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J. E. N. 301Sp ISSN 0081-3397 '
porF. Mingot, J. L. Jorcano,C. A. Dávila
JUNTA DE ENERGÍA NUCLEAR
MADRID, 1975
Toda correspondencia en relación con este trabajodebe dirigirse al Servicio de Documentación Biblioteca yPublicaciones, Junta de Energía Nuclear. Ciudad Univer-sitaria, Madrid-3, ESPAÑA.
Las solicitudes de ejemplares deben dirigirse aeste mismo Servicio,
Los descriptores se han seleccionado del Thesaurodel INIS para describir las materias que contiene este informe con vistas a su recuperación. Para mas detalles cónsultese el informe IAEA-INIS-12 (INIS: Manual de Indización)y IAEA-INIS-13 (INIS: Thesauro) publicado por el OrganismoInternacional de Energía. Atómica,
Se autoriza la reproducción de los resúmenes ana-líticos que aparecen en esta publicación.
Este trabajo se ha recibido para su impresión enAbril de 1975
Depósito legal n° M-17993-1975 I.S.B.N. 84-500-6846-0
ÍNDICE
Fágs,
I .- INTRODUCCIÓN 3
II.- MÉTODOS EXPERIMENTALES 7
II.1.- Introducción 9
II.2.- Teoría de la sedimentación 14
II.3.- Medida de los coeficientes de sedimentación 31
II.4.- Metodología e instrumentación de la sedimen
tacion. 41
II.5.- Teoría de la viscosidad 61
I "1.6.— Factores de que depende la viscosidad 71
II.7.- instrumentación y metodología de la viscosi
rnetría 77
U.S.- Correlaciones S-|7j|-Peso molecular 83
III.- MATERIALES 89
III.1.a.- Aislamiento de DMA de bacteriófago T2 91
III.1.b.- Aislamiento de DMA de Pseudomona savasta
noi. 93
III.2.- Caracterización de DNA 95
IV.- ESTUDIO DE LA HETEROGENEIDAD 99
IV.1.- introducción 101
IV.2.- Metodología 103
IV.3.- Cálculo 109
V.- PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 115
V.I.— Determinación del peso molecular a partir de
medidas de viscosidad 117
V.2.- Heterogeneidad de una preparación de DNA del
fago T2 119
V.3.- Degradación de DNA de Pseudomona savastanoi 126
V.4.- Proposición de la o de la gausiana equiva-
lente como parámetro de heterogeneidad 130
VI.- REFERENCIAS 135
I . INTRODUCCIÓN
La circunstancia de que el ácido desoxiribonucleico
sea el portador de la información genética y el hecho -
de que sus alteraciones tengan, por tanto, importantes
repercusiones funcionales, ha motivado el continuo estu
dio de los fenómenos de interacción de esta macromolécu
la con diversos agentes y de las consecuencias a que e_s
ta interacción da lugar.
Un conjunto de estos agentes, los que actúan localmen
te mediante una reacción química, entre los que se en-
cuentran las radiaciones ionizantes cuando actúan sobre
soluciones diluidas, producen en la estructura del DNA
roturas de enlaces intermonomerieos. Estas roturas sim-
ples (por serlo en sólo una de las cadenas), que por sí
mismas no producen disminución de tamaño molecular deb_i
do a la estructura bicatenaria del DNA, llegan a produ-
cirla ai coincidir, espacialmente, dos de estas roturas
sobre cada una de las cadenas. La rotura doble a que da
lugar esta coincidencia es la causa inmediata de la dis
minuéion de tamaño molecular, que es el efecto observa-
ble en cualquier proceso de degradación.
Este proceso de degradación ha sido descrito en es-
te laboratorio (MINGOT, F, 1972) mediante una expresión
que relaciona la probabilidad de rotura doble por molé-
cula con la densidad de roturas simples por monómero que
exista en esa molécula:
PRD = 1 " exP(~(2h+1) N P dPv
4
donde P es la probabilidad de rotura doble por molécula,
d , es la densidad de roturas simples por monómero, N es
el número de pares de bases (unidad monomérica en la doble
hélice del DNA) de la molécula y h es el número de enlaces
de hidrógeno rotos en la estructura bicatenaria, en la zo-
na en que se ha producido la rotura simple, y como conse-
cuencia de ella.
Otra forma propuesta para describir este proceso (THOMAS,
C A . 1956) (PEACOCKE, A.R. ; PRESIÓN, B.N. ; 1960) (HAGEN, U.
1964) (HAGEN, u. 1967), ha sido la expresión:
(1.2)
donde N es el número de roturas dobles producidas en la
preparación, h y d significan lo mismo que en el expre-
sión anterior y N es el número total de nucleotidos de la
muestra,
Ambas expresiones son dos formas distintas de descrip_
ción de esta fenomenología, y la coherencia entre ellas -
ha sido demostrada (MINGOT, F, 1972).
Tanto en una como en otra forma de expresión, P , NÍ\.U Í\.U
y d miden únicamente acontecimientos, mientras que h es
un parámetro estructural, índice de la desestabilización
local en la zona de la rotura simple. La determinación del
parámetro h permitiría, por tanto, un mejor conocimiento
de la perturbación en el entorno local de la rotura sim-
ple y de las características de la cooperatividad de la -
estructura bicatenaria del DNA.
Sea cual sea, de estas dos, la expresión que se inten
te utilizar, la determinación de h exige la de d y P«n,lvO ¡X.U
o bien N . Se puede evitar la determinación de d expre]\D lvo
sando esta variable en función del tiempo de tratamiento
con el agente; pero entonces sólo es posible obtener va-
riaciones relativas de h, a menos que se conozcan las cons_
tantes de velocidad de reacción y factores de eficacia pa
ra la producción de roturas simples, situación poco fre-
cuente en la práctica.La determinación de estas magnitudes, P-,n> -nc» ° ^ n»
JxD í\. o IZu
se puede llevar a cabo a través del estudio de la distri-
bución de tamaños de las moléculas de DNA en estructura -
bicatenaria y en estructura de cadena simple.
En la presente memoria se comentan los diversos méto-
dos que dan información sobre esta distribución de tama-
ños y se describe la puesta a punto de uno de ellos. Tam
bien se aplica esta metodología a un problema de degrada,
ción y a la determinación de la heterogeneidad de una pre
paración concreta de DNA.
Si bien el objetivo perseguido con este trabajo es -
el descrito anteriormente, nos ha parecido conveniente -
realizar además una revisión crítica de la aplicabilidad
de la teoría de sedimentación y viscosimetría de macromo
léculas al problema concreto de soluciones de DNA.
I I . MÉTODOS EXPERIMENTALES
La metodología experimental necesaria para abordar la pr£
blemática planteada en la introdiicción de esta memoria, debe
ser capaz de proporcionar información de las magnitudes mole-
culares medias y de la distribución de tamaños de una muestra,
al mismo tiempo que debe ser, aunque elaborada, de ágil reali-
zación.
Es necesario, además, que la metodología utilizada en la
determinación de tamaños moleculares del DNA bicatenario, no
sea sensible a la existencia de roturas intermonoméricas en
una sola de las cadenas, ni a las pequeñas alteraciones loca-
les que las acompañan»
La tabla 1, resume los métodos más importantes de determi
nación de pesos moleculares de preparaciones de DNA y la in-
formación que facilitan» En esta tabla nos basaremos para co-
mentar los distintos métodos y justificar la elección de uno
de ellos, para lo cual procederemos por exclusión.
La dispersión de luz, que proporciona varias magnitudes -
moleculares medias (en número, en peso y Z) tiene, a los efe£
tos que comentamos, dos limitaciones: no proporciona informa-
ción directa de la distribución de tamaños moleculares y tie-
ne un intervalo de aplicación restringido, incluso con los ins_
trumentos más elaborados, por la necesidad de extrapolación -
a ángulo cero (GAECES, F. 1973).
La determinación enzimática de fosfato terminal, es un mé
todo que no es útil en la determinación de pesos moleculares
de DNA bihelicoidal, debido a que es sensible a las roturas -
simples. Sí es, sin embargo, interesante en las roturas sim-
10
pies y ha sido aplicado a problemas de degradación en va-
rias ocasiones (COLLYNS, D. y otros, 1965) (BOPP, Ao; HA-
GEN, U. 1970) presentando como inconveniente la necesidad32
de utilizar DNA marcado en P, o, en caso contrario, un
sistema enzimático más elaborado»
Las técnicas de visualización de las moléculas de DNA,
entre las que se incluye, además de las medidas de longitud,
el método de la estrella, presentan en todos los casos el
inconveniente, de gran importancia en un estudio que re-
quiere gran número de muestras con variados tratamientos,
de los largos tiempos de espera, así como dificultades de
preparación de las muestras,
De las dos técnicas cromatográficas citadas, sólo la de
DSAE-celulosa ha sido ampliamente utilizada y aplicada a -
problemas de degradación (MINGOT, F. 1972), Si bien es de
una gran facilidad de realización y además proporciona in
formación directa sobre la heterogeneidad del DNA nativo,
sólo ha sido calibrada para su aplicación hasta 25x10 da_l
ton (MINGOT, F,; DAVILA, C.A. 1974). y no proporciona in-
formación sobre DNA desnaturado. La cromatografía MAíC, no
se ha útilizado prácticamente en el fraccionamiento de DNA
nativo. Su principal utilización ha sido en la separación
de DNA nativo y desnaturado.
De entre las técnicas hidrodinámicas, la sedimentación
isopícnica y la viscosimetría no son útiles en este probl_e
ma de determinación de polidispersidad, puesto que no dan
ninguna información al respecto»
Sin embargo, la viscosimetría, debido a su sencillez y
gran sensibilidad, al hecho de disponer de una calibración
exhaustiva y a que este parámetro (la viscosidad intrínseca)
TABLA 1 O)
HIDRODINÁMICAS
TÉCNICAS
Electroforesis
Velocidad desedimentación
Gradiente deconc. sacarosa
Sedimentaciónisopícnica
Viscosimetría
INTERVALO DE PM
Menor que 6
De 0,3 a 125
De 0,3 a 125
Mayor que 0,05
Mayor que 0,1
INFORMACIÓNOBTENCIÓN DE PM HETEROGENEIDAD
Calibración
Calibración
Calibración
Directa
Calibración
Directa
Directa
Directa
No da
No da
LONGITUD
Microscopíaelectrónica
Au toradi ograf ía Mayor que 40
Directa
Directa
Directa
Directa
FRACCIONAMIENTO
Cromatografía MAK
CromatografíaDE AE--celulosa
Dispersión de luzFosfato terminalMétodo de laestrella
1-25
Menor que 30Bajo PM
•K (GARÓES, F . 1973)«K (En Mdai tón)
Calibración
Calibración
DirectaDirecta
Directa
Directa
Directa
IndirectaNo da
Directa
12
acompaña al coeficiente de sedimentación en la expresión de
Mandelkern-Flory, es una técnica de la que normalmente no
se prescinde, incluso cuando se realizan otro tipo de deter_
minaciones.
La sedimentación isopícnica, por el contrario, aunque
permite obtener un parámetro (la sigma de la banda) corre-
lacionable con el peso molecular, no es útil ni en la de-
terminación del peso molecular medio, debido a que la he-
terogeneidad composicional ensancha la banda, lo cual im-
plica una sLibestimación sistemática del peso molecular -
(FRITSCH, A. 1964),
La electroforesis en geles de baja consistencia permi
te obtener información tras una adecuada calibración, pero
en un intervalo muy restringido de tamaño molecular, Esta
técnica es comparable, a todos los efectos, con la sedimen
tación en gradientes de concentración de sacarosa, aunque •
esta última permite obtener información en un intervalo ma
yor de tamaño molecular (GAECES, F8 1973)»
Las experiencias de velocidad de sedimentación en ul-
tracentrifuga analítica, proporcionan información tanto -
sobre pesos moleculares medios como sobre polidispersidad
(posteriormente comentaremos en detalle este aspecto), y
tanto para DNA nativo como desnaturado» La correlación de
las magnitudes obtenibles directamente de la sedimentación
en ultracentrifuga analítica (coeficiente de sedimentación)
con el peso molecular no requiere la comparación paralela
con un patrón como en el caso de los gradientes de concen-
tración de sacarosa, sino que existe una correlación entre
el coeficiente de sedimentación y el peso molecular esta-
13
blecido por comparación con medidas de microscopía elec-
trónica y dispersión de luz, y sobre todo, con datos ob-
tenidos a partir de la expresión de Mandellcern-Flory, o
Mande Lkern-Flory-Scheraga.
L.:3 experiencias de velocidad de sedimentación, así
como las de viscosimetría, si bien elaboradas, son rea-
lizables en tiempos suficientemente cortos como para per
mitir un trabajo sistemático.
En lo que sigue se estudian los aspectos más impor-
tantes, teóricos y prácticos, de estas metodologías, cu
va puesta a punto y crítica forma parte del motivo de —
O C 7" C^ T '-^ P H P-, 1 .-i
14
II.2. TEORÍA DE LA SEDIMENTACIÓN
El hecho de que en un experimento de velocidad de sedi-
mentación exista siempre un transporte neto de materia, es
decir, que la sedimentación sea siempre superior a la difu-
sión, implica la inaplicabilidad de la termodinámica de equi
librio a este proceso, que puede ser tratado, sin embargo,
en el marco de la termodinámica de aproximación al equili-
brio»
Consideraremos el sistema, en principio, como marlcoffia
no y lineal, pues supondremos que cada flujo depende, line
almente, de los valores en cada instante de las fuerzas ge:
neralizadas que actúan sobre el sistema, si bien discutiré
rnc•- posteriormente la validez de estos supuestos»
Tras i a justificación de la ecuación de continuidad en
cualquier elemento de volumen de la célula de sedimentación,
se discutirán las ecuaciones de flujo, aplicándolas a varios
casos particulares para obtener en ellos expresiones que re
lacionen magnitudes medibles con el peso molecular» La dis-
cusión de las condiciones reales de sedimentación dentro de
esta aproximación, permitirá obtener por vía teórica la ex-
presión práctica del coeficiente de sedimentación.
La discusión que se realiza a continuación, sigue funda,
mentalmente las líneas de la realizada por Williams '"(WIL
J.W. y otros; 1958),
Consideremos el elemento de sector de la célula de sed_i
mentación representado en la fig. 1, y sean A y A las -
áreas de las superficies que lo limitan. Se cumple:
A = r 9 1 A = (r + dr) 0 1 (II.2.1)
1 c
16
Si J y Jp son los flujos de materia a través de A y
A , la variación de la cantidad de materia (dm) presente
en el elemento será (x)
— = A (r) J (r) --A (r) J (r) =dt s
= r 0 1 J (r) - (r+dr)0 1 J2 (r+dr) (II.2.2)
Despreciando los términos de segundo orden, se puede
escribir
J (r+dr) = J (r) + jLLl£Í_ dr;dr
~ = r 6 1 J(r) - [ r Q 1 J(r) + r 6 1 - ^ T ^ dr + dr
(II.2.3)
Entonces:
f = -01 [ r J(r)] dr (II.2.4)
Si c es la concentración del soluto en el elemento de
volumen, se cumplirá:
m = c = dv
Se utilizará el subíndice e para indicar entrada en el
elemento considerado, y s para indicar salida.
17
dv = 0 1 r dr
m = c 0 1 r dr
dm „ . de ,-TT = 9 1 r —- drdt dt
(r,t) = _ I 3__ [r J(r)] , (11,2.6)
y generalizando a n solutos
de i/d(rj.)
M t / r dr 'r t
(II.2.7)
Ecuaciones de flujo
la mayor parte de los métodos experimentales en sedi-
mentación, están basados en soluciones de esta ecuación
de continuidad, que dan c, o dc/dr, como una función de
r y t; pero para resolver esta ecuación es necesario cono
cer el flujo,
El problema de expresar J. ha sido abordado por medio
de la termodinámica de procesos irreversibles, cuyos resul_
tados son los más correctos hasta el momento, a pesar de
las limitaciones impuestas a los sistemas al suponerlos
markoffíanos y lineales»
La función de disipación de entropía puede escribirse
q
T a = I (J±) Xi (II.2.8)
18
donde T es la temperatura en K, los flujos J. van entre
paréntesis para indicar que no especificamos el sistema
de referencia en el que están definidos, y donde X. son
las fuerzas generalizadas que actúan sobre el sistema,,
Como el solvente no sedimenta en los campos centrífu
gos utilizados en el estudio de biopolímeros, la conducta
del sistema vendrá totalmente determinada por la de los
solutos, así que al solvente lo denominaremos componente
cero y nos desocuparemos parcialmente de él.
Por suponer lineal el sistema, podemos escribir:
q
J = I (L ) X , (lio 2.9)
1=0
teniendo en cuenta que esta ecuación sólo es válida p<.-"-.
pequeños X , es decir, en la proximidad del equilibrio.
Entonces
q q
T o = X I (L.. ) X.X, (11,2,10)ík i k
i=0 k=0
con
f 1 \ í T \ { T T O 1 1 \\ - L J - - J 7 — \ h. . J t ^ 1 1 • £. o I I y
ya que en estas condiciones se cumplen las relaciones de
reciprocidad de Onsager,
Si suponemos que el sistema sedimentante está en equi
librio térmico, y despreciamos las fuerzas de Coriolis,
las fuerzas generalizadas serán los potenciales gravita-
1 9
cional, eléctrico y químico. En consecuencia,
q -
T<7= 2 (j.)a [ (1 - v i P ) W2 r - 2 i _ e
i=0 i
(II.2.12)
donde (j.) se refiere al flujo relativo a un determina-i a (
do sistema de referencia (a), v es el volumen específico
parcial, p la densidad de la solución, z la valencia -
del ion, M el peso molecular del soluto, e la carga por
mol de protones, d(p/c)T el gradiente de potencial electros
tático, y f¿. el potencial químico por gramo, que se puede
expresar en la forma
u, = « + - ~ - ln y, c. , (II.2.13)
siendo /u un potencial químico de referencia, y. el coe
ficiente de actividad y c. la concentración en g.l
Llamando potencial total por gramo a
2 2 z .(II.2.14)
y, suponiendo que v y n son constantes en toda la célu
la para hacer posible la anterior integración ímplicita,
se obtiene:
q n ~
T a = - I (Ji)a ( ^ — ) t • (II.2.1
i=0
20
Supongamos, de momento, que el sistema no contiene so
lutos ionizables, es decir, z.= 0 (i= 1 , ..., q).
Tomando el solvente como sistema de referencia de los
flujos (componente cero), esta ecuación se reduce a q flu
jos y q gradieites:
(11.2.16)
siendo (j ) = 0 .
De acuerdo con la expresión de producción de entropía,
_./ dr = X., y, en consecuencia,
j - .
i ulk>0 (-*r
con
(L ) = (L1 .) (11*2,18)
Sin embargo, la observación obliga a utilizar flujos
relativos a la célula. Para obtener éstos, y supuesto que
nos encontramos en equilibrio mecánicot es decir, do>/dt=0,
se puede usar el teorema debido a (PRIGOGINE, I.; 1947) -
(DE GROOT, S.R.; 1951), que permite expresar los flujos en
función de la velocidad media de volumen, definida como:
q
v1 = I v,J. (II.2.19)
j=0
21
Es fácil demostrar (HOOYMAN, G.J. y otros; 1953) que
esta velocidad media se hace cero si se pueden despreciar
los efectos transversales debidos a las fuerzas de Corio
lis, y si, al mismo tiempo, los volúmenes específicos par
ciales v. no dependen ni de la presión ni de la concentra
ción.
Aceptadas ambas suposiciones, se obtienen los flujos
relativos a la célula mediante la expresión:
J± = (J ±) o + c.vo (II.2.20)
donde v es la velocidad del solvente con respecto a lao
célula.
Multiplicando la ecuación (II,2»20) por v., sumando
sobre todos los componentes, y teniendo en cuenta la -
ecuación (II.2.1 9) y que £v.c.=1 (HOOYMAN, G.J. y otros;
1953), se obtiene:
q
V Q = - X v . ( j . ) o ( I I . 2.21)
que conduce a la siguiente expresión para los flujos re
lativos a la célula:
J i = ~ Z L ik ( ¿/r } t ( i = 1 , . . . , q) (II .2.22)
1=1
siendo
Lilc -
22
Hay que hacer notar que estos L , tras el cambio de
sistema de referencia, no satisfacen-la ecuación de pro-
ducción de entropía, y, por lo tanto, no cumplen
ik ki
debido a la introducción de una referencia ajena al sis-
tema.
Como lo que nos interesa es encontrar un conjunto de
ecuaciones para el flujo relativo a la célula, ésto no
parece demasiado importante. Además la mayor parte de
las veces, las L. . se eliminan de un modo u otro.
Una ecuación de flujo para sistemas multicomppnentes.
Para el investigador experimental, es necesario expre
sar la ecuación del flujo en una forma que contenga mag-
nitudes directamente medibles y el menor número posible
de coeficientes desconocidos. Examinemos ahora las varia
bles y coeficientes de esta ecuación,
í 2J i = 2 Lik j d - v k p ) a ) r - Z
(11,2.25)
23
siendo
Si consideramos a de ./ dv y a w r como variables y a
los otros términos como coeficientes, una forma práctica -
para la ecuación del flujo es:
q- de.J± = ciSi£/r
(II.2.27)
siendo
— i — 2 L (J - v /?) i = 1 , . . o , q (II o 2.28)1 k=1
D . . = E ^fc/'V i,j = 1, ..., q (II. 2.29)
k=i
Hay que hacer notar también que, por ser funciones de
L..« s. y D.. dependerán del sistema de referencia, de T,
P y de la composición»
Es de destacar que a partir de las ecuaciones de s. nc
se pueden determinar los L.., pues para un sistema de ai n -
solutos hay q coeficientes de sedimentación, pero hay q
coeficientes fenómenológicos, con tan sólo ¿q(q+i) res-
tricciones debidas a las relaciones de reciprocidad, que
24
son aplicables deshaciendo el cambio de sistema de refe-
rencia» Entonces, excepto en el caso de q=1, no se pue-
den obtener más que combinaciones de L a partir de los
S . oi
Sin embargo, a partir de los D. . sí se pueden obtenerij
los L .. , aunque ésto requiere conocer los a ... , cosa re-
cientemente posible también para DNA (STRASSBURGER, Js
REINERT, K.E.; 1 971 ) =
Ecuaciones para los pesos moleculares.
Comentaremos primero el caso clásico de un sistema bi
nario (q=i). Las expresiones generales se convierten en:
(II.2.30)
(II.2.31)
Expresando Ju / de comoI i
(II.2.33)
_1ya que n está referido a concentración en gl , y sustitu
yendo L despejada de la expresión de D en la de s , se -
obtiene:
MD (1 - Vp )
3 = — (II.2.34)ET [1 + c din y / de }
que reordenada da
din y
I i J¿M = _ ( I I . 2 . 3 5 )
D ( 1 - v p )
y en el límite c —*> 0 confirma la ecuación de Svedberg (SVED
BEEG, T.; PEDERSEN, K.O.; 1940)
i k s = M (1 - ~r p )D/RT, (11,2o 36)C —* 01
única para velocidad de sedimentación obtenida sin suposi
ciones ni parametrizaciones,
Es importante señalar el paralelismo existente entre
la expresión
s1 = L^(1 - Y|p)/c1 (íi.2. 37)
obtenida aquí con la obtenida (SVEDBERG, To; PEDERSEN,
?Ce0=; 1940) a partir de teoría cinética
M1s1 = -y- (1 - vp), (II.2.38)
donde £ es el coeficiente de fricción del soluto»
26
Esta comparación permite expresar L como
~ c (11.2,39)
forma en la que se pone de manifiesto el significado fí-
sico del coeficiente fenomenologico.
La expresión del peso molecular así obtenida es un pun
to de coincidencia entre las teorías cinética y termodiná-
mica, si bien por esta última se responde a muchas cues-
tiones que no obtuvieron respuesta en la anterior, al mis
mo tiempo que permite, al menos desde un punto de vista
teórico, abordar sistemas no ideales de n componentes.
Puede ser usado el mismo procedimiento para hallar la
expresión de M, en sistemas ternarios, uno de cuyos comp o
nentes suele ser una sal monovalente. Como la expresión de
s del componente 1 contiene entonces los dos coeficientes
L11 y L12
(11,2.40)
es necesario escribir las expresiones de dos de los cuatro
D. .
fl + L /U22 (II.2.41b)
27
Según Eisenberg (EISENBEEG, Ho; 1962), L 2/c sería el
coeficiente de solvatación F (en nuestro caso, del DNA
por la sal añadida) definido como
r =M,
M
¿i(11,2,42)
donde m. es la molalidad del componente i. Esta proposi-
ción es claramente intuitiva, ya que la sedimentación de
un biopolímero produce un flujo del componente que lo sol_
vata, cuya magnitud estará indudablemente relacionada con
el correspondiente coeficiente fenomenologico„
Escribiendo L y L en función de D y JU , y sustitu
yendo en la ecuación anterior, se obtiene en el límite
lím s =O
+ °din
(II.2.43)
donde el primer corchete del producto del segundo térmi-
no es la solvatación del soluto 1 por el 2, y el segundo
28
corchete tiene en cuenta la no idealidad termodinámica del
sistema, debida al componente dos, pues para el componente
uno hemos extrapolado a concentración cero»
Es de destacar la semejanza de este resultado con las ecua
ciones que se hallan para M por sedimentación al equilibrio,
lo que es lógico, ya que estamos estudiando estados próximos
al equilibrio o
Para sistemas ternarios cargados se obtiene, por una deduc
ción formalmente equivalente a las comentadas, aunque más ela
boradaá
1
C..— O1 RT
<?D
•) p
(II.2.44)
siendo z la carga del polielectrolito y suponiendo que el com
ponente dos es monovalente,
Este último caso suele representar para los biopolímeros
la situación real, aunque siempre se asimila al sistema bina
rio, sólo obtenible en disoluciones de algunos polímeros sin
téticos o
La carencia de datos sobre la magnitud del segundo factor,
29
impide evaluar el nivel de error que se introduce en esta
aproximación, ya que los datos obtenibles por métodos no
hidrodinámicos están sometidos al mismo tipo de limitación,,
Sin embargo, la comparación de los datos experimentales
con el valor real, que se puede hallar en el caso de co-
nocer completamente la secuencia de aminoácidos de una
proteína, muestra que las diferencias entre datos experi
mentales y reales son del mismo orden que las que exis-
ten entre los propios datos experimentales» La correc-
ción introducida por Eisenberg (EISENBERG, H.; 1962) só-
lo es significativa en solventes de alta fuerza iónica,
para 0,2 M Na' también cae dentro del error experimental»
31
lio 3» MEDIDA DE LOS COEFICIENTES DE SEDIMENTACIÓN v"*;
Expresión del coeficiente de sedimentación y de la posi-
ción de la frontera.
Para medir un coeficiente de sedimentación es neces_a
rio expresarlo de tal modo que pueda ser determinado a
partir de magnitudes medibles experimentalmente. Una defi
nición frecuente de s es la de velocidad de sedimentación
por unidad de campo centrifugo, y, algunas veces, s se d_e
fine como M(i-vp)/f (SVEDBERG, T8; PEDERSEN, K.O.; 1940),
Sin embargo, las velocidades moleculares no son, en gene-
ral, directamente medibles, y la segunda definición, ni -
es general ni asequible experimentalmente.
Es posible dar una expresión experimental de s. en -
función del flujo J. si se hacen dos suposiciones: a) Exis
te una zona de la célula en la que, estando presente el
componente i, no hay gradiente de concentración; b) la
variación de c. frente a r es medible.i
A partir de estas suposiciones, y usando la ecuación
(11.2.27) para el flujo J., se obtiene
2 ^ Cis- = J./c.co r , con y ± = 0 (j = 1, . .., q)-L X X (J X
(II.3.1)
Para ver que J. es una cantidad medible, escribamos
la ecuación de continuidad (II.2.7) para los puntos r =r
(posición del menisco) y r = r (posición en que se quie¿ p =
(s) La terminología experimental que se utiliza en este -apartado, está descrita en el siguiente.
32
re medir J.):
v(rj±)r - (rj.)r = -j^r ( 5 P rc.dr), (II.3.2)
o - p rQ
que se reduce a
(rji)r = - - 4 ( j P rCidr) (II.3.3)P
o
ya que
(Ji)T, = 0 (II.3.4)~ o
Supuesto que el segundo miembro se puede conocer por di
ferenciación e integración numérica, esta ecuación muestra
que J. viene expresado en función de cantidades medibles.
En la práctica, el coeficiente de sedimentación de un S
luto se mide habitualmente a partir de la velocidad de sedi
mentación de su frontera, siendo las ecuaciones anteriores
la justificación teórica de esta metodología. Consideremos
primero el caso hipotético de que el límite sea un escalón
perfecto en todo momento, tal como muestra la figura 2: r
es la posición de la frontera y c es la concentración de s£
luto más allá de la frontera entre r y r „ En este caso, -
la integral (II.3.3) es fácilmente calculable.
rpJ" rcdr = (r2 - r|)cP/2 (II.3.5)o
FIGURA 2
(a) (b) (c)
P JP P
Diagramas de concentración frente a distancia para ciertos tipos de fronterasr es la posición del menisco, r~ la posición de^la frontera, r,, está en unar§gion (p) donde no hay gradiente de concentración» (a) Frontera hipotética,perfectamente escalonada (no hay difusión)» (b) Frontera típica de sedimentaclon (c=0 en r ) . (c) Tipoferióte de cerb a lo largo
de frontera formado por pequeñas moléculas; c di—del experimento en r
34
A partir de la ecuación de continuidad y de la expre-
sión general del flujo, es inmediato obtener que, en la z_o
na de gradiente nulo, se cumple
¿7c de——nr = - 2 <*> c-s- ; c o n "i = ° (11.3.6)¿rt 1 1 ' ¿/r
Sustituyendo (II.3.5) (II.3.6) y (II.3.1) en (II.3.3),
se obtiene
(11.3:7)
La ecuación (H.3.6) muestra que la concentración varía
con el tiempo en la zona de plateau. Esto es consecuencia
de que la ecuación de continuidad está deducida para una ce
lula de forma sectorial, (II.2.1), La combinación de las ex
presiones (II.3.6) y (II.3.7) da
c Pr| = c°r2o (11,3,8)
siendo c la concentración inicial de soluto, que es la co-
nocida ley de la dilución radial, aplicable tanto si varía s
con c como si no0
En general, las fronteras no son perfectamente escalona-
das, sin embargo, como Goldberg (GOLDBERG, R0J»; 1953) ha de
mostrado, es posible usar la ecuación (11,3.6) para definir
una "posición de la frontera escalonada equivalente", para -
la cual es válida la misma expresión del coeficiente de sedi.
mentación s .
35
Cuando la frontera se separa del menisco, es habitual
sustituir rc por r , la posición del máximo del gradienter H
(coincide con la posición del máximo del pico de Schlieren,
primer sistema óptico utilizado), siempre y cuando la fron
tera sea simétrica. La estimación del error que se comete
con este cambio, se obtiene integrando por partes el pri-
mer miembro de la ecuación (II.3.5):
^ cP (II.3.9)o r
o
En una frontera simétrica, r coincide con r, el pri-H
mer momento, Jado por
Y' -7
r = í F r -¿ dr / cp (II. 3.10)T
O
La posición de la frontera puede relacionarse con r a
partir de la ecuación (II.3.9), sin más que tener en cuenta
que en r , c=0:
2 —2 2r. = r + o (II.3.11 )
siendo
a2 = J p (r-?)2 - ^ dr / cP (II.3.12)ro
36
Diferenciando la ecuación (ii.3.11) respecto al tiem2 2 ~"
po y dividiendo por 2 OJ r , resulta
1
?OJ V
f
d r f
d t
r p
" f
1
. ( 2 _60 r
d r
d t 2
1
2CU
2r f
(
d a2
d t
II.3.1 3)
Si llamamos s' ai coeficiente de sedimentación aparen-_ 2—
te obtenido a partir de (dr/dt)/o> r, la ecuación (II.3.13)
se convierte en
2 o>"sr „ dt—+ ... (H.3.14)
En el caso de un único soluto con s y D constantes, se
le demos 1
ne dada por
2puede demostrar (WILLIAMS, J.W; y otros, -1958) que a vie
a2 = — \ (e2sc°2t-i) + ... (II.3.15)s OJ
con l o que l a ecuación ( n . 3 . 1 4 ) se c o n v i e r t e en
( D / s w 2 r 2 J - o » . ( I I . 3 . 1 6 )
37
o bien
~ = 1 - (RT/M(i-v/?))co2r| (II.3.17)
expresión que coincide con la hallada por Lamm (LAMM, 0.;
1929) al estudiar la posición del máximo del gradiente da
do por la ecuación de Fax en (FAXEN, H.; 1929) para un úni
co soluto con s y D constantes.
La ecuación (II.3.16) está limitada a fronteras simé-
tricas, en las que r = r , pero, de acuerdo con Williamsri
(WILLIAMS, J.W.; 1958), es aplicable también a sistemas -
polidispersos y dependientes de la concentración (no idea,
les).
El término de error de la ecuación (II.3.17) es apro-
ximadamente el 0,1% para un soluto de M=60.000, si<x>=60.000
rpm y 1-v£>=0,25. Teniendo en cuenta que nuestras molécu-
las de DNA tienen un M de, al menos, dos órdenes de magni
tud mayor, se comprende que este error es despreciable. E_s
ta deducción es totalmente válida para la curva integral
obtenida con el explorador fotoeléctrico, pues si la cur-
va diferencial es simétrica, rTI=r_^0/.ri 3U/0
Evolución temporal de la posición de la frontera.
Cuando s puede ser tratado como una constante, indepen
diente de r y t, y co no varía con t, la integración de la
ecuación (II.3.7) es inmediata;
38
In (ry'r ) = stu2t , (II.3.18)
que indica como se desplaza la frontera con el tiempo.
Pero, en general, el coeficiente de sedimentación depen
de de la concentración, y ésta varía con el tiempo- Alberty
(ALBERTY, R.A.; 1954) ha demostrado que se puede expresar s~
como una serie de potencias de c y hallar los coeficientes
de esta serie integrando la ecuación (II.3.6). Por ejemplo,
si s depende de c en la forma
s = s (1-k c-k c") (11,3.19)
p]a dependencia de s* con t viene dada por
sp= s+ [ i+2(s° OJ x.) [ k.]co+2k (co)~]+ ...] (II. 3.20)
siendo
s+ = s° [ 1-kiCO-lc2(c
O)2] (II.3.21)
es decir, el coeficiente de sedimentación inicial. El error
que se comete al hacer la aproximación s =s es desprecia-
ble (sobre todo en soluciones de DNA, donde usando absorción
ultravioleta pueden emplearse concentraciones muy bajas) ya
que los demás términos son cuadráticos en s , es decir, del— ? f)
orden de 10 . Para disoluciones de DNA, esto ha sido com-
probado experimentalmente (SCHUMAKEK, V.N.; SCHACHMAN,
M.K.; 1957).
La posición de la frontera se halla sustituyendo la ecua
39
ción (II. 3.20) en la ecuación (H.3.7), e integrando:
in (r£/rQ) = s+co2t + s+s°(o;2t)2 [ 1 c°-i-21<2(c
O)
(II.3.22)
donde, por la misma razón anterior, se aproxima la suma
del segundo miembro al primer sumando, con lo que la úni
ca diferencia entre este caso y el más sencillo de la -
ecuación (II.3.18) estriba en la dependencia de s con c,
Han sido discutidos varios métodos para medir coefi-
cientes de sedimentación a partir de estas ecuaciones»
También se ha integrado de un modo análogo la ecuación
(II.3.7) en los casos s=s /(1+Icc)y s=s (i-kc)y ha sido es
tudiada la relación entre ln(r /r ) v t para el caso enH o
que s=s (1-kc).
La consideración de la dependencia de s con la presión
modificaría profundamente este análisis. En primer lugar,
como hemos visto (II.2.20), la ecuación básica para el flu
jo relativo a la célula es aplicable solamente si el volu-
men específico parcial no varía significativamente con la
presión. En segundo lugar, (BRIKSON, A.F.V.; 1956) (FUJI
TA, H.; I956)se ha demostrado que una consecuencia de la d_e
pendencia de s con P es la aparición de un gradiente de con
centración continuo entre la frontera y el fondo de la cé-
lula. En estas circunstancias, la ecuación (II.3.1) no da
una definición experimental de s y la ecuación (II.3.5) no
define la posición de la frontera. Una aproximación al pr£
blema sería resolver la ecuación de continuidad en el ca-
so de que s sea una función empírica de la presión.
A O
Para un sistema poiidisperso, además del coeficiente de
sedimentación medio, a veces es interesante estudiar alguna
otra propiedad, tal como, por ejemplo, la posición de la -
mediana o máximo ordinario de la distribución simétrica de s.
En una primera aproximación, r_. se corresponde con el máximoti
ordinario de esta distribución, pero se demuestra que sólo
hay una correspondencia estricta a tiempo y concentración ce
ro. Así pues, sólo en estas condiciones, el coeficiente de s£
dimentación de una muestra polidispersa, medido a partir -
de dr /dt se corresponde con el máximo ordinario de la dis-
tribución de s.
41
II.4. METODOLOGÍA E INSTRUMENTACIÓN DE LA SEDIMENTACIÓN
-A-) Metodología
Ciando se somete a una solución de DNA (en general de
cualquier polímero) a un fuerte campo centrífugo (100.000
-300,000 g), las moléculas de soluto se mueven a lo largo
de un camino radial a través de la solución, hacia la pe-
riferia de la célula de sedimentación. La velocidad alean
zada por una molécula, además de por su posición radial,
viene determinada por la velocidad tú del rotor, la diferen
cia de densidad entre soluto y solvente y por el peso mol_e
cular 3/ la forma del DMA» Por tanto, dados solvente y ve-
locidad tú , el comportamiento de una solución de DNA vie-
ne caracterizado por el peso molecular y la forma de las
moléculas, a través de su coeficiente de sedimentación.
Conforme progresa la sedimentación, en las proximidades
del menisco (separación entre las regiones 2 y 3 (fig. 3)),
se produce un decrecimiento de la concentración. Como, pa.
ra el DNA, la sedimentación es mucho mayor que la difusión
desde las regiones de alta concentración a las de baja, la
concentración de soluto en el menisco tiende a cero, produ
ciéndose una zona, cada vez mayor, de solvente puro (región
A de la figura 3).
A mayores distancias del eje de giro, existe una zona
de concentración constante, la llamada meseta o "plateau"
de concentración hacia cuyo final sube bruscamente la con
centración, debido al soluto acumulado en el fondo de la
célula (región C de la fig. 3). En cualquier instante, la
1 o — E j e de ro taci ón2O— Burbuja de aire3.- Solución4.- Fondo de la célula5.- Dirección del haz luminoso
K>
FIGURA 3
43
concentración permanece constante en la meseta,pero confor
me pasa el tiempo, debido a la forma sectorial de la célu-
la, existe un pequeño efecto de dilución.
Entre ambas regiones de la célula (A y c) , hay una zona
de transición en la que la concentración varía con la dis-
tancia al eje de rotación. Esta región es la que llamare-
mos "frontera" o límite de sedimentación.
Los coeficientes de sedimentación, calculables mediante
observación por métodos ópticos del movimiento de esta fron
tera, deben corregirse a las que se denominan condiciones
estándar (COATES, J.H.; 1970) (SCHACHMAN, H.K.; 1957), para
obtener el valor que tendrían en un solvente con una dens_i
dad y viscosidad iguales a las del agua a 202C0 Esta norma,
lización viene impuesta por el hecho de que las correlacio
nes empíricas entre el coeficiente de sedimentación y el -
peso molecular habitualmente empleadas para el cálculo de
M, están establecidas en estas condiciones»
Las correcciones del coeficiente observado, s , , sonobs
donde T}./nori es el principal factor de corrección, corres't '¿o —pondiente a la viscosidad del agua a t^C relativa a la de
(aO202C; r\ /r¡ es la viscosidad relativa del solvente al -
Consideraremos como solvente la solución salina en quese encuentra el DNA.
44
agua; y p y p^ son las densidades del agua a 202C y del
solvente a t^C, respectivamente» v es el volumen específico
parcial del DNA en el solvente de referencia, y se supone
implícitamente que tiene el mismo valor que en el solvente
usado en la experiencia.
En realidad, esta corrección, así expresada, debería
hacerse después de la extrapolación a concentración cero
que a continuación comentamos, pero como ambas correcciones
son independientes y van a significar multiplicar el s nobs
por sendos números, no importa el orden en que se lleven a
cabo.
Dependencia con la concentración.
Experimentalmente se ha comprobado que existe una gran
dependencia del coeficiente de sedimentación del DNA con -
la concentración de la solución. Este efecto es debido a la
no idealidad termodinámica de estos sistemas (EIGNER, J.; y
otros; 1962) (EIGNER, J.; DOTY, P.; 1965) (BLOOMFIELD, V.Á.;
1968) (CROTHERS, D.M.; ZIMM, B0He; 1965).
Para determinar el s correspondiente a una molécula -
aislada y sin perturbar por las demás, deben medirse los -
coeficientes de sedimentación a diferentes concentraciones
y extrapolarlos a dilución infinita.
Fue visto (EIGNER, Jo; y otros; 1962) que 1/s es lineal
frente a c, cumpliéndose la ecuación
1/s = 1/s .(1+Kc) (II.4.2)
45
en la que se ha comprobado empíricamente que para una gran
cantidad de biopolímeros, entre ellos el DNA, K es propor-
cional a la viscosidad intrínseca de la solución (que debe
ser expresada en unidades inversas a las de concentración
empleadas):
K = k[rj\ (II.4. 3)
Eigner, Schildlcraut y Doty (EIGNER, J.; y otros; 1962)
han mostrado que para DNA nativos, con pesos moleculares -
entre 0,3 y 30 Mdalton y de varios orígenes, k es aproxima
damente constante, y vale 0,8+0,1 o Estudios con DNA de bac
teriófagos de peso molecular del orden de 130 Mdalton, da-
ban un valor más alto, que, de acuerdo con Aten y Cohén -
(ATEN; J.B.T.; COHÉN, J,A.; 1965) es de -0,97+0,15. Sin em
bargo, en el Grupo de Biofísica de la JoE.N. estamos some
tiendo a crítica esta constante, habiendo encontrado una
dependencia de su valor con el peso molecular y, probable
mente, con la heterogeneidad de la preparación»
De esta imprecisión en el valor de k, se deduce que,
para obtener resultados aceptables a partir de esta fórmula
de extrapolación, deben usarse concentraciones muy bajas de
DNA, inferiores a 10 ^¿g/ml. En cualquier caso, siempre es
recomendable hacer esta extrapolación, cuya magnitud puede
observarse en nuestros resultados experimentales.
Esta dependencia del coeficiente de sedimentación con
la concentración da lugar a dos fenómenos importantes:
a) E_fec_to_de estrechamiento de_JLa_frontera
Al ser el coeficiente de sedimentación observable inver
46
sámente proporcional a la concentración, en las regiones -
próximas al plateau, el DNA sedimenta más despacio que en
las próximas al solvente puro, obteniéndose una frontera -
más brusca de lo que correspondería a la homogeneidad del
soluto (BALDWIN, R.; 1954).
b) Efecto de Johnston-Ogston
Johnston y Ogston han mostrado (JOHNSTON, J0Pa; OGSTON,
A.G.; 1946) (ROSEMBLOOM, J.; SCHUMAKER, V.N.; 1963) que, -
en sistemas de dos componentes, si el coeficiente de sedi-
mentación del componente lento es mayor en ausencia que en
presencia del rápido, aquél se acumulará detrás de éste, dan
do lugar a una frontera escalonada» Este efecto también apji
ece en una frontera continua cuando el soluto que sedixnen
ta es heterogéneo, pero, al tener una distribución continua
de coeficientes de sedimentación, los escalones no son visi
bles.
Dependencia con la velocidad angular
De acuerdo con los datos de Eigner et al» (EIGNER, Jo;
1962) existe una dependencia del coeficiente de sedimenta-
ción y de la forma de la frontera con la velocidad angular
del rotor. Este fenómeno es más pronunciado a altos pesos mo
leculares y a altas concentraciones de DNA; para M menor que
16 Mdalton, s es prácticamente constante entre 20,000 y -
40.000 rpm y, a partir de aquí, empieza a crecer; para M muy
grande este efecto es importante siempre (EJGNER, J,; 1962)
(BLOOMFIELD, V.A.; 1968).
Consideraciones teóricas (ATEN, J.B.T.; COHÉN, J8A0; -
47
1965) (ROSEMBLOOM, M OJ.; SCHUMAKER, V.N.; 1963) parecen
descartar la posibilidad de que esta dependencia se deba a
un alineamiento hidrodinámico de las moléculas de DNA, y
se apuntan las posibilidades de corrientes de convección o
la.formación reversible de agregados intermoleculares depen
diendo de la velocidad.
Cualquiera que sea la causa, en la práctica estos fenó
menos pueden ser evitados trabajando a velocidades por de-
bajo de 15 = 000 rpm y a concentraciones menores de 20 /iig/ml»
Las inestabilidades de la frontera (tales como reversión
de la sedimentación o ausencia de ella) encontradas por Eig
ner (EIGNER, Jo; 1962) y otros investigadores a tan relati-
vamente bajas velocidades, creemos haber hallado, de acuer-
do con otros autores (TRIEBEL, H.; 1972), que, al menos en
parte, son debidas a corrientes de convección producidas por
imperfecciones del sistema termostatizador de la tiltracen-
trífuga Beckman, modelo E,
B) Instrumentación (MODEL E INSTRUCTION MANUAL)(PHOTOELEC-
TRIC SCANNING SYSTEMo INSTRUCTION MANUAL)o
Para nuestros trabajos en sedimentación hemos dispues-
to de una ultracentrífuga analítica Beckman, modelo EQ En
este modelo, el material bajo estudio se coloca en la pie
za central, (fig0 4), recipiente especialmente diseñado pja
ra ello (generalmente con forma sectorial para evitar las
corrientes de convección que se producirían por interacción
de las moléculas sedimentantes con las paredes) en el centro
de la célula de centrifugación. Esta está construida de tal
modo que permite el paso de luz a su través» Una vez montada,
áS
FIGURA 4 (*)8 9
!„- Monocromador2.- Lente colimadora3»- Célula de dos sectores4« — Contrapeso5.- Lente condensadora6«- Espejo7o- Lente de cámaraSo— Imagen compuestaQo- Fotomultiplicador
(±) Beckman, Photoelectric scanning system. Instruction Manual p. 2-2
49
la célula se coloca en uno de los agujeros del rotor, es
tabilizando éste mediante un contrapeso adecuado colocado
en el agujero opuesto. Se instala, entonces, el rotor en
la cámara; se le sujeta al eje de giro; se hace vacío y
se le acelera hasta conseguir la velocidad deseada»
Al progresar la rodada, los instrumentos componentes a_c
túan para mantener óptimas las condiciones experimentales:
el sistema de control de la velocidad minimiza cualquier -
variación de la misma, bien sea por fricción o por cambios
de voltaje; el sistema de vacío mantiene la presión de la— 3
cámara a 10 torr; y el sistema de control de temperatura
mantiene al rotor a la temperatura deseada, eliminando cual
quier variación debida a fricción o conducción de calor»
Bajo estas condiciones, la solución está siendo someti_
da a altas fuerzas centrífugas, que producen la sedimenta-
ción de las moléculas o La luz procedente de la fuente del
sistema óptico, atraviesa la porción transparente de la ce
lula de centrifugación y nos permite segLiir el movimiento
de las partículas observando la variación de intensidad lu
miñosa que, fotoeléctricamente, produce en un registrador
una gráfica de absorción frente a distancias radiales en la
célula»
El sistema de control de velocidad es electrónico, y -
básicamente consiste en una lámpara, un fototransistor y -
un disco interruptor de haz, los cuales van montados en la
parte superior del eje irr^ilsor del rotor, Al girar, el dis
co interrumpe o deja pasar, de un modo alternativo, la luz
desde la lámpara al fototransistor. La frecuencia variable
producida por éste, es convertida en un voltaje proporcio-
nal a la velocidad del rotor, que está siendo continuamente
50
comparado con un voltaje estable de referencia, correspon-
diente a la velocidad escogida con el selector. La máxima
desviación permitida respecto al valor escogido es de ¿0,15%
El sistema de vacío está formado por dos bombas, una -
mecánica y otra difusora conectadas en serie, que permiten
vaciar y mantener la cámara del rotor a una presión de 1 0
torr.
El sistema de control de la temperatura consta de dos
unidades: unidad de refrigeración y unidad de ICTR (indica
dora y Controladora de la Temperatura del Rotor,)
La unidad de refrigeración es un sistema normal de gas
Freon, cuyo serpentín rodea la cámara por su parte exterior,
y actúa permanentemente»
La ICTR consta de un circuito de calefacción., cuyo ele-
mento calefactor está en el interior de la cámara, controla
do por un circuito'de medida, cuyo elemento sensible (aguja
semiconductora) está montado sobre el rotor y en contacto -
con el circuito a través de una copa de mercurio»
El sistema óptico está esquematizado en la figura 4. La
lámpara es de mercurio y xenón a muy alta presión, con cu-
bierta de cuarzo. El monocromador es el mismo usado en el
espectrofotómetro Beckman, modelo DU (de prisma), con lige
ras modificaciones para facilitar su manejo, dada su sitúa
ción en la ultracentrífuga. Permite seleccionar longitudes
de onda muy puras entre 265 nm y 440 nm,
En nuestro trabajo hemos usado el rotor analítico AN-F,
de titanio, con cuatro agujeros (tres para las células y -
uno para el contrapeso)»
Las células consisten en un complicado conjunto, cuyo
montaje se corresponde con el de la fig. 5. Hemos utilizado
siempre ventanas planas de zafiro y piezas centrales Epon-
i-1 C;I . ;RA
1 ''
1 4 - -
— ' t u e r c a— Junta de tuerca
- >o p o rte de ve n t ana
— -Junta de vent.ana
- Alineador de ventana
- \entana
— -/unta de pieza cen-
tral.
- P i e/. a cent i-a I
— -Junta de P i e / a c e n -t r a l .
- \ e n t a n;:— Al i. neador de v e n t a n a- -Junta de vent.ana-• S o p o r t e de v e n t a n a
( i J i ndro de a i o j a -m i en t o .• Jun t a de l o vn ¡Lio[oi-ni 1 Lo de l a g u j e -ro de í 1 enacio .
\±) Bcckman . Mod(>! {• . A n a i y t i c a i u 1 t r a c e n Lr i ru j i eM a n u a J . p á y . 2-S
I n s t r u c t i o n
rellenas de dos sectores (uno para el solvente y otro pa.
ra la solución) para obtener una buena línea de base.
El contrapeso es un cilindro de aluminio con un orificio
central en el que se pueden roscar diferentes tornillos de
latón, de peso conocido, a fin de equilibrar el rotor en su
giro o Sin embargo, su importancia principal le viene confe-
rida por dos pares de agujeros que tiene, colocados de tal
modo que, superponiendo el contrapeso y una célula, quedan
al principio y al final de cada sector. Al pasar la luz por
estos agujeros, produce dos señales en el registro ("refe-
rencia interna" y "referencia externa" en la fig. 6) que -
nos permiten: 12) saber donde empieza y termina el registro
de los sectores; 22) conocida su distancia al eje de giro
del rotor (5,66 cm. en nuestro caso), convertir las distancias
del registro en distancias radiales reales.
El sistema de detección compara las intensidades lumino
sas que salen de los dos sectores de la célula. Básicamente,
realiza las funciones de un espectrofotómetro de doble haz,
aunque sin separación de haces, gracias al giro del rotor
y a la porción de pieza central comprendida entre ambos se_c
tores, que es la que corta la señal luminosa.
El modo de trabajar de este- sistema es el siguiente:
Una imagen ampliada y compuesta de los sectores de la
célula y los agujeros del contrapeso, es proyectada por el
sistema óptico sobre el plano focal de la "lente de cámara".
En este plano se monta un fotomultiplicador móvil que reco-
rre la imagen desde el agujero de referencia externo hasta
el interno (del fondo de la célula a la superficie), y vuel
ve automáticamente a su posición de partida.
Gracias al giro del rotor, la imagen de la célula se -
-•) j
FIGURA O
Ref. Interna
Par-te &up. de
la célula
Menisco ^oLu-cí ón—ai re
Gráfica de con-centración
Derivada
Fondo de lacélula
Ref, externa
Dirección de
sedimentac i ón
Marcas de
<• I pos.?' c i ón
Menisco ai re-solvente
.Sol vente-
Frontera
Cal i bración
Cero O.D.
Ü.2 O.D.
;*) A manual of methods for the analytical ultracentrifuge. pág. 15
Chervenka C.H. Ed. Beckman, Palo Alto, California.
54
mueve verticalmente a través de la rendija del fototubo, -
el cual detecta separadamente el nivel de luz de cada punto
de los sectores de la pieza céntralo
Los impulsos de voltaje del diagrama de la figura 7 repre
sentan la salida del preamplificador del fotomultiplicador,
en una posición radial concreta, a medida que la imagen de
la célula pasa por delante de la rendija. La altura de estos
impulsos es directamente proporcional a la intensidad de la
luz transmitida, y su secuencia en el tiempo es la siguiente:
1 o- No hay impulso: El sector A, que contiene la muestra, se
aproxima a la rendija del fotomultiplicador.
2o- La altura del impulso A aumenta al ir pasando el extremo
del sector A sobre la rendija,
3»- La altura del impulso A es máxima cuando el sector A es-
tá centrado sobre la rendija0
4.- La altura del impulso A disminuye según el sector A aban
dona la rendija.
5o- No hay impulso cuando la separación entre sectores atra-
viesa la rendija,
6,7,8o- Se repite el proceso para el sector B que contiene
el solvente.
Los impulsos procedentes del fotomultiplicador son proce-
sados por el circuito electrónico cuyo diagrama se presenta
en la figura 8, Después de atravesar el preamplificador, los
impulsos pasan a través de un amplificador logarítmico, y
son llevados, por una parte, hacia el circuito de control
de voltaje del fototubo, y, por otra, al circuito lógico y
al de puertas o Los impulsos A y B son reconocidos y separa-
dos por un circuito conmutador de alta velocidad. La sección
lógica de este circuito sincroniza la conmutación con la ro-
6-Z 'SUIUUBOS oT.aq.Daiaoq.OTJj °
tnC 3
ss
FIGURA 8(*)
FOTOMULTIPLICADOR
O
CONTROL VOLTAJEDEL
FOTOMULTIPLICADOR
GENERADOR DE
PULSOS ESTÁNDAR
ATENUADOR
PRE-AMPLIFICADOR
PUERTAS
LÓGICA
AMPLIT'ICA-DOR LOGARITMICO
CANAL B
Oí
FILTRO
REGISTRADOR
(±) Beckraan, Photoelectric scanning system, Instruction Manual, pág. 2-ji
57
tación del rotor, independizando el funcionamiento del sis
tema de detección de la velocidad angular del rotor. El -
circuito de puertas, dirige estos pulsos separados hacia
diferentes canales, donde son almacenados, alargados lo su
ficiente para ser restados con exactitud, y, finalmente,
restados. La salida de este circuito, después de filtrada,
es la que mueve la pluma del registrador. Esta señal tam-
bién puede hacerse pasar por un circuito diferenciador, cu
ya salida mueve otra pluma, la del "circuito derivada".
Un circuito independiente de calibración proporciona
al sistema electrónico una serie de impulsos de corriente
proporcionales a los cambios de densidad óptica en la célu
la. Estos impulsos nacen en el fotomultiplicador, como res
puesta a la luz que pasa a través de los agujeros externos
de referencia, y recorren los mismos circuitos que las se-
ñales provinientes de la imagen de la célula. La salida -
de este circuito de calibración produce sobre la carta re
gistradora una serie de escalones, cada uno de ellos propor
cional a un cambio de 0,2 D.O. en la célula.
El sistema de detección va acompañado de un accesorio
electrónico, el Multiplexer, que le permite identificar y
estudiar, automática y secuencialmente, cada una de las ce
lulas del rotor. Para ello, el rotor lleva en su parte su
perior un anillo de aluminio, codificado a base de zonas
claras y oscuras. Una de las zonas oscuras es más ancha que
las demás, permitiendo al Multiplexer conocer cual es la cé
lula número uno, y, a partir de ella, por las demás zonas
oscuras, distinguir a las demás. Esto se consigue gracias
a un sensor que contiene dos fototransistores, los cuales
convierten la luz reflejada por los sectores claros y oscu
58
ros del anillo en las seríales necesarias para establecer -
la secuencia de estudio.
Si bien desde el punto de vista teórico, como hemos co
mentado previamente (II.3), la estimación del peso molecu-
lar medio a partir del punto 50% de la frontera sólo es co
rrecta para muestras homogéneas o heterogéneas que presen-
ten una frontera simétrica, en la práctica, el estableci-
miento de la correlación empírica entre M y s .ha sidow 50%
hecho de modo que es independiente de la forma de la fron-
tera» Así, de acuerdo con la expresión deducida para el co_e
ficiente de sedimentación
s = (1/cü2 r ) . d r/dt
la secuencia de operaciones en orden a su determinación es
la sigua ente: (ver figura 9 y tabla II)
i) Sobre una serie de registros (del orden de 8), obtenidos
a la misma velocidad co , a diferentes tiempos, de una célu
la con una solución de DNA, se miden las distancias del pun
to 50% de la frontera y la referencia interna y externa a
una referencia arbitraria (ver figura 6).
ii) Estas distancias sobre el papel, se convierten en dis-
tancias radiales reales corrigiéndolas por el factor de am
plificación correspondiente a las condiciones que hayamos
impuesto en el sistema de registro, y sumándoles la distan
cia que hay entre el eje de giro y la referencia interna,
iii) El logaritmo neperiano de estas distancias debe ser -
lineal con el tiempo, y la pendiente de esta recta, divid_i
da por el cuadrado de la velocidad de rotación en radianes/
segundo, es inmediatamente transformada en Svedbergs sin -—1
más que dividir por 10
zo
6S
TABLA I I
t (min)
0
16
32
48
64
80
Ref. int .
0,31
0,23
0,37
0,22
0,09
0,48
cm
n
i i
ti
i i
ti
Ref. Ext.
39,70 cm
39,68 "
39,81 "
39,68 "
39,52 "
39,90 »
Valor
1 8,20
1 9 , 3 7
20,48
21 ,50
22,55
24,0
50%
cm
i i
ti
i i
Radio
6,3953
6,4455
6,4855
6,5331
6,5822
6,6260
50%
cm
i i
i i
In Radio 50%
1,8556
1 ,8634
1,8696
1 ,8769
1,8844
1 , 8910 o
61
11.5. TEORÍA DE LA VISCOSIDAD
Un líquido se caracteriza porque, si aplicamos una fuer
za tangencial F que venza las fuerzas atractivas entre mole
culas de diferentes láminas, fluye.
El fenómeno se puede poner de manifiesto al desplazar ••
paralelamente, una respecto a otra, dos superficies entre
las que se encuentra un fluido (figura 10). La fuerza nece
saria para mantener la superficie superior moviéndose con
una velocidad constante v respecto a la inferior, es pro
porcional al área de las placas y al gradiente de veloci-
dad v /d:o
F/A = f] VQ/d , (11=5.1 )
o D i en
S = 7] G , (II.5.2)
siendo S la tensión tangencial y G el gradiente de veloci-
dad. La constante rj de proporcionalidad se llama coeficierr
te de viscosidad.
Así,el coeficiente de viscosidad es generalmente consi
derado como la resistencia de un líquido a fluir cuando es,
tá sometido a fuerzas tangenciales. Sin embargo, puede de-
mostrarse que, físicamente, es un índice de la cantidad de:;
energía que se necesita para mantener una cierta velocidad
de flujo en el líquido. Por eso, cuando a un solvente le
añadimos grandes moléculas, como proteínas o ácidos nucle_i
eos, crece su viscosidad, ya que estas macromoléculas rom-.
JO
IIo
o.o
Q
>
63
pen las líneas normales de flujo del líquido y se disipa
más energía en mantener éste.
Si la situación no fuese tan sencilla como dos láminas
desplazándose paralelamente, siempre sería posible consid_e
rar un elemento de volumen rectangular, con sus caras para,
lelas al flujo. La expresión (II.5.1) se convierte en este
caso (fig. 11) en
AF/AA= 7] Av^/ Ay = X] J v y dy , ( I I . 5 . 3 )
si el flujo tiene lugar en la dirección x0 En el caso gene
ral tendremos
dv ¿7vvJL •"•} ( l i o 5 « 4 )s _ f, (_^«JL + ,
xy ' <7X dy
y expresiones análogas para s y s oy z xz
Un caso particularmente importante, ya que es la base
teórica de nuestro método experimental, lo constituye el
movimiento de un líquido entre dos cilindros coaxiales -
(fig. 12) (FEYMAN, RoP=;y otros; 1969)»
De la simetría del problema se deduce que el flujo es
tangencial, y que su magnitud depende sólo de r:v = v(r).
Sea un punto del fluido. Sus coordenadas en función del
tiempo son:
X = r eos cota) - v / r ( I I . 5. 5)
y = r sen OJX
f—i >
+£><
t—i
a
y las componentes de la velocidad:
v = -rCÚ senwt = -coyx J
( I I . 5 . 6 )
V = TOO COS Cüt = OJ X
De la ecuación (II.5.4) se deduce
= í )
Sobre cualquier radio, y, en concreto, en el que cumple
y=0, ooj/oy = 0, con lo que (II.5»7) se convierte en
( S x y ) y = Q = rjr da)/dr, (II.5.8)
y dada la simetría, la tensión tangencial es la misma alre-
iedor de todo el cilindro.
El momento que actúa sobre la superficie cilindrica es
el producto de la tensión tangencial por la distancia r y
por el área 2 7rrl, obteniéndose:
M = 27rr2l(S ) = 27TTjlr3 do>/dr (II.5.9)
Si el movimiento del líquido es estacionario -no hay
aceleración angular- el momento neto sobre la hoja de flui
lo entre r y r+dr debe ser cero, o sea, debe ser independien
;e de r,
:e B, y
o
;e de r. En otras palabras, r da>/dr es igual a una constan
dco/dr = B/r3 (II. 5.10)
67
e integrando,
Cú = -B/2r2+C (II. 5.11 )
B y C se determinan f i j ando l a s condic iones a) = co
para r=a y OJ = OJ para r=b . Obtenemos:
B = 2cy2h2{üJy-co ) / ( b 2 - a 2 )D a
C = {h2a)-eL2a) ) / ( b 2 - a 2 ) ( I I . 5 . 1 2 )b a
y e l momento:
M = 27TT] IB ( I I . 5.1 3)
M = 47r77la 2 b 2 (co , -co ) / ( b - a )
que es proporcional a la velocidad angular relativa de am-
bos cilindros, e inversamente proporcional a la diferencia
de los cuadrados de los radios.
De la expresión (II.5.1) se obtiene que las unidades de_2
r] son (se suele usar el sistema C.G.S.) din.seg.cm o poi-
se. La viscosidad del agua a 202C es aproximadamente 1 cen-
tipoise, y ésta es la unidad comúnmente usada.
Llamamos líquidos newtonianos a aquéllos que presentan
una viscosidad constante, independiente de la fuerza tangen
cial aplicada. La conducta no newtoniana viene caracteriz_a
da por un cambio en la viscosidad al cambiar la tensión tan
68
gencial, y puede ser debida a varias causas. En disolucio-
nes de macrcmoléculas, que es nuestro caso, es debida gene_
r-almente a un alineamiento parcial de las moléculas asimé-
tricas como consecuencia del gradiente de velocidad, con -
lo que se reduce su contribución a la fricción interna de
la solución. En ausencia de este alineamiento, las asimétri
cas, como por ejemplo el DNA, están sometidas a un movimien
to browniano, y, a consecuencia de la rotación sobre sí mi_s
mas, ocupan un volumen efectivo mayor que el geométrico.
De este modo, interceptarán un mayor número de líneas de -
flujo, y su viscosidad será mayor que la de partículas es-
féricas de su misma masa molecular. Sin embargo, hacemos -
notar que el hecho de que este fenómeno presente una depen
dencia con la concentración, de modo que disminuya con és-
ta, hace pensar que también el efecto puede ser debido a -
que la tensión tangencial destruye el ordenamiento produci
do por la presencia de la macromolécula.
La adición de macromoíéculas a un solvente de viscosi-dad Í? . produce una disolución de viscosidad más alta TJ .
' o' * '
Este incremento depende de la concentración del soluto y -
de sus propiedades intrínsecas, como el tamaño y la forma.
De aquí la importancia de la viscosimetría como técnica pa
ra estudiar pesos moleculares y conformaciones.
Las siguientes expresiones son comúnmente usadas :
i) Viscosidad relativa: 77reí T7
ii) " específica: rj = 7? . - 1' esp 'reí
69
iii) Viscosidad reducida: r¡r e d
77
iv) " intr ínseca: [77] = lím lím ( *-)c-*0 S,G-*O °
La viscosidad relativa es la magnitud observada direc-
tamente. La viscosidad específica describe el incremento
de viscosidad debido al soluto macromolecular. La viscosi-
dad reducida es el incremento por unidad de concentración
de soluto añadido. Esta cantidad, extrapolada a concentra-
ción cero (para eliminar las interacciones moleculares del
soluto) y a tensión tangencial cero (para eliminar la con
ducta no newtoniana), es la llamada viscosidad intrínseca,
y, por su propia definición, será la que más directamente
nos dé información sobre el tamaño y la forma de las mole
culas del soluto o
71
II6I.6. FACTORES DE QUE DEPENDE LA VISCOSIDAD
i) Fuerza tangencial
Las disoluciones de DNA son líquidos no newtonianos.
Las moléculas asimétricas de DNA tienden a orientarse según
las líneas de flujo, con el resultado de que disminuye su
contribución a la fricción interna de la solución. Para -
muestras de alto peso molecular, la orientación persiste
incluso a muy bajos valores de la fuerza tangencial. Final
mente, a extremadamente bajos valores de la tensión tangen
cial, la tendencia a la orientación es vencida por el movi
miento browniano y la solución de DNA se comporta como un
líquido newtoniano.
Los datos de Zimm y Crothers (ZIMM, B.M.; CROTHERS.'D.
M.; 1962) que presentamos en la figura 13, muestran resul-
tados típicos de la dependencia de r\ con el gradiente
de velocidad para una preparación concreta de DNA. La pen-
diente se hace muy fuerte para valores de 6 menores que --1
20 seg , lo cual hace necesarios aparatos de muy baja ten
sión tangencial para estudiar DNA (ZIMM, B.M.; CROTHERS, D.
M.; 1962) (EIGNER, J. ; 1968).—1En la región de G comprendida entre 0,2 y 1,0 seg -
T] resulta ser independiente de la tensión tangencial.
Si no se dispone de viscosímetros capaces de trabajar en
esta región, es necesario representar los valores de TJ'esp
determinados experimentalmente, frente a los valores de S
o G a los que fueron medidos, a sabiendas de que esta ex-
trapolación conduce a valores sobreestimados de la viscosi
dad.
Gradiente de velocidad, SegT1
0,84 3.3
0.1 0.2 0.3
Tensión tangencial, din/cm2
FIGURA 13
73
El valor de G al que r\ permanece ya constante, depen
de del peso molecular. Por debajo de 2.10 dalton, el flu-_1
jo newtoniano se puede encontrar a algunos cientos de s
Para nuestro DNA de fago T2 no se encuentra sino por encima
de 0,5 s~1.
Otros varios factores influyen también en la dependen-
cia con la tensión tangencial. En general, la pendiente de
la curva de 77 frente a G se reduce a alta concentración' esp
de contraiones y baja concentración de DNA. Estas condicio
nes facilitan la extrapolación a fuerza tangencial cero.
ii) Concentración del soluto
Han sido varias las ecuaciones empíricas propuestas p_a
ra describir la variación de la viscosidad específica con
la concentración, pero la más comúnmente usada es la debida
a Huggins (HUGGINS, I.M.; 1942).
?= [r¡] + ]<• [77] c (11.6.1)
siendo l<c' la llamada constante de Huggins.
Huggins ha demostrado que esta ecuación es una aproxima
ción de la ecuación
^esp
c = W + *'W *?esP (II.6.2)
propuesta sobre bases semiteoricas por Schultz y Blachske
(SCHULTZ, G.W.; BLACHSKE, F.; 1 941) , viendo que si la 7]
74
del segundo miembro de la ecuación (H.6.2) se sustituía
usando la ecuación (II.6.1), la ecuación (11.6.2) tomaba
la misma forma que la ecuación (II.6.1), pero con un térmi
no cuadrático en c, que puede ser despreciado en solucio-
nes diluidas.
Esta aproximación ha sido, sin embargo, puesta en duda
por Ibrahim (IBRAHIM, F.; 1965), que ha comparado los val£
res de (rj) y k1 obtenidos a partir de ambas expresiones p_a
ra poli-isobutilenos, polienos y poliamidas en varios sol-
ventes, hallando diferencias de por encima del 30% para [rj]
y del 300 % para k'.
Otra ecuación que ha sido extensamente usada (KRAEMER,
E.O.T.; 1938)(MEAD, D.F.; FOUSS, E.M.; 1942) es:
1 n 77
i ¿ = [ T ] | + k " lr¡\ c ( I I . 6 . 3 )
Pero
I n r i _ = l n (1+ TI ) = rt - r\ / 2 + c . . .r e í e sp ' e s p e s p
( I I . 6 . 4 )
despreciando los términos superiores del desarrollo para -
pequeños valores de rj . Sustituyendo esta expresión en
(II.6.3) y comparando con (II.6.1) se obtiene k'!= k'-0,5.
Entonces, en el límite c-»0, las ecuaciones (II.6.T) -
(ll.6.2)(ll.6.3) son idénticas de forma, y deben dar val_o
res idénticos para [r¡] . Esto ha sido observado por Noda et
al.(N0DA, I y otros, 1967) y Kotaka et al. (I0TAKA, To y
75
otros, 1968), pero no por Ibrahim (IBRAHIM, F.; 1965)
quien sugiere que la ecuación (II.6.2) es fundamentalmente
más exacta. Sin embargo, recientes trabajos han mostrado -
que en el caso de esferas, la ecuación de Huggins tiene uní.
base teórica razonable (BRADBURY, J.M.; 1970). Bajo estos -
supuestos, se usa corrientemente la ecuación de Huggins, -
aunque en vista de los resultados de Ibrahim, es aconseja-
ble estudiar en cada caso si es posible usar esta aproxima
ción o, por el contrario, la ecuación (II.6,2). Actualmen-
te, para soluciones de DMA parece existir una creciente pr«
ferencia por la ecuación (II.6.3)(CROTHERS, D.M.; ZIMM, B.
H.; 1965), ya que, al ser l<"=k'-0,5, los errores cometidos
en la extrapolación deberían ser menores con esta ecuación
qu.e con la (11.6.1). Sin embargo, Scruggs y Ross (SCRUGGS,
R.I.; ROSS, P.D.; 1968), en un detallado estudio sobre vis
cosimetría de soluciones de DNA de bacteriófagos, comparan
ambas fórmulas y encuentran más satisfactoria la de Huggin:
(II.6.1).
Si se desea hacer experimentalmente la extrapolación -
a concentración cero, se determinan una serie de valores -•••'
de r\ para valores decrecientes de c, y se construye un.
aráfica de r] /c frente a c (Be. 11.6.1) o de T) /C -'esp 'esp
frente a T? (EC. II.6.2). Estas gráficas suelen ser li-'esp
neales para soluciones diluidas, en ausencia de agregación
u otros efectos especiales. ITJ| se obtiene a partir de la
ordenada en el origen, y kf a partir de la pendiente.
Debido a la dificultad que representa un tratamiento -
teórico, no existe una adecuada teoría para k1, excepto en
el caso de esferas solvatadas, para las que se predice un •••
lor de k'=2,0 que ha sido comprobado experimentalmente po:
76
Cheng y Schachman (CHENG, P.Y.; SCHACHMAN, H.K.; 1955). Para
DNA a una concentración 0,2 M Na se encuentra el valor k' =
0,6+0,3 tanto para el nativo como para el desnaturado. Habi-
tualmente, se ha tomado k'=0,5 (CROTHERS, D.M.; ZIMM, B.H.;
1965)(EIGNER, J. y otros; 1962).
Estudios de viscosidad en el viscosímetro de Zimm y Cro-
thers (ZIMM, B.H.; CROTHERS, D.M.; 1962), han mostrado que
tanto [Tjj como k1 dependen del tipo y concentración de contra
iones tanto como del peso molecular del DNA, de la muestra -
que se trate (ROSS, P.D.; SCRUGGS, R.L.; 1968) (SCRUGGS, R.L.;
ROSS, P.D.; 1964). Está comprobado también que la contamina-
ción de proteínas o polipéptidos reduce k' hasta cerca de ce
ro (BALDWIN, R.; 1954) (SCRUGGS, R.L.; ROSS, P0D0; 1964).
iii) Terrip er a tur a
El efecto observado al aumentar la temperatura puede -
ser de varios tipos, pero, para el DNA, [77] permanece cons-
tante hasta llegar a la temperatura de desnaturación. No -
obstante, todas nuestras medidas fueron hechas a 25eC, que
es el valor más usual. Las disminuciones de viscosidad in-
trínseca encontradas por varios investigadores al aumentar
la temperatura, han sido interpretadas por nosotros mismos
MINGOT, F.; 1962) y por Zimm (HAYS, B.J.j ZIMM, B.H»; 1970)
como debidas a nuevas roturas dobles, producidas al aumentar
con T el valor del parámetro h de estabilidad local (ver -
Introducción).
77
II.7. INSTRUMENTACIÓN Y METODOLOGÍA DE LA VISCOSIMETRIA
Los dos tipos de viscosímetros utilizados normalmente
en el trabajo con soluciones de biopolímeros son:
a) Viscosímetro del tipo Couette. :
La muestra se coloca en un pequeño espacio anular exis
tente entre dos cilindros concéntricos de pequeña diferencia
de diámetro. Un cilindro se hace girar a velocidad constan
te respecto al otro, que permanece quieto. De la velocidad
angular, el momento requerido para mantener esta velocidad
o el par que induce en el otro cilindro, y las dimensiones
de ambos cilindros, se puede calcular la viscosidad de la
disolución sin más que aplicar la propia definición de vis
cosidad.
b) Viscosímetros capilares.
Consisten en'un tubo capilar de radio r y longitud L,
a través del cual se hace pasar un volumen V de líquido b_a
jo su propia presión hidrostática. La aplicación de la ley
de Poiseuille nos lleva a la expresión siguiente para la -
viscosidad:
471 _ hg p r n t' " 8 LV
siendo h la altura del líquido, p su densidad, g la cons-
tante gravitacional y t el tiempo que tarda un volumen da- "'
do en pasar a través del capilar.
Nosotros hemos usado una variedad del tipo Couette, d_e
bida a Zimm y Crothers (ZIMM, B.H.; CROTHERS, D.M.; 1962),
cuyas características y ventajas presentamos a continuación.-/
Viscosímetro de cilindro rotante»
En vista del gran tamaño de las moléculas de DNA actual_
mente aislables, y de la extrema dependencia de la viscosi-
dad de sus soluciones con la tensión tangencial, es neces_a
rio usar un viscosímetro con las ventajas y exactitud de -
los capilares de uso corriente, pero capaz de operar a ten
siones tangenciales varios órdenes de magnitud menores, y,
a ser posible, sin los problemas del alto coste de los vis
cosímetros Couette.
El instrumento que aquí describimos es barato, de fácil
construcción, pone la solución solamente en contacto con -
vidrio y abarca un rango de tensión tangencial desde 0,0001
a 0,3 din/cm (G desde 0,01 a 30 s ). Se puede alcanzar -
una precisión del 0,2% en medidas de viscosidad relativa,,
Concretamente hemos dispuesto del "low shear viscome-
ter" de Beckmari, que responde a las características del -
modelo A descrito por Zimm y Crothers (ZIMM, B.H.; CROTHERS,
D.M.; 1962),
Diseño (fig., 14)
Los viscosímetros de Couette construidos anteriormente,
consistían en un cilindro exterior rotando a una velocidad
constante, de tal manera que el momento transmitido a través
del líquido a xm cilindro interior estático era medido por
algún aparato apropiado,
Ntiestro viscosímetro usa un cilindro interior flotando
libremente, y que permanece centrado por la tensión siiper-
ficial del menisco, al que se le aplica un momento constan
te por interacción magnética entre un pequeño cilindro de
acero colocado en su fondo y un imán rotante exterior*
79
FIGURA 14
1 ™9 —¿- .
3.-4.-5.-6.-
8.-9.-
10.-11.-12.-
13.-
TapónCamisa termostatizadoraFluido circulanteTubo interior de tygonMeniscoRotorEstatorEnrasePieza de hierroNylonCilindro de aceroImánEje del motor
80
De este modo, se aplica -una fuerza tangencial constante
al líquido que ha} entre ambos cilindros» Se mide, entonces,
la velocidad del cilindro interior respecto al exterior, te
niendo en cuer ta que dicha velocidad es inversamente propor
cional a la viscosidad de la solución.
No existe ninguna unión mecánica al cilindro móvil, por
lo que toda disipación de energía ocurre dentro del propio
líquido» Esto simplifica mucho la construcción del viscos_í
metro y permite medir a muy baja tensión tangencial con al
ta precisión,.
Para producir el campo rotante, se hace girar un imán y
se dirigen las líneas del campo mediante piezas de hierro
en los polos del imán. El motor rueda aproximadamente a -
1000 rpm.
Los detalles de diseño se completan con un sistema de
termostatización y un montaje rígido„
"Metodología
Este viscosímetro se usa para medir viscosidades rela-
tivas, para lo cual basta con dividir el tiempo empleado -
por el rotor en dar un número determinado de vueltas cuan-
do flota en solución y solvente puro, respectivamente» Ob-
tenida TI . . se consigue n sin más que restarle 1 , y,
/ rei' a iesp
a partir de n , se consigue [r¡] por medio de la fórmula
de Euggins ya comentada.
La limpieza es fundamental en estas medidas, dada la al
ta sensibilidad del aparato» Por ello, todo el material que
vaya a ser usado debe ser previamente lavado perfectamente,
81
así como, por supuesto, el rotor y el estator, que serán -
objeto de atenciones especiales, tales como exponerlos al
aire el menor tiempo posible, para evitar la formación so
bre SUS paredes de depósitos por evaporación de solvente.
El solvente se libera de partículas por filtración, a
través de un filtro Millipore (0,45/x), y la solución por
centrifugación a 20.000 rpm durante 20 minutos, en un ro-
tor SW 39 de brazos oscilantes, para evitar degradaciones
del DNA por fuerzas tangenciales al atravesar la membrana
del filtro» Después de comprobar la adecuada termostatiz_a
ción del aparato, se introducen 2 mi de solvente en el es
tator, se introduce el rotor, y, añadiendo solvente con -
una jeringa apropiada, se enrasa el viscosímetro, llevando
a coincidencia los niveles de rotor y estator.
Conseguido ésto, se pone en marcha el motor y se proce
de a la toma de tiempos, finalizada la cual, se repite to-
do el proceso para la solución de DNA.
Para tratar de minimizar errores, se miden varias vuel
tas en cada enrase, y se hacen varios enrases por muestra.
Precisión e influencia de variables externas.
Las principales fuentes de error en la medida son dos:
medida de tiempo y enrasado. El error de medida de tiempo ;-
también está presente en los viscosimetros capilares: en to
do caso no debería ser mayor del 0,1 ó 0s2%. El otro error :
está asociado con la posición vertical del rotor, pues la
intensidad de la interacción magnética depende de ella, Enr;
sando con el debido cuidado, este error no debería repre-
82
sentar más de un 0,1% de la velocidad.
En este viscosímetro es muy importante un buen control
de la temperatura y una adecuada circulación del líquido -
termostatizador, pues variaciones de la temperatura pueden
producir corrientes de convección que desplazarían al ro-
tor, aparte de las variaciones intrínsecas de la viscosi-
dad del líquido.
Parece (ZIMM, B.H.; CROTHERS, D.M. ; 1962) que el arra_s
tré por interacción magnética es satisfactorio, mientras no
se someta al rotor a campos muy fuertes, los cuales polari
zan el acero y cambian temporalmente su interacción con el
campo rotante, como hemos comprobado que sucede con los ro
tores comerciales después de cierto tiempo de uso.
También debe ser tenida en cuenta la densidad del lí-
quido/ pues como el rotor se mantiene por flotación, sólo
pueden medirse líquidos cuya densidad caiga dentro de un -
rango del cero al cinco por ciento de la del líquido para
el que se haya calculado la flotación del rotor.
La otra única fuente sistemática de error que se ha ob
servado (ZIMM, B.H.; CROTHERS, D.M.; 1962), es que el rotor
tenga irregularidades geométricas.
Otra fuente de error, aunque ajena al dispositivo, es
la que proviene de la determinación de la concentración de
DNA en la solución. Naturalmente, ésto depende hasta cierto
punto de las precauciones que se tomen en la medida, e influ
ye grandemente a altos pesos moleculares (10 Mdalton) da-
da la correlación exponencial existente entre [y] y M (ver
capítulo "correlaciones s-[7?l-peso molecular").
83
I I . 8 . CORRELACIONES S-[7?]-PESO MOLECULAR
El camino más directo, y correcto en principio, para -
hallar pesos moleculares, a partir de métodos hidrodinámicos,
es una combinación de datos de sedimentación y difusión. Am
bos coeficientes, el de sedimentación s y el de difusión D,
dependen, aparte del peso molecular, de un único parámetro:
el coeficiente de fricción f, que es sensible a la conforma
ción molecular» Al eliminar el coeficiente de fricción en-
tre s y D , como indica la conocida fórmula de Svedberg -
(SVEDBERG, To; PEDERSEN, K.O.; 1940), se obtiene directamen
te la masa molecular, sin hacer hipótesis sobre la configu-
ración espacial del DNA:
M = _s_-_ —II (II.8.1)D° (1-vp)
—1donde R es la constante de los gases expresada en erg.mol
grad" .
Desafortunadamente, el coeficiente de difusión para -
DNA nativo es tan extraordinariamente bajo que su medida
se hace tediosa e imprecisa, y, además, la dependencia de
D con la concentración no ha sido bien establecida para el
DNA. Recientemente, Reinert (STRASSBURGER, J.; REINERT, K.E.
1971) ha medido los coeficientes de difusión de DNA de al
rededor de 25 Mdalton y ha establecido su dependencia con
la concentración después de introducir importantes mejoras
de los métodos convencionales.
Sin embargo, puede usarse una combinación de s y [rj p_a
ra obtener M, a pesar de tener una base teórica menos con-
sistente y exigir una hipótesis sobre conformación ya que
[7]} , al contrario que D, no depende del coeficiente de f:•: i
8 di-
ceion de un modo simple.
Para varias conformaciones macromoleculares específicas
se han desarrollado ecuaciones semiempíricas relacionando s
y [771 con el peso molecular.. Para proteínas con forma de -
elipsoides rígidos ha sido usada con éxito la ecuación de -
Scheraga-Mandelkern (SCHERAGA, H.A.; MANDELKERN, L.; 1953)=
La de Mandelkern-Flory, formalmente análoga a la anterior,
desarrollada para polímeros sintéticos con estructura de ovi
lio al azar (MANDELKERN, Lo; FLORY,P.J.; 1952) aplicable al
DNA como comentaremos desptiés es;
/ V2/O ,1/3 , \
M ^ _ J_gOjW . ?—v (11,8,2)
siendo
M ,.. o.,. o . o, o« Peso molecular media en peso
s° ,.,,..,.,, e Coeficiente de sedimentación (en segundos)
corregido a las condiciones del agua a 202c.
[77] t.....a..... Viscosidad intrínseca en dl/g, medida a ten
sión tangencial nula,
N .,,..,.....».. Número de Avogadro
r\ y p .....,, Viscosidad y densidad del agua a 202C,
v *,...,, 8.. , o.. Volumen específico parcial del polímero
(0,55 ml/g para el DNA),
P, .«i.,..»..*., cociente entre dos términos dependientes de
la conformación, que proviene de las expre-
siones individuales de s y [rf] o Para DNA por
encima de 3.10 dalton, P> es aproximadamente
constante, tanto para DNA nativo como desna-
85
turado siendo su valor 2,5.10 (EIGNER,
J.; DOTY, P.; 19^5), en total acuerdo con
estimaciones teóricas hechas a partir de
estudios sobre "ovillos rígidos"»
Sustituyendo los valores de estas constantes en la ecua—1 3
ción anterior, e introduciendo el factor 10 para usar -unidades svedberg en vez de segundos, se obtiene
M = 12.347 ( s ° 0 w [7]]i/3)3/2 (II.8.3)
Sin embargo, en muchas ocasiones, sería deseable obte-
ner una estimación de M a partir de medidas de sedimenta-
ción o viscosidad. Ante ésto, hemos de hacer notar que, si
bien, como se ve en la ecuación de Mandellcern-Flory, para
una muestra dada de DNA el producto s [rj] es insen-
sible a su estructura, y a las condiciones experimentales,
s y [rf] individualmente varían grandemente, dependiendo de
propiedades del DNA tales como conformación y de propieda-
des del solvente como pH, temperatura, concentración y ti-
po de cohtraiones, etc,
Obviamente, si queremos usar s o [77] separadamente pa-
ra calcular M, debemos conocer algunas cosas sobre nuestra
muestra de DNA y escoger un solvente cuyos efectos de estos
tipos sean conocidos.
Para DNA nativo han sido propuestas una gran variedad
de ecuaciones empíricas para obtener M a partir de medidas
de sedimentación o viscosidad» De todas ellas, las más em-
pleadas son las de Zimm y Crothers (CEOTHERS, D.M.; ZIMM,
B.H.; 1965), pues a la consistencia de SLIS resultados unen
86
la ventaja de cubrir un rango de 1.10 a 130.10 dalton y
tienen en cuenta los efectos de exclusión de volumen. Estas
ecuaciones son:
0,445 log M = 1,819 + log (s°Q - 2,7) (II.8.4)
0,665 log M = 2,863 + log ( [rj] + 5)
En general, cuando no se tienen en cuenta los efectos
de exclusión de volumen, la dependencia de la viscosidad y
del coeficiente de sedimentación con el peso molecular del
soluto viene dada por ecuaciones semiempíricas del tipo de
la de Mark-Houwink (MARÍC, H. ) (HOUWINK, R.; 1940)
ir}) = K . M a (11.8,5)
donde K y a son constantes características para cada sis-m J — r
tema particular soluto-solvente y temperatura, existiendo
una gran variedad de estas expresiones.
Es importante comentar que K es una constante meramenm
te empírica, que en el caso del DNA vale 6,9.10 (EIGNEE, J,
DOTY, P.; 1965) mientras que a. depende de la forma y solva
tación de la molécula. Si suponemos la molécula de DNA co-
mo una varilla semirígida, cabría esperar para a. valores -
comprendidos entre 1,5 y 0,5 que son los determinados teó-
rica y experimentalmente para varillas rígidas y ovillos al
azar respectivamente, en polímeros sintéticos.
A alto peso molecular, el grado de flexibilidad del DNA
es suficiente como para que sea asimilable a un ovillo al
87
azar, incrementándose el valor de _a al disminuir el peso -
molecular por debajo de 2.10 y aumentar la rigidez de la
molécula. Eigner y Doty (EIGNER, J,; DOTY, P.; 1965) prop_o
nen los valores
6a = 1,32 para M<2.10
a = 0,70 para M>2.1O6 (II.8.5)
Cox et al. (COX, R.A. y otros, 1955) obtienen a partir de
experiencias de degradación y para M —10 el valor de 0,93.
Las expresiones de Zimm y Crothers, que proporcionan
los mejores resultados se pueden escribir
(s - q ) = K Mas~s s
(11,8,6)
U7?]- q^; - x\ i
mostrando valores de a y a T, muy próximos a 0,5 de acuerdo
con la suposición de cadena estadística, ya que q y q só
lo tienen importancia a valores bajos de M, en concordancia
con un progresivo acercamiento a la varilla rígida que debe
ser un DNA de muy bajo peso molecular.
Por otra parte, el DNA es un polianión constituido por
una doble cadena de cargas negativas debidas a los iones -
fosfato, y las interacciones entre estas cargas tienen una
profunda influencia sobre el comportamiento de la molécula
en solución.
Para un polielectrolito flexible disuelto en una solu-
ción salina, la dilución con agua disminuye el número de -
o o
contraiones, aumentando la repulsión entre las cargas y pro
unciéndose una expansión de la molécula, con un considera-
ble aumento de la viscosidad de la disolución y una dismi-
nución del coeficiente de sedimentación.
Nosotros hemos evitado este problema trabajando siempre
con DNA disuelto en solLición salina citrato (0,15 M CINa,
0,015 M citrato trisódico) ya que tanto la constante k1 de
la ecuación de Huggins como las correlaciones de Zimm y -
Crothers, han sido determinadas en esas condiciónese Como
la consecuencia de la variación de la fuerza iónica es una
variación de la conformación, ésto afectará al valor de as
y a??, exigiendo por lo tanto, para titilizar una expresión de
correlación [7]J -M o s-M ponerse en las condiciones de sol-
vente para las que esa correlación fue determinada»
III. MATERIALES
91
111.1.a. AISLAMIENTO DEL DNA DE BACTERIÓFAGO T2
Nuestro lote de DNA de fago T2 fue obtenido por una mo
dificación del método de Harriot (HARRIOT, P.; 1952), a par
tir de un cultivo de E. coli B 101, infectado por el fago,
y cuyo medio tenía la siguiente composición por litro:
NaH2P04 1,6 g. Na2HP04 7,2 g., NH^Cl 1,0 g, KCl 0,5 g., -
MgCl2 0,2 g., Na2S0 0,3 g., Glucosa 3 g.
El procedimiento operativo ha sido:
9,5 1. de medio de cultivo se inoculan con 0,5 1. de culti
vo crecido durante una noche. El crecimiento se sigue por
turbidimetría a 450 nm. Cuando la densidad óptica del medio
es de 0,8 se infecta el cultivo con 0,1 mi de una suspen-1 2
iión de 10 fagos/ml.
Si el medio se mantiene a pH 7, 372C, una agitación de
200 rpm y un caudal de aireación de 8 l/min, después de d£
ce horas, la densidad óptica del medio habrá caido hasta -
0,15 - 0,30, momento en que se procede a la separación de
los fagos.
Después de una filtración selectiva a través de varios
filtros con diámetro dé poro entre 3 ¡u y 0,4^ , que no per_
miten el paso de las bacterias, se procede a una precipita
ción lenta de proteínas, en frío, añadiendo 1N HC1 hasta -
alcanzar un pH de 3,9-4,0, Este precipitado, en el que es-
tarán incluidos los fagos,se resuspende en 200 mi de 0,14
M NaCl y se neutraliza lentamente hasta pH 6,5 con 1 M -
NaHCO .
A continuación se lleva a cabo una incubación con DNasa,
a una concentración de ésta de 1 g/ml, previa adición de
92
0,2 mi de 2,8 M MgSO sin cuyo catión no se activa la enzi_
ma. Esta incubación no afecta al DNA intracapsular del fa-
go, pero degrada al DNA residual de la bacteria.
Uña vez digerido el DNA bacteriano presente en nuestra
preparación, se procede a la eliminación de bacterias y ves_
tos bacterianos que hayan pasado la filtración, mediante re
petición de centrifugaciones diferenciales de las siguientes
características:
i) \ hora a 2.400 g. se recoge el sobrenadante
II) \ hora á 5.000 g. se recoge el sobrenadante
III) \ hora a 11.000 g. se recoge el sedimento
E.í --sedimento final se resuspende en el solvente en que
se desee conservar el DNA, en nuestro caso 0,15 M NaCl, -
0,015 M citrato trisódico (SSC), a una concentración de fa
gos tal que produzca una absorbancia a 260 nm de 6 u.o. La
pureza de la suspensión se controla mediante espectroscopia
ultravioleta^ ya que la relación (A Jk . )„,„ debe ser -' J ^ x ma* m m 260
igual a í,5 en el caso de pureza total.
La etapa final consiste en la ruptura de la cubierta -
proteica de los fagos, con la subsiguiente liberación de
su DNA, proceso que se lleva a cabo mediante la adición -
en frío de fenol recién destilado y saturado de SSC, que-
dando las proteínas en la interfase fenol-solución, y el
DNA en la solución acuosa. Se recoge cuidadosamente esta
fase', se repite con ella el tratamiento, y la solución fi
nal de DNA se libera del fenol mediante tratamiento con -
éter o por diálisis frente a SSC, con tubos de diálisis
previamente hervidos en una solución de Na CO .
93
III.1.b. AISLAMIENTO DE DNA DE PSEUDOMONA SAVASTANOI
Este aislamiento de DNA ha sido realizado a partir de
cultivos en medio líquido de Pseudomona savastanoi, siguien
do el método de Marmur (MARMUR, J.; 1961 )
Composición del medio por litro:
KC1 1,5 g; NH4C1 0,25 g; NaCl 5,0 g; K2HP04 3,0 g; KH2P04
3,0 g; Na2S04 0,05 g; MgCl2'6H20 0,1 g; CaCl2 2., 0 mg; FeCl3
2,0 mg; glicerina 1,5 mi; glucosa 1,0 g; ácido casamínico
10,0 g.
El cultivo se realiza en fermentador de 14 litros, el
pH del medio se mantiene a 7, la duración del cultivo es
de 16 horas a una temperatura de 372C con agitación a 200
rpm y un caudal de aireación de 8 l/min. Las células se re
colectan por centrifugación.
Previamente a la lisis y con objeto de eliminar los po
sibles restos del cultivo, se realiza un lavado en 0,14 M
NaCl y 0,1 M ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a ra-
zón de un volumen de 20 mi por gramo de células»
La primera etapa, lisis celular, se realiza mediante
la combinación de una incubación con lisozima, a fin de -
degradar los péptido glicanos de la pared celular, y un -
tratamiento con dodecil sulfato sódico (SDS) a concentra-
ción final de 0,5%, con lo que se origina la lisis celu-
lar con la consiguiente liberación del DNA, así como de
próteinas y de RNA.
Comienza entonces, la purificación que consiste en la
eliminación de proteínas y RNA liberado en la lisis, me-
diante desproteinizaciones e hidrólisis del RNA. Una pri
Q/L
mera desproteinización se consigue alimentando la concen-
tración salina con perclorato sódico hasta un valor de -
1 M» Esta, se refuerza por desnaturación de las proteínas
en la int.er£ase de una emulsión agua/cloroformo =
En la emulrión, los ácidos nucleicos permanecen en la
fase acuosa, las proteínas en la interfase, y tras la sep_a
ración de las fases por centrifugación, el DNA se precipi-
ta en etanol al 60%,, Con una varilla de vidrio se recoge -
el DNA por enrollamiento, redisolviéndolo en SSC. Las des-
proteinizaciones continúan hasta que en la interfase no ap_a
recen proteínas»
La separación de los ácidos ribonucleicos se consigue
por hidrólisis enzimática con ribonucleasa hasta oligoribo
nucleotidos, que presentan baja precipitabilidad, entonces,
en etanol e isopropanol.
'95
III.2. CARACTERIZACIÓN
La naturaleza del proceso de aislamiento y los requeri
mientis de nuestro trabajo han hecho necesaria la caracte-
rización de estas preparaciones de DNA respecto a estructu
ra y pureza.
Estas características se reflejan en los siguientes pa
rámetros: coeficiente de extinción molar e hipercromicidad.,
contaminación por RNA y contaminación por proteínas; pará-
metros que comentamos a continuación»
Coeficiente de extinción molar
E] coeficiente de extinción molar ha sido definido co-
mo la relación de la absorbancia en el máximo, a la concen
tración en átomos-gramo de fósforo de una muestra de DNA.
Este parámetro es indicativo del estado estructural en
que se encuentra el DNA, debido a la hipercromicidad dife-
rente que caracteriza cada conformación y también tiene -
una utilidad práctica al permitir conocer la concentración
en peso a partir de la absorción.
Se puede determinar por análisi colorimétrico de la
concentración en fósforo o bien análisis colorimétrico de
la concentración en desoxiribosa.
Pero no han sido utilizados estos métodos en este tra
bajo, sino que hemos utilizado como indicador estructural
la transición térmica doble-simple cadena.
El DNA en estado nativo es una hélice bicatenaria, que
responde a las características de la estructura propuesta
96
por Watson-Crick (WATSON, J.D.; CRICK, F.H.C.; 1953).
El apilamiento entre bases que existe en esta estructu
ra, implica una interacción entre ellas que modifica sus -
propiedades ópticas, de manera que se produce una disminu-
ción de su absorbancia respecto a la correspondiente al DNA
monocatenario y, en consecuencia, cuando tal estructura bi
catenaria se destruye, se observa un incremento de absorción
que se conoce con el nombre de efecto hipercrómico.
El seguimiento de este fenómeno se ha realizado estu-
diando la variación de la absorbancia en función de la tem
peratura. Representando el cociente de la densidad óptica
del DNA a cada temperatura respecto a la densidad óptica -
a 252C (efecto hipercrómico) frente a temperaturas, se ob-
tiene la gráfica del proceso. El valor correspondiente al
50% del incremento de ese cociente es la Tm (temperatura
de fusión de la muestra»)
La transición nativo-desnaturado sucede en un intervalo
pequeño de temperaturas. El incremento de absorción es del
orden de un 40%.
La Tm está correlacionada con la estabilidad de la es-
tructura bicatenaria y muestra una dependencia con la com-
posición en bases, como consecuencia, tanto de la diferen-
cia de energía de la interacción de apilamiento, como del
número de enlaces de hidrógeno que se pueden formar.
97
Impurezas de la preparación
a) Contaminación por RNA. Método de Schmidt-Tannhauser
(MUNRO, H.N.; FLECK, A,; 1966).
Este método está basado en la precipitabilidad en medio
ácido de los ácidos nucleicos macromoleculares y en la hi-
drólisis selectiva de los ácidos ribonucleicos en medio al
calino»
Método:
Precipitación en ácido perclórico (PCA) 0,2 N y en frío
de los ácidos nucleicos macromoleculares. El sobrenadante
obtenido se corresponde con la fracción ácido soltible. El
precipitado se lleva a 0,3 N KOH incubándose a 372c una ho
ra, con lo que se consigue la hidrólisis de los ácidos ri-
bonucleicos .
Una nueva precipitación en 0,2N PCA colocará los oli-
goribonucleotidos en la fracción ácido soluble» La cuantiza
ción de esta fracción se lleva a cabo por éspectrofotometría,
El cociente entre la cantidad en peso del RNA y del DNA
(conocida por espectrofotometria previa al análisis), nos
dará el grado de contaminación,
b) Contaminación por proteinas. Método de Louory (LOWRY,
O.H. y otros, 1951).
Está basado en la reacción de los iones Cii ' (solubili_
zados en presencia de tartrato) , con la tirosina y el trip_
tófano, para dar un complejo capaz de reducir al reactivo
de Folin-Ciocalteau. Esta reducción se visualiza con la ap_a
rición de color azul. La coloración es proporcional a la -
cantidad de proteínas presentes. La lectura se realiza a -
727 nm. Simultáneamente se construye una curva patrón me-
diante lecturas de muestras con distintas concentraciones
98
de seroalbúmina. La interpolación de nuestros resultados
en la misma, nos dará la cantidad de proteínas presente»
El cociente entre la concentración de proteínas y la
concentración de DNA, indicará el grado de contaminación
de la muestra.
I V . ESTUDIO DE LA HETEROGENEIDAD
101
IV,1. INTRODUCCIÓN
Al hablar de soluciones macromoleculares, hay que dis-
tinguir dos tipos de heterogeneidad: la física y la quími-
ca. Existe heterogeneidad física cuando las diferentes ma-
cromoléculas en solución tienen la misma estructura química,
distinguiéndose unas de otras tan sólo por el número de -
monómeros que forman la molécula» Existe heterogeneidad quiL
mica cuando varía la naturaleza de los monómeros, y cuando
éstos no se suceden regularmente„
En el caso de soluciones de DNA y polímeros sintéticos,
dada la corta variedad de sus elementos constituyentesf aja
neralmente se estudia su heterogeneidad física, introduci-
da en el primer caso por el proceso de aislamiento y manipu
laciones posteriores (sin tener en cuenta la heterogeneidad
intracelular de los DNA de céltilas de mamíferos) , y en el
segundo por la aleatoriedad de la interrupción del proceso
de polimerización.,
Sin embargo, como se ve claramente en la figura 15, es
prácticamente imposible distinguir el tipo de heterogenei-
dad de una solución de estos polímeros simplemente a partir
de la observación cualitativa de los diagramas de sedimen-
tación obtenidos en la ultracentrifuga analítica, debido -
a que la forma de la frontera de sedimentación está afecta
da además de por la heterogeneidad macromolecular, por la
difusión, la presión hidrostática dentro de la célula, y la
dependencia con la concentración de los coeficientes de se;
dimentación y difusión, por lo que se hace imprescindible
el estudio y elaboración matemática que a continuación co-
mentamos .
FIGURA 15
Naturaleza del Distribuidor! diferencialsoluto de la masa
dM
Isomolecular
Diagrama diferencialde sedimentación
dedr
Diagrama integralde sedimentación
de
Paucimolecular
de
o
d e ldM
Polimolecular
de.dr
dM
Pauci-Polimolecular
dedr
103
IV. 2
Existen varios métodos para estudiar la heterogeneidad
de soluciones macromolecuiares» Nosotros hemos seguido, has
ta ahora, el propuesto por Williams et al. (WILLIAMS, J0W0;
1952) que se basa en lo que sigue:
Se supone que el ensanchamiento de la frontera de sedi
mentación es debido fundamentalmente a dos razones: a) he-
terogeneidad del soluto tanto en masa molecular como en for
ma,b) difusión desde las zonas de alta concentración hacia
las de baja (desde el plateau hacia el menisco)e Al estudiar
heterogeneidades de disoluciones, el fenómeno b) hay que tratar
de evitarlo o corregirlo, aunque ya sabemos que para el DNA
ha de ser mínimo debido a su enorme masa molecular,
Si se pudiese suponer que ambos efectos son independien
tes, sabiendo que el momento segundo de una distribución -
compuesta de distribuciones independientes es igual a la -
suma de los momentos segundos de las distribuciones indivi-
duales, se podría escribir que el momento segundo de la ~
frontera, <j , es igual al momento segundo de la distribu-
ción debida a difusión, más el debido a la distribución de
coeficientes de sedimentación»
Como las moléculas de DNA no sedimentan ni difunden in
dependient emente unas de otras, sino qtie inter accionan en-
tre sí, bien directamente, bien a través de las perturba-
ciones que su desplazamiento produce en el solvente, para
que todo lo anteriormente dicho sea válido» previamente a
todo cálculo se debe hacer la extrapolación a concentración
cero, con lo que, además, se evitan las dependencias de los
104
coeficientes de sedimentación y difusión con la concentra
ción»
La velocidad de sedimentación de una especie molecular
de coeficiente de sedimentación s en un campo centrífugo -
es
= s Ü) r ; — — — = s a) dt (IV.2.1)dt
Con las condiciones iniciales t=0, x=x , se obtiene al
integrar
rí
-r0
d rr
J SóO~dt (IV. 2.2)0
2ln ~ — = sa>2t ; r= r ,e S 6 J t (IV.2.3)
~ o
Si existe una distribución de coeficientes de sedimentja
ción como consecuencia de una heterogeneidad macromolecular,
esta expresión se cumplirá en todos los casos (figura 16).
s a) tr = r ,e mm o
2r( + ) = ro,e
(sm+p)w t (IV.2.4)
r, -. = r .e(Vp] ^(P ) o
siendo p la desviación estándar de la distribución de coefi-
105
cientes de sedimentación. Podemos, pues, escribir
(P(p+) ._r(ir)) . ro esmw2t (<?"** - e ^ S (W.2.5)
(r + - r -.) = r^ 2sen h (poj2t) (IV.2.6)
2 3(r(P+) " r(p-)} = " . l p a ? t t (p
3"t} + — i (IV-2-7)
y aproximando el desarrollo del seno hiperbólico al primer
térrñino:
i ( r +) - r -,) = „ „ = rmP<u2t , (IV.2.8)
que es id expresión de la raíz cuadrada del momento segundo
ele ja distribución que se produce como consecuencia de la
heterogeneidad.
Si consideramos que la difusión en la célula de la cen
trífuga es equiparable a la difusión en un cilindro en uno
de cuyos extremos la concentración es máxima y en el otro
cero, existiendo inicialmente una frontera central, el gra
diente de concentración es descriptible por la distribución
gausiana (NETTER, M..; 1969)
(iv.2.9)
siena-'.;
O¿ •= 2Dt (IV. 2.10)
106
CC
z¡L3t—i
107
Nótese que también se hace la aproximación de ignorar
la influencia del campo centrífugo en esta difusión, si bien
esto no afecta los propósitos cualitativos que se pretenden,
como lo demuestran Baldwin y Williams (BALDWIN, R.L»; WILLIAMS,
J»W0; 1950).
Así pues, la distribución observada en una sedimentación
tendrá un momento segundo representado por
2 2 2
2 2 2 4 2O = r p Cú t + 2Dt (IV.2.11)
Como se ve inmediatamente en la expresión anterior, pa
ra tiempos muy largos la abertura de la frontera debida a
la difusión es despreciable frente a la debida a la heterc)
geneidad, ya que la primera es proporcional a t y la según2
da a t o Por lo tanto, extrapolando a tiempo infinito se -
elimina la contribución de la difusión y la distribución
que entonces se obtiene será únicamente debida a la inhomo
geneidad del soluto.
Por otra parte, reescribiendo la expresión anterior en
1a forma
2 2 2 4a r p w
_ _ = D + 2 t , (IV. 2.12)
2la representación de o /2t frente a t es lineal, con -
2 2 4 /r p co /2 como pendiente y D como ordenada en el origen.
108
Así pues, de paso, se obtiene un método para calcular el
coeficiente de difusión promedio en peso D y la desvia-
ción estándar de la distribución de coeficientes de se-
dimentación, la cual ya es una medida de su heterogénea
dad.
Sin embargo, lo que a nosotros nos interesa es obtener
información directa sobre la heterogeneidad molecular expre
sada como una distribución de coeficientes de sedimentación
q(s) que dependa de la forma y tamaño de las macromoleculas
en solución. Signer y Gross (SIGNER, R.; GROSS, Ho; 1934),
trabajando con el sistema óptico de Schlieren obtienen q(s)
a partir de la curva gradiente de índice de refracción, en
el caso de que la difíisión sea muy pequeña, mediante la fór
muía
2q ( s) = (_,_) . - _ . . _ _ (iv,2,13)
o "1 "o
que luego extrapolan a tiempo infinito para eliminar los -
efectos debidos a la difusión. Nosotros, trabajando con el
sistema de detección y registro electrónico, hemos resuel-
to el problema hallando q(s) experimentalmente, a partir de
los coeficientes de sedimentación de los puntos 10%, 20%,
..., 90%? de densidad óptica sobre la frontera, los cuales,
después de extrapolarlos a concentración cero y normalizar
los a las condiciones del agua a 202C, se extrapolan a tiem
po infinito, según el método propuesto por Elias (ELIAS, H,
G.; — ), que comentamos a continuación»
109
IV.3. CALCULO
Gomo ya hemos comentado, una manera de obviar la influen
cia de la difusión es extrapolando a tiempo infinito las dis
tribucionés de coeficientes de sedimentación obtenidas, Pe-
ro para que sea válida, hay que suponer que las moléculas -
no interaccionan entre sí, cosa que no es cierta a no ser que
se trabaje a dilución infinita. Esto es imposible, pero una
concentración muy pequeña puede considerarse lo suficientemen
te cerca de las condiciones ideales» Evidentemente, la dis-
tribución obtenida deberá extrapolarse después a concentra-
ción cero o
A\:-í pues, Elias (ELIAS, H,G.; -) recomienda escoger "11112.
• •oncentT'dCión o. a la cual el coeficiente de sedimentación «=
s difiera en un 5% de s. Esto presenta dos tipos de ventajas:
a) teóricas, porque las correcciones ulteriores son mínimas;
b) experimentales, porque de este modo sólo se halla una cur
va de distribución.
Sobre las fronteras de los registros de la sedimenta-
ción a esta concentración, se miden las distancias radiales
de los puntos cuya densidad óptica sea el 10%, 20%, „. „ , 90%
de la total.
Se utilizan los puntos de densidad óptica 50% para ca]^
cular su coeficiente de sedimentación, que llamaremos sJ,.
para indicar que se tiene en cuenta la compresibilidad del
sistema:
El factor de compresibilidad f viene dado por la exprj|
sión
110
?v.5o'=77T--—^——— (iv.3.1)
Como se ve, h¿y que calcular la presión hidrostática en to
dos los puntos de la célula. En el menisco, esta presión -
es de, prácticamente 1 atm., y en un punto cualquiera r de
la célula viene dada por
P = ° 2 (r - r~) , (IV,3.2)
siendo p la densidad del solvente, a> la velocidad angular
del rotor y r el radio del menisco.J m
Las variaciones de la densidad y de la viscosidad del
solvente vienen dadas por las relaciones
(IV.3.3)
donde los coeficientes P, y e pueden encontrarse en algunas
tablas al respecto» Si no se tienen valores exactos, no es
una mala aproximación admitir que el volumen específico par
cial v^ tiene el mismo valor a cualquier presión que se mi
da dentro de la célulaa
Con esta corrección se calcula un falso coeficiente de
sedimentación de la siguiente manera:
111
50
y sv . es un falso coeficiente de sedimentación, porque, a
partir de la definición de coeficiente de sedimentación, -
se ve inmediatamente que
(IV. 3.5)
La utilidad de este parámetro se verá más tarde; de momento
hacemos notar que s es una medida de la anchura del lí-
mite; a través del ln(r Vr ).
Evidentemente, representando s.. frente a t se obtiene50 "'
el verdadero sv , pero como luego hay que extrapolar a tiem
po infinito, no se pueden emplear los tiempos de registro -
como se hace en el cálculo convencional de s , sino los -
tiempos reales de sedimentación» Estos se definen como a que
líos medidos a partir del momento en que la frontera se s_e
para del menisco, y se obtienen midiendo la abscisa en el2 2
origen de la representación de (r -r ) frente a t, en el -
supuesto de que ambas cantidades dependen linealmente entre
sí desde el momento en que se estabiliza la velocidad. Pa-
ra justificar este cálculo, tengase en cuenta que para s muy
grande puede ocurrir que cuando se obtenga el primer regi_s
tro ya se está muy cerca de poder suponer que la aportación
de la difusión a la abertura de la frontera es desprecia-
ble frente a la heterogeneidad.
Una vez obtenido sn, , para no tener que hallar los coe
y ~
112
ficientes de sedimentación de todos los puntos 10%, ..., 90%
definidos al principio, y ésto es un punto interesante del
método de Elias, se calculan las siguientes relaciones, que
se obtienen sin más que aplicar la ecuación (II.3.18) a dos
puntos diferentes de la frontera:
°/ °/ °/s° ln(r°/r ) f°
* * J_ / 'T"TT O ,
505 y
cálculo que se facilita usando la expresión aproximada
0/ o/
si0, r'° - rZ JE50 - * c50
A continuación, se representan estos coeficientes frente a
1/s j_ o, lo que es lo mismo, frente a i/si; .t, y sé extray* L 50 ~*
polan a valor cero, equivalente a s .t, =GD. Evidentemente,
multiplicando estos valores por sv se obtienen los coefi-
cientes de sedimentación extrapolados a tiempo infinito que,
pueden ser inmediatamente transformados en la distribución
de masas moleculares deseada.
Desde nuestro punto de vista, quizás el mayor éxito del
método sea extrapolar frente a i/st=O y no frente a i/t=0
como, en principio, parecía lógico. Así se tiene en cuenta
la gran influencia del coeficiente de sedimentación en la
difusión, de tal modo que para s muy grande sea inútil hacer
extrapolación, pues ya en los primeros registros la abertu
ra de la frontera será debida prácticamente a heterogenei-
dad, mientras que para s pequeños este cálculo se hace im-
prescindible a la hora de estudiar distribuciones de masas
moleculares.
11 3
Recientemente, Reinert, Triebel y Strassburger (TRIEBEL,
H.; 1968) (REINERT, K.E.; 1971) (REINERT, K.EO y otros: »
1971) siguen también este método propuesto por Elias, Ob-
tienen sus distribuciones de coeficientes de sedimentación
a partir de la ecuación (IV.3.6), aunque sin corregir por
efectos de presión, por ser esta corrección prácticamente,
despreciable, y en vez de extrapolarlos a tiempo infinito,
prefieren hallar las distribuciones a partir de los límites
obtenidos a tiempos de sedimentación suficientemente largos
siempre por encima de una hora, por considerar que, dado el
bajo coeficiente de difusión del DNA, en esos momentos la
abertura de la frontera ya es sólo debida a la heterogéneo.
dad macromolecular. Como nosotros, en vez de trabajar b \ ?.ia
única y baja concentración de DNA, prefieren obtener las -
distribuciones de los coeficientes de sedimentación a va-
rias concentraciones, y extrapolarlas a concentración cero
por ajuste, evitando así el uso de la problemática constan
te de extrapolación a concentración cero (II.4o3).
V. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN
DE RESULTADOS
117
V.1. DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR A PARTIR DE MEDIDAS
DE VISCOSIDAD.
En primer lugar, se ha llevado a cabo la comprobación
de que se estaba trabajando a una fuerza tangencial lo su-
ficientemente baja para que el comportamiento de la disolu
ción fuese newtoniano.
Efectivamente, a partir de las expresiones (II.5.8) -
(II.5.10) (II.5.12), es inmediato obtener que el valor me-
dio de la fuerza tangencial promedio a través del anillo de
líquido es:
R1 R2 2— . cu din/cm (V.1.1)
'4 -siendo ?] la viscosidad de la solución en poises, w la ve
locidad angular del rotor en revoluciones por segundo, y -
R y R los radios de los cilindros móvil y fijo respectiva
mente, que en nuestro caso valen R =0,5 cm; R =0,65 cm.
Con ésta fórmula y midiendo agua a 259C, cuya viscosi-
dad es 0,8904 eentipOises (HANDBOOÍC OF CHEMISTRY AND PHYSICS,
1969-70), se ha obtenido el valor
-4 / 2< s > = 'o, tí5 x 10 dm/cm ,
el cual, teniendo en cuenta que nuestra solución tenía una
concentración de 16,1 ,ug/ml de DNA (medida por espectrofot£
metría, a 260 nm, en un espectrofotómetro PYE UNICAM SP 700
A), según los valores dados por Zimm y Crothers (ZIMM, B.H.;
CROTHERS, D.M.; 1962) está totalmente dentro de la región
de independencia de [y] con la fuerza tangencial.
Una vez comprobado ésto, se llevó a cabo la medida del
tiempo de revolución del rotor en una muestra de la solu-
ción de DNA y otra de solvente puro, a razón de seis enra-
ses por muestra y cuatro revoluciones por enrase. Los tiem
pos promedio de estas medidas fueron 583 s/rev y 379,3s/rev,
respectivamente, lo que Conduce a un valor de r\ para
el DNA de 0,5373, y, mediante la ecuación de Huggins (II.6.1),
a un valor de la viscosidad intrínseca de [r¡] = 273,5 dl/g.
Sustituyendo este valor de [v] en las correlaciones dadas
por Zimm y Crothers, se obtiene para nuestro DNA de fago T2
un peso molecular medio de 98,5 Mdalton, en buen acuerdo
con los valores obtenidos por sedimentación, ya que sólo di_
fiere el 9% del peso molecular media en peso obtenido me-
diante esta técnica,
11 9
V.2. HETEROGENEIDAD DE UNA PREPARACIÓN DE DNA DEL FAGO T2
Como puesta a punto del método expuesto, se ha llevado
a cabo el estudio de la heterogeneidad de una preparación
del DNA del bacteriófago T2 de E. coli B.
Para ello, se han realizado cuatro sedimentaciones, a
razón de tres concentraciones por cada sedimentación, cu-
briendo un rango entre 7 /Ug/ml y 30jUg/ml. Las concentra-
ciones dentro de las células de sedimentación han sido d_e
terminadas a partir de la densidad óptica detectada por -
exploración fotoeléctrica, previamente comprobada su exac
titud frente a un espectrofotometro SP7OO A PYE UNICAM -
mediante una solución de timina, y haciendo uso de dos c£
rrecciones que tienen en cuenta que el paso óptico de la
pieza central es de 12 mm en vez de 1 cm y que en el expío
rador, por ser la lámpara de mercurio a alta presión, tra
bajamos a 265 nm y no a 26Onm, donde el DNA, pero también
el mercurio, tiene el máximo de su banda de absorción.
Las sedimentaciones se han llevado a cabo a tres velo
cidadeSj 15.000 rpm, 12.000 rpm y 8.000 rpm, observándose .
en la figura 17 que, efectivamente, por debajo de 15.000
rpm no parece existir dependencia del coeficiente de sedi_
mentación con la velocidad angular del rotor.
Sobre los registros obtenidos de estas sedimentaciones
se hizo el estudio de heterogeneidad descrito, para obte-
ner las distribuciones de coeficientes de sedimentación -
s , las cuales fueron ajustadas frente a sus respectivas20,w
concentraciones, obteniéndose así la distribución de coe-
ficientes de sedimentación extrapolados a concentración -
FIGURA 17
(Svedberg)
0,04
0,02 k
pg/ml
121
cero, s ^ . A partir de ésta, mediante las fórmulas pro-20,w
puestas por Zimm y Crothers se ha obtenido la distribución
de pesos moleculares que, en sus formas diferencial e in-
tegral, se presenta en la figura 18.
Las extrapolaciones a concentración cero de los coefi-
cientes de sedimentación se han hecho por ajuste y no si-
guiendo la expresión propuesta por Eigner et al. (EIGNER,
J. y otros; 1962), para el punto 50% de concentración. (Ver
expresiones (II.4.2) (n.4.3). Según esa expresión, la pen
diente de la extrapolación de 1/s , frente a c sería -
K™/S20,w-Conocida la viscosidad intrínseca de nuestro DNA y su
distribución de s_^ , a partir de las pendientes de las¿ 0, w
extrapolaciones a concentración cero de los coeficientes
de sedimentación de los puntos 10%, ..., 90% de concentra,
ción, que se muestran en la figura 19, es posible hallar
los valores de le correspondientes a esos mismos puntos, qiie
en la figura 20 se muestran representados frente a s . Como
se ve, existe una clara dependencia lineal de le con s y,
a su través, con M, fenómeno observado ya anteriormente en
este laboratorio con DNA de diversas procedencias- Además,
los valores obtenidos para k son superiores a los hallados
por Aten y Cohén (ATEN, J.B.T; COHÉN, J.A.; 1965), para -
DNA de fago T2 de 130 Mdalton, y, por supuesto, superiores
a los dados por Eigner y Doty (EIGNER, J.; DOTY, P.; 1965)
(EIGNER, J. y otros; 1962) válidos sólo hasta 30 Mdalton.
Por todo ésto, y a falta de un estudio más completo de
las dependencias de le, que en la actualidad estamos llevan
do a cabo, creemos recomendable siempre efectuar la extra-
polación por ajuste de los datos de i/s frente a c para ot>o
tener s .
0,2
80 100M daíton
120
o ExperimentalA Gausiana: 2 <r= 69 ? x m = 91,2a Exponencial: y = 1 - exp ( -aM -s-b)
a - 0,00018b= 0,013
Mo=30 Mdaltona Poisson : rn
u = Mn1 =87,68
82381=0,
140
dC/dM
-0,05
Error N0,0290,016
0,1
FIGURA 18
123
a\
C3
1 2 1
FIGURA 20
60 svsdberg
125
Lo primero que sorprende al ver la distribución de pe-
sos moleculares de nuestra preparación, es la gran anchura
de la banda, sobre todo teniendo en cuenta que, por proce-
der el DNA de un fago, sus preparaciones deberían ser más
homogéneas, pues está probado que los DNA virales son homo
géneos intracapsulármente. La polidispersidad detectada en
nuestra muestra indica, sin duda, la presencia de defectos
en el proceso de aislamiento de esta preparación concreta
o en las manipulaciones posteriores, que han producido de-
gradaciones, probablemente de tipo mecánico, pues por tra-
tarse de un DNA de fago está disminuido mucho más el ries-
go de ataque enzimático durante el aislamiento»
Se han ajustado los datos experimentales a varios tipos
diferentes de distribución, como se muestra en la figura 18,
aún a sabiendas de que algunos de estos ajustes no son váli
dos analíticamente y que únicamente tienen valor en el inter
valo de nuestros datos experimentales» Es de destacar el he
cho de que todos los ajustes dieron bondad parecida, según
el criterio del error medio IAI, lo cual demuestra la difji
cuitad de poder asignar a una distribución de pesos molecu .
lares de DNA una determinada expresión, para a partir de ella
tratar de extraer conocimientos sobre el proceso degradati
vo que dio lugar a tal distribución,
También hay que resaltar el hecho de que, a pesar de la-
manifiesta heterogeneidad de nuestra preparación, el valor
del parámetro u de heteroge:
aparentemente sorprendente.
del parámetro u de heterogeneidad3" es muy pequeño, hecho
M3£ Este parámetro se define: u = w
M " 'n
126
V.3. DEGRADACIÓN DE DMA DE PSEUDOMONA SAVASTANOI, POR TRA-
TAMIENTO CON DNasao
Como continuación de la puesta a punto del método exp_e
pimental expuesto, se ha hecho un estudio del peso molecular
y de la heterogeneidad de muestras de DNA de Pseudomona sa
vastanoi, diferentemente tratadas con DNasao
Toda la experiencia se ha llevado a cabo a una única -
concentración de 10/ig/ml, por lo que no se ha tenido en -
cuenta la extrapolación a concentración cero. Sin embargo,
dada la baja concentración empleada, y que el peso molecu-
lar máximo es de 16 Mdalton, la corrección introducida por
esta extrapolación sería pequeña»
Las distribuciones de peso molecular se obtienen siguien
do el mismo método que para el DNA de fago T2, y a partir
de ellas se obtienen los pesos moleculares media en peso,
M^, y media en número, M , mediante las expresiones
Z m.M. In.M. Z m.
M = 1 1 M i i ~
Zm. ~ Zn. -Z m./M.i i r i
(V.3.1)
donde m. es el tanto por uno, en peso, de moléculas de pe-
so molecular M., y n. su número.i i
La variación de estos pesos moleculares medios en fun-
ción del tiempo de tratamiento con DNasa viene dada en la
figura 21, en la que, como era de esperar, se observa que
M es menor siempre que M , y que, además, decrece más rá—
127
ceL3i—:
128
pidamente, al ir aumentando el número de moléculas de menor
t amaño«
Sin embargo, el objetivo fundamental de nuestra experien
cia es el estudio de la variación del parámetro u de hetero
geneidad, variación puesta de manifiesto en las figuras 22a
y 22b en función del tiemno de tratamiento y de M , respec-
tivamente.
Como vemos en la figura 22a, u crece linealmente con el
tiempo de tratamiento,, lo cual podría inducirnos a pensar
que la heterogeneidad de la preparación está realmente au-
mentando. Sin embargo, como se deduce de la expresión (i.i)
ya comentada
m (I-PRD) =
en un proceso de degradación es mayor la probabilidad de ro
tura doble en las moléculas grandes que en las pequeñas, por
lo que, en realidad, y partiendo de una distribución conti-
nua, la preparación es cada vez más homogénea a medida que
el peso molecular medio se desplaza hacia valores más pequeños,
Este hecho, unido a que el valor de u como índice de he
terogeneidad de una preparación depende del peso molecular
de ésta, ya que distribuciones de la misma anchura, pero -
centradas en diferentes pesos moleculares, dan valores de
u progresivamente menores cuanto mayor sea el peso molecu-
lar1, nos lleva a denunciar u como parámetro poco intuitivo
y a intentar proponer en su lugar la a de la gausiana equi
valente a la distribución de pesos moleculares de la prepa
ración, intento que abordamos en el apartado siguiente»
129
JQ
CN
cr
_ O
130
Va4, PROPOSICIÓN DE LA O DE LA GAUSIANA EQUIVALENTE COMO PARA-
METRO DE HETEROGENEIDAD,
Para tratar de encontrar si existe alguna relación entre
el parámetro u y la o de una distribución de peso molecular,
supuesta esta gausiana, se han calculado las gausianas en p_e
so de la Tabla 3, con diferentes valores de a y centradas a
varios pesos moleculares, observándose que u es lineal fren-2 2
te a 1/M , y que, a su vez, el producto uM es lineal fren-n' n
te a (2 d) según la expresión
uM2 = 0,1488 (2 O")2 + 0,0574 (V.4.1)
obtenida por ajuste de mínimos cuadrados de los datos de la
figura 23»
Es de destacar el hecho de que la a de la gausiana -
equivalente ya es un parámetro absoluto (no depende de M)
e intuitivo de la heterogeneidad, aunque hay que tener en
cuenta que la ecuación que proponemos es empírica, y presu
pone asimilar la distribución de M a una gausiana.
Esto se cumple con buena aproximación en las primeras -
etapas de los procesos degradativos al azar, pero que va de
jando de cumplirse conforme la u va creciendo y la distribu
ción real de M va haciéndose exponencial, como queda de maní
fiesto en la figura 24, en la que se representa frente a u
el error relativo de la o de la gausiana equivalente, ( a ),
obtenida a partir de nuestra ecuación y la o , ( (7 ), obte-
nida de los valores de M entre los puntos 16% y 84% de nue_s
tras distribuciones de peso molecular de DNA de Pseudomona
savastanoi v de otras diez de DNA de E. coli irradiado con
131
L3
132
síCM
ce
ce
133
dosis crecientes de rayos gamma, entre cero y 300 krads»
Eventualmente, nuestra ecuación permitiría conocer la
gausiana equivalente en peso, sin llevar a cabo los arduos
estudios de heterogeneidad aquí descritos, determinando M
por sedimentación, viscosimetría o dispersión de luz y M
por dispersión de luzo
134
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1905
J.E.N. 301 J.E.N. 301
Junta de Energía Nuclear, División de Física de Radiaciones, Madrid,
" A n á l i s i s por s e d i m e n t a c i ó n de h e t e r o g e n e i d a d
m a c r o m o l e c u l a r en DNA"MIMÜOT, F.; JÜRCANO, J .L . ; DAVILA, C.A, (1975) 142 pp. 24 f igs . 7! reís.
En este trabajo se describe la puesta a punto, en nuestro laboratorio, de un
método de determinación de la distribución de pesos moleculares en muestras po-
lidispsrsas de DMA. Se trata del análisis de límites en experiencias de veloci-
dad de sedimentación, método de validez general para ENA nativo y desnaturado.
La cr í t ica de diversos factores experimentales que influyen sobre el coef i -
ciente de sedimentación y la viscosidad intrínseca, conduce al establecimiento
de ciertos cr i ter ios en lo que se refiere a su extrapolación a dilución i n f i n i t a .
Se propone, además, la sustitución del parámetro U de heterogeneidad, dado su
carácter relat ivo, por la signa de la distribución en peso gausiana equivalente,
Junta de Energía Nuclear, División de Física de Radiaciones, Madrid,
"Anál i s i s por sedimentación de he te rogene idad
m a c r o m o l e c u l a r en DNA"MINGOT, F.; JÜRCANO, J A . ; DAVILA, C.A, (1975) 142 pp.. 24 f igs . 71 refs.
En este trabajo se descrioe la puesta a punto, en nuestro laboratorio, de un
método de determinación de la distribución da pesos moleculares en muestras po-
1¡dispersas de DNA. Se trata del análisis de límites en experiencias de veloci-
dad de sedimentación, método de validez general para DNA nativo y desnaturado.
La c r í t i ca de diversos factores experimentales que influyen sobre el coef i -
ciente de sedimentación y la viscosidad intrínseca, conduce al establecimiento
de ciertos cr i ter ios en lo que se refiere a su extrapolación a dilución in f i n i ta .
Se propone, además, la sustitución del parámetro U de heterogeneidad, dado su
carácter re lat ivo, por la sigma de la distribución en peso gausiana equivalente,
J.E.N. 301 J.E.N. 301
Junta de Energía Nuclear, División de Física de Radiaciones, Madrid,,"Anál i s i s por sedimentac ión de he te rogene idad
m a c r o m o l e c u l a r en DNA"MINGOT, F.; JÜRCANO, J .L . ; DAVkA, C.A. (1975) 142 pp. 24 f igs . 71 refs.
En este trabajo se describe la puesta a punto, en nuestro laboratorio, de un
método de determinación de la distribución de pesos moleculares en muestras po-
lidispersas de DNA. Se t rata del ^análisis de límites en experiencias de veloci-
dad de sedimentación, método de validez general para DNA nativo y desnaturado.
La cr í t ica de diversos factores experimentales que influyen sobre el coef l - .
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de ciertos cr i ter ios en lo que se refiere a su extrapolación a dilución i n f i n i t a .
Se propone, además, la sustitución del parámetro U de heterogeneidad, dado su
carácter relat ivo, por la sigma de la distribución en peso gausiana equivalente,
Junta de Energía Nuclear, División de Física de Radiaciones, Madrid,"Anál i s i s por sedimentación de heterogeneidad
m a c r o m o l e c u l a r en DNA"MINQOT, F.f JÜRCANO, J.L. ; DAVILA, C.A., (1975) 142 pp. 24 f igs . 71 refs.
En este trabajo se describe la puesta a punto, en nuestro laboratorio, de un
método de determinación de la distribución de pasos moleculares en nuestra po-
lidispersas de DNA. Se trata del análisis de límites en experiencias de veloci-
dad de sedimentación, método de validez general para DNA nativo y desnaturado.
La cr í t ica de diversos factores experimentales que influyen sobre el coefi-
ciente de sedimentación y la viscosidad intrínseca, conduce ai establecimiento
de ciertos cr i ter ios en lo que'se refiere a su extrapolación a dilución i n f i n i t a .
Se propone, además, la sustitución del parámetro U de heterogeneidad,'dado su
carácter relat ivo, por la sigma de la distribución en peso gausiana equivalente,
que tiene carácter absoluto y por ende intuitivo. que tiene carácter absoluto y por ende intuitivo.
CLASIFICACIÓN INIS Y DESCRIPTORES.- C11; Distribution; Molecular Weight;Quantitaíive Chemical Analysis; Ultracentrifugation; Sedimentation; DNA;Viscosity; Holecules; Decomposition.
CLASIFICACIÓN INIS Y DESCRIPTORES,- C11; Distribution; Molecular Weight;Quantitative Chemical Analysis; Ultracentrifugation; Sedimentation; DNA;Viscosity; Moléculas; Decomposition»
que tiene carácter absoluto y por ende intuitivo. que tiene carácter absoluto y por ende intuitivo.
CLASIFICACIÓN INIS Y DcSCRIPTüRES.- C11; Distribution; Molecular Weight;Quantitative Chemical Analysis; Ultracentrifugation; Sedimentation; DNA;Viscosity; Molecules; Decomposition.
CLASIFICACIÓN INIS Y DESCRIPTORES.- C11; Distribution; Molecular Weight;Quantitative Chemical Analysis; Ultracentrifugation; Sedimentation; IKA;Viscosity; ñolecules; Decomposition.
J.E.N. 301
Junta de Energía Nuclear, División de Física de Radiaciones, Madrid
"Sedimentation analysis of DNA polydisper sity"MINGOT, F.; JORCANO, J .L . ; DAVILA, C.A. (1975) 142 pp. 24 f igs . 71 refs..
This work describes the introduction in our laboratory, of a method for
polydispersity study in DNA samples. The method'is'basecl on boundary analysis
in boundary sedimentation runs.. This analysis is valid for both, native and
denatured samples.
We make a cri t icism of factors af fecting the in f in i te di lut ion extrapolation
of the sedimentation coefficient. and int r ins ic viscoty.
Also we propose the susti tut ion of the heterogeneity parameter U, which has
a relativa character, by the sigrna of the gaussian equivalent to the weight dis~
t r ibu t ion . This last parameter is more in tu i t ive due to i t s absolute character.
J.E.N. 301
Junta de Energía Nuclear, División de Física de Radiaciones, Madrid
"Sedimentation analysis of DNA polydispersity"MINGOT, F.; JORCANO, J . L ; DAVILA, C.A. (1975) 142 pp. 24 f i gs . 71 refs.
This work describes the introduction in our laboratory, of a method for
polydispersity study in DNA samples. The raethod is based on boundary analysis
in boundary sedimentation runs. This analysis is valid for both, native and
donatured samples.
We make a cri t ic ism of factors af fecting the in f in i te di lut ion extrapolation
of the sedimentation coefficient and int r ins ic viscoty.
Also we propose the sustitution of the heterogeneity parameter U, which has
a relative character, by the sigma of the gaussian equivalent to the weight dis-
t r ibu t ion . This last paramater is more in tu i t ive due to i t s absolute character.
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J.E.N. 301 J.E.N. 301
Junta de Energía Nuclear, División de Física de Radiaciones, Madrid"Sedimentation analysis of DNA polydispersity"
MINGOT, F.; JORCANO, J .L . ; DAVILA, C.A. (1975) 142 pp. 24 f igs . 71 refs.
This work describes the introduction in our laboratory, of a method for
polydispersity study in DNA samples. 1 he method is based on boundary analysis
in boundary sedimentation runs. This analysis is valid for both, nativ? and
denatured samples.
We make a cri t ic ism of factors affecting the in f in i te di lut ion extrapolation
of the sedimantation coefficient and int r ins ic viscoty.
Also we propose the sustitution of the heterogeneity parameter U, which has
a relative character, by the sigma of the gaussian equivalent to the weight dis-
t r ibu t ion . Ihis last parameter is more intu i t ive due to i t s absokrte character.
Junta de Energía Nuclsar, División de Física de Radiaciones, Madrid
"Sedimentation analysis of DNA. polydispersity"F.; JORCANO, J .L . ; DAVILA, C.A. (1975) 142 pp, 24 f igs . 71 refs.
This work describes the introduction in our laboratory, of a method forpolydispersity study in DNA samples. The method is based on boundary analysisin boundary sedimentation runs. Chis analysis is valid for both, native anddenatured samples.
We make a criticism of factors affecting the infinite dilution extrapolationof the sedimentation coefficient and intrinsic viscoty.
Also we propose the sustitution of the heterogeneity parametsr U, which hasa relative character, by the sigma of the gaussian equivalent to the weight dis-tribution. This last parameter is more intuitive due to its absolute characícr-
'CLASIFICACIÓN INIS Y DESCRIPTORES,,- C1V D'siribirno->: Molecular Woíght;
QuatHaiiva Chemical Analysis; U1iracerr.r¡Tüayt¡Gii; !s:-ü'!Ti;ntaiion; DNA;
Viscosity; Holecules; Dncomposition-
CLASIFICJCION INIS Y DESCRIPTORES.- C11; Di s ü-i b.; í. i en; Haloc^'ar Weiaíii-
Qnmtiínti-v-:- Cómica! Analysi:,: L'!J:tv.;íir:r¡Ti.uui:iun; Se o "• ni t .-n+--li: i cr: D¡JA"
VrscosiJ:v: ño!i;culfls; D^o^ipositio i-
ÜLAS;FiCACiúM- iN;-S Y ESCRíPÍORES.- C11; Distr ibution; Molecular feight;
Q'-^ÍIT: .aCTVi.; Chanir.a¡ Analysís; üí+ra-^ira'ifL'gaT.icn; S:¡dimulta1:ion; HA.
Visc;¡s;-;v; Ho'^-': j .s; D ía» ;os t i ón .
CLASIFICACIÓN INIS Y DESCRIPTORES..- C11; Dis+ribution: Hoiíc-.ilar Vloighi
Quairtilativa Chemical Analysis; Ultracentrif. igation; Sediu-:nLa::i:•••.; DNA
Viscosity; Molec.ilos; D^composinon-
