10%

CBL 1-2% 1-2% 3-6% 4%

SETBP1 1-2% 1-2% <1% 11%

NRAS <1% <1% 4-9% 11%

Harutyunyan NEJM 2011, Vainchencker Blood 2011; Brecqueville Leukemia 2012; Nangalia NEJM 2013; Vanucchi Leukemia 2013; Lundberg Blood 2014; Guglielmelli Leukemia2014; Tefferi Blood advances 2016; Lasho Blood advances 2018.

Frecuencia de mutaciones non-driver en relación con genotipo en NMPs

Lundberg P et al, Blood, 2014

JAK2 CALR

No JAK2V617F ni CALR

• Las mutaciones non-driver son más frecuentes en pacientes JAK2+ independientemente de la enfermedad

• JAK2 se asocia con TET2, DNMT3A y ASXL1, TP53

• CALR no se asocia con mutaciones en genes de splicing

Mutaciones non-driver en NMP JAK2-mutadas

Lundberg 2014 Tefferi 2016 Delic 2016 Fernández 2018

NGS 104 genes NGS 27 genes NGS 28 genes NGS 50 genes

TE

N 41 95 21 53

No mut (%) 68.3 43.1 52.4 62.3

1 mut (%) 29.3 41 38.1 28.3

≥ 2 mut (%) 2.4 15.8 9.5 9.4

PV

N 79 130 29 60

No mut (%) 58.2 46 34.5 56.7

1 mut (%) 29.1 30 51.7 28.3

≥ 2 mut (%) 12.6 24 13.8 15

Lundberg et al. Blood 2014

Tefferi et al. Blood Advances 2016

Delic et al. BJH 2016

Fernández et al 2018 (unpublished)

Mutaciones non-driver e importancia en Neoplasias Mieloproliferativas

•Podrían favorecer la dominancia clonal del gen driver •Modifican el fenotipo de la enfermedad •Promueven la progresión de la enfermedad a MF o LAM

Kralovics 2017

Hematopoyesis Clonal de significado incierto

Jaiswal NEJM 2014, Genovese NEJM 2014; Xie Nature 2014

• La hematopoyesis clonal aumenta con la edad: 10% en >60 años y 1% en <50 años

• Se asocia con mayor riesgo de neoplasia

hematológica y muerte, así como de eventos cardiovasculares

• Un subgrupo de genes (DNMT3A, TET2 y

ASXL1) está frecuentemente mutado en gente aparentemente sana, por lo que podría suponer un evento temprano previo a la aparición de la enfermedad

Lundberg et al, Blood 2014

N = 197 (PV, ET, PMF)

Probabilidad de transformación a LAM por la

presencia de mutaciones en genes non-driver

0 10 20 30 40

% mutated cases

post-PV post-ET

AML POST-PV/ET (n=29)

PV (n=14) ET (n=15) JAK2 JAK2 M TN

JAK2

MPL

TP53

TET2

ASXL1

RUNX1

DNMT3A

IDH1/2

EZH2

SRSF2

SETBP1

CBL

PTPN11

SH2B3

NOTCH1

SF3B1

ETV6

NF1

ZRSR2

Caracterización molecular en LAM post-PV o post-TE

Álvarez-Larrán et al, BJH 2017

Variant allele frequency en muestras pre- y post- LAM (n=19)

LAM JAK2V617F-negativa en 48% de casos previamente JAK2V617F-mutados

DNMT3A, TET2, ASXL1, SRSF2: detectables en fase crónica

TP53, RUNX1, IDH1/2: no detectables o presentes con VAF baja

Álvarez-Larrán et al, BJH 2017

Tefferi et al, Blood Advances 2016

Variantes/mutaciones detectadas en PV (n = 133) y TE (n = 183) pacientes

Mutaciones en genes non-driver en NMP Ph-neg

• Mutaciones adversas en 15% de pacientes con PV

• ASXL1, SRSF2 e IDH2

• SG: ASXL1, SRSF2, IDH2

• Transformación a LAM: SRSF2, IDH2, RUNX1

• Transformación a MF: SRSF2, RUNX1

Tefferi et al, Blood advances 2016

Mutaciones adversas en Policitemia Vera

n=133

Tefferi et al, Blood advances 2016

• Mutaciones adversas en 15% de pacientes con TE

• SH2B3, SF3B1, U2AF1, TP53, IDH2, y EZH2

Mutaciones adversas en Trombocitemia Esencial

• SG: IDH2, SH2B3, EZH2

• Transformación a LAM: TP53, EZH2, SRSF2, IDH2

• Transformación a MF: SF3B1, U2AF1

n=183

Senín et al, Annals of Hematology 2018

Mutaciones adversas en PV y TE

• SG: DNMT3A, SRSF2, SF3B1, IDH1/2, RUNX1

• Transformación a LAM: ASXL1, TP53, SRSF2, IDH1/2, RUNX1

• Transformación a MF: SF3B1, SRSF2, DNMT3A, IDH1/2

Transformación a LAM Transformación a MF n=100

p=0,002 P<0,0001

Presencia mutación non-driver

Ausencia mutación non-driver

Evolución clonal en PV y TE

• La mayoría de pacientes que evolucionaron a LAM tenían mutaciones detectables por NGS en la primera muestra realizada al diagnóstico de la PV/TE

Senín et al , Annals of Hematology 2018

PV/TE en fase crónica con más 10 años de seguimiento molecular

n=50

PV/TE con evolución a LAM n=12

Transformación mielofibrótica en PV/TE

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Cum

ula

tive In

cid

ence

0 5 10 15 20 25 30Years

Stable < 50% Other patterns

According to pattern of JAK2 allele burden

Adjusted cumulative incidence of progression to MF

p< 0.001

Variable HR (IC 95%) p

Edad 1,45(0,6-3,7) 0,4

Diagnóstico (PV or TE) 0,85 (0,3-2,6) 0,8

Mutación non-driver 2,6 (0,9-6,9) 0,06

Carga alélica de JAK2V617F 10,8 (2,4-49,1) 0,002

PV/TE con evolución a MF n=24

Älvarez-Larrán et al Am J Hematol. 2014; Senín et al , Annals of Hematology 2018

Evolución clonal durante el seguimiento en PV/TE JAK2+

Senín et al , Annals of Hematology 2018

Mutaciones x 100 años-persona

1,7 4,4

25,6

• Los pacientes sin mutaciones en

fase crónica adquirían menos mutaciones non-driver que aquellos con mutaciones adversas en la 1ª muestra

• Las mutaciones non-driver confieren

inestabilidad genética

PV n=404 (Clínica Mayo - Universidad de Florencia)

TE n= 502 (Clínica Mayo - Universidad de Florencia)

Factores de riesgo de trombosis

Overall PV TE

Trombosis arterial

>60 años

ASXL1 WT

RUNX1 WT

>60 años

ASXL1 WT

RUNX1 WT

>60 años

JAK2V617F

ASXL1 WT

RUNX1 WT

Trombosis venosa

↓ edad

Leucocitosis

JAK2V617F

Leucocitosis

↓ edad

JAK2V617F

SRSF2 WT

Molecular profile and risk of thrombosis in JAK2V617F positive PV

patients

• N=127 (median age at diagnosis 69.5 years (20,3-95))

• Molecular characterization at the time of diagnosis (JAK2V617F & NGS 25 gens)

Results

• Median follow-up: 50 months (1-200)

• 20 thrombosis in 14 patients (10,9%) (85% arterials)

• Median time from diagnosis to first thrombosis : 28 months (5,8-80)

• No differences between JAK2 mutational burden and thrombotic complications

0-24% 25-49% 50-74% 75-100% p = ns

Distribution JAK2V617F

Angona, EHA 2019

• 104 mutations in non-driver genes in 61 patients (48%); 0,8 mut non-driver/patient

• TET2 (36%), ASXL1 (13,2%), DNMT3A (12,5%)

Molecular profile and risk of thrombosis in JAK2V617F positive PV

patients

Angona, EHA 2019

• 104 mutations in non-driver genes in 61 patients (48%); 0,8 mut non-driver/patient

• TET2 (36%), ASXL1 (13,2%), DNMT3A (12,5%)

Molecular profile and risk of thrombosis in JAK2V617F positive PV

patients

Angona, EHA 2019

69%

80%

1% 2% 1%

0

36,4% 44%

90%

6,3%

34%

42%

33,3%

49%

41%

13.06.05 15.09.08 18.03.11 16.05.12 16.01.15 12.02.18

JAK2

DNMT3A

SETBP1

ASXL1

DNMT3A

SETBP1

ASXL1

HUyAASBUSULFÁNSóloAASFlebotomíasyAAS

RHCHb7,9NF0,75Plq47

Hb12,7Leuc12NFT3,2Mono2Plq277

Displasia?JAK2V617F

Dx 2005

STOP por decisión paciente

STOP por pancitopenia

Varon, 67 años Dx : Policitemia vera

Caso 2: Mutaciones non-driver Las mutaciones non-driver pueden estar presente en un 40-50 % de los pacientes con PV y TE en el momento del diagnóstico El significado pronóstico de estas mutaciones en el diagnóstico y/o su aparición durante el seguimiento está por definir

Take-home messages

69%

80%

1% 2% 1%

0 0,10%

36,4% 44%

90%

98%

6,3%

34%

42% 47%

33,3%

49%

41%

48%

52%

13.06.05 15.09.08 18.03.11 16.05.12 16.01.15 12.02.18 15.03.19

JAK2

DNMT3A

SETBP1

ASXL1

CSF3R

DNMT3A

SETBP1

ASXL1

HUyAASBUSULFÁNSóloAASFlebotomíasyAAS

RHCHb7,9NF0,75Plq47

Hb10,8Leuc53Plq335

JAK2V617F

Dx 2005

STOP por decisión paciente

STOP por pancitopenia

Varon, 67 años Dx : Policitemia vera

CSF3R