제 39회 전국과학 전람회

생 물

곶감 추출물의 항균효과와

세포독성에 관한 연구

서울 금옥여자고등학교

교 사 박 은 배

차 례

1. 연구동기 ·······························································································1

2. 연구목적 ·······························································································3

3. 곶감의 성분 특징에 관한 기존연구 내용 ··································3

4. 곶감추출물과 화학방부제의 항균력(抗菌力)비교 ····················3

(1) 실험동기 및 목적 ···························································································3

(2) 실험방법 ············································································································6

(3) 실험결과 ············································································································9

5. 곶감추출물의 세포독성에 관한 실험 ········································13

(1) 실험재료 ··········································································································13

(2) 실험방법 ··········································································································13

(3) 실험결과 ··········································································································14

6. 곶감가루(粉)의 당분석 및 전자현미경 사진 ··························19

7. 연구 결과 ··························································································22

8. 연구 전망 ··························································································23

9. 참고 문헌 ··························································································23

- 1 -

1. 연구동기

(1) 우리 나라는 현재 방부제로 허용한 품목이 보존제 13종, 살균제 4종, 산화방지

제 7종, 모두 24종이 있다. 이들 화학방부제는 소량씩, 장기적으로 섭취하면

發癌, 돌연변이유발, 위염, 중추신경마비, 간의 기능저하 등의 부작용을 일으키

고 있다.

그러나 자연식품에는 발암물질 등이 전혀 없는 것은 아니지만 항암 물질이나

오염에 대한 자체방어 기능이 있다고 알려져 있다.

(2) 곶감은 東醫寶鑑에 의하면 柿子는 「氣寒潤心肺 澁腸楚痢渴痰退」라하여 창

자의 건강, 설사를 멈추게 하며 폐에 좋다고 하여 한약으로 이용해 오고 있다.

(3) 美國의 국립보건연구에서는 복합당(Complex sugar)이 갖고 있는 자연적인 면

역력을 이용하여 癌細胞를 확인하여 죽이는 연구를 하고 있다.

(4) 곶감은 건조된 후에도 수분을 30-36%나 갖고 있지만 가루가 생긴 후에는 오

랜 시간 보존이 가능한 것은 곶감이나 가루에 상당한 抗菌力이 있다는 가설을

설정하였다.

(5) 곶감가루를 원생생물에 투여하여 보면 陰性走化性을 보이고 있다.

(Fig 1, 2, 3, 4. 참조)

(6) 곶감이나 곶감가루에 항균력이 있다면 천연방부제로 개발할 수 있다고 보았

다.

(7) 곶감에 抗菌力이 있다면 다른 화학방부제에 비하여 毒性이 적을 것으로 생각

이 된다.

(Fig. 1) 유글레나 배양액을 원심분리한 것 (Fig. 2) 유글레나는 곶감가루에 음성주화성을 보인다.

- 2 -

(Fig. 3)

곶감 가루를 피하는 유글레나

(음성주화성)

(Fig. 4)

곶감 가루의 부근에서 죽는

짚신벌레

(Paramecium bursaria)

* 원생생물은 곶감의 가루에 음성주화성을 일으키거나 죽는데 곶감가루에 항균효

과가 있다는 가설을 설정했다.

- 3 -

2. 연구목적

(1) 곶감가루의 탄수화물 종류를 규명하고 전자현미경적 구조를 규명한다.

(2) 곶감과 가루의 추출물과 화학방부제(3종)1)의 抗菌力을 비교한다.

(3) 곶감추출물과 화학방부제 3종과의 細胞毒性2) 실험을 하여 비교한다.

(4) 곶감가루 (粉)와 곶감추출물이 원생생물에 어떤 영향을 끼치는지 파악한다.

(5) 무공해 防腐劑를 개발하여 식품과 약품에 이용함으로 농촌경제와 국민건강에

이바지한다.

3. 곶감의 성분 특징에 관한 기존연구 내용

(1) 곶감의 건조초기에는 Sucrose가 급격하게 감소하고 Fructose와 Glucose는 증

가하며 가루(粉)는 대부분이 포도당이다.

(2) Invertase의 활성은 건조 10일째 최고이며 精製酵素의 최적 PH는 5.0～6.0, 최

적온도는 40℃이다.

(3) 곶감의 수분함량은 30～36%이다.

(4) 곶감의 천일 건조기간은 34일, 30도의 열풍 건조하면 5일 걸린다.

(5) 당의 비율은 40.50%～40.52%이었다.

(6) 곶감의 당은 포도당, 과당, 설탕이었으며 포도당과 과당이 대부분이고 설탕은

극미량이다.

4. 곶감추출물과 화학방부제의 항균력(抗菌力)비교

(1) 실험동기 및 목적

곰팡이(Candida albicans)와 효모(Aspergillus niger)가 자라는 배지에 곶감추출물

참조 : (한국식품 연구문헌 총람 68～69P, 88～89P)

1) Sorbic acid, Benzonic acid, Chlorohexidine

2) mouse cell, monkey kidney cell.

- 4 -

을 약간 가하고 48시간 경과 후 관찰한 결과 추출물 부근의 곰팡이나 효모가 죽

는 것을 볼 수 있다.(Fig 5, 6, 7)

이와 같은 현상을 일으키는 곶감추출물의 항균력을 화학방부제와 비교함으로써

무독성 방부제의 개발 가능성을 제시한다.

(Fig. 5)

효모배지

(A. niger)

(Fig. 6)

효모 (A. niger)에 곶감

추출물의 투여

(Fig. 7)

효모 (A. niger)가 48시간

후 곶감 추출물부근에서

죽은 모습

- 5 -

(Fig. 8)

곰팡이 (C. albicans)가 곶감

추출물부근에서 죽은 모습

(Fig. 9)

아메바 세포막의 일부가

곶감추출물에 의해 변화

되고 있다.

(Fig. 10)

아메바 세포막의 변화.

(A) 곶감 추출물입자.

- 6 -

(2) 실험방법

1) Agar - dilution법 (배지 희석법)

① 실험재료 및 시약

㉠ 시중에서 구입한 곶감

㉡ 방 부 제 : Sorbic acid, Benzonic acid.

㉢ 살 균 제 : Chlorohexidine digloconate.

㉣ 액체배지 : Branine heart infusion (BHT), Trypic joy agar.

㉤ 고체배지 : Nutrient agar (박테리아용), Potato dextrose agar (효모, 곰

팡이용)

② 곶감 추출물 추출

㉠ <Methanol 추출물> : 곶감의 겉 표면을 얇게 절단하여 건조시킨 다음

그 겉 표면 50g과 곶감의 표면에 있는 흰 가루를 모은 것 50g에

Methanol 500㎖를 가하여 실온에서 10일간 침척 추출하여 여과한 후, 그

여과 액을 감압 증발시켜 추출물을 얻었다. (Fig. 11)

㉡ <Ethanol 추출물 제조> : 건조된 곶감 겉 표면과 겉 표면의 가루 50g에

Ethanol (95%) 500㎖를 가하여 실온 10일간 침적 추출하여 여과한 후 그

여과 액을 감압 증발시켜 Ethanol 추출물을 얻었다. (Fig. 12)

㉢ <물 추출물 제조> : 건조된 곶감 겉 표면 50g과 가루 50g을 각각 증류

수 500㎖를 가하여 실온 10일간 침적 여과한 후, 그 여과 액을 감압 증

발하여 물 추출물을 얻었다.

③ 항균력 측정

㉠ 실험균주

본 실험에 사용한 균들은 United States Pharmacopeia XIX (미국 약전

기준)에 등재된 Antimicrobial Preservative3)에 사용하는 균 5종을 사용

하였다.

3) 항 미생물 방부제

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균주명

Candida albicans ATCC 10231 곰 팡 이

Aspergillus niger ATCC 16404 효 모

Escherichia coli ATCC 8739 세 균

Staphy lococcus aureus ATCC 6538 세 균

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9721 세 균

상기 균들은 한국 유전자 보관센터에서 분양 받아 Bacteria는 Nutrient

agar에 Fungi는 Potato dextrose agar에 계대배양하여 4℃에 보관하여

사용하였고 항균력 실험시에는 Nutrient agar, Potato dextrose agar 상

의 균을 Trypitic soy broth에서 16시간～20시간 배양한 후 사용하였다.

㉡ 각 추출물의 항균력 실험

각 실험 시료들은 다음의 종류대로 만들었다.

껍질의 메타놀 추출물 (Methanol extracts of surface)

가루의 메타놀 추출물 (Methanol extracts of powder)

껍질의 에타놀 추출물 (Ethanol extracts of surface)

가루의 에타놀 추출물 (Ethanol extracts of powder)

껍질의 물 추출물 (Water extracts of surface)

가루의 물 추출물 (Water extracts of powder)

시료의 종류

위의 각 시료들의 균주에 대한 항균력은 Agar-dilution법에 의하여 측정

하였다.

Trypic soy agar에 각 시료들을 가해 적당 농도로 희석한4) 후 Prtri

dish에 부어 굳힌 다음 Trypic soy agar에서 배양한 균들을 1백금 취하

여 도말 하였다.

그리고 37℃에서 48시간 배양한 후 균의 생장여부를 관찰하여 생육이 관

찰되지 않는 가장 낮은 농도를 최소저지농도 (Minimnm inhabitory

concentration : MIC)로 하였다.5)

4) 희석농도 : 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 ㎍/㎖

5) MIC : 최소저지 농도로 ㎍/㎖로 나타낸다.

값이 적을수록 항균력이 크다.

- 8 -

㉢ 최소저지 농도 측정 방법

(예) Sorbic-acid의 최소저지농도 (MIC)값이 E. coli에 대해 1,000㎍/㎖이

다.

- 9 -

(Fig. 11)

곶감 겉표면 부분(B)과 가

루(A) 50g씩을 Methanol

500㎖에 넣고 10일간 침

척 여과시킨다.

감압 환류 증발 추출장치

(Fig. 12)

침적여과물을 감압 환류

증발 추출장치로 곶감추

출물을 만든다.

(3) 실험결과

일상생활에서 흔히 접할 수 있는 세균 3종과 효모 1종, 곰팡이 1종을 대상으

로 항균력을 검색한 결과, (Table 1)에 나타난 바와 같이 곶감의 겉 표면이나

가루의 추출물은 MIC값으로 500～2000㎍/㎖로 비슷한 항균력을 보인다.

곶감의 추출물은 치약이나 화장품 기타의 약제의 살균제로 가장 많이 사용하

는 Chlorohexicine-digloconate의 MIC에 비해서는 아주 낮은 항균력을 지니

고 있지만 기타 식품 첨가물인 Sorbic acid나 Benzonic acid와는 거의 비슷한

항균력을 나타내었다.

그리고 물 추출물은 MIC가 4000㎍/㎖이상으로 나타나므로 항균력이 거의 없

는 것으로 생각된다.

- 10 -

(Table 1) 곶감추출물과 화학방부제의 항균력 비교

균주

추출물

MIC(㎍/㎖) 최소저지농도값

E. coli S. aureus P. aerugionosa C. albicans A. niger

곶감의 Methanol

추출물500㎍/㎖ 2000 1000 500 1000

가루의 Methanol

추출물500 2000 2000 500 500

곶감의 Ethanol

추출물500 2000 2000 500 500

가루의 Ethanol

추출물5000 2000 2000 500 500

곶감의 Water

추출물4000 4000이상 4000 4000 4000

가루의 Water

추출물4000 4000이상 4000 4000 4000

Sorbic acid 1000 2000 1000 1000 1000

Benzonic acid 1000 2000 1000 1000 1000

Chlorohexidine 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

(Table 2) 균주 E. coli에 대한 항균력 비교

- 11 -

(Table 3) 균주 S. aureus에 대한 항균력 비교

(Table 4) P. aerugimosa에 대한 항균력 비교

- 12 -

(Table 5) 균주 C. albicans에 대한 항균력비교

(Table 6) A. niger에 대한 항균력 비교

- 13 -

5. 곶감추출물의 세포독성에 관한 실험

곶감추출물과 식품첨가용 방부제의 세포성장 및 생존에 미치는 영향을 관찰하

고자 세포부착능 시험(Method of cytotoxicity by detachment of cells)을 택하

여 시험하였다.

(1) 실험재료

1) L929 : mouse fibroblast cell(쥐의 섬유아세포)

2) Vero E6 : African Green Monkey Kidney cell(원숭이 신장세포)

3) 상기 두 세포는 단국대학교 면역학 실험실에서 계대배양하고 있는 것을 분

양 받아 사용하였다.

(2) 실험방법

1) 세포의 배양

10% fetal bovine serum6), 100 unit/㎖l 페니실린, 100 unit/㎖l 스트렙트마이

신, 0.2㎍/㎖ fungizone이 함유된 MEM 배지를 75㎠ clture flask를 사용하여

5% CO2 배양기에서 배양하였다.

2) 세포의 독성측정

① 세포의 생존에 관한 세포독성 실험

2차 배양시에 70～80% Monolayer cell이 형성된 배지를 버리고 0.25% 트

립신을 이용하여 세포를 분리시켰다.

이것을 Hemocytometer를 이용하여 세포수가 10×104Cell/㎖가 되도록 조

절하여 24 Well plate에 1㎖씩 분주하여 5% CO2 배양기에서 24시간 배양

하였다.

이 배양된 Well에 각 Sample를 1㎖ 넣고 2배 계단 희석하여 37℃ CO2 배

양기에서 4시간 재 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 각 Well에 2㎖의

D-PBS7)를 넣고 씻어낸 다음 메탄올을 2㎖ 넣고 30분간 고정시켰다.

고정 후 메탄올을 버리고 105 김자염색액 1㎖를 첨가하여 30분간 염색 후

6) 소의 태아혈청

7) D-PBS : Dulbecco's Phosphate-Buffered Salines

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증류수로 씻어낸 다음 Inverted 현미경으로 세포를 관찰하였다.

② 세포성장에 관한 독성실험

10×104Cell/㎖로 조절된 세포를 60㎜ 배양접시에 약 3㎖정도 넣고 각

Sample를 2000㎍/㎖이 되게 투여한 다음, 50% CO2 배양기 37℃에서 4시

간, 24시간, 48시간 배양하였다.

배양 중 각 시간별로 0.25% 트립신을 주입하여 세포를 분리한 다음 배양

액을 혼합하여 세포부유액을 만든 다음 Micro pipette로 20㎕를 취하여

tryphone blue로 염색한 다음 현미경에서 Hemocytometer를 사용하여 세포

수를 계산하였다.

(3) 실험결과

1) 세포의 생존율 비교

주의 세포나 원숭이의 세포는 곶감추출물에서는 100% 생존율을 보이나 화학

방부제에서는 (Table 7, 8)같이 독성을 나타냈다.

(Table. 7) 원숭이 신장세포의 생존율(%)

희석도(㎍/㎖)

sample16,000 8,000 4,000 2,000 1,000 500 250

곶감추출물 100 100 100 100 100 100 100

Sorbic acid 50 70 90 100 100 100 100

Benzonic acid 30 50 70 90 100 100 100

Chlorohexidine 0 0 0 0 0 0 0

(Table. 8) 쥐의 섬유아세포 생존율(%)

희석도(㎍/㎖)

sample16,000 8,000 4,000 2,000 1,000 500 250

곶감추출물 100 100 100 100 100 100 100

Sorbic acid 40 70 90 100 100 100 100

Benzonic acid 30 40 60 80 100 100 100

Chlorohexidine 0 0 0 0 0 0 0

- 15 -

2) 세포의 성장률 비교

세포들의 시간별 성장속도를 비교하여 보면 곶감추출물은 세포성장에 크게

변화를 끼치지 않으나 화학방부제는 크게 제한을 끼치고 있는 것을 알 수

있다. (Table 9. 10 참조)

(Table. 9) 원숭이 신장세포의 세포 수 성장비교

(세포의 숫자 변화)

시간

sample0시간 4시간 24시간 48시간

대 조 군 10.0 23.8±6.5 32.9±4.7 39.2±3.2

곶감추출물 10.0 21.8±2.3 30.9±4.7 38.2±3.2

Sorbic acid 10.0 11.8±4.5 20.1±1.9 15.2±3.2

Benzonic acid 10.0 8±1.5 18.1±1.4 10.9±1.4

Chlorohexidine 10.0 0 0 0

(Table. 10) 쥐 섬유아세포의 세포 수 성장비교

시간

sample0시간 4시간 24시간 48시간

대 조 군 10.0 27.2±4.2 41.1±1.5 52.5±1.9

곶감추출물 10.0 26.8±1.5 38.2±3.4 49.8±6.5

Sorbic acid 10.0 10.5±5.5 12.3±4.6 9.224.6.2

Benzonic acid 10.0 8.5±4.7 15.2±6.7 7.691.8.4

Chlorohexidine 10.0 0 0 0

쥐의 세포의 변화를 보면 대조군에 비하여, 곶감추출물을 투여한 것은 약간의 감소

수를 보였으나 Sorbic acid나 Benzonis acid를 투여한 경우에는 큰 수적 감소를 보

여주고 있다.

- 16 -

(Fig. 13)

Vero E6 :

Monkey Kidney Cell 정상

세포(대조군)

x 40

(Fig. 14)

원숭이 신장세포에 곶감추출물

16,000㎍/㎖ 투여

(Fig. 15)

원숭이 신장세포에 Sorbic acid

16,000㎍/㎖ 투여

- 17 -

(Fig. 16)

원숭이 신장세포에 Benzonic acid

16,000㎍/㎖ 투여

(Fig. 17)

L 929 :

쥐의 섬유아세포 대조군(정상세포)

x 40

(Fig. 18)

쥐의 섬유아세포에 곶감추출물

18,000㎍/㎖ 투여

- 18 -

(Fig. 19)

쥐의 섬유아세포 Sorbic acid 첨가

8,000㎍/㎖ 투여

(Fig. 20)

쥐의 섬유아세포에 Benzonic acid

18,000㎍/㎖ 투여

(Fig. 21)

Sorbic acid 첨가 4,000㎍/㎖

- 19 -

6. 곶감가루(粉)의 당분석 및 전자현미경 사진

(1) 분석조건

1) 용매 : 70%의 CH3CN

2) Column : Bondapak Carbohyrate Column( 美 Water社)

3) 검출계 : R - 401 RI Detector

4) 기준당의 종류 :

① Fructose 1% Glucose 1% Sucrose 1% Maltose 0.5%

② Raffinose 0.5%

5) 분석내용 : 표 11참조

6) 결과(표 11) 참조

① Fructose 6.1% Glucose 52.9% Sucrose 0% Maltose 0%

② Raffinose 0%

7) 실험실 : 한국양봉협회 : 蜂産物연구소

- 20 -

(Table. 11) 곶감가루의 당비율

- 21 -

(Fig. 22)

곶감표면 가루의 전자현미경사진

(Carl Zeiss DSM940으로 촬영)

x 30

(Fig. 23)

x 5,000

(Fig. 24)

x 10,000

- 22 -

7. 연구 결과

(1) 곶감의 흰 가루는 포도당 52.9%, 과당 6.1% 기타의 성분으로 구성된 복합당

이다.

(2) 곶감과 곶감가루의 추출물은 복합당(Complex sugar)으로써 5개의 균주에 대

하여 MIC(최소저지농도) 값으로 500～2,000㎍/㎖의 항균효과를 나타낸다.

(3) 곶감추출물의 항균효과는 살균제인 Chlorohexidine 보다는 아주 낮지만 화학

방부제로 식품에 많이 이용되는 Sorbic acid나 Benzonic acid와는 비슷한 항균

력을 나타낸다.

(4) 곶감의 물 추출물은 MIC값이 4000㎍/㎖로 항균력이 거의 나타나지 않는다.

(5) 곶감추출물은 원숭이 신장세포나 쥐의 섬유아세포에 250～16000㎍/㎖ 투여해

도 100% 생존하나 Sorbic acid나 Benzonic acid는 30～80%의 생존율을 보인

다.

(6) 세포수의 성장률에서는 곶감추출물을 투여한 것은 정상세포(대조군)와 비슷하

나 화학방부제를 투여한 것은 세포수의 감소를 보인다.

(7) 곶감추출물은 독성이 없는 무공해 식품방부제(防腐劑)로 활용이 가능하다.

Conclusion

1. The white powder on the surface of a drided persimom is complex

composed of 52.9% glucose, 6.1% fructose and other ingredients.

2. The complex sugar in the abstract of a persimmom has antibacterial effect

of 500-2000㎍/㎖ for MIC on its five host.

3. Although the antibiotic effect of a dried persimmom is far smaller than that

of Chlorohexidine, bacteriacide, it has the similar antibiotic value to that of

Sorbic acid or Benzonic acid used for chemical preservatives in food.

4. The liquid ingredients of dried persimmom has 4000㎍/㎖ MIC value, which

has little antibiotic power.

5. When the Kidney cells all Afirican monkey or the fibroblast cells of a

- 23 -

mouse were imput with 250-16000㎍/㎖, 100% of them survived.

6. When the cell was imput with the persimmom abstract it showed the

similar number in the growing rate of the cell number. Imput with

chemical prevatives it showed the decrease of the number.

7. As shown in the above experiments, the persimmom abstract may be used

unpoisonous natural anticeptics.

8. 연구 전망

(1) 식품이나 약품에 많이 사용하는 화학방부제의 생물농축 현상으로 인하여 국

민건강에 심각한 우려를 낳고 있다.

이에 곶감의 추출물이 갖고 있는 抗菌效果를 이용하여 無公害防腐劑를 개발함

으로써 국민건강에 이바지한다.

(2) 매년 농촌에서 따지 않고 버려지는 감으로 곶감을 만들어 활용함으로 국가경

제에 공헌한다.

(3) 곶감추출물의 복합당이 갖고 있는 抗菌力을 이용하여 유용한 의약품의 원료

로 활용할 계기를 삼는다.

9. 참고 문헌

1. 東醫寶鑑

2. 한국식품 연구문헌 총람

3. 이온크로마토그라피의 원리 및 이용 : 인성과학

4. 微生物學 : 홍순우외 2인