ISOLASI FUNGI ENDOFIT PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROBA DARI DAUN CABAI KATOKKON

(Capsicum annuum L. var. chinensis) DAN PROFIL KLT-BIOAUTOGRAFI

SOENDARIA INTAN N111 09 006

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR

2013

ISOLASI FUNGI ENDOFIT PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROBA DARI DAUN CABAI KATOKKON

(Capsicum annuum L. var. chinensis) DAN PROFIL KLT-BIOAUTOGRAFI

SKRIPSI

untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi syarat – syarat untuk mencapai gelar sarjana

SOENDARIA INTAN N111 09 006

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR

2013

iii

iv

v

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini adalah karya

saya sendiri, tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh

gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan sepanjang pengetahuan

saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau

diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah

ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Apabila dikemudian hari terbukti bahwa pernyataan saya ini tidak

benar, maka skripsi dan gelar yang diperoleh, batal demi hukum.

Makassar, Mei 2013

Penyusun

Soendaria Intan

vi

ABSTRAK

Fungi endofit kini banyak dieksplorasi sebagai alternatif senyawa bioaktif karena kemampuannya menghasilkan metabolit yang potensial untuk dikembangkan menjadi bahan baku obat. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh isolat fungi endofit yang mampu menghasilkan senyawa antimikroba. Penelitian ini dilakukan dengan cara mengisolasi fungi endofit dari daun tanaman cabai katokkon(Capsicum annuum L.var.chinensis). Isolat yang diperoleh kemudian digunakan untuk produksi senyawa melalui proses fermentasi. Pada akhir proses fermentasi, media fermentasi diekstraksi dengan etil asetat. Ekstrak yang diperoleh selanjutnya dianalisa profil KLTnya dan diuji aktivitas serta KLT-bioautografinya. Proses isolasi menghasilkan 2 isolat yang diberi kode DC-1 dan DC-2, hasil uji antagonis isolat DC-1 menunjukkan penghambatan yang paling tinggi. Hasil uji dengan metode difusi menunjukkan bahwa pada konsentrasi ekstrak 10 μL/disk mampu menghambat pertumbuhan Eschericia coli (29,50mm), Staphylococcus aureus (16,50mm) dan Pseudomonas aeruginosa (19,00mm). Hasil bioautografi agar-overlay menunjukkan bahwa senyawa aktif yang ada dalam ekstrak etil asetat media fermentasi memiliki Rf 0,54 cm aktif terhadap bakteri Eschericia coli (18,3mm) dengan perbandingan fase gerak heksan : etil asetat 1:5. Ekstrak etil asetat dari media fermentasi isolat DC-1 diduga merupakan golongan senyawa terpenoid dan alkaloid. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa jamur endofit pada daun cabai katokkon mampu menghasilkan senyawa yang mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Kata Kunci : Fungi endofit, Cabai katokkon,antimikroba

vii

ABSTRACT

Endophytic fungi had been widely explored as an alternative source of bioactive compound because its ability to produce metabolites that have potency to be developed as drug materials. The aim of this study was to acquire endophytic fungi isolate that had ability to produce antimicrobial compounds. This study was conducted by isolating endophytic fungi from “cabai katokkon” (Capsicum annuum L.var.chinensis) leaf. Then, isolates were used to produce active compounds through fermentation process. In the end of the process, fermentation media was extracted with ethyl acetate. After that, acquired extracts were analyzed to find out its TLC profile. Its activity and TLC-bioautography were also tested. two isolates were acquired and one of them shows highest inhibition score, which is isolate DC-1. The result of diffusion method test shows that in concentration of 10 μL/disk could inhibit Eschericia coli (29,50mm), Staphylococcus aureus (16,50mm) and Pseudomonas aeruginosa (19,00mm) growth. Agar-overlay bioautography result shows that the active compound in ethyl acetate extract of fermentation media had an Rf value of 0,54 cm which is active against Escherichia coli (18,3 mm) with eluen hecsan :ethyl acetate 1:5. The ethyl acetate extract of fermentation media of isolate DC-1 maybe from terpenoid and alkaloid group. The result of this study shows that endophytic fungi from “cabai katokkon” leaf could produce active compound that had ability to inhibit microbial growth. Keywords: Endophytic fungi, katokkon leaf, antimicrobial activity

viii

UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillah, puji syukur penulis kekhadirat Allah Yang Maha Kuasa

dan Maha Penyayang karena berkat dan izin-Nya sehingga penulis berhasil

menyelesaikan skripsi ini sebagai salah satu syarat untuk memeperoleh

gelar sarjana pada Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin. Shalawat dan

salam kepada junjungan Nabi Besar Muhammad SAW.

Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini banyak

rintangan dan hambatan yang dihadapi, namun dengan doa dan bantuan

dari berbagai pihak, skripsi ini dapat terselesaikan. Oleh karena itu,

perkenankanlah penulis mengungkapkan rasa terima kasih dan penghargaan

yang sebesar-besarnya kepada ayahanda Ir.Yustan Intan dan ibunda

tersayang Indo Upe yang telah banyak memberikan pengorbanan baik moril

maupun materil yang tidak akan mampu penulis balas sampai akhir hayat, di

dalam doa yang senantiasa dipanjatkan.Penulis juga menyampaikan rasa

terima kasih kepada adik tercinta Muhammad Imam Shobri Nur intan yang

selalu memberikan rasa kasih dan sayangnya, begitupula dengan seluruh

sanak famili yang tak dapat penulis sebutkan satu persatu yang senantiasa

memberikan dorongan dalam dunia perkuliahan.

Tiada kata yang dapat penulis ucapkan selain terima kasih yang

sebesar-besarnya kepada ibu Dr.Herlina Rante M.Si, Apt selaku Pembimbing

Utama dan bapak Drs. H. Burhanuddin M.Si, Apt selaku Pembimbing

Pertama dan Penasehat Akademik Penulis yang telah meluangkan waktu

selama ini untuk memberi petunjuk, membagi ilmu dan menyumbangkan

ix

fikiran dalam membimbing penulis selama melakukan penelitian hingga

selesainya skripsi ini.

Pada kesempataan kali ini pula, penulis menyampaikan terima kasih

kepada:

1. Dekan, Wakil Dekan, Ibu Dr. Hj. Latifah Rahman, DESS., Apt. , Bapak

Drs. H. Syaharuddin Kasim, M.Si., Apt dan Bapak Prof.Dr.H.M.Natsir

Djide, MS., Apt selaku penguji penulis serta seluruh dosen dan staf

Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas bantuannya dalam

penyelesaian skripsi ini

2. Saudara Suhermawan, Nasriah, Ayu Asyhari, Riskah Mathar, Khairul

Amry dan Pratiwi Syarifuddin atas segala waktu, dan bantuan yang

diberikan kepada penulis dalam dunia perkuliahan

3. Saudari Iin Fitriana Pakata selaku teman Penelitian Cabai Katokkon

4. Saudara-saudara Asisten Laboratorium Farmaseutika.

5. Saudara-saudara selaku rekan penelitian Fungi Endofit.

6. Saudara-saudara seangkatan Ginkgo 2009.

7. Haslia S.Si. selaku Laboran Laboratorium Mikrobiologi Farmasi

Universitas Hasanuddin

8. Arti selaku Laboran Laboratorium Fitokimia Farmasi Universitas

Hasanuddin

9. Sumiati S.Si. selaku Laboran Laboratorium Farmasetika Farmasi

Universitas Hasanuddin

x

10. Semua pihak yang tidak disebutkan namanya atas bantuan dan

kerjasamanya kepada penulis selama penelitian dan menjalani

penelitian

Penulis menyadari skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Maka dari

itu saran dan kritik sangat penulis harapkan guna menambah wawasan agar

dalam pengerjaan penelitian selanjutnya dapat lebih baik.

Akhirnya semoga karya ini memberikan manfaat bagi keilmuan

Farmasi dan kepada masyarakat.

Makassar, Mei 2013

Soendaria Intan

xi

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .......................................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN ........................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................. iv

HALAMAN PERNYATAAN ............................................................. v

ABSTRAK ....................................................................................... vi

ABSTRACT ..................................................................................... vii

UCAPAN TERIMA KASIH ............................................................... viii

DAFTAR ISI .................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR ......................................................................... xiv

DAFTAR TABEL ............................................................................. xv DAFTAR

PENDAHULUAN ............................................................................. 1

TINJAUAN PUSTAKA..................................................................... 5

II.1 Uraian Tanaman ........................................................... 5

II.1.1 Morfologi .................................................................... 5

II.1.2 Klasifikasi ................................................................... 5

II.2 Fungi Endofit ................................................................. 6

II.3 Antimikroba ................................................................... 9

II.4 Isolasi Fungi Endofit ..................................................... 12

II.5 Uji Aktivitas Antimikroba dengan Metode Difusi Agar ... 14

II. 6 Metabolit Sekunder dari Fungi Endofit ......................... 16

II.7 Produksi Metabolit Sekunder ....................................... 18

II.8 Metode KLT-Bioautografi ............................................. 23

xii

II.8.1 Kromatografi Lapis Tipis............................................ 23

II.8.2 Bioautografi ............................................................... 25

II.9 Mikroba Uji ................................................................... 27

METODE PENELITIAN ................................................................... 31

III.1 Alat dan Bahan yang digunakan ................................. 31

III.1.1 Alat ........................................................................... 31

III.1.2 Bahan ....................................................................... 31

III.2 Prosedur Penelitian ..................................................... 31

III.2.1 Sterilisasi alat ........................................................... 31

III.2.2 Pengambilan dan Penyiapan Sampel Penelitian ...... 32

III.2.2.1 Pengambilan Sampel ............................................ 32

III.2.2.2 Pengolahan Sampel .............................................. 32

III.3 Penyiapan mikroba uji ................................................. 32

III.4 Pembuatan Medium .................................................... 33

III.4.1 Pembuatan Potato Dekstrosa Agar (PDA) ............... 33

III.4.2 Pembuatan Potato Dekstrosa Yeast (PDY).............. 33

III.4.3 Pembuatan Potato Dekstrosa Broth (PDB) .............. 33

III.4.4 Pembuatan Nutrien Agar (NA) ................................. 33

III.5 Isolasi Mikroba Endofit ................................................ 34

III.6 Pemurnian FungiEndofit .............................................. 34

III.7 Uji Aktivitas Fungi Endofit............................................ 35

III.7.1Uji Aktivitas Antimikroba Fungi Endofit ..................... 35

III.7.2 Fermentasi Isolat ...................................................... 35

xiii

III.7.3 Ekstraksi Isolat ......................................................... 36

III.7.4 Uji Aktivitas terhadap Malassezia furfur, Escherichia coli,

Staphylococcus aureus , dan Pseudomonas aeruginosa. ... 36

III.8 Pengujian KLT-Bioautografi ........................................ 37

III.9 Pengukuran Zona Hambat .......................................... 37

III.10 Pengumpulan dan Analisis Data ............................... 38

III.11 Penarikan Kesimpulan .............................................. 38

HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 39

IV.1 Hasil Isolasi Fungi Endofit.......................................... 39

IV.2 Hasil Uji Antagonis Fungi Endofit ............................... 40

IV.3 Hasil Fermentasi Fungi Endofit .................................. 42

IV.4 Ekstraksi Metabolit Sekunder Fungi Endofit .............. 44

IV.5 Uji KLT Bioautografi Ekstrak Etil Asetat dari Isolat A . 46

KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 49

V.1 Kesimpulan .................................................................. 49

V.2 Saran ........................................................................... 49

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................ 50

Lampiran ......................................................................................... 54

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Koloni murni fungi endofit daun cabai katokkon ............ 39

Gambar 2. Uji Antagonis fungi endofit isolat daun cabai katokkon . 41

Gambar 3. Kurva diameter hambatan fermentat fungi endofit isolat

DC-1 terhadap lama fermentasi .................................. 44

Gambar 4. Ekstrak fungi endofit Isolat DC-1 daun cabai katokkon 46

Gambar 5. Uji KLT-Bioautografi fungi endofit Ekstrak Isolat DC-1

daun cabai katokkon ..................................................... 48

Gambar 6. Tanaman cabai katokkon .............................................. 60

Gambar 7. Produksi dan Fermentasi Fungi Endofit Isolat DC-1

daun cabai katokkon .................................................... 60

Gambar 8. Kromatogram Ekstrak Isolat DC-1 daun cabai katokkon 60

Gambar 9. Identifikasi Ekstrak Isolat DC-1 daun cabai katokkon ... 61

Gambar 10. Uji KLT-Bioautografi Ekstrak Isolat DC-1 daun cabai

katokkon terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa 61

Gambar 11. Uji KLT-Bioautografi Ekstrak Isolat DC-1 daun cabai

katokkon terhadap bakteri Staphylococcus aureus ..... 61

xv

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Karakterisasi makroskopik isolat fungi endofit .................. 40

Tabel 2. Hasil pengujian aktivitas antimikroba ................................ 41

Tabel 3. Hasil pengujian aktivitas antimikroba fermentat fungi endofit

isolat DC-1 ....................................................................... 43

Tabel 4. Hasil pengujian aktivitas antimikroba ekstrak isolat DC-1 . 45

1

BAB I

PENDAHULUAN

Antimikroba merupakan suatu produk atau bahan metabolit yang

dihasilkan oleh satu jenis mikroorganisme yang dapat menghambat

pertumbuhan mikroorganisme lainnya. Bahan metabolit yang dapat

menghambat atau membunuh mikroorganisme disebut antibiotika dan

cara kerjanya disebut antibiosis. Antibiotika tersebar di alam bebas, tetapi

hanya beberapa yang tidak toksik dipakai dalam pengobatan dan

kebanyakan diperoleh dari genus Bacillus, Pinicillium dan trepomyces.

Sebagai contoh antibiotika alami adalah pinisilin, tetrasiklin dan eritromisin

Senyawa antimikroba didefinisikan sebagai senyawa biologis atau kimia

yang dapat menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba (1,2).

Tanaman merupakan salah satu sumber bahan baku obat dan

termasuk senyawa antimikroba. Cabai (Capsicum sp.) adalah salah satu

dari sekian banyak tanaman obat yang khasiat serta kegunaannya telah

cukup dikenal oleh masyarakat kita. Khasiat cabai yang begitu banyak

tersebut disebabkan oleh senyawa kapsaisin (C18H27NO3) yang

terkandung di dalam buah cabai. Kapsaisin yang merupakan unsur aktif

dan pokok yang berkhasiat terdiri dari lima komponen kapsaisinoid, yaitu

nordihidro kapsaisin, dihidro kapsaisin, homo kapsaisin, dan homo dihidro

kapsaisin. Senyawa senyawa tersebut bisa dijadikan obat untuk

pengobatan sirkulasi darah yang tidak lancar di tangan, kaki, dan jantung.

Sewaktu kita mengonsumsi cabai yang berasa pedas (buah cabai merah

2

mempunyai tingkat kepedasan 100-250.000 unit scoville), terutama cabai

merah dan cabai rawit, suhu tubuh akan meningkat sehingga merangsang

metabolisme tubuh. Akibatnya, sirkulasi darah menjadi lancar dan aliran

nutrisi di jaringan tubuh meningkat. Selain mengandung kapsaikin, cabai

juga mengandung kapsikidin. Senyawa yang terdapat di dalam biji ini

berguna untuk memperlancar Sekresi asam lambung dan mencegah

infeksi sistem pencernaan. Senyawa lain yang juga dimiliki cabai adalah

kapsikol. Senyawa ini bisa berfungsi sebagai pengganti minyak kayu putih

yang berguna untuk mengurangi pegal-pegal, rematik, sakit gigi, sesak

napas, dan gatal-gatal (3).

Sebagian besar komponen kimia yang berasal dari tanaman yang

digunakan sebagai obat dan bahan obat adalah merupakan metabolit

sekunder. Salah satu cara terbaru dalam memproduksi senyawa metabolit

sekunder sejenis yang terdapat dalam tanaman adalah dengan

memanfaatkan mikroba endofit yang hidup dalam jaringan tanaman (4).

Mikroba endofit adalah organisme hidup yang berukuran

mikroskopis (bakteri dan jamur) yang hidup di dalam jaringan tanaman

(xylem dan phloem), daun, akar, buah, dan batang. Mikroba ini hidup

bersimbiosis saling menguntungkan, dalam hal ini mikroba endofitik

mendapatkan nutrisi dari hasil metabolisme tanaman dan memproteksi

tanaman melawan herbivora, serangga, atau jaringan yang patogen

sedangkan tanaman mendapatkan derivat nutrisi dan senyawa aktif yang

diperlukan selama hidupnya (5).

3

Mikroba endofit yang terdiri atas bakteri dan jamur merupakan

mikroba yang hidup di dalam jaringan tanaman dan membentuk koloni

tanpa membahayakan inangnya. Tanaman tingkat tinggi dapat

mengandung beberapa mikroba endofit yang menghasilkan metabolit

sekunder. Fungi endofit dapat membentuk koloni dalam jaringan tanaman

tanpa membahayakan inangnya Hubungan yang terjadi antara inang dan

fungi endofit bukan merupakan hubungan patogenitas. Fungi endofit yang

terdapat dalam tanaman memacu perkecambahan, untuk bertahan dalam

kondisi yang kurang menguntungkan, mempercepat pertumbuhan,

ketahanan terhadap patogen lemah, dan beberapa kasus yang dapat

meningkatkan ketahanan tanaman terhadap tekanan lingkungan.

Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder

sesuai dengan tanaman inangnya yang merupakan peluang sangat besar

dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikroba

endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya (6,7,8).

Pemanfaatan mikroba endofit dalam memproduksi senyawa aktif

memiliki beberapa kelebihan, antara lain (1) lebih cepat menghasilkan

dengan mutu yang seragam, (2) dapat diproduksi dalam skala besar dan

(3) kemungkinan diperoleh komponen bioaktif baru dengan memberikan

kondisi yang berbeda (9).

Penelitian tentang uji aktivitas antimikroba ekstrak cabai terhadap

berbagai mikroba patogen secara in vitro telah dilakukan oleh Dyan dkk

4

(2008) dengan hasil positif menunjukkan nilai KHM pada E.coli (7,29%),

S.aureus (2,35%) dan C.albicans (7,29%).

Berdasarkan uraian di atas, permasalahan yang timbul adalah

apakah dapat mengisolasi dan memperoleh metabolit sekunder fungi

endofit sebagai penghasil senyawa antimikroba dari daun cabai katokkon

(Capsicum annuum L. var. chinensis) yang segar maupun dari daun cabai

yang telah mulai menguning asal suku Solanacae Kabupaten Tana Toraja

Provinsi Sulawesi Selatan ?. Sehubungan dengan itu telah dilakukan

penelitian mengenai isolasi fungi endofit dari daun cabai katokkon

(Capsicum annuum L. var. chinensis) yang segar maupun dari daun cabai

yang telah mulai menguning asal suku Solanacae Kabupaten Tana Toraja

Provinsi Sulawesi Selatan. Fungi endofit diisolasi dan dilakukan uji

aktivitas dengan metode difusi agar, selanjutnya dilakukan fermentasi,

ekstraksi dan uji KLT-Bioautografi.

Penelitian ini bermaksud untuk untuk menguji aktivitas fungi endofit

dari daun cabai katokkon (Capsicum annuum L var. chinensis) yang segar

maupun dari daun cabai yang telah mulai menguning terhadap beberapa

mikroba uji dan tujuan dari penelitian ini yaitu untuk memperoleh isolat

fungi endofit yang merupakan senyawa antimikroba.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Uraian Tanaman

II.1.1 Morfologi

Habitus semak, sistem perakaran tunggang, batang bulat,

bercabang. Bangun daun bulat telur, ujung daun meruncing, pangkal daun

runcing, tepi daun rata, pertulangan daun menyirip, warna daun hijau, dan

daging daun seperti kertas. Mahkota bunga berlekatan. Buah berbentuk

bakul(katokkon, bahasa Toraja) keluar dari ketiak daun, pada saat masih

muda buah berwarna hijau muda sampai keungu-unguan, kuning dan

setelah masak berwarna merah terang. Buah Lombok katokkon tergolong

buah berukuran pendek berlekuk panjang 3-4 cm dan lebar 2,5-3,5 cm.

jika dipotong akan mengeluarkan aroma khas terasa pedis, jumlah sekat

ada 3 ruang tidak sama besar, biji terletak di sudut tengah sekat buah

(axillaris). Sympetalae artinya mahkota bunga saling berlekatan.

Tubiflorae artinya susunan mahkota bunga bersatu membentuk susunan

seperti tabung/lonceng. Kelompok Suku Solanaceae artinya tanaman

terong-terongan.

II.1.2 Klasifikasi

Tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah daun cabai

katokkon (Capsicum annuum L.var. chinensis). Identifikasi tanaman yang

6

digunakan dilakukan oleh Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi,

Universitas Gadjah Mada Yogyakarta (Lampiran 1).

Regnum : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Anak divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Anak Kelas : Sympetaleae

Bangsa :Solanales/tubiflorae

Famili : Solanaceae

Genus : Capsicum

Spesies : Capsicum annuum L.var.chinensis (Lampiran 1)

II.2 Fungi Endofit

Fungi merupakan protista nonfotosintetis yang tumbuh dengan

bercabang, jalinan filament (hifa) yang dikenal dengan sebutan miselium

(mycelium). Meskipun hifa memiliki sekat atau septa, akan tetapi septa

umumnya memilik pori yang cukup besar sehingga ribosom, mitokondria

dan bahkan nukleus dapat mengalir dari satu sel ke sel lain. Jadi secara

utuh, organisme ini adalah coenocytes (bentukan berinti banyak dengan

sitoplasma saling berhubungan) berada dalam deretan tabung-tabung

yang bercabang. Tabung-tabung ini dibentuk dari polisakarida seperti

khitin, yang mirip dengan dinding sel. Bentuk miselial disebut mold, jenis

lain seperti ragi, tidak membentuk miselium namun mudah dikenali

7

sebagai fungi melalui proses reproduksi seksualnya dan dari adanya

bentuk-bentuk peralihan (10).

Fungi adalah eukariotika, dan sebagian besar adalah eukariotika

multiseluler. Fungi mempunyai ciri-ciri spesifik antara lain: mempunyai inti

sel, membentuk spora, tidak berklorofil, heterospora, saprofit, dapat

berkembang biak secara aseksual maupun seksual. Meskipun fungi

pernah dikelompokkan ke dalam kingdom tumbuhan, fungi adalah

organisme unik yang umumnya berbeda dari eukariotika lainnya jika

ditinjau dari cara memperoleh makanan, organisasi struktural, serta

pertumbuhan dan reproduksi. Pada kenyataannya kajian molekuler

menunjukkan bahwa fungi dan hewan kemungkinan berasal dari satu

nenek moyang yang sama (11).

Endofit merupakan mikroorganisme yang tumbuh dalam jaringan

tanaman tetapi tidak membahayakan inangnya, dapat diisolasi dari

jaringan tanaman yang telah disterilisasi permukaan ataupun diekstraksi

dari dalam jaringan tanaman. Endofit dapat memiliki beberapa efek yang

menguntungkan pada inangnya dan dapat digunakan sebagai kontrol

biologis bagi hama tanaman, juga dapat mempertinggi karakteristik

tanaman seperti meningkatkan ketahanan terhadap kering, panas,

efisiensi nitrogen, sebagai bioherbisida dan juga memiliki efek

farmakologis. (12)

Pada umumnya isolat mikroba endofit adalah fungi. Fungi tumbuh

dalam bentuk filamen-filamen yang tumbuh dari bagian tanaman pada

8

permukaan medium isolasi. Kebanyakan isolat fungi yang diperoleh

termasuk dalam golongan fungi imperfekti atau deuteromisetes. Sebagian

besar endofit ini menghasilkan metabolit sekunder jika dikultur fermentasi.

Akan tetapi, temperatur, komposisi medium, dan derajat aerasi sangat

menentukan jumlah dan macam komponen yang dihasilkan oleh fungi

endofit. (13)

Fungi endofit adalah fungi yang terdapat di dalam sistem jaringan

tumbuhan seperti daun, bunga, ranting ataupun akar tumbuhan. Fungi ini

menginfeksi tumbuhan sehat pada jaringan tertentu dan mampu

menghasilkan mikotoksin, enzim serta antibiotik (14).

Asosiasi fungi endofit dengan tumbuhan inangnya digolongkan

dalam 2 kelompok (14):

1. Mutualisme konstitutif yaitu asosiasi yang erat antara fungi dengan

tumbuhan terutama rumput-rumputan. Pada kelompok ini fungi

endofit menginfeksi ovula (benih) inang, dan penyebarannya

melalui benih serta organ penyerbukan inang.

2. Mutualisme induktif adalah asosiasi antara fungi dengan tumbuhan

inang, yang penyebarannya terjadi secara bebas melalui air dan

udara. Jenis ini hanya menginfeksi bagian vegetative inang dan

seringkali berada dalam keadaaan metabolism inaktif pada periode

yang cukup lama.

Fungi endofit memiliki arti ekonomis penting di masa depan karena

menyimpan potensi tak terbatas yang saat ini belum banyak diaplikasikan

9

dalam bidang industri farmasi sebagai sumber bahan baku obat dan

senyawa biologis berkhasiat lainnya. Arti penting ditemukannya

mikroorganisme yang mampu memproduksi senyawa berkhasiat ini dapat

mengubah paradigma dalam hal pencarian bahan baku farmasi yang

efektif dari bahan alam. Mengingat kebutuhan bahan baku obat yang

semakin meningkat baik jumlah maupun macamnya maka potensi sumber

daya alam Indonesia khususnya mikroorganisme dalam hal ini endofit

perlu digali dan dikembangkan (15).

II.3 Antimikroba

Antimikroba adalah bahan-bahan atau obat-obat yang digunakan

untuk memberantas infeksi mikroba pada manusia termasuk diantaranya

antibiotika, antiseptika, kemoterapeutika, dan pengawet. Obat-obat yang

digunakan untuk membasmi mikroorganisme yang menyebabkan infeksi

pada manusia, hewan ataupun tumbuhan harus bersifat toksisitas selektif

artinya obat atau zat tersebut harus bersifat sangat toksik terhadap

mikroorganisme penyebab penyakit tetapi relatif tidak toksik terhadap

jasad dengan inang atau hospes (16).

Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antimikroba yang bersifat

menghambat pertumbuhan mikroba yang disebut sebagai aktivitas

bakteriostatik, dan ada yang bersifat membunuh mikroba, dikenal sebagai

aktivitas bakterisid. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat

pertumbuhan mikroba atau membunuhnya, masing-masing di kenal

sebagai kadar hambat minimal (KHM) atau kadar bunuh minimal (KBM).

10

Antimikroba tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik

menjadi bakterisid apabila kadar antimikrobanya ditingkatkan melebihi

KHM (17).

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antimikroba dibagi dalam lima

kelompok :

1. Antimikroba yang menghambat metabolisme sel mikroba

Mikroba membutuhkan asam folat untuk kelangsungan hidupnya,

dimana bakteri patogen harus mensintesis sendiri asam folat dari asam

para amino benzoat (PABA). Apabila suatu zat antimikroba menang

bersaing dengan asam para amino benzoat (PABA) untuk

diikutsertakan dalam pembentukan asam folat maka terbentuk analog

asam folat yang nonfungsional. Akibatnya kehidupan mikroba akan

terganggu. Contoh obat yaitu sulfonamida, trimetoprim, asam p-

aminosalisilat (PAS) dan sulfon.

2. Penghambatan terhadap sintesis dinding sel

Dinding sel mikroba secara kimia adalah peptidoglikan yaitu

suatu kompleks polimer mukopeptida (glikopeptida). Struktur dinding sel

dapat dirusak dengan cara menghambat reaksi pembentukannya atau

mengubahnya setelah dinding sel tersebut selesai dibentuk.

Antimikroba ini dapat menghambat sintesis atau menghambat

aktivitas enzim seperti enzim transpeptidase yang dapat menimbulkan

kerusakan dinding sel yang berakibat sel mengalami lisis.

Contoh basitrasin, sefalosporin, sikloserin, penisilin, vankomisin.

11

3. Penghambatan terhadap fungsi membran sel

Membran sitoplasma mempertahankan bahan-bahan tertentu di

dalam sel dan mengatur aliran keluar masuknya bahan-bahan lain.

Membran sel memelihara integritas komponen-komponen seluler.

Kerusakan pada membran ini akan mengakibatkan menghambatnya

pertumbuhan sel atau matinya sel, akibatnya mikroba akan mati.

Jika fungsi integritas membran sitoplasma dirusak, makromolekul

dan ion keluar dari sel, kemudian sel akan rusak. Dalam hal ini

antimikroba dapat berinteraksi dengan sterol sitoplasma pada jamur,

dan merusak membran sel bakteri Gram negatif.

Contoh amfoterisin , kolistin, imidasol, polien, polimiksin.

4. Penghambatan terhadap sintesis protein

Hidupnya suatu sel tergantung pada terpeliharanya molekul-

molekul dalam keadaan alamiah. Suatu kondisi atau substansi

mengubah keadaan ini yaitu mendenaturasikan protein dengan

merusak sel tanpa dapat diperbaiki kembali. Suhu tinggi dan

konsentrasi beberapa zat kimia dapat mengakibatkan koagulasi

irreversibel komponen-komponen seluler yang vital ini.

Antimikroba mempengaruhi fungsi ribosom pada mikroorganisme

yang menyebabkan sintesis protein terhambat. Dimana dapat berikatan

dengan ribosom 30S yang dapat menyebabkan akumulasi sintesis

protein awal yang kompleks, sehingga salah dalam menerjemahkan

tanda m-RNA dan menghasilkan polipeptida yang abnormal. Selain itu

12

juga dapat berikatan dengan ribosom 50S yang dapat menghambat

ikatan asam amino baru pada rantai peptida yang memanjang. Contoh

aminoglikosida, kloramfenikol, tetrasiklin, eritromisin dan linkomisin.

5. Penghambatan terhadap sintesis asam nukleat

DNA dan RNA memegang peranan penting dalam proses

kehidupan normal sel. Hal ini berarti bahwa gangguan apapun yang

terjadi pada pembentukan atau pada fungsi zat-zat tersebut dapat

mengakibatkan kerusakan total pada sel. Dalam hal ini mempengaruhi

metabolisme asam nukleat, seperti berikatan dengan enzim DNA-

dependen, RNA-polymerase bakteri, memblokir helix DNA. Contoh

quinolon, pyrimethamin, rifampicin, sulfonamid, trimethoprim,

trimetrexat.

II.4 Isolasi Fungi Endofit

Ada beberapa metode isolasi yang bisa diterapkan dalam

mengisolasi fungi tetapi yang umum digunakan adalah dengan sterilisasi

permukaan. Isolasi fungi dapat dilakukan dari jaringan tanaman, daun

atau dari buah, umumnya dilakukan dengan cara meletakkan sedikit

jaringan sampel secara langsung diatas permukaan medium agar pada

cawan petri maupun pada agar miring. Terlebih dahulu dilakukan

sterilisasi permukaan diikarenakan dikhawatirkan adanya kontaminan

pada permukaan sampel. Sterilisasi permukaan dapat dilakukan dengan

menggunakan (a) etanol 95% selama beberapa detik kemudian

dihilangkan dengan mencuci pada air steril, (b) kemudian merendam

13

sampel pada larutan 1:1000 HgCl2 selama 15-25 detik kemudian dibilas,

(c) direndam dalam larutan calsium hipoklorit selama 1 menit kemudian

dibilas, (d) kemudian dalam larutan H2O2 50% selama 15 detik hingga 5

menit kemudian dibilas. Setelah itu sampel diletakkan diatas medium agar

dan diinkubasi. (18)

Mikroorganisme yang penting dalam industri fermentasi dapat

diperoleh dari berbagai sumber di alam. Untuk mendapatkan isolat

mikroba dari suatu bahan yang mengandung campuran mikroba dapat

dilakukan dengan beberapa cara tergantung dari mikroorganismenya

antara lain :

1. Isolasi pada agar cawan

Kebanyakan bakteri, kapang dan khamir dapat membentuk koloni

pada medium padat, sehingga mudah diisolasi dengan cara menyebarkan

sel-sel tersebut pada agar cawan sedemikian rupa sehingga tumbuh

koloni-koloni yang terpisah. Konsentrasi agar yang digunakan 1–2 %,

tetapi terkadang digunakan agar yang lebih lunak untuk mengisolasi

beberapa mikroba tertentu. Prosedur isolasinya dapat menggunakan

metode gores yaitu dengan menggoreskan sampel di permukaan medium

agar ataupun dengan metode tuang yaitu dengan cara mengencerkan

kultur yang kemudian dituang kedalam cawan dan kemudian

menambahkan medium agar.

14

2. Isolasi dalam medium cair

Beberapa bakteri terutama yang ukuran selnya besar dan

kebanyakan protozoa dan ganggang tidak dapat tumbuh pada agar

cawan, tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Cara yang termudah

untuk mengisolasi mikroba dalam medium cair adalah dengan metode

pengenceran. Dalam metode ini, inokulum diencerkan di dalam medium

steril, dan sejumlah tabung yang berisi medium diinokulasikan dengan

suspensi inokulum dari masing-masing pengenceran.

3. Isolasi sel tunggal

Untuk mengisolasi sel mikroba yang ukurannya besar dan tidak

dapat diisolasi dengan metode agar cawan atau pengenceran, ada suatu

cara isolasi yang disebut isolasi sel tunggal. Sel mikroba yang dapat

dilihat dengan perbesaran 100 kali atau kurang, setiap selnya dapat

dipisahkan dan diambil dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat

halus, kemudian dicuci beberapa kali di dalam medium steril yang

jumlahnya relatif besar untuk menghilangkan mikroba kontaminan yang

ukurannya lebih kecil(19).

II.5 Uji Aktivitas Antimikroba dengan Metode Difusi Agar

Pada metode ini didasarkan atas perbandingan antara luas daerah

hambatan yang terjadi. Beberapa modifikasi dari metode difusi yaitu difusi

silinder pipih, difusi dengan mangkuk pipih, difusi dengan kertas saring,

difusi Kirby-Bauer, dan difusi agar berlapis ( 16,20,21).

15

a. Cara difusi silinder pipih. Cara ini didasarkan atas perbandingan antara

luas daerah hambatan yang dibentuk larutan contoh terhadap

pertumbuhan mikroba dengan daerah hambatan yang dibentuk oleh

larutan pembanding. Pada cara ini digunakan plat silinder yang

diletakkan pada media, kemudian larutan dimasukkan ke dalamnya.

b. Cara difusi dengan mangkuk pipih. Cara ini sama dengan silinder pipih

namun perbedaannya menggunakan lubang yang dibuat langsung

pada medium.

c. Cara difusi dengan kertas saring. Cara ini menggunakan kertas saring

dengan bentuk ukuran tertentu, biasanya dengan garis tengah 0,7-1

cm, yang nantinya akan dicelupkan kedalam larutan contoh dan

pembanding. Pengamatan dilakukan setelah masa inkubasi dengan

melihat daerah hambatan yang terbentuk.

d. Cara difusi Kirby-Bauer. Cara ini menggunakan alat untuk meletakkan

kertas saring dan cawan yang digunakan berukuran 150 x 15 mm

sehingga langsung dapat diuji dengan berbagai larutan contoh.

e. Cara difusi agar berlapis. Cara ini merupakan modifikasi dari Kirby-

Bauer. Perbedaannya pada cara ini menggunakan dua lapis agar.

Lapis pertama (based layer), tidak mengandung mikroba, sedangkan

lapis kedua (seed layer) mengandung mikroba.

II. 6 Metabolit Sekunder dari Fungi Endofit

16

Metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikroba endofit tersebut

telah berhasil diisolasi dan dimurnikan serta telah dielusidasi struktur

molekulnya. Beberapa diantaranya adalah :

1. Mikroba endofit yang menghasilkan antibiotika Cryptocandin adalah

anti-fungi yang dihasilkan oleh mikroba endofit Cryptosporiopsis quercina

yang berhasil diisolasi dari tanaman obat Tripterigeum wilfordii, dan

berhasiat sebagai antijamur yang patogen terhadap manusia yaitu

Candida albicans dan Trichopyton spp

2. Jenis endofit lainnya yang juga menghasilkan antibiotika berspektrum

luas adalah mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman Grevillea

pteridifolia. Endofit ini menghasilkan metabolit kakadumycin. Aktifitas

antibakterinya sama seperti munumbicin D, dan kakadumycin ini juga

berkhasiat sebagai anti malaria

3. Mikroba endofit yang memproduksi antivirus Jamur endofit Cytonaema

sp. dapat menghasilkan metabolit cytonic acid A dan B, yang struktur

malekulnya merupakan isomer p-tridepside, berhasiat sebagai anti virus.

Cytonic acid A dan B ini merupakan protease inhibitor dan dapat

menghambat pertumbuhan cytomegalovirus manusia.

4. Mikroba endofit yang menghasilkan metabolit sebagai antikanker

Paclitaxel dan derivatnya merupakan zat yang berkhasiat sebagai

antikanker yang pertama kali ditemukan yang diproduksi oleh mikroba

endofit. Paclitaxel merupakan senyawa diterpenoid yang didapatkan

dalam tanaman Taxus. Senyawa yang dapat mempengaruhi molekul

17

tubulin dalam proses pembelahan sel-sel kanker ini, umumnya diproduksi

oleh endofit Pestalotiopsis microspora, yang diisolasi dari tanaman Taxus

andreanae, T. brevifolia, dan T. wallichiana. Saat ini beberapa jenis

endofit lainnya telah dapat diisolasi dari berbagai jenis Taxus dan

didapatkan berbagai senyawa yang berhasiat sebagai anti tumor.

Demikian pula upaya untuk sintesisnya telah berhasil

5. Mikroba endofit penghasil zat anti malaria Colletotrichumsp. merupakan

endofit yang diisolasi dari tanaman Artemisia annua, menghasilkan

metabolit artemisinin yang sangat potensial sebagai anti malaria. Di

samping itu beberapa mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman

Cinchona spp, juga mampu menghasilkan alkaloid cinchona yang dapat

dikembangkan sebagai sumber bahan baku obat anti malaria.

6. Endofit yang memproduksi antioksidan Pestacin dan isopestacin

merupakan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh endofit P.

microspora. Endofit ini berhasil diisolasi dari tanaman Terminalia

morobensis, yang tumbuh di Papua New Guinea. Baik pestacin ataupun

isopestacin berhasiat sebagai antioksidan, dimana aktivitas ini diduga

karena struktur molekulnya mirip dengan flavonoid.

7. Endofit yang menghasilkan metabolit yang berkhasiat sebagai

antidiabetes Endofit Pseudomassaria sp yang diisolasi dari hutan lindung,

menghasilkan metabolit sekunder yang bekerja seperti insulin. Senyawa

ini sangat menjanjikan karena tidak sebagaimana insulin, senyawa ini

tidak rusak jika diberikan peroral. Dalam uji praklinik terhadap binatang

18

coba membuktikan bahwa aktivitasnya sangat baik dalam menurunkan

glukosa darah tikus yang diabetes. Hasil tersebut diperkirakan dapat

menjadi awal dari era terapi baru untuk mengatasi diabetes di masa

mendatang (22).

II.7 Produksi Metabolit Sekunder

Sistem fermentasi dapat dilakukan dengan 3 macam, yaitu :

1. Sistem Batch

Sistem ini adalah sistem yang paling sederhana dan sering digunakan di

laboratorium untuk mendapatkan produk sel atau metabolitnya.

Fermentasi sistem batch adalah sistem tertutup, artinya semua nutrisi

yang dibutuhkan mikroba selama pertumbuhan dan pembentukan produk

berada di dalam 1 fermentor. Jadi tidak ada penambahan bahan atau

pengambilan hasil selama fermentasi berlangsung. Keuntungan sistem ini

adalah mudah, sederhana, dan kecil kemungkinan adanya kontaminasi;

sedangkan kerugiannya adalah kultur mikroba yang menua, yaitu tidak

ada perbaruan pertumbuhan mikroba, pembentukan metabolit toksik yang

bercampur dengan produk, konsentrasi substrat terbatas, dan sukar untuk

diaplikasikan dalam skala besar.

2. Sistem Fed-batch

Sistem ini tidak tertutup seperti halnya sistem batch. Selama fermentasi,

substrat, nutrisi, atau induser dapat ditambahkan ke dalam fermentor.

Sistem fed-batch dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu sistem volume

tetap dan sistem volume berubah. Sistem volume tetap berarti setiap ada

19

penambahan medium baru ke dalam fermentor, ada medium lama,

produk, atau sel yang dikeluarkan sebanyak medium baru yang

dimasukkan fermentor; sedangkan sistem volume berubah, berarti ke

dalam fermentor ditambahkan medium baru tetapi tidak ada medium lama

atau produk yang dikeluarkan dari dalam fermentor. Keuntungan sistem ini

adalah mudah dalam pengontrolan konsentrasi medium/substrat,

pertumbuhan mikroba dapat dioptimalkan dan tingkat kebutuhan oksigen

dapat dikontrol; sedangkan kerugiannya adalah membutuhkan

pengetahuan tentang profil pertumbuhan mikroba, kontrol lebih ketat, dan

membutuhkan peralatan dan operator yang lebih terlatih.

3. Sistem Continous

Sistem fermentasi ini biasanya digunakan dalam skala industri. Sistem

continous adalah sistem batch yang fase eksponensialnya diperpanjang,

dengan tetap menjaga fluktuasi nutrisi dan jumlah sel/biomassa. Mikroba

diberi nutrisi/medium segar, sementara itu sejumlah sel atau medium

dikeluarkan dari sistem dengan kecepatan yang sama. Hal ini menjamin

tingkat kestabilan dari faktor-faktor seperti volume kultur, biomassa,

konsentrasi produk dan substrat, pH, suhu, dan oksigen terlarut.

Keuntungan sistem ini adalah mempunyai produktivitas dan kecepatan

pertumbuhan dapat dioptimalkan, proses dalam waktu lama dapat

dijalankan, dapat digunakan model sel amobil, serta faktor fisis dan

lingkungan mudah dianalisis; sedangkan kerugiannya adalah tidak sesuai

20

dengan kaidah Good Manufacturing Practice sehingga dilarang digunakan

untuk memproduksi produk farmasi, resiko kontaminasi yang besar,

produk yang belum optimal terbentuk, dan mudah timbul

perubahan/evolusi pada mikroba(23).

Ada beberapa metode yang dapat digunakan dalam proses

fermentasi mikroorganisme antara lain :

1. Kultur Permukaan (surface culture)

Pada metode ini, medium diinokulasikan spora atau miselium

fungi. Miselium akan tumbuh diseluruh permukaan medium cair

membentuk suatu koloni bervariasi. Ini merupakan metode yang paling

mudah dan murah, akan tetapi memiliki beberapa kerugian yaitu

pertumbuhan yang tidak homogen dimana koloni terdiri dari beberapa

miselium yang berbeda pertumbuhannya dan lingkungan tumbuhnya

dimana miselium yang berada diatas pemukaan koloni berada dalam

kondisi yang lebih aerobik dibandingkan yang dibawah permukaan

koloni, hal ini berkebalikan pada keadaan kontak dengan medium.

2. Kultur dengan pengocokan (shaker culture)

Pada metode ini medium dikocok setelah diinokulasikan spora

atau miselium sehingga pertumbuhan akan tampak pada seluruh

medium. Kelebihan metode ini dibandingkan dengan metode kultur

permukaan yaitu pemanfaatan medium oleh mikroorganisme lebih

efisien, mempercepat pertumbuhan dan pertumbuhannya lebih

homogen.

21

3. Kultur dengan pengocokan, mengalirkan udara (stirred aerate culture)

Metode ini merupakan pengembangan dari metode kultur dengan

pengocokan, menggunakan pengaduk medium dan jalur udara atau

oksigen. Dikarenakan efisiensi pengocokan dan aerasi produksi dapat

meningkat pesat dan ini merupakan metode yang paling efisien untuk

memproduksi metabolit fungi dalam skala besar.

4. Kultur berkelanjutan (continous culture)

Metode ini dilakukan dengan cara berkala mengganti medium

pada fermentor dengan medium fermentasi yang baru, hal ini akan

menyebabkan proses fermentasi akan terus berlangsung. Metode ini

akan sangat bermanfaat untuk penelitian laboratorium fermentasi,

karena dengan menjaga ketersediaan medium baru kita dapat menjaga

proses fermentasi pada tahapan yang diinginkan sementara efek yang

lain dipelajari. (20)

Pada proses fermentasi terdapat beberapa faktor yang

berpengaruh pada metabolit sekunder yang diperoleh yaitu :

1. pH

Selama fermentasi berlangsung, pada umumnya pH ini dapat

mengganggu pertumbuhan sel dan produksi metabolit. Oleh karena

itu selama fermentasi berlangsung pH harus tetap dipertahankan

pada pH optimum. Untuk itu dapat dilakukan dengan penambahan

buffer yang tidak dapat dirombak oleh mikroorganisme atau dengan

22

larutan asam atau basa dari luar, jika pH berubah, hal ini dapat

dilakukan secara manual atau dengan cara otomatis.

2. Medium

Medium harus dapat menyediakan seluruh kebutuhan nutrisi

mikroorganisme. Kebutuhan tersebut meliputi senyawa sumber

karbon, nitrogen, mineral, vitamin dan air. Mineral dapat dibuat dari

senyawa sintetis yang menyediakan nutrien-nutrien. Senyawa

sintetis ini relatif murni dari strukturnya sehingga konsentrasi di

dalam medium diketahui pasti. Kelebihan lainnya adalah

konsentrasi di dalam medium mudah ditambah dan dikurangi, serta

tidak berbuih. Kekurangannya adalah cukup mahal.

3. Suhu

Suhu dibutuhkan dalam proses fermentasi dimana pertumbuhan sel

atau produksi metabolit yang tertinggi. Berdasarkan suhu tersebut,

pada umumnya mikroorganisme yang digunakan adalah

mikroorganisme yang bersifat mesofil dengan suhu 20-45°C dan

kadang-kadang yang bersifat termofil dengan suhu optimum 45 °C.

4. Nutrien

Mikroorganisme membutuhkan senyawa senyawa sumber energi

t\yang diperoleh dari perombakan senywa organik maupun

anorganik. Senyawa yang mengandung nitrogen dibutuhkan

terutama untuk pembentukan sel dan metabolit-metabolit yang

mengandung nitrogen. jenis senyawa nitrogen ini dapat

23

mempengaruhi proses fermentasi misalnya produksi antibiotika

dapat dihambat oleh sumber nitrogen yang cepat dicerna.

5. Agitasi

Agitasi bertujuan untuk menghomogenkan penyebaran

mikroorganisme, nutrien dan oksigen di dalam medium.kecepatan

putaran agitasi di antaranya ditentukan oleh volume fermentor.

6. Aerasi

Fermentasi yang bersifat aerobikn memerlukan sistem aerasi untuk

mensuplai kebutuhan oksigen. Laju aerasi fermentasi berkisar 0,25-

1,0 volume udara (volume medium/menit)

7. Potensial reduksi oksidasi

Potensial reduksi oksidasi (redoks) diukur dengan elektroda

khusus. Interpretasi hasil pengukuran harus mempertimbangkan

kemungkinan potensial redoks mikroba yang tidak sama dengan

kultur/medium.(16)

II.8 Metode KLT-Bioautografi

II.8.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis atau Thin Layer Chromatography adalah

teknik analisis sederhana untuk memisahkan komponen secara tepat

berdasarkan prinsip partisi dan adsorpsi. Kromatografi lapis tipis terbuat

dari lempeng gelas atau logam yang tahan karat atau lempengan tipis

yang cocok sebagai penyangga.

24

Prinsip KLT adalah pemisahan secara fisikokimia. Pemisahan

komponen kimia berdasarkan prinsip adsorpsi dan partis, dimana

komponen kimia bergerak mengikuti cairan pengembang karena daya

serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, sehingga

komponen kimia bergerak dengan kecepatn berbeda dan hal ini

menyebabkan pemisahan.

Harga Rf dapat dihitung dengan menggunakan perbandingan

sebagaimana dalam persamaan :

Nilai Rf =

Faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Rf dari KLT, yaitu :

1. Struktur kimia dari senyawa yang akan dipisahkan

2. Sifat dari penjerap dan derajat aktivitasnya

3. Tebal dan kerataan lapisan penjerap. Ketidakrataan akan

menyebabkan aliran pelarut menjadi tidak rata

4. Pelarut dan derajat kemurniannya

5. Derajat kemurnian dari uap dalam mana bejana pengembangan yang

digunakan

6. Jumlah cuplikan yang digunakan

7. Panjang trayek migrasi

8. Adanya zat asing atau pencemar

9. Kelembaban udara

10. Suhu. (24,25)

25

II.8.2 Bioautografi

Bioautografi adalah teknik laboratorium untuk mendeteksi zat yang

mempengaruhi tingkat pertumbuhan organisme uji dalam campuran yang

kompleks dan matriks. Metode ini didasarkan pada aktivitas biologis dari

analit, yang dapat berupa antibakteri, antijamur, antitumor, antiprotozoa.

Bidang utama bioautografi adalah :

1. Mencari zat antibiotik baru dan baru antijamur, antitumor, dan

antiprotozoae senyawa dengan mempelajari aktivitas biologis zat yang

berasal dari tanaman, mikroorganisme atau kombinasi zat kimia

2. Penyelidikan antibiotik dan senyawa biologis-aktif lainnya dalam air

limbah, air minum, cairan tubuh, makanan

3. Kontrol kualitas obat-obatan antibiotik

4. Mencari senyawa antimikroba yang efektif melawan bakteri patogen

tanaman dan jamur

5. Deteksi dan penentuan senyawa beracun (misalnya, aflatoksin) atau

fototoksik (misalnya, furocoumarins).

Metode bioautografi biasanya dibagi menjadi tiga kategori:

1. Difusi agar atau bioautografi kontak.

Dalam bioautografi kontak, antimikroba berdifusi dari plat TLC atau

kertas ke agar inokulasi. Kromatogram ditempatkan menghadap ke

bawah agar inokulasi dan dibiarkan selama beberapa menit atau jam

untuk memungkinkan difusi. Kemudian kromatogram dipindahkan dan

lapisan agar diinkubasi. Zona hambat diamati pada permukaan agar di

26

tempat di mana noda antimikroba yang menempel pada agar. Metode

ini menyerupai alat tes disk. Kelemahan dari bioautografi kontak

adalah kesulitan dalam memperoleh kontak sempurna antara agar dan

plat dan kepatuhan dari adsorben ke permukaan agar. Kekurangan ini

dihindari dengan menerapkan penggunaan kromatografi lembaran

serat kaca asam silikat, chromar.15 Namun, dasar dari metode ini

sama dan antimikroba harus ditransfer dari lembar ke agar

menyebabkan kerugian dan dilusi.

2. Perendaman atau bioautografi agar-overlay.

Dalam bioautografi perendaman, kromatogram ditutupi dengan

media, agar yang cair. Setelah pemadatan, inkubasi dan noda

penghambatan (biasanya dengan pencelupan tetrazolium) atau

pertumbuhan koloni pertumbuhan adalah akan tampak. Kadang-

kadang, sebelum inkubasi, plat yang tersisa selama beberapa jam

pada suhu rendah untuk memungkinkan diffusi. Agar-overlay adalah

penggabungan antara bioautografi kontak dan bioautografi langsung.

Antimikroba ditransfer dari pelat TLC ke lapisan agar seperti dalam uji

kontak tetapi selama inkubasi dan visualisasi lapisan agar tetap dalam

plat seperti dalam bioautografi langsung. Kerugian utama dari metode

ini adalah sensitivitas yang lebih rendah disebabkan oleh cairan

antibakteri dalam lapisan agar dibandingkan dengan bioautografi

langsung. Agar- overlay disarankan terutama ketika bioautografi

langsung adalah tidak memungikinkan untuk dilakukan.

27

3. Bioautografi langsung.

Dalam bioautografi langsung, pengembangan palt dicelupkan

dalam suspensi mikroorganisme yang tumbuh dalam kaldu cocok atau

suspensi ini disemprotkan ke plate. Plat ini diinkubasi dan

mikroorganisme tumbuh secara langsung di atasnya. Oleh karena itu,

pemisahan, penyiapan, inkubasi dan visualisasi yang dilakukan

langsung di plat. Untuk lokasi dan visualisasi antibakteri garam

tetrazolium biasanya digunakan, yang dikonversi oleh dehydrogenases

oleh mikroorganisme hidup untuk intens berwarna, formazan. Bakteri

yang dibunuh oleh antimikroba pada pelat TLC mengakibatkan warna

tidak diproduksi di tempat noda antibakteri dan disebut zona

penghambatan yang pucat yang terbentuk pada latar belakang

berwarna(26).

II.9 Mikroba Uji

1. Escherichia coli

a. Klasifikasi

Divisi : Procaryota

Kelas : Gammaproteobacteria

Bangsa : Enterobacteriaes

Suku : Enterobacteriaceae

Marga : Escherichia

Jenis : Escherichia coli

28

b.Sifat dan Morfologi.

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang

lurus, 1,1-1,5 µm x 2,0-6,0 µm, motil dengan flagelum peritrikus

atau non motil. Tumbuh dengan mudah pada medium nutrien

sederhana. Laktose difermentasi oleh sebagian besar galur dengan

produksi asam dan gas(27,28).

2. Staphylococcus aureus

a. Klasifikasi

Kerajaan : Protophyta

Kelas : Bacilli

Bangsa : Bacillales

Suku : Staphylococcaceae

Marga : Staphylococcus

Jenis : Staphylococcus aureus

b. Sifat dan Morfologi.

Staphylococcus aureus adalah bakteri Gram positif , sel-sel

berbentuk bola, berdiameter 0,5-1,5 µm, terdapat tunggal dan

berpasangan, dan secara khas membelah diri lebih dari satu

bidang sehingga membentuk gerombol yang tidak teratur. Dinding

sel mengandung dua komponen utama ; peptidoglikan dan asam

teikoat. Metabolisme secara respiratif dan fermentatif. Tumbuh

lebih cepat dan lebih banyak dalam keadaan aerob. Suhu optimum

35-40oC. Terutama berasosiasi dengan kulit, dan selaput lendir

29

hewan berdarah panas. Kisaran inangnya luas, dan banyak galur

merupakan patogen potensial(27,29).

3. Pseudomonas aeruginosa

a. Klasifikasi

Divisio : Proteobacteria

Kelas : Gammaproteobacteria

Bangsa : Pseudomonadales

Suku : Pseudomonadaceae

Marga : Pseudomonas

Jenis : Pseudomonas aeruginosa

b. Sifat dan Morfologi.

Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri Gram negatif dengan

berbentuk sel tunggal, batang lurus atau melengkung, namun tidak

berbentuk heliks. Pada umumnya berukuran 0,5-1,0 µm x 1,5-4,0

µm. Motil dengan flagelum polar; monotrikus atau multitrikus. Tidak

menghasilkan selongsong prosteka. Metabolisme dengan respirasi,

beberapa merupakan kemolitotrof fakultatif, dapat menggunakan H2

atau CO2 sebagai sumber energi. Oksigen molekular merupakan

penerima elektron universal, dapat melakukan denitrifikasi dengan

menggunakan nitrat sebagai penerima pilihan(27,29).

4. Malassezia furfur

a. Klasifikasi

Kerajaan : Fungi

30

Divisio : Basidiomycota

Kelas : Hymenomycetes

Bangsa :Tremellales

Suku : Filobasidiaceae

Marga : Malassezia

Jenis : Malassezia furfur

b. Sifat dan Morfologi.

Malassezia furfur merupakan flora normal dan terdapat pada

mukosa dan kulit. Jamur ini berupa kelompok sel-sel bulat,

bertunas, berdinding tebal, dan hifanya berbatang pendek dan

bengkok. Malassezia furfur menghasilkan konidia sangat kecil

(mikrokonidia) pada hifanya, tetapi di samping itu juga

menghasilkan makrokonidia besar, multiseptat, berbentuk

gelendong yang jauh lebih besar daripada mikrokonidianya(30).

31

BAB III

METODE PENELITIAN

III.1 Alat dan Bahan yang digunakan

III.1.1 Alat

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu alat-alat gelas, alat

sentrifuge (model DKC-1006T), autoklaf (All American Model 25x-2),

cawan petri, enkas, Inkubator (WTB Binder), Jangka sorong, Laminar Air

Flow (Envirco), lemari pendingin (Panasonic), mikropipet (Nesco), oven

(Fisher), shaker (Gemmy orbit model VRN-480), dan sentrifuge.

III.1.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu air suling,

aluminium foil, etanol 70%, etil asetat, larutan NaOCl 5,25 %, medium NA

(Pronadisa), medium PDA(Pronadisa), mikroba uji (Malassezia furfur,

Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, dan

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853), dan sampel daun cabai

katokkon (Capsicum annuum L. var. chinensis).

III.2 Prosedur Penelitian

III.2.1 Sterilisasi alat

Alat-alat yang terbuat dari gelas direndam dan dicuci hingga bersih

dengan menggunakan detergen. Cawan petri dan alat-alat gelas lainnya

dibungkus dengan kertas dan disterilkan dalam oven pada suhu 180°C

selama 2 jam. Adapun alat-alat gelas yang berskala dan tidak tahan

32

terhadap pemanasan dan yang terbuat dari plastik disterilkan dalam

autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 2 atm selama 15 menit. Ose

disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala api bunsen.

III.2.2 Pengambilan dan Penyiapan Sampel Penelitian

III.2.2.1 Pengambilan Sampel

Sampel penelitian yang digunakan berupa daun cabai katokkon

(Capsicum annuum L. var. chinensis) diperoleh dari Kelurahan Sarira,

Kecamatan Makkendek, Kabupaten Tana Toraja, Propinsi Sulawesi

Selatan. Dilokasi pengambilan sampel, tanaman ini dikenal dengan nama

Katokkon.

III.2.2.2 Pengolahan Sampel

Sampel daun dibersihkan dan dicuci dengan air mengalir.

III.3 Penyiapan mikroba uji

Mikroba uji yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bakteri

dan fungi. Bakteri yang digunakan adalah Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, sedangkan fungi yang

digunakan adalah Malassezia furfur. Stok bakteri dan jamur yang berasal

dari stok kultur koleksi Laboratorium Mikrobiologi Farmasi Universitas

Hasanuddin diremajakan dalam medium NA miring untuk bakteri dan PDA

miring untuk jamur serta dIIInkubasi untuk bakteri pada suhu 37˚C selama

1x24 jam dan untuk jamur pada suhu kamar selama 3x24 jam. Kemudian

33

didispersikan dengan air steril yang selanjutnya dapat digunakan sebagai

mikroba uji.

III.4 Pembuatan Medium

III.4.1 Pembuatan Potato Dekstrosa Agar (PDA)

Media PDA ditimbang sebanyak 39 gram kemudian dilarutkan

dalam 1000 ml air suling dan dipanaskan. Selanjutnya media yang sudah

jadi disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C tekanan 2 atm selama 15

menit (19).

III.4.2 Pembuatan Potato Dekstrosa Yeast (PDY)

Media PDB ditimbang sebanyak 26,5 gram dan media ekstrak

yeast ditimbang sebanyak 4 gram kemudian dilarutkanhingga1000 ml

dengan air suling dan dipanaskan. Selanjutnya media yang sudah jadi

disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (19).

III.4.3 Pembuatan Potato Dekstrosa Broth (PDB)

Media PDB ditimbang sebanyak 26,5 gram kemudian dilarutkan

hingga1000 ml dengan air suling. Selanjutnya media yang sudah jadi

disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (19).

III.4.2 Pembuatan Nutrien Agar (NA)

Media NA ditimbang sebanyak 23 gram kemudian dilarutkan

dalam 1000 ml air suling dan dipanaskan. Selanjutnya media yang sudah

jadi disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C tekanan 2 atm selama 15

menit (19).

34

III.5 Isolasi Mikroba Endofit

Daun cabai katokkon (Capsicum annuum L var. chinensis) yang

segar dicuci dengan air mengalir guna menghilangkan tanah dan kotoran

yang menempel dan dipotong kecil dengan ukuran + 2 cm2 lalu sampel

dikeringkan di atas cawan petri.Masukkan dalam erlenmeyer 250 ml,

tambahkan etanol 70% sampai terendam. Kocok pelan dan lakukan

sterilisasi selama 2 menit. Buang etanol 70%, lanjutkan sterilisasi dengan

bayclean (NaClO 5,25%) selama2 menit. Bilas dengan akuades steril

sebanyak 3 kali, masing-masing selama 1 menit. Lakukan sterilisasi

dengan erlenmeyer steril secara aseptis di dalam LAF kabinet.Tiriskan

bahan-bahan tersebut dalam cawan petri steril. Potong potong dengan

pisau skalpel steril menjadi ukuran + 1 cm2. Tanam bagian-bagian

tersebut dalam media PDA di dalam cawan petri steril pada suhu kamar

(25oC) selama 3 hari. Sebagai kontrol,inokulasikan air bilasan terakhir

eksplan pada media PDA. Setelah 3 hari terjadi pertumbuhan fungi,

diisolasi untuk mendapatkan biakan murni.Biakan murni fungi endofit

ditumbuhkan pada media PDA dalam cawan petri (31).

III.6 Pemurnian Fungi Endofit

Medium yang digunakan untuk permurnian fungi endofit yaitu

medium PDA. Fungi endofit yang tumbuh pada medium PDA, dimurnikan

masing-masing pada medium PDA. Kemudian diinkubasi selama3hari

pada suhu 25 0C, setelah inkubasi dilakukan pengamatan terhadap bentuk

35

dan warna koloni pada medium PDA. Setiap koloni yang berbeda bentuk

maupun warnanya disubkultur lagi pada medium PDA miring sampai

diperoleh koloni murni (31).

III.7Uji Aktivitas Fungi Endofit

III.7.1Uji Aktivitas Antimikroba Fungi Endofit

Identifikasi awal dari daun cabai yang menghasilkan senyawa

antibakteri dilakukan dengan cara uji hayati sebagai berikut: semua isolat

daun cabai ditumbuhkan ke dalam media PDA, kemudian cakram daun

cabai katokkon yang berumur 7 hari inkubasi pada media PDA

ditempatkan di permukaan media NA dan PDA yang telah berisi mikroba

uji. Selanjutnya diinkubasi selama 1 hari pada suhu 37oC untukNA dan 3

hari pada suhu 25 oC untuk PDA. Masing-masing isolat diamati

kemampuannya menghambat bakteri uji yang ditandai dengan

terbentuknya zona jernih disekitar cakram uji dan dievaluasi : >20 mm

(strong inhibition), 5-10 mm (moderate inhibition) and <5 mm (weak

inhibition). Isolat yang stabil membentuk zona jernih pada 3 kali pengujian

dipilih sebagai isolat untuk pengujian selanjutnya (31).

III.7.2 Fermentasi Isolat

Isolat aktif dibuat prekultur pada labuerlenmeyer 500 mL yang

mengandung 100 mL medium cair PDY dan diinkubasi pada suhu 25° C

selama 3 hari. Prekultur (starter) dipindahkan ke dalam erlenmeyer 500

mL yang mengandung 100 mL medium yang sama. Fermentasi dilakukan

36

pada suhu 25° C pada kondisi terkocok. Kemudian disentrifus untuk

memperoleh filtrat dan miselia. Kemudian filtrat diuji setiap hari selama 18

hari (32).

III.7.3 Ekstraksi Isolat

Setelah diperoleh fermentasi yang terbaik pada hari ke-5, media

pertumbuhan mikroba disaring untuk memisahkan biomassa dan cairan

fermentasi. Cairan fermentasi diekstraksi 2 kali dengan pelarut etil asetat

(1:1 v/v) dalam corong pisah selama 20 menit. Ekstrak yang diperoleh

diuapkan lalu disimpan pada desikator untuk digunakan pada uji

selanjutnya (31).

III.7.4 Uji Aktivitas terhadap Malassezia furfur, Escherichia coli,

Staphylococcus aureus , dan Pseudomonas aeruginosa.

Dimasukkan 20 µl dispersi mikroba uji ke dalam botol steril, lalu

ditambahkan 20 ml medium NA untuk bakteri uji dan PDA untuk jamur uji,

dihomogenkan dan dituang di cawan petri, dibiarkan hingga memadat.

Sebanyak 10 µL ekstrak dimasukkan ke dalam kertas cakram (diameter

6mm). Setelah semua pelarut menguap selanjutnya kertas cakram

diletakkan pada permukaan medium. Diinkubasikan selama 1 hari pada

suhu 37 oC untuk NA dan 3 hari pada suhu 25 oC untuk PDA, lalu diamati

dan diukur zona hambatan yang terbentuk.

37

III.8 Pengujian KLT-Bioautografi

Pengujian KLT-Bioautografi ekstrak fungi endofit daun cabai

katokkon yang paling aktif sebagai antimikroba menggunakan lempeng

KLT silica gel GF-254 yang telah diaktifkan. Ekstrak ditotolkan pada

lempeng KLTkemudian dielusi dengan perbandingan eluen heksan : etil

asetat = 1:5. Setelah itu divisualisasikan dan dihitung nilai Rf-nya

(33,34,35).

Noda pada kromatogram lempeng I divisualisasikan dengan

beberapa reagen uji identifikasi. Lempeng II diletakkan pada permukaan

media NA dan PDA yang telah diinokulasikan dengan beberapa mikroba

uji. Cawan petri diinkubasi pada suhu 370C selama 1 x 24 jam untuk

bakteri, dan untuk jamur dIIInkubasi pada suhu kamar selama 3 x 24 jam.

Setelah itu diamati adanya adanya zona hambat pertumbuhan mikroba

pada media. Kemudian dibandingkan hasil kromatogram lempeng I

dengan zona hambat yang dibentuk oleh lempeng II pada media

(33,34,35).

III.9 Pengukuran Zona Hambat

Aktivitas antimikroba diperoleh dengan mengukur zona hambat

yaitu zona bening yang terbentuk di sekitar cakram uji. Zona bening yang

terbentuk di sekitar cakram uji menunjukkan mikroba tidak dapat tumbuh

di sekitar cakram uji. Zona uji yang terbentuk di sekitar cakram uji tersebut

diukur dengan menggunakan jangka sorong. Zona hambat yang kecil

38

menunjukkan aktivitas antimikroba yang rendah sedangkan zona hambat

yang besar menunjukkan aktivitas anti bakteri yang tinggi.

III.10 Pengumpulan dan Analisis Data

Data yang dikumpulkan berupa zona hambat yang dihasilkan oleh

tiap-tiap isolat terhadap mikroba uji dan data pada pengujian lain.

III.11 Penarikan Kesimpulan

Kesimpulan diambil berdasarkan hasil data yang diperoleh.

39

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Isolasi Fungi Endofit

Pada penelitian ini dilakukan isolasi fungi endofit dari daun cabai

katokkon sebagai penghasil senyawa antimikroba. Hasil determinasi

tanaman menyatakan bahwa cabai katokkon yang digunakan merupakan

spesies Capsicum annuum L. var. chinensis.

Fungi endofit yang tumbuh pada sekitar tanaman merupakan fungi

endofit karena telah dilakukan sterilisasi permukaan pada sampel.

Permukaan tanaman membawa banyak kontaminasi mikroba untuk

menghindari kontaminasi ini tanaman harus disterilisasi permukaasn

secara keseluruhan sebelum diinokulasikan dalam media (36). Sterilisasi

permukaan dilakukan dengan etanol 70% v/v selama 1 menit lalu

dilakukan perendaman lagi dengan Na hipoklorit 5,3 % selama 2 menit.

Proses sterilisasi tidak digunakan etanol murni, tetapi digunakan etanol

70% karena proses denaturasi protein mikroba memerlukan keberadaan

air, dan etanol dengan kadar 70% adalah kadar yang optimal untuk tujuan

ini. Dalam larutan, natrium hipoklorit (NaOCl) akan melepaskan radikal

klor (Cl.) yang mampu merusak membran dan protein mikroba (37).

Fungi endofit yang diperoleh dari daun cabai katokkon tumbuh

pada hari ke-3. Selama pengamatan dilakukan proses purifikasi dengan

memindahkan setiap fungi yang tumbuh di sekitar potongan sampel ke

media agar yang baru berdasarkan persamaan warna, bentuk koloni dan

40

ada tidaknya lingkaran konsentris sampai diperoleh isolat fungi endofit

yang murni.

Dari hasil isolasi diperoleh 2 isolat fungi endofit yaitu isolat DC-1

dan isolat DC-2 yang diamati berdasarkan ciri makroskopik meliputi

warna, permukaan, dan bentuk koloni. (gambar 1 dan tabel 1)

Tabel 1. Karakterisasi makroskopik isolat fungi endofit

Sampel / kode isolat Pengamatan Makroskopik

Warna koloni Permukaan koloni Bentuk koloni

DC-1 Putih Seperti kapas Bundar

DC-2 Coklat tua Seperti kapas Bundar

Gambar 1. Koloni murni fungi endofit daun cabai katokkon (Capsicum annuum L.var.chinensis)

Warna yang teramati merupakan warna koloni setelah inkubasi,

permukaan koloni seperti kapas jika hifa yang tumbuh tampak seperti

kapas, koloni membentuk lingkaran. Bentuk koloni diamati dari

penampakan atas koloni.

IV.2 Uji Antagonis Fungi Endofit

Hasil isolasi fungi endofit dari daun cabai katokkon diperoleh dua

isolat fungi endofit. Selanjutnya dilakukan uji antagonis fungi endofit

terhadap mikroba uji. Uji antagonis adalah untuk melihat aktifitas langsung

DC-1 DC-2

41

terhadap organisme uji dan menyeleksi isolat-isolat yang memiliki aktivitas

antimikroba terhadap bakteri dan jamur. Hasil positif ditandai dengan

terbentuknya zona bening di sekitaran isolat. Fungi endofit isolat DC-1

aktif terhadap Pseudomonas aeruginosa(25,9 mm) diameter hambatan

yang diperoleh menunjukkan >20 mm(strong inhibition), Staphylococcus

aureus(16,6 mm), dan Eschericia coli(16,6) dan pada fungi endofit isolat

DC-2 tidak menunjukkan adanya diameter hambatan.

(tabel 2 dan gambar 2)

Tabel 2. Hasil pengujian aktivitas antimikroba

Kode Isolat

Diameter Zona Hambat (mm)

Pseudomonas aeruginosa

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Malassezia furfur

Pengujian

DC-1 25,9 16,6 16,6 -

DC-2 - - - -

a. b. c.

Gambar 2.Uji Antagonis fungi endofit isolat daun cabai katokkon

Keterangan : a = Pengujian terhadap bakteri Eschericia coli b = Pengujian terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa c = Pengujian terhadap bakteri Staphylococcus aureus

DC-2 DC-2 DC-2

DC-1

DC-1

DC-1

42

IV.3 Fermentasi Fungi Endofit

Isolat fungi endofit yang aktif terhadap mikroba uji (isolat DC-1)

kemudian diproduksi senyawa antimikroba menggunakan metode

fermentasi yang dimulai dengan medium pembenihan PDY (Potato

Dekstrosa Broth dan Ekstrak Yeast) selama 3X24 jam sambil terus

dikocok(prekultur/starter), Tujuan pembuatan starter yaitu mempercepat

fase lag yang selanjutnya starter difermentasikan ke dalam medium

produksi yang diinkubasi selama 5 hari pada suhu 25°C dan sesekali

dikocok. Fermentasi dengan pengocokan merupakan metode

pemanfaatan medium oleh mikroorganisme yang hasilnya lebih efisien,

mempercepat pertumbuhan, dan pertumbuhannya lebih homogen. Hasil

fermentasi fungi endofit isolat DC-1 berwarna kuning yang tadinya

berwarna putih. Perubahan warna yang terjadi karena adanya proses

fermentasi yang dilakukan oleh isolat bakteri dimana perubahan ini

menunjukkan metabolit sekunder telah diproduksi. Sistem fermentasi yang

digunakan adalah Sistem Batch. Sistem ini adalah sistem yang paling

sederhana dan sering digunakan di laboratorium untuk mendapatkan

produk sel atau metabolitnya. Fermentasi sistem batch adalah sistem

tertutup, artinya semua nutrisi yang dibutuhkan mikroba selama

pertumbuhan dan pembentukan produk berada di dalam satu fermentor.

Jadi tidak ada penambahan bahan atau pengambilan hasil selama

fermentasi berlangsung. Keuntungan sistem ini adalah mudah, sederhana,

dan kecil kemungkinan adanya kontaminasi (23). Hasil fermentasi

43

disentrifus terlebih dahulu untuk memisahkan filtrat dan residu, hal ini

dilakukan karena mikroorganisme dapat mensekresikan metabolit

sekunder selama proses fermentasi ke luar sel yang terdapat pada filtrat

(38). Penentuan waktu inkubasi fermentasi didasarkan pada aktivitas

antimikroba dari cairan fermentasi yang disampling selama 18 hari (32).

Hasil pengujian cairan fermentasi menunjukkan waktu inkubasi pada hari

kelima menunjukkan diameter hambatan paling besar (29,25 mm),

diameter hambatan yang diperoleh menunjukkan >20 mm (strong

inhibition). (tabel 3 dan gambar 3)

Tabel 3. Hasil pengujian aktivitas antimikroba fermentat fungi endofit isolat DC-1

Hari Diameter hambatan(mm)

E.coli P.aeruginosa S.aureus M.furfur

1 26.75 21.50 11.75 8.50

2 27.25 24.00 14.00 9.00

3 25.25 22.00 13.50 9.20

4 23.75 19.50 16.50 10.00

5 29.25 20.50 19.25 14.50

6 23.50 25.00 17.50 14.00

7 12.50 11.50 13.50 12.00

8 11.50 11.00 12.50 10.00

9 9.00 10.60 10.50 0.000

10 9.00 11.00 9.50 0.000

11 7.65 8.70 9.00 0.000

12 7.10 8.50 8.00 0.000

13 24.5 14.00 12.85 0.000

14 24.7 21.00 18.75 0.000

15 25.30 14.50 14.50 0.000

16 25.00 13.5 13.50 0.000

17 21.00 15 14.00 0.000

18 20.50 17.5 11.25 0.000

44

Gambar 3. Kurva diameter hambatan fermentat fungi endofit isolat DC-1 terhadap lama fermentasi

Kurva diameter hambatan yang telah dilakukan terjadi fluktuasi

disebabkan oleh faktor : a) Kecepatan aerasi sering tidak sesuai dengan

jumlah oksigen yang dibutuhkan dan oksigen yang terlarut dalam media.

b) Jumlah sumber karbon dan nutrisi lain tidak sesuai baik dalam jumlah

dan komposisi dengan mikroba dan produk yang diinginkan; c) Toksin

yang terakumulasi d) Perubahan pH selama proses fermentasi. e) Busa

yang mungkin timbul. Busa dapat disebabkan oleh : kandungan garam,

pH, suhu, komposisi media, dan aliran udara (23).

IV.4 Ekstraksi Metabolit Sekunder Fungi Endofit

Sebelum dilakukan uji aktivitas antimikroba terlebih dahulu

dilakukan proses ekstraksi senyawa metabolit dengan tujuan untuk

memecah sel sehingga senyawa metabolit berdifusi ke pelarut. Ekstraksi

metabolit sekunder fungi endofit isolat DC-1 dilakukan pada media

45

pertumbuhan mikroba disaring untuk memisahkan biomassa dan cairan

fermentasi, ekstraksi dilakukan setelah hari kelima fermentasi. Cairan

fermentasi diekstraksi 2 kali dengan pelarut etil asetat (1:1 v/v) dalam

corong pisah selama 20 menit. Ekstrak yang diperoleh diuapkan lalu

disimpan pada desikator. Ekstrak yang diperoleh yaitu sebanyak 58 mg.

Ekstrak yang diperoleh diuji aktivitas antimikroba terhadap mikroba uji

dengan metode difusi agar sebanyak 10µL dengan menggunakan paper

disk. Metode difusi agar memiliki kelebihan yaitu sederhana untuk

dilakukan dan dapat digunakan untuk melihat sensitivitas berbagai jenis

mikroba terhadap antimikroba pada konsentrasi tertentu (39).Hasil

pengujian ekstrak fungi endofit isolat DC-1 memberikan penghambatan

pada Eschericia coli (29,5 mm), Pseudomonas aeruginosa (19,00 mm)

dan Staphylococcus aureus (16,50 mm) diameter hambatan yang

diperoleh menunjukkan >20 mm (strong inhibition), tidak terdapat

penghambatan pada Malasezzia furfur. Hal ini diduga dipengaruhi oleh

beberapa hal, seperti tingkat sensitifitas dari organisme uji, kecepatan

difusi dari senyawa antibakteri dan konsentrasi senyawa antibakteri (39).

(tabel 4 dan gambar 4)

Tabel 4. Hasil pengujian aktivitas antimikroba ekstrak isolat DC-1

Ekstrak Diameter hambatan (mm)

E.coli P.aeruginosa S.aureus M.furfur

10 µL 29.50 19.00 16.50 0.000

46

a. b. c. d.

Gambar 4.Ekstrak fungi endofit Isolat DC-1 daun cabai katokkon (Capsicum annuum L.var.chinensis)

Keterangan : a = Ekstrak Isolat DC-1 dan pelarut etil asetat terhadap bakteri Eschericia coli b =Ekstrak Isolat DC-1 dan pelarut etil asetat terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa c = Ekstrak Isolat DC-1 dan pelarut etil asetat terhadap bakteri Staphylococcus aureus d = Ekstrak Isolat DC-1 dan pelarut etil asetat terhadap jamur Malassezia furfur

IV.5 Uji KLT Bioautografi Ekstrak Etil Asetat fungi endofit Isolat DC-1

Uji fitokimia Ekstrak Etil Asetat fungi endofit Isolat DC-1 digunakan

untuk mengetahui golongan senyawa bioaktif yang terdapat pada ekstrak

secara kualitatif. Uji fitokimia dilakukan pada Ekstrak Etil Asetat fungi

endofit Isolat DC-1 disebabkan ekstrak menunjukkan hasil zona hambat

yang besar (strong inhibition). Lempeng KLT di elusi dengan

menggunakan campuran heksan : etil asetat (1:5). Noda aktif

divisualisasikan dibawah sinar UV 254 dan 366 nm dan penyemprotan

H2SO4 serta beberapa pereaksi semprot.

Pada uji dengan menggunakan pereaksi Liebermann-Bucchard

menunjukkan adanya noda berwarna hijau muda, noda tersebut

kemungkinan adalah senyawa terpenoid (40,41).

Ekstrak EToAC

EToAC

Ekstrak EToAC

Ekstrak EToAC

EToAC

EToAC

EToAC

Ekstrak EToAC

47

Pereaksi Mayer adalah pereaksi yang khas untuk senyawa

golongan alkaloid dimana hasil menunjukkan adanya noda berwarna putih

kekuningan yang diduga adalah senyawa golongan alkaloid (22,41).

Hasil penyemprotan dengan sitroborat menunjukkan bahwa di

dalam ekstral etil asetat isolat tidak terdapat adanya noda yang

berflouresensi kuning hijau di bawah sinar UV 366 nm sehingga ekstrak

etil asetat isolat tidak terdapat senyawa flavonoid (22).

Hasil penyemprotan dengan larutan FeCl3 menunjukkan bahwa di

dalam ekstrak etil asetat isolat tidak terdapat senyawa fenolik. Hal ini

terbukti dengan tidak ditemukannya noda hasil elusi sampel yang

berwarna ungu kecoklatan sebagai hasil reaksi antara ion feri dengan

gugus hidroksi fenolik (40,41).

. Kemudian ekstrak etil asetat diuji dengan metode Perendaman

atau bioautografi agar-overlay. Agar-overlay adalah penggabungan antara

bioautografi kontak dan bioautografi langsung. Antimikroba ditransfer dari

pelat TLC ke lapisan agar seperti dalam uji kontak tetapi selama inkubasi

dan visualisasi lapisan agar tetap dalam plat seperti dalam bioautografi

langsung (26). Hasil uji menunjukkan noda dengan Rf sebesar 0,54 cm

aktif terhadap Eschericia coli (18,3mm) diameter hambatan yang diperoleh

menunjukkan penghambatan yang besar. (Gambar 5)

48

Rf = 0,54 cm

A a. b.

Gambar 5.Uji KLT-Bioautografi fungi endofit Ekstrak Isolat DC-1 daun cabai katokkon A =Uji KLT Bioautografi dengan metode Perendaman-agar Overlay a =Penampakan noda dengan pereaksi Mayer b =Penampakan noda dengan pereaksi Lieberman Burchard

49

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat

disimpulkan bahwa:

1. Isolasi fungi endofit dari daun cabai katokkon (Capsicum annuum L.

var. chinensis) diperoleh 2 isolat fungi yang diberi kode DC-1 dan

DC-2.

2. Fungi endofit isolat DC-1 merupakan isolat yang paling aktif. Hasil

uji antimikroba menunjukkan bahwa ekstrak fungi endofit isolat

DC-1 menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Eschericia coli

(29,50 mm), Staphylococcus aureus (16,50 mm), dan

Pseudomonas aeruginosa (19,00 mm) yang menunjukkan

diameter hambatan yang besar.

3. Hasil Uji KLT-Bioautografi ekstrak fungi endofit isolat DC-1 memiliki

efek antibakteri terhadap Eschericia coli (18,3 mm) dan diduga

merupakan golongan senyawa terpenoid dan alkaloid.

V.2 Saran

1. Perlu dilakukan karakterisasi isolat fungi endofit A secara

molekuler.

2. Perlu dilakukan optimasi produksi senyawa antimikroba dari isolat

fungi endofit A

50

DAFTAR PUSTAKA

1. Tortoa, et al. 2001. Microbiology in Introduction. International Edition.

Banjamin Cummings, Inc

2. Volk dan Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar 1. Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.

3. Wiryanta. 2006. Bertanam Cabai pada Musim Hujan. Tangerang:

Agromedia .

4. Strobel, G.A. 1998. Endophytic Microbes Embody Pharmaceautical Potensional.ASM News. 64:263-268.

5. Tanaka M, Sukiman H, Takebayashi M, Saito K, Suto M, Prana MS,

dan Tomita F, 1999. Isolation, Screening and Phylogenetic Identification of Endophytes from Plants in Hokaido Japan and Java Indonesia. Microbes and Environment 14(4):237–241.

6. Radji, Maksum. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit

dalam Pengembangan Obat Herbal. Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi. Vol. II. Departemen Farmasi, FMIPA-UI, Kampus UI Depok. 113 – 126. Departemen Farmasi, FMIPA-UI, Kampus UI Depok 16424 Majalah Ilmu Kefarmasian, , No.3, Desember 2005, 113 – 126

7. Syarmalina. 2008. Endofit dan Pelestarian Alam. PT. ISFI Medisina

Edisi 2/ vol 1/ April-Juni 2007. 8. Nugroho, Deny. 2004. Eksplorasi Bakteri Endofit Pada AkarTanaman

Kentang Yang Berpotensi Sebagai Antagonis Pseudomonas solanacearum. Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya.

9. Susilowati,D.N.,R.Saraswati.,dan E.Yuniarta. Tanpa Tahun. Isolasi dan

Seleksi Mikroba Diazotrof Endofitik dan Penghasil Zat Pemacu Tumbuh Pada Tanaman Padi Dan Jagung. Prosiding Seminar Hasil Penelitian Rintisan Dan Bioteknologi Tanaman. Balai Penelitian Bioteknologi Dan Sumberdaya Genetik Pertanian.

10. Brooks, G. F., Butel, S J., Morse, S. A. Mikrobiologi Kedokteran.

Terjemahan oleh Bagian Farmakologi FK-UNAIR. 2005. Penerbit Salemba Medika, Jakarta. 2001. Hal. 8, 224

51

11. Campbell, N.A., Reece, Jane B.,Mitchell, Lawrence G., Biologi. Ed 5 Jilid 2. Terjemahan oleh Prof.Dr.Ir. Wasmen Manalu. 2003. Penerbit Erlangga. Jakarta. 1999. Hal. 185,193,194

12. Sakiyama, C. C. H., Paula, E. M. 2001. Characterization of pectin lyase

produced by an endophytic strain isolated from coffe cherriesI. Letters of applied Microbiology. Vol. 33.

13. Strobel, G. Daisy, B. Castillo, U. 2004. Natural Products from

Endophytic microorganisms, Journal of Natural Products,Vol. 67 no. 2 14. Worang, R.L. Fungi Endofit Sebagai Penghasil Antibiotika. Makalah

Individu., Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. 2003. hal. 2 15. Sugijanto, N.E, Gunawan I.,dan Zaini NC,. Isolasi dan Determinasi

Berbagai Jamur Endofit dari tanaman Aglaia elliptica, Aglaia eusideroxylon, Aglaia odorata, dan Aglaia odoratissima. Jurnal penelitian Medika Eksakta. Agustus 2004. Vol. 5 No. 2 hal. 131, 139

16. Djide, N.,Sartini., dan Kadir S. 1997, Metode Instrumentasi

Bioteknologi Farmasi, Laboratorium Mikrobiologi Farmasi, Jurusan Farmasi Fakultas MIPA, Universitas Hasanuddin, Makassar.

17. Ganiswara, G.S. Farmakologi dan Terapi edisi 4. FK-UI. Jakarta. hal. 571-573. 1995.

18. Wolf, F. A., Wolf, F.T. The Fungi. Hafner Publishing Company. New

York. 1969. pg 14-15 19. Fardiaz, S.. Fisiologi Fermentasi. Lembaga sumber daya informasi –

IPB. Bogor. 1988. Hal. 79, 105-107 20. Stainer R. Y. Dunia Mikrobiolgi I. Bharata Karya Aksara, Jakarta. 1982 21. Lay, Bibiana.W. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT. Raja Grafindo

Persada. Jakarta. 1994. Hal. 18-20, 56-59, 81-86 22. Harborne, J. Metode Fitokimia: Penuntun cara modern menganalisis

tumbuhan. (K. Padmawinata, & I. Soediro, Trans.) Bandung: ITB.1987

23. McNeil, B. and Harvey, L.M., Practical Fermentation Technology, 42, 70-90, 100-101, John Wiley & Son Ltd., England. 2008

24. Yazid, Estien. Kimia Fisika untuk Paramedis. Yogyakarta : Penerbit Andi. 2005.

52

25. Gholib, Ibnu. Kimia Farmasi Analisis.. Jogjakarta : Pustaka Pelajar. 2009. Hal 328, 353.

26. LCGC chromatographyonline.com. The Use of Thin-Layer

Chromatography with Direct Bioautography for Antimicrobial Analysis [serial on the internet]. 2012 [dikutip 5 November 2012]; Available from: http://www.chromatographyonline.com/lcgc/Features/The-Use-of-Thin-Layer-Chromatography-with-DirectArticleStandard/Article/detail/177453

27. Pelczar. Jr. M. J. Dasar-dasar Mikrobiologi. R.S. Hadioetomo. UI-Press. Jakarta. 1988.

28. Fardiaz. S. Analisa Mikroba Pangan. PT., Raga Medika. Jakarta. 1993. 29. Holt, J. G. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. [9th Ed.].

The Williams & Wilkins Company. Baltimore. Maryland 21202 United States of America. 1994.

30. Inamandar AC,Paliit A.The Genus Malassezia and human disease. Indian j.DErmatol Venereol Leprol(serial on the internet) 2003(dikutip 8 april2013);69:265-70.Available from :

http://www.ijdvl.com/text.asp?2003%2F69%2F4%2F265%2F4990

31. Peterson, S.W., Vega, F.E., Posada, F., and Nagai, C., 2005. Penicillium coffeae, a new endophytic species isolated from a coffee plant and its phylogenetic relationship to P. fellutanum and P. brocae based on parsimony analysis of multilocus DNA sequences, Mycologia, 97 (3), 659-666.

32. Prihatiningtias, W. Widyastuti, S.M, Wahyuono, S. Aktivitas Antibakteri

Fungi Endofit Thievalia Polygonoperda, Isolat Dari Tumbuhan Akar Kuning (Fibraurea Chloroleuca Miers). Universitas Gadjah Mada:Yogyakarta.. (Tanpa Tahun).

33. Soetarno, S, Antimicrobial Aktivities of The Ethanol Extracts of

Capsicum Fruits with Different Levels of Pungency. JMS Vol. 2 No. 2. Oktober 1997. Hal 57-63.1997

34. Pandey, B., Ghimirel, P., and Agrawal, V.P. Studies on the

antibacterial activity of theactinomycetes isolated from the Kumbu region of Nepal. Brazi J. Mic, 67 (4), 24-31. 2004

35. Rante, H.Wahyono.,Murti YB. Dan Alam G. Purifikasi dan Karakterisasi

Senyawa Anti-Bakteri dari Actinomycetes Asosiasi Spons Terhadap Bakteri Patogen Resisten. Majalah Farmasi Indonesia, 21(3), 158-165. 2010.

53

36. Daud, NH. Jayaraman S. Mohamed R. An improved surface sterilization technique for introducing leaf, nodal and seed explants of Aquilaria malaccensis from field sources into tissue culture. AssPPaacc JJ.. MMooll.. BBiiool.l .B Bioitoetcehcnhonl. Vol. 20 (2) : 55-58. 2012

37. Pratiwi, S.T., , Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta. 2008

38. Waluyo, L. Mikrobiologi Lingkungan.Universitas Muhammadiyah Malang Press.Malang.2005

39. Mawaddah Rosliana. Kajian Hasil Riset Potensi Antimikroba Alami dan

Aplikasinya dalam Bahan Pangan di Pusatinformasi Teknologi Pertanian Fateta IPB. FAkultas Teknologi Pertanian institute Pertanian Bogor. 2008

40. Marlinda, M., Sangi, M.S., Dan Wuntu, A.D. Analisis Senyawa Metabolit Sekunder Dan Uji Toksisitas Ekstrak Etanol Biji Buah Alpukat (Persea Americana Mill.). Jurnal Mipa Unsrat Online 1 (1). 2012. Hal. 24-29

41. Purwanto. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Penghambat Polimerisasi Hem Dari Fungi Endofit Tanaman Artemisia Annua L. Tesis, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. 2011. Hal. 88-90, 155-156

54

Lampiran 1. Bukti Determinasi Sampel Daun Cabai Katokkon

55

Lampiran 2. Komposisi Medium

No Medium Komposisi

1 Nutrien Agar (NA)

Pepton 5 gram

Ekstrak daging 15 gram

Agar 15 gram

Air suling ad 1000 ml

pH 7,0 ± 0,2

2 Potato Dextrose Yeast

(PDY)

Pepton 10 gram

Glukosa 40 gram

Agar 15gram

Ekstrak Yeast 4 gram

Air suling ad 1000 ml

pH 7,0 ± 0,2

3 Potato Dextrose Agar

(PDA)

Pepton 10 gram

Glukosa 40 gram

Agar 15gram

Air suling ad 1000 ml

pH 5,6 ± 0,1

56

Lampiran 3. Skema Isolasi Fungi Endofit

Daun cabai katokkon (Capsicum annuum

L.var.chinensis)

Dipotong-potong kecil hingga ukuran + 1cm

Medium PDA

Diinkubasi 5 hari suhu 25o C

Koloni Murni

Stock Culture

Dipindahkan ke media PDA lempeng dan PDA miring.

Sterilisasi permukaan

- dicuci dengan air mengalir ± 10 menit - dipotong-potong sesuai dengan ukurannya

Di rendam dalam :

-etanol 70% selama 2 menit

-Na hipoklorit 5,3 % selama 2 menit

-air suling steril selama 1 menit

Daun cabai katokkon (Capsicum annuum

L.var.chinensis) dipotong

57

Lampiran 4. Skema Fermentasi dan Ekstraksi Isolat Fungi Endofit

Stock culture (Isolat fungi endofit)

Medium produksi

Dishaker pada media PDY pada suhu kamar selama 3 hari

Dishaker sampai hari ke-5 pada suhu kamar

Disaring

Pemisahan biomassa dan cairan fermentasi

Cairan Fermentasi

Diekstraksi 2 kali dengan cairan pelarut etil asetat (1:1 v/v) dalam corong pisah selama 20 menit

Ekstrak

Ekstrak yang diperoleh diuapkan lalu disimpan pada desikator untuk digunakan pada uji selanjutnya

58

Lampiran 5. Skema Uji Aktivitas Antimikroba dari Fungi Endofit

Mikroba Uji

Pengumpulan Data

Cawan petri berisi medium NA untuk bakteri

Dispersi Mikroba Uji Cakram mengandung

ekstrak

Ekstrak

Medium yang

telah diinkubasi

Diteteskan ke dalam 5 cakram sebanyak 10 µl

Didispersikan dengan penambahan air steril

dan medium

Cawan petri berisi medium PDA untuk fungi

Diinkubasi selama 1 x 24 jam suhu

37 C

Diinkubasi selama 3 x 24 jam pada suhu kamar

Medium yang

telah diinkubasi

Diukur zona hambat yang terbentuk

Diukur zona hambat yang terbentuk

Pengumpulan Data

Hasil

59

Lampiran 6. Skema Uji KLT Bioautografi dan Identifikasi Ekstrak

Uji KLT Bioautografi Identifikasi senyawa Ekstrak

Pengumpulan Data

Hasil

Ekstrak

Kesimpulan

60

Lampiran 7. Komposisi Reagen 1. Asam Sulfat

Asam sulfat pekat : 10 mL

Air : 100 mL

2. Lieberman-Burchard

Asam asetat anhidrat : 1 mL

Asam sulfat pekat : 1 mL

Metanol :10 mL

3. Feri Klorida

FeCl3 : 1 g

Air : 100 mL

4. Asam Sitroborat

Asam borat : 0,5 g

Asam sitrat : 0,5 g

Etanol : 50 mL

5. Mayer

HgCl2 : 1,358 g

Air : 60 ml

61

LAMPIRAN GAMBAR

Gambar 6. Tanaman cabai katokkon (Capsicum annuum L var. chinensis)

Gambar 7. Produksi dan Fermentasi Fungi Endofit Isolat DC-1 daun cabai katokkon

a. b. c. Gambar 8.Profil Kromatogram Ekstrak Isolat DC-1 daun cabai katokkon

(Capsicum annuum L var. chinensis)

Keterangan : a =Penampakan noda pada uv 254 nm dengan perbandingan pelarut heksan : etil = 1:5 b =Penampakan noda pada uv 366 nm dengan perbandingan pelarut heksan : etil = 1:5 c =Penampakan noda pada penyemprotan H2SO4 dengan perbandingan pelarut heksan : etil = 1:5

62

a. b. c. d.

Gambar 9.Identifikasi Ekstrak Isolat DC-1 daun cabai katokkon Keterangan : a =Penampakan noda dengan pereaksi FeCl3 b =Penampakan noda dengan pereaksi Mayer c =Penampakan noda dengan pereaksi Sitroborat d =Penampakan noda dengan pereaksi Lieberman Burchard

Rf =0,54 cm

Gambar 10. Uji KLT-Bioautografi Ekstrak Isolat DC-1 daun cabai katokkon (Capsicum annuum L var. chinensis) terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa

Rf =0,54 cm

Gambar 11. Uji KLT-Bioautografi Ekstrak Isolat DC-1 daun cabai katokkon (Capsicum annuum L var. chinensis) terhadap bakteri Staphylococcus aureus