IZOLACIJA SEKUNDARNIH

METABOLITA

Odabir procedure za izolaciju sekundarnih metabolita zavisi od

Biljnog materijala

Spojeva koji se izoliraju

Prije odabira metode, potrebno je utvrditi cilj izolacije, koji može biti:

· nepoznata bioaktivna komponenta

· poznata komponenta

· grupa spojeva koji su strukturno slični

2

Fitohemijski screening uključuje;

Izbor odgovarjućeg biljnog materijala

Adekvatno prikupljanje biljnog materijala

Determinacija biljnog materijala

Sušenje

Pakovanje i skladištenje

Ekstrakcija

Separacija

Identifikacija

3

PRIKUPLJANJE BILJNOG MATERIJALA

Potrebno je kod prikupljanja biljnog materijala

voditi računa o;

Odgovarajuća fenološka faza (količina i vrsta

konstituenata zavisi od stepena razvoja biljke)

Prikupljena biljka treba biti zdrava (npr. da nije

inficirana nekim virusom, bakterijom ili gljivicom)

Determinaciju biljnog materijala treba izvršiti

stručno lice

Obavezno ostaviti voucher (reprezentativan uzorak)

4

PRIKUPLJANJE BILJNOG MATERIJALA

Divlje biljke Kultivirane biljke

Limitirano prirodno stanište (rijetke i endemične vrste), rašireni na velikom prostoru

Prisutni na limitiranom području

Teško dostupni Lako dostupni

Moguće da dođe do nedostatka materijala zbog konstatnog prikupljanja

Dostupni kontinuirano

Osoba koja vrši prikupljane mora biti iskusan botaničar

Osoba koja vrši prikupljanje ne mora biti botaničar

Daje pravu sliku hemijskog sastava na prirodnom staništu

Uticaj kontroliranih uslova života

Neistražen biljni materijal koji pruža mogućnost identifikacije novih aktivnih komponenata

5

Izolacijski proces za biljne materijale uključuje sljedeće

korake:

sušenje i usitnjavanje biljnog materijala (homogenizacija)

odabir i primjena prikladne metode izolacije npr: ekstrakcija,

destilacija ili presovanje

pročišćavanje ekstrakta

koncentriranje (npr. uparavanjem)

sušenje ekstrakata

6

Sušenje biljnog materijala

obično se obavlja u prostorijama koje nisu direktno izložene

sunčevoj svjetlosti

Pakuju se u papirne vrećice

Čuvaju se u sredini u kojoj su kontrolirani uslovi

7

Izolacija volatilnih sekundarnih metabolita vrši

se različitim metodama npr;

Headspace tehnikom

Destilacijom

Cijeđenjem

Anfleranž (enfleurage)

...

8

HEADSPACE TEHNIKA

Headspace tehnika se zasniva na određivanju volatilnih

komponenti prisutnih u zraku koji okružuje različite objekte.

Predstavljena je u novembru 1986 na 10. Internacionalnom

kongresu esencijalnih ulja u Washingtonu, gdje su prezentirani

rezultati na uzorku cvijeta jasmina.

Headspace predstavlja zrak iznad ili oko mirisnog uzorka koji

sadrži volatilne spojeve.

Ova metoda nije destruktivna

9

Headspace je važna ekstrakciona tehnika koja

omogućava direktnu analizu volatilnih spojeva koji su

prisutni u nevolatilnom matriksu.

Headspace omogućava da se dobiju podaci o aromi

koju imaju biljke na prirodnom staništu i daju nam

jasniju sliku o razlikama u sastavu volatilnih

konstituenata kod žive biljke i ekstrahovane faze

10

Primjenjene tehnike često se kalsificiraju prema različitim

principima uzorkovanja, na

statičku

dinamičku

11

HEADSPACE TEHNIKA (HS)

Statička HS metoda se sastoji u tome da se tečni ili čvrsti

uzorak stavi u vijalicu, koja se zagrijava do određene

temperature prije zatvaranja.

Termin statička metoda se odnosi na zatvoreno okruženje

gdje se sakupljaju nastale volatilne komponente.

Nakon što uzorak dostigne ravnotežu sa

gasovitom fazom, alikvot se prebacuje

siringom za GC na hromatografsku analizu.

Osjetljivost statičke headspace tehnike je u

mikrogramskim količinama, a zavisi i od

prirode volatilnih komponenata.

12

HEADSPACE TEHNIKA (HS)

Dinamička HS analiza koristi purge and trap (čišćenje i zamka)

tehniku, provodi se povlačenjem volatilnih komponenata sa

materijala strujom prečišćenog zraka ili inertnog gasa kroz cjevčicu

napunjenu nekim čvrstim adsorbentom.

Nakon određenog vremena cjevčica se prebacuje u jedinicu za

toplotnu desorpciju gdje se zagrijava, a adsorbovane komponente

nošene inertnim gasom se sakupljaju u jedinici trap, u kojoj je

temperatura mnogo niža.

Kada su sve kompnente desorbovane purge, i sakupljene idu dalje

na GC/MS analizu.

Osjetljivost dinamičke headspace tehnike je reda veličine

nanograma.

13

14

DESTILACIJA

Vrste destilacija

destilacije vodenom parom,

vodene destilacije (hidrodestilacije),

vodeno-parne destilacije.

Sve tri metode se zasnivaju na istim

teorijskim principima destilacije, a razlika

je u primarnom kontaktu biljnog

materijala i vode, tj. vodene pare.

15

16

Ilustracija destilacije esencijalnog ulja

CIJEĐENJE

Cijeđenjem se dobija esencijalno ulje iz svježe kore npr. limuna i narandže, jer se nalazi ispod same epiderme. I ova ulja se mogu dobiti destilacijom vodenom parom, ali zbog njihove lake dostupnosti vrši se cijeđenje na običnoj temperaturi.

Spugna-proces se sastoji u cijeđenju ulja iz svježe kore agruma na spužvu. Na kori se napravi nekoliko rezova i cijedi. Kada se spužva napuni uljem, iscijedi se u sud u kome se kasnije, stajanjem, ulje postepeno odvaja od mutne vode i pliva na njoj. Na ovaj način se dobije najbolje ulje, ali je metoda spora, ima mnogo gubitaka, tako da je prinos mali. Odvojeno ulje se filtrira da se dobije bistar proizvod.

Cijeli plodovi se pritišću i taru u posebno izbušenim posudama od nerđajućeg lima koje na unutrašnjoj strani imaju sitne, vrlo oštre iglice. Ove iglice izbuše spoljni dio kore u kome se nalaze velike šupljine sa uljem.

17

ANFLERAŽ (ENFLEURAGE)

(enfleurage) je francuski način izdvajanja esencijalnih ulja. Metoda je spora i skupa. Primjenjuje se za slučajeve kada je količina esencijalnih ulja tako mala, da se drugi načini ne mogu primjeniti. Princip se zasniva na tome da se koristi osobina masti da vrlo lako upijaju mirisne materije bilja na običnoj temperaturi.

Metoda se zasniva na adsorpciji mirisnih sastojaka na prečišćenom bezmirisnom loju. Dobvena “mirisna mast” se obrađuje odgovarajućim otapalom.

18

Mast se rasporedi po staklenoj ploči postavljenoj u drveni ram.

Svježi cvjetovi se rasporede po površini, nakon što se

esencijalna ulja absorbuju u masnoći, cvjetovi se zamijene

novim.

Na ovaj način se dobiju najfinija i najskupocjenija esencijalna

ulja. Pošto se radi na običnoj temperaturi i s neutralnim

materijama za upijanje, praktično se dobija prirodno

esencijalno ulje, onakvo kakvo se nalazi u biljci, jer se pod tim

okolnostima ekstrakcije ne mijenjaju ni organoleptičke osobine,

niti fizičke i hemijske konstante.

19

ANFLERAŽ (ENFLEURAGE)

EKSTRAKCIJA

proces razdvajanja komponenata iz biljnog materijala,

na osnovu različite topljivosti u otapalu kojim se vrši

ekstrakcija. Ekstrakcija uključuje nekoliko

istovremenih procesa:

difuzija otapala u stanice biljnog materijala

otapanje metabolita u otapalu

difuzija otapala s otopljenim tvarima izvan stanica

ispiranje

20

EKSTRAKCIJA

Faktori koji utiču na ekstrakciju su temperatura,

veličina čestica,

kretanje otapala i

pH-vrijednost.

Poželjna svojstva otapala za ekstrakciju: selektivnost za spojeve koje se žele ekstrahirati,

veliki ekstrakcijski kapacitet,

nereaktivnost s biljnim komponentama,

neškodljivost za ljude i opremu,

potpuna hlapljivost i

niska cijena.

21

EKSTRAKCIJA

Često se metode esktrakcije s otapalima dijele na kontinuirane i nekontinuirane postupke.

Maceracija

Ultrazvučna ekstrakcija

Perkolacija

Ekstrakcija po Soxhletu

Ekstrakcija s otaplaom pod pritiskom

Ekstrakcija pod refluksom

Ekstrakcija superkritičnim fluidima

22

MACERACIJA

usitnjeni biljni materijal u pogodnom otapalu u zatvorenoj

posudi se ekstrahira na sobnoj temperaturi. Povremeno ili

konstantno miješanje može povećati brzinu ekstrakcije

(maceracija uz miješanje ili vrtložna maceracija).

23

ULTRAZVUČNA EKSTRAKCIJA

ovo je modificirana maceracija, gdje je ekstrakcija

olakšana upotrebom ultrazvuka (visoko-frekventni

pulsevi, 20 kHz)

Ultrazvuk se koristi za mehanički stres na stanice

stvarajući kavitacije u uzorku. Raspadanje stanica

povećava topljivost metabolita u otapalu i poboljšava

ekstrakciju.

24

PERKOLACIJA

usitnjeni biljni materijal se postavlja u

perkolator (cilindrični kontejner s

slavinom na dnu) i natapa u otapalu.

Dodatno otapalo se zatim dodaje na vrh

biljnog materijala i pušta da «perkolira»

polako (kapajući) sa dna perkolatora.

25

EKSTRAKCIJA U SOXHLET-u

Biljni materijal se postavlja u cilindar u

ekstrakcijskoj komori koja se postavlja iznad

posude za sakupljanje, a ispod refluksirajućeg

hladila.

Glavna prednost ove vrste ekstrakcije je

kontinuirana ekstrakcija. Svježe otapalo se

kondenzira i ekstrahira biljni materijal

kontinuirano. Otapalo s ekstrahiranim tvarima

prelazi u balon gdje se koncentrira.

Nedostatak je u tome što se ekstrakt kontinuirano

zagrijava na temperaturu vrenja otapala, što može

dovesti termičkih razlaganja.

26

EKSTRAKCIJA POD REFLUKSOM

biljni materijal se uranja u otapalo u tikvici

koja je spojena na hladilo. Otapalo se

zagrijava do ključanja. Kako otapalo

otparava ulazi u hladilo gdje se

kondenzira i vraća se u tikvicu.

27

EKSTRAKCIJA SUPERKRITIČNIM FLUIDIMA

(engl. supercritical fluid extraction, SFE) – superkritični fluidi (SCFs) zamjenjuju organska otapala. Kritična tačka čiste tvari se definiše kao najviša temperatura i pritisak na kojima tvar može postojati u parno-tekućoj ravnoteži.

Na temperaturama i pritiscima iznad ove tačke nastaje jedan homogen fluid, poznat kao superkritični fluid.

SCF je težak kao tekućina, ali ima svojstvo prodiranja

kao gas. SCF nastaju zagrijavanjem gasova iznad

kritične temperature ili komprimiranjem tekućina iznad

kritičnog pritiska. Npr: Promjenom pritiska i

temperature mijenja se sposobnost otapanja

superkritičnog CO2 (visokokomprimirani CO2 (t > tk i p >

pk), bez mijenjanja sastava otapala. Ekstrakcija se

obično vrši na 40-50 oC i pritisku 200-300 bara.

28