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Aus dem Walther-Straub-Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Ludwig-
Maximilians-Universität München
Vorstand Prof. Dr. med. Thomas Gudermann
Isolierte Organmodelle zur Entwicklung neuer
therapeutischer Ansätze bei
Organophosphatvergiftungen
Dissertation
zum Erwerb des Doktorgrades der Humanbiologie
der Medizinischen Fakultät der
Ludwig-Maximilians-Universität zu München
vorgelegt von
Katharina Aurelia Marquart, geb. Neumaier
aus
Aichach
2018
Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität München
Berichterstatter: Prof. Dr. med. Franz Worek
Mitberichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Frank Mußhoff
Mitberichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Gerhard Scherer
Mitbetreuung durch den
promovierten Mitarbeiter: PD Dr. med. Timo Wille
Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reinhard Hickel
Tag der mündlichen Prüfung: 11.12.2018
I
Zusammenfassung
Jährlich sterben mehrere hunderttausend Menschen durch Organophosphat
(OP)-Vergiftungen, sei es in suizidaler Absicht mit Pestiziden oder im Rahmen
militärischer Einsätze, wie 2013 und 2017 durch den Einsatz von Sarin in
Syrien. Bei diesen Vergiftungen kommt es zu einer irreversiblen Hemmung der
Acetylcholinesterase. Die Patienten leiden aufgrund der daraus resultierenden
Übererregung der cholinergen Rezeptoren an Miosis, Salivation, Bronchorrhoe,
Faszikulationen, Konvulsionen und einer peripheren, bzw. zentralen
Atemlähmung, an der sie auch versterben können. Da die bisherige
Standardtherapie bei einigen OP-Vergiftungen unzureichend ist, bedarf es
neuer Therapeutika. Aus ethischen Gründen können Untersuchungen von
potentiellen Antidoten nicht am Menschen erfolgen. Deswegen stellen isolierte
Organmodelle, die schon seit Jahrzehnten zur Pharmaka-Testung verwendet
werden, sinnvolle und notwendige in vitro Methoden zur Eignungsprüfung dar.
Ein möglicher Therapieansatz im Rahmen einer OP-Vergiftung ist die
direkte Modulation von nikotinergen, bzw. muskarinergen Rezeptoren durch
Bispyridinium-(Non)-Oxime, z.B. HI-6 und SAD-128. Die weiterentwickelte
Leitsubstanz MB 327 zeigte in in vitro und in vivo Versuchen mit Soman
vielversprechende Therapieerfolge, war jedoch in hohen Konzentrationen in
vivo toxisch. Dies hat uns dazu veranlasst, erstmalig nikotinerge und
muskarinerge rezeptoraktive Substanzen am Langendorff-Rattenherz und im
Rattenjejunum, als Modell der glatten Muskulatur, zu untersuchen.
Keine der getesteten Substanzen war im isolierten Langendorff-Herz
kardiotoxisch. Demgegenüber zeigten die getesteten Substanzen im isolierten
II
Dünndarm-Modell nach vorheriger Stimulation mit Carbamoylcholin eine
konzentrationsabhängige Relaxation der glatten Muskulatur. Die Leitsubstanz
MB 327 war hierbei am potentesten (EC50 = 0,7 x 10-5 M).
Aufgrund der Relevanz von Speziesunterschieden im Rahmen von OP-
Vergiftungen und der entsprechenden Therapeutika-Entwicklung, wurden
anschließend humane Dünndarmpräparate mit den Ergebnissen der Ratte
verglichen. MB 327 zeigte einen zur Ratte vergleichbaren Effekt
(EC50 = 0,7 x 10-5 M) bzw. entsprechende AChE-Aktivitäten.
Isolierte Organmodelle stellen eine praktikable Untersuchungsmethode
potentieller Therapeutika im Rahmen einer OP- Vergiftung als Zwischenschritt
von in vitro und in vivo Versuchen dar. Kardiologische Effekte lassen sich am
isolierten Langendorff-Herz und glattmuskuläre Relaxation an Darmgewebe
untersuchen, wobei für die relaxierende Wirkung eine Übertragbarkeit auf den
Menschen gewährleistet ist.
III
Summary
Intoxications with organophosphorous compounds (OP) still pose a major
threat. This is demonstrated by annual several hundred thousand deaths
annually due to pesticide (self-) poisoning and the recent attacks with sarin in
Syria 2013 and 2017. Here a partly irreversible inhibition of the enzyme
acetylcholinesterase results in a subsequent overstimulation of cholinergic
receptors. Patients suffer from miosis, salivation, bronchorrhoe, fasciculation,
convulsions and a peripheral, as well as central respiratory paralysis possibly
resulting in death. As the current standard therapy is insufficient for some OP
compounds, new therapeutics have to be developed. Since these potential
antidotes cannot be examined in humans due to ethical reasons and isolated
organ models are used in pharmacological research since decades, these in
vitro methods pose a sensible and necessary suitability test.
One possible therapeutic approach in case of OP poisoning is the direct
modulation of nicotinergic and muscarinergic receptors with bispyridinium-(non)-
oximes, e.g. HI-6 or SAD-128. The refined lead substance MB 327 showed
promising results with soman in vitro and in vivo. However, it was toxic in high
dosages in vivo. Therefore, nicotinic and muscarinic receptoractive substances
were examined for the first time in the isolated Langendorff-heart, as well as the
isolated rat jejunum, being a model for smooth musculature. None of the tested
compounds showed a cardiotoxicity in the isolated Langendorff-heart. All
substances displayed a concentration dependent smooth muscle relaxing effect
in the isolated small bowel model; MB 327 being the most potent
(EC50 = 0.7 x 10-5 M).
IV
As species differences play a major role for OP poisoning as well as for
their drug development, we compared human small bowel samples with the
results gained with rat tissue in a follow-up study. MB 327 showed a
comparable relaxing effect (EC50 = 0.7 x 10-5 M), and respective AChE-activity.
Summarizing, isolated organ models are useful tools to assess potential
therapeutics for OP poisoning, as intermediate stage between in vitro and in
vivo experiments. Cardiotoxic effects can be examined with isolated
Langendorff-hearts. On the other hand the spasmolytic effect of different
compounds can be investigated with small bowel samples, whereby
transferability from rat to humans is warranted.
V
Eidesstattliche Versicherung
Ich erkläre hiermit an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation mit dem
Thema "Isolierte Organmodelle zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze
bei Organophosphatvergiftungen" selbständig verfasst, mich außer der
angegebenen keiner weiteren Hilfsmittel bedient und alle Erkenntnisse, die aus
dem Schrifttum ganz oder annähernd übernommen sind, als solche kenntlich
gemacht und nach ihrer Herkunft unter Bezeichnung der Fundstelle einzeln
nachgewiesen habe.
Ich erkläre des Weiteren, dass die hier vorgelegte Dissertation nicht in
gleicher oder in ähnlicher Form bei einer anderen Stelle zur Erlangung eines
akademischen Grades eingereicht wurde.
Dr. Olga Prokopchuk (Chirurgische Klinik des Klinikum rechts der Isar,
TU München) hat an der Durchführung dieser Arbeit mitgewirkt. Sie nahm die
Patientenaufklärung, Probenentnahme und Probenübergabe des humanen
Darmgewebes vor.
München, den 19.12.2018,
_____________________________
(Katharina Marquart)
VI
Inhalt
Zusammenfassung .............................................................................................. I
Summary ........................................................................................................... III
Eidesstattliche Versicherung .............................................................................. V
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................... VIII
Publikationsliste ................................................................................................. IX
1. Einleitung ..................................................................................................... 1
1.1 Phosphororganische Verbindungen ...................................................... 1
1.2 Wirkmechanismus ................................................................................. 2
1.3 Diagnostik ............................................................................................. 3
1.3.1 Symptomatik ................................................................................... 3
1.3.2 Labordiagnostik .............................................................................. 4
1.4 Standardtherapie ................................................................................... 5
1.5 Alternativer Therapieansatz: Bispyridinium-Non-Oxime ........................ 7
1.6 Speziesunterschiede ............................................................................. 9
1.7 Ziel der Dissertation .............................................................................. 9
2. Veröffentlichungen ..................................................................................... 12
2.1 Veröffentlichung I ................................................................................ 12
2.2 Veröffentlichung II ............................................................................... 18
3. Literaturverzeichnis .................................................................................... 24
4. Danksagung ............................................................................................... 30
VII
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1. 1 Strukturformeln verschiedener OP-Verbindungen. ............................. 2
Abb. 1. 2 Reaktion eines Organophosphats (OP) mit dem Enzym
Acetylcholinesterase (AChE) und die daraus resultierende Hemmung der
AChE. ................................................................................................................. 3
Abb. 1. 3 Strukturformel von MB 327. ................................................................ 8
VIII
Abkürzungsverzeichnis
ACh Acetylcholin
AChE Acetylcholinesterase
BChE Butyrylcholinesterase
GA Tabun
GB Sarin
GD Soman
GF Cyclosarin
mAChR muskarinerge ACh Rezeptoren
nAChR nikotinerge ACh Rezeptoren
OP phosphororganische Verbindungen
PAM positiver allosterischer Modulator
NKS Nervenkampfstoff(e)
IX
Publikationsliste
Publikationen
1. Neumaier, K., Worek, F., Thiermann, H., Wille, T., 2016. Bispyridinium
non-oximes: An evaluation of cardiac effects in isolated hearts and smooth
muscle relaxing effects in jejunum. Toxicol. In Vitro 35, 11–16.
10.1016/j.tiv.2016.05.005.
2. Marquart, K., Prokopchuk, O., Worek, F., Thiermann, H., Martignoni, M.E.,
Wille, T., 2017. Human small bowel as a useful tool to investigate smooth
muscle effects of potential therapeutics in organophosphate poisoning.
Toxicol. Lett. 293, 235–240. 10.1016/j.toxlet.2017.11.012.
Zusätzliche Publikationen
1. Wille, T., Neumaier, K., Koller, M., Ehinger, C., Aggarwal, N., Ashani, Y.,
Goldsmith, M., Sussman, J.L., Tawfik, D.S., Thiermann, H., Worek, F.,
2016. Single treatment of VX poisoned guinea pigs with the
phosphotriesterase mutant C23AL: Intraosseous versus intravenous
injection. Toxicol. Lett. 258, 198–206. 10.1016/j.toxlet.2016.07.004.
2. Worek, F., Schilha, M., Neumaier, K., Aurbek, N., Wille, T., Thiermann, H.,
Kehe, K., 2016. On-site analysis of acetylcholinesterase and
butyrylcholinesterase activity with the ChE check mobile test kit-
Determination of reference values and their relevance for diagnosis of
exposure to organophosphorus compounds. Toxicol. Lett. 249, 22–28.
10.1016/j.toxlet.2016.03.007.
X
3. Worek, F., Seeger, T., Neumaier, K., Wille, T., Thiermann, H., 2016.
Blaptica dubia as sentinels for exposure to chemical warfare agents - a
pilot study. Toxicol. Lett. 262, 12–16. 10.1016/j.toxlet.2016.09.006.
4. Marquart, K., Herbert, J., Amend, N., Thiermann, H., Worek, F., Wille, T.,
2018. Effect of cholinergic crisis on the potency of different emergency
anaesthesia protocols in soman-poisoned rats. Clin. Toxicol. 11, 1–7.
10.1080/15563650.2018.1520241.
1
1. Einleitung
Der Einsatz von Sarin in Syrien 2013 und 2017 sowie mehrere hunderttausend
Tote jedes Jahr durch Vergiftungen mit Organophosphatpestiziden zeigen die
hohe toxikologische Relevanz von phosphororganischen Verbindungen (OP)
[1–4]. Im Nachfolgenden werden zunächst die Unterschiede von verschiedenen
OP und deren Wirkmechanismus aufgezeigt sowie Diagnostik- und
Therapiemöglichkeiten erklärt. Anschließend wird auf nikotinerge bzw.
muskarinerge rezeptormodulierende Substanzen eingegangen und deren
Untersuchung in verschiedenen Organmodellen und entsprechende Ergebnisse
in beiden Veröffentlichungen diskutiert.
1.1 Phosphororganische Verbindungen
Zu den OP zählen neben einer Vielzahl von Pestiziden auch Nervenkampfstoffe
(NKS). Hierbei wird zwischen der G-Reihe, bestehend aus Tabun (GA), Sarin
(GB), Soman (GD), Cyclosarin (GF), und der V-Reihe (VX, VR, CVX)
unterschieden (siehe Abb. 1-1). Diese Phosphon- bzw. Phosphorsäurederivate
mit zwei Alkylgruppen und einer Abgangsgruppe weisen Unterschiede
hinsichtlich ihrer Toxizität und ihrer physikochemischen Eigenschaften auf [5,6].
Kampfstoffe der G-Reihe sind hydrolyselabilere und volatilere Flüssigkeiten als
die Substanzen der V-Reihe und ihre Aufnahme erfolgt meist inhalativ. Bei den
hydrolysestabileren NKS der V-Reihe hingegen kommt es meist zu einer
perkutanen Vergiftung. Dies kann in einer kontinuierlichen Resorption des NKS
resultieren und zu einer verzögerten, jedoch länger andauernden Vergiftung
führen [5,7,8].
1. Einleitung 2
Paraoxon-Ethyl
VXTabun (GA) Sarin (GB)
Cyclosarin (GF)Soman (GD)
Abb. 1. 1 Strukturformeln verschiedener OP-Verbindungen. Dargestellt ist die Grund-
Strukturformel aller OP, verschiedene NKS der G-Reihe bzw. VX und Paraoxon-Ethyl als
Vertreter der Pestizide.
1.2 Wirkmechanismus
Bei einer Vergiftung mit OP kommt es zur irreversiblen Hemmung von
Esterasen, vor allem der Acetylcholinesterase (AChE). Hierbei wird die Serin-
Hydroxyl-Gruppe im aktiven Zentrum des Enzyms phosphoryliert bzw.
phosphonyliert [5]. Durch diese Hemmung der lebensnotwendigen AChE
kommt es zu einer Akkumulation von Acetylcholin (ACh) im synaptischen Spalt,
was zu einer Übererregung der cholinergen Rezeptoren mit cholinerger Krise
(siehe 1.3.1) führt [3,9–11]. Die phosphorylierte bzw. phosphonylierte AChE
kann in einigen Fällen durch spontane Hydrolyse reaktiviert werden
(Spontanreaktiverung; Abb. 1-2). Bei einigen NKS, wie z.B. Soman, kommt es
innerhalb weniger Minuten durch Dealkylierung zu einer schnellen „Alterung“
1. Einleitung 3
der AChE. Der so entstandene stabile Komplex kann anschließend nicht mehr
durch Nukleophile reaktiviert werden (siehe Abb. 1-2) [5,6,8,12,13]. Bei einigen
OP, wie z.B. Tabun, ist eine Reaktivierung aufgrund stabilisierender
Konformationsänderungen des Enzym-NKS-Komplexes schwer möglich [5,14].
Im besten Fall kann durch Nukleophile, wie z.B. Oxime, eine Ablösung des OP-
Restes von der AChE erreicht werden und so die Enzymfunktion reaktiviert
werden (siehe Abb. 1.4).
X-
AChE - OH
AChE - OHHemmung
ki
Oxim
ks
ka
AChE - OH
kr2 = kr/KD
H2OH2O
Reaktivierung durch OximSpontanreaktivierung Alterung durch Dealkylierung
Abb. 1. 2 Reaktion eines Organophosphats (OP) mit dem Enzym Acetylcholinesterase
(AChE) und die daraus resultierende Hemmung der AChE. Die Hemmkonstante ki ist
abhängig von den chemischen Eigenschaften des OPs. In den folgenden Schritten sind die
Spontanreaktivierung (Spontanreaktivierungskonstante ks), Alterung durch Dealkylierung
(Alterungskonstante ka) und die Reaktivierung durch ein Oxim (Reaktivierungskonstante kr2)
dargestellt. Modifiziert nach [15].
1.3 Diagnostik
1.3.1 Symptomatik
Durch die Hemmung der AChE im Rahmen einer OP Vergiftung kommt es zu
einer Akkumulation von ACh im synpatischen Spalt. Infolge dessen werden
1. Einleitung 4
muskarinerge bzw. nikotinerge ACh Rezeptoren (mAChR, bzw. nAChR)
überstimuliert (vgl. Kapitel 1.2). MAChR kommen im Gehirn und in
parasympathischen Erfolgsorganen vor, wobei bisher fünf Subtypen (M1 bis
M5) mit Signaltransduktion durch heptahelikale Rezeptoren mit Aktivierung
eines G-Proteins beschrieben sind [5,16,17]. NAChR hingegen sind
Ionenkanäle, die aus fünf Untereinheiten bestehen und im Gehirn, in
vegetativen Ganglien und an neuromuskulären Endplatten vorkommen [5]. Je
nach Ort der Übererregung wird deswegen zwischen drei unterschiedlichen
Symptomengruppen unterschieden: muskarinerge (Miosis, Bradycardie
Bronchorrhoe, Bronchospasmus, Hyperhidrose, Salivation, Defäkation,
Urinabgang), nikotinerge (Tachykardie, Hypertension, Faszikulationen, Plegien)
und zentrale Symptome (Atemdepression, Angstzustände, Unruhe, Schwindel,
Kopfschmerzen, Tremor, Konvulsionen). Die Patienten versterben i.d.R. an
einer Kombination aus peripherer bzw. zentraler Atemlähmung [5,6,13]. Bei
inhalativen Intoxikationen, wie z.B. durch Sarin, zeigen die Patienten erst lokale
Veränderungen an den Schleimhäuten und Augen (z.B. Miosis, Rötungen,
Lakrimation), anschließend kommt es rasch zu einer Generalisierung. Bei
perkutaner Intoxikation hingegen, z.B. durch VX, tritt die Symptomatik verzögert
auf [6].
1.3.2 Labordiagnostik
Da die Symptomatik bei inhalativen Intoxikationen schnell nach der Exposition
auftritt und umgehend therapeutische Maßnahmen ergriffen werden müssen,
kommt der Labordiagnostik nur ein konfirmatorischer Nachweis zu. Bei V-
Stoffen hingegen, bei denen es zu einer langsamen Resorption kommt, stellt sie
1. Einleitung 5
die einzige Möglichkeit dar, um ggf. schon vor dem Auftreten der Symptome mit
therapeutischen Maßnahmen zu beginnen. Die Ermittlung der
Cholinesteraseaktivitäten des Patienten ist hier die einzige einsatzrelevante
Diagnostikmethode (ChE check mobile bzw. ChE status monitor, Securetec
Detektions-Systeme AG, Neubiberg, Deutschland). Hierbei wird die AChE-
Aktivität im Vollblut und die Butyrylcholinesterase (BChE)-Aktivität im Vollblut
bzw. Plasma mittels kolorimetrischen Ellman Assays gemessen [6,18–20]. Des
Weiteren können NKS, deren Metabolite und Proteinaddukte im Vollblut,
Plasma und Urin durch aufwendige Verfahren im Labor nachgewiesen werden.
Diese Methoden besitzen jedoch keine Relevanz für die Einleitung und die
Steuerung der Therapie [6,21–25].
1.4 Standardtherapie
Die bisherige Standardtherapie im Rahmen einer OP-Vergiftung besteht aus
Atropin und einem Oxim.
Atropin wirkt hierbei als kompetitiver muskarinerger Rezeptorantagonist,
verhindert somit eine Übererregung und die Ausbildung lebensbedrohlicher
Symptomatik, wie z.B. Bronchokonstriktion und zentrale Atemdepression
[12,13,17,26–29]. In hohen Konzentrationen wirkt es sogar krampflösend [17].
Initial sollten dem Patienten 2 mg Atropin intravenös oder intramuskulär
verabreicht werden. Diese Dosis wird bis zum Sistieren der Symptomatik
verdoppelt (4 – 8 – 16 – 32 mg, etc.) [17,26]. Dies kann dazu führen, dass
Atropinkonzentrationen erreicht werden, die in unvergifteten Patienten zu
schwerwiegenden Nebenwirkungen führen können [30].
1. Einleitung 6
Oxime hingegen reaktivieren die AChE indem sie die kovalente Bindung
zwischen dem OP und dem Enzym in zwei Schritten brechen (siehe Abb. 1-2)
[27,29,31]: Zuerst bindet das Oxim an die kovalent gebundene Phosphylgruppe,
wodurch ein Oxim-Phosphyl-AChE-Konjugat entsteht [13,29,32]. Anschließend
wird die reaktivierte AChE freigesetzt (Abb. 1-2) [12,27,29,32]. Die
Reaktivierung wird durch mehrere Faktoren, wie z.B. Speziesunterschiede,
spontane Reaktivierung und die "Alterung" der AChE beeinflusst (siehe Abb. 1-
2) [33–40].
In Deutschland und weiteren Ländern wird das 1964 entwickelte
Obidoxim verwendet [41,42]. Die vorgeschlagene Dosierung liegt hier initial bei
einem Bolus von 250 mg und anschließender kontinuierlicher intravenöser
Gabe von 750 mg über 24 Stunden [27,43,44]. Der ATOX II Combopen®
(Meridian Medical Technologies Ltd, Belfast, Großbritannien) Autoinjektor
enthält neben 2 mg Atropinsulfat 220 mg Obidoximchlorid. Das in den 1950er
Jahren synthetisierte Pralidoxim (2-PAM) hingegen wird in Großbritannien und
USA, aber auch in asiatischen Ländern eingesetzt [42,45–47]. Autoinjektoren
enthalten 600 mg Pralidoximchlorid [48,49]. Zusätzlich gibt es noch TMB-4, das
in Israel und HI-6, welches in Kanada und in Schweden in Autoinjektoren zum
Einsatz kommt [13]. Jedoch sind alle bisher entwickelten Oxime nur gegen ein
begrenztes OP-Spektrum wirksam. Obidoxim z.B. ist gegen Paraoxon, Sarin
und VX effektiv wirksam. Es ist jedoch nur ein schwacher Reaktivator
gehemmter AChE bei Cyclosarin- und Tabun-Vergiftungen [13,29].
Die im Rahmen der Vergiftung auftretenden Krampfanfälle sollten mit
Benzodiazepinen behandelt werden. Hierbei wird je nach Schweregrad initial
eine Dosis von 5 – 20 mg intravenös verabreicht [50,51].
1. Einleitung 7
1.5 Alternativer Therapieansatz: Bispyridinium-Non-Oxime
Da die bisherige Standardtherapie bestehend aus Atropin und einem Oxim (z.B.
Obidoxim) bei einigen Nervenkampfstoffen, wie z.B. bei Soman, Tabun oder
Cyclosarin, und Pestiziden, wie z.B. Fenamiphos und Profenofos, unzureichend
ist, bedarf es neuer Therapeutika (vgl. Kapitel 1.1 und 1.4). Eine
vielversprechende Möglichkeit stellt dabei die Modulation nikotinerger
Rezeptoren dar.
Schon in den 1970er bzw. 1980er Jahren zeigten Oxime (z.B. HI-6)
sowohl in vitro als auch in vivo neben der Reaktivierung der AChE einen
therapeutischen Effekt [30,52–55]. Für SAD-128, eine weiterentwickelte
Substanz ohne Oximgruppe, konnte eine Interaktion mit nikotinergen und
muskarinergen Rezeptoren nachgewiesen werden [55,57–62]. Aufgrund dieser
Rezeptormodulation war SAD-128 in in vivo Versuchen mit Soman-vergifteten
Mäusen wirksam, ohne die gehemmte AChE zu reaktiveren [63–65]. Neben
SAD-128 konnte eine Vielzahl von weiteren Bispyridinum-(Non)-Oximen die
muskuläre Übertragung nach Somanvergiftung am isolierten Rattendiaphragma
wiederherstellen [66]. MB 327 (1,1'-(propan-1,3-diyl)bis(4-tert-butylpyridinium)),
eine weiterentwickelte Variante von SAD-128, wurde zunächst im Defence
Science & Technology Laboratory, Porton Down, UK, untersucht und zählt zu
den Bispyridinium-Non-Oximen. Sie zeichnet sich durch zwei Tert-Butyl-
Gruppen und einen Propyl-Linker, der die beiden Pyrdiniumringe verbindet, aus
(siehe Abb. 1-3) [30]. MB 327 zeigte ebenfalls eine rezeptormodulierende
Wirkung an nikotinergen und muskarinergen Rezeptoren [67–69] sowie einen
anti-nikotinergen Effekt in Rhabdomyosarkom-Zellen [69]. Neueste Studien
belegen, dass Bispyridinium-Non-Oxime an muskarinergen Rezeptoren als
1. Einleitung 8
kompetitiver Antagonist über eine orthosterische Bindungsstelle und an
nikotinergen Rezeptoren als positiv allosterische Modulatoren (PAM) wirken
[67,70,71]. Zusätzlich war MB 327 in der Lage, die neuromuskuläre
Übertragung in der quergestreiften Muskulatur nach Somanvergiftung
wiederherzustellen [69,72]. Darüber hinaus hatte es in vivo einen protektiven
Effekt bei Soman-vergifteten Meerschweinchen. Kontrolltiere, die kein Soman
injiziert bekommen hatten, zeigten jedoch ab 30 mg/kg MB 327
Vergiftungserscheinungen in Form von schlaffer Lähmung und respiratorischer
Insuffizienz. Ab 100 mg/kg wirkte MB 327 sogar tödlich, wobei der genaue
Mechanismus der Toxizität nicht geklärt wurde [73].
Abb. 1. 3 Strukturformel von MB 327. MB 327 (1,1'-(propan-1,3-diyl)bis(4-tert-butylpyridinium)) besitzt zwei Tert-Butylgruppen und einen Propyl-Linker.
Bispyrdinium-Non-Oxime wirken somit sowohl an mAChR als auch an
nAChR. Voraussetzungen für eine mögliche Zulassung von cholinergen
Antagonisten sind jedoch eine gute Verträglichkeit in unvergifteten Patienten,
die Wirksamkeit selbst bei hohen ACh-Konzentrationen und eine erhaltene,
kontrollierte Erregungsweiterleitung [30].
1. Einleitung 9
1.6 Speziesunterschiede
Ratten wurden bis in die späten 1970er Jahre als das Standardversuchstier für
Versuche mit Nervenkampfstoffen verwendet [8]. Jedoch hatten einige
(potentielle) Therapeutika, die in anderen Spezies wirksam waren, in diesem
Tiermodell eine viel schwächere Wirkung [8].
Zusätzlich weist diese Tierart im Gegensatz z.B. zum Meerschweinchen,
hohe Aktivitäten der Plasma-Carboxylesterasen auf. Diese funktionieren als
natürliche Bioscavenger und können somit die Toxizität von OP um bis zu 90 %
reduzieren [74–77]. Obwohl die AChE nur von einem Gen kodiert wird und
somit in jedem Gewebe einer Spezies hoch konserviert vorliegt [9,78], gibt es
deutliche Unterschiede zwischen verschiedenen Tierarten hinsichtlich der
Struktur und somit der Kinetik dieses Enzyms [13].
Diese Diskrepanzen können die Übertragbarkeit für die in der Ratte
gewonnenen Daten beeinflussen. So war in Soman-vergifteter, quergestreifter
Muskulatur die Wiederherstellung der neuromuskulären Aktivität im humanen
Gewebe nur mit MB 327, nicht jedoch mit HI-6 möglich. In der Ratte hingegen
zeigten beide Substanzen einen therapeutischen Effekt [53,72,79,80].
1.7 Ziel der Dissertation
Die Therapielücken bei Vergiftungen mit OP-Pestiziden und NKS, die trotz
jahrzehntelanger, intensiver Forschung nach einem Breitspektrum-
Therapeutikum weiterhin bestehen, unterstreichen den Forschungsbedarf für
die Entwicklung neuartiger Therapieansätze bei OP-Vergiftungen. Da humane
Studien aus ethischen Gründen nicht möglich sind, stellen in vitro Versuche mit
1. Einleitung 10
tierischem bzw. humanem Gewebe eine unerlässliche Untersuchungsmethode
dar. In der pharmakologischen und toxikologischen Forschung werden isolierte
Organmodelle eingesetzt, um potentielle Therapeutika im komplexen
Zellverband zu untersuchen [81]. So wurden diese bisher u.a. in der
quergestreiften Muskulatur, in Precision Cut Lung Slices, aber auch in der
glatten Muskulatur getestet [71,72,79,82–84]. Speziesspezifische Unterschiede
in der Toxizität von OP aufgrund verschiedener Cholinesterasen erschweren
die Übertragbarkeit von tierischen Daten auf die humane Situation [39,85].
Ein vielversprechender Therapieansatz im Rahmen einer OP-Vergiftung
ist die Modulation von nikotinergen bzw. muskarinergen Rezeptoren.
Bispyridinium-Non-Oxime sind in der Lage, an nikotinergen Rezeptoren als
PAM und an muskarinergen Rezeptoren als kompetitive Antagonisten zu
binden [67,70,71]. Diese Wirkstoffgruppe, vor allem die Leitsubstanz MB 327,
zeigte vielversprechende Therapieerfolge im Rahmen einer OP-Vergiftung in
vitro und in vivo. Jedoch führte MB 327 im Tierversuch mit Meerschweinchen in
Dosen knapp oberhalb des therapeutischen Bereichs zum Tod der Tiere [73].
Daher wurde in der ersten Studie dieser Arbeit der Effekt von Bispyridinium-
Non-Oximen an zwei unterschiedlichen Modellen getestet: 1) dem isolierten
Langendorff-Herz, um eine mögliche Kardiotoxizität der Substanzen zu
untersuchen und 2) dem Modell der glattmuskulären Relaxation, um die
anticholinerge Wirksamkeit am Rattendarm nachzuweisen. (siehe Kapitel 2.1).
Keine der getesteten Substanzen war hierbei kardiotoxisch. In der glatten
Muskulatur hingegen, zeigten alle Bispyridinium-Non-Oxime nach vorheriger
Stimulation mit Carbamoylcholin einen deutlichen spasmolytischen Effekt.
Da speziesspezifische Unterschiede bei der Toxizität von OP und der
Wirksamkeit von Antidoten vorliegen, die ggf. die Übertragbarkeit der in der
1. Einleitung 11
Ratte gewonnenen Daten auf den Menschen verhindern, wurde ein humanes
Darmmodell vergleichbar zu dem Modell der glatten Muskulatur mit
Rattengewebe aus der ersten Veröffentlichung etabliert. Hierbei wurden
verschiedene Bispyridinium-Verbindungen untersucht, um die Ergebnisse mit
den zuvor gewonnenen Rattendaten zu validieren. Zusätzlich wurden die
Cholinesteraseaktivität im humanen und im Ratten-Dünndarmgewebe
(Jejunum, Ileum) gemessen. Die Untersuchungen weisen auf eine
Übertragbarkeit der für aus Rattengewebe mit Bispyridinium-(Non)-Oxim-
Verbindungen gewonnenen Daten auf den Menschen hin (siehe Kapitel 2.2).
2. Veröffentlichungen 12
2. Veröffentlichungen
2.1 Veröffentlichung I
2. Veröffentlichungen 13
2. Veröffentlichungen 14
2. Veröffentlichungen 15
2. Veröffentlichungen 16
2. Veröffentlichungen 17
2. Veröffentlichungen 18
2.2 Veröffentlichung II
2. Veröffentlichungen 19
2. Veröffentlichungen 20
2. Veröffentlichungen 21
2. Veröffentlichungen 22
2. Veröffentlichungen 23
24
3. Literaturverzeichnis
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30
4. Danksagung
Den Personen, die zum Gelingen dieser Arbeit direkt oder indirekt beigetragen
haben, möchte ich hier meinen Dank aussprechen.
Besonders möchte ich meinem Doktorvater Oberstarzt Prof. Dr. Worek
und meinem Betreuer Oberfeldarzt PD Dr. Wille danken, die mich während
meiner wissenschaftlichen Tätigkeit und dem Schreiben der Publikationen, als
auch der Promotion stets begleitet, unterstützt und motiviert haben, als auch für
die persönliche Unterstützung und ihre geduldigen Hilfestellungen, Ratschläge
und Korrekturen. Joanna Brosig, die mich eingearbeitet und mit ihrer Erfahrung
unterstützt hat, gilt ebenfalls mein Dank. Bei allen Mitarbeitern, Doktoranden,
Post-Docs und Arbeitsgruppenleitern des Institutes bedanke ich mich für ihre
Hilfsbereitschaft und die angenehme Atmosphäre, besonderer Dank gilt hier Fr.
Oberstabsveterinär Dr. Herbert. Herrn Oberstarzt Prof. Dr. Thiermann, Leiter
des Instituts für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr, danke ich für
die Möglichkeit an diesem Institut wissenschaftlich tätig zu sein und meine
Dissertation anfertigen zu können.
Meinen Dank möchte ich auch Prof. Dr. Martignoni und Dr. Prokopchuk
für die gute und produktive Kooperation aussprechen.
Meinen Geschwistern Christopher und Teresa bin ich dankbar, für ihr
Vorbild, die Motivation und ihre Hilfestellung. Besonderer Dank gilt meiner
Mutter Ulrike, die mich in all meinen Interessen unterstützt und gefördert hat.
Die es aber auch geschafft hat, mir in einer sehr schweren Zeit Anker und
Stütze zu sein und maßgeblich zum Gelingen meines Studiums, als auch der
Promotion beigetragen hat.
4. Danksagung 31
Meinem Ehemann Stefan, der mir nicht nur während des Studiums und
meiner Promotion immer mit aufbauenden Worten, Wissen und Ermutigungen
zur Seite gestanden und somit besonders zum Gelingen dieser Arbeit
beigesteuert hat.
Mein letzter Dank gilt meinem verstorbenen Vater Albert.