Upload
nawawi-khalimi
View
127
Download
15
Embed Size (px)
Citation preview
1
TEKNIK ISOLASI DNA BENIH TANAMAN TEH (Camellia sinensis L.)
Oleh:
GATI WINDIASTIKA, SP. MP (Calon Pengawas Benih Tanaman)
Balai Besar Perbenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan Surabaya
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat
di dalam inti sel dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan
kloroplast. Sehingga penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya.
DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom
mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria serta DNA genom
kloroplast berasal dari kloroplast.
Perbedaan diantara ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linear dan
berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan
kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu,
DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat
yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang
memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua. Dilihat dari organismenya,
struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak
memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk
linear dan memiliki protein histon.
Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat
herediter pada seluruh sistem kehidupan. Sehingga pada dasarnya isolasi DNA
dapat dilakukan dari berbagai sumber (semua sel yang mempunyai inti), antara lain
organ manusia (darah, rambut dan tulang); organ tanaman (semaian, daun,
kotiledon, biji, akar, batang, buah, endosperm, embrio, kalus, dan pollen); dan organ
hewan (darah putih, hepar, sisik, ekor). Pada individu yang sama, DNA yang
diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki jenis, jumlah dan ukuran yang sama.
Pada isolasi DNA dari tanaman, kesulitan utama adalah proses destruksi
dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki
dinding sel yang kuat dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari
ekstrak asam nukleat. Selain itu DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali
2
terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder lainnya seperti tanin,
pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sehingga pada tanaman dengan kandungan
polisakarida dan metabolit sekunder tinggi perlu dilakukan modifikasi pada saat
ekstraksi DNA.
Keberadaan polisakarida dan senyawa metabolit sekunder dalam sel
tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat. Struktur polisakarida yang
mirip dengan asam nukleat menyebabkan polisakarida dapat mengendap bersama
asam nukleat. Adanya polisakarida dalam tanaman ditandai dengan kekentalan
pada hasil isolasi DNA. Penambahan senyawa pereduksi seperti β-mercaptoethanol
dan dithiothreitol (DTT) dapat mencegah oksidasi senyawa fenolik sehingga
menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap
asam nukleat. Metabolit sekunder dan polisakarida juga dapat menghambat aktivitas
enzim, misalnya DNA tidak sensitive oleh enzim retriksi dan dapat mengganggu
proses amplifikasi DNA dengan PCR akibat penghambatan aktivitas taq polymerase.
Oleh karena itu diperlukan suatu teknik isolasi DNA genom tanaman yang tepat
sehingga diperoleh kualitas DNA yang baik bagi proses amplifikasi PCR.
A. TAHAPAN ISOLASI DNA
Ada 5 (lima) tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu:
1. Isolasi jaringan
Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.
2. Pelisisan dinding dan membran sel
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara
penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000
rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel
harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya.
Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak
mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau
dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi.
3. Pengekstraksian dalam larutan
Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan
ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.
4. Purifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada
larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit
pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang
sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk
menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.
3
5. Presipitasi
Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon,
sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan
protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi
dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian
divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi
protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein
mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah,
sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian
disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip
utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis
molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang
lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas.
B. KOMPONEN EKSTRAKSI DNA DAN PENGARUHNYA
Pada umumnya isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan buffer ekstraksi
Cetyltrimetil Ammonium Bromide (CTAB) atau Sodium Dodecyl Sulfat (SDS). Berikut
ini komponen dari buffer ekstraksi yang sering digunakan untuk isolasi DNA:
Tabel 1. Komponen Ekstraksi DNA dan Pengaruhnya
KOMPONEN SIFAT PENGARUH
Bovin Serum Albumin (BSA)
AAbbssoorrbbeenn
ppoollyyffeennooll DDeennaattuurraassii eennzziimm ddeeggrraaddaattiiff
CCeettyyllttrriimmeettiill
AAmmoonnnniiuumm BBrroommiiddee
((CCTTAABB))
DDeetteerrggeenn kkaattiioonniikk MMeerruussaakk mmeemmbbrraann sseell,,
mmeennddeennaattuurraassii pprrootteeiinn,, mmeemmbbeennttuukk
kkoommpplleekkss ddeennggaann DDNNAA,,
mmeenngghhaammbbaatt aakkttiivviittaass nnuukklleeaassee
CChhlloorrooffoorrmm--IIssooaammyyll
AAllkkoohhooll ((CCIIAA)) EEkkssttrraakkssii pprrootteeiinn
CCyyaanniiddee
MMeelliinndduunnggii ddaarrii eennzziimm ookkssiiddaassee
llooggaamm bbeerraatt
DDiieettyyllddiittiiooccaarrbbaammiicc
aacciidd ((DDIIEECCAA)) IInnhhiibbiittoorr
ffeennoollookkssiiddaassee MMeennggkkeellaatt CCuu
22++
DDiieettyyllppyyrrooccaarrbboonnaattee,,
BBeennttoonniittee,, SSppeerrmmiinnee,,
SSppeerrmmiiddiinnee
PPoolliiaammiinn MMeelliinndduunnggii ddaarrii RRNNAAssee mmeenncceeggaahh
ookkssiiddaassii mmeettaabboolliitt sseekkuunnddeerr ddeennggaann
ccaarraa mmeennggiikkaatt sseennyyaawwaa ffeennoolliikk..
EEtthhyylleennee DDiiaammiinnee
TTeettrraaaacceettaattee ((EEDDTTAA)) MMeennggkkeellaatt kkaattiioonn ((MMgg)),, mmeenngghhaammbbaatt
eennzziimm yygg mmeennggaanndduunngg llooggaamm
((nnuukklleeaassee,, DDNNAAssee))
GGaarraamm ((NNHH44++
,, NNaa++,,
NNaaOOAAcc,, NNaaCCll,,
NNHHOOAAcc))
PPrreessiippiittaassii aallkkoohhooll
4
KOMPONEN SIFAT PENGARUH
HHiiddrrookkssiikkuuiinnoolliinn,,
GGlluukkoossaa,, CCyysstteeiinn,, ββ--
mmeerrkkaappttooeetthhaannooll,,
GGlluuttaattiioonn,, NNaa22SS
22OO
55,,
DDiitthhiiootthhrreeiittooll,, AAssaamm
aasskkoorrbbaatt
AAggeenn ppeerreedduukkssii MMeenngghhaammbbaatt pprroosseess ookkssiiddaassii,,
mmeelliinndduunnggii DDNNAA ddaarrii qquuiinnoonnee,,
ddiissuullffiitt,, ppeerrooxxiiddaassee,,
ppoollyypphheennoollookkssiiddaassee,, mmeenncceeggaahh
ppeennccookkllaattaann oolleehh ppoolliiffeennoolliikk
Isoamil alkohol Membantu pemisahan fase, menurunkan jumlah material kontaminan yang terikut pada fase cair dan interfase serta membantu menurunkan busa
IIssoopprrooppaannooll PPrreessiippiittaassii kkoommpplleekkss CCTTAABB--DDNNAA,, sering digunakan untuk presipitasi pertama, tetapi tidak untuk tahap akhir karena cenderung mengendapkan garam dibanding ethanol
KKlloorrooffoorrmm MMeenngghhiillaannggkkaann lliippiidd ddaann ppaaddaa ttaahhaapp
aakkhhiirr eekkssttrraakkssii mmeemmbbaannttuu
mmeenngghhiillaannggkkaann ssiissaa ffeennooll
NNaa//KK GGaarraamm MMeennssttaabbiillkkaann iinnttii
NNHH MMeelliinndduunnggii ddaarrii HH
++
ppHH PPeenngghhaammbbaatt eennzziimm ddeeggrraaddaattiivvee
PPhheennooll PPeennddeennaattuurraassii pprrootteeiinn
PPhheennooll dan kloroform (1:1)
Deproteinasi lebih efektif jika digunakan 2 macam pelarut organik
Polyvinilpirolidon (PVP),
AAbbssoorrbbeenn
ppoollyyffeennooll MMeenngguurraannggii eeffeekk ppoolliiffeennooll,, qquuiinnoonn,,
ttaanniinn
PPrrootteeiinnaassee KK EEnnzziimm MMeennddiiggeesstt pprrootteeiinn
SSooddiiuumm DDooddeeccyyll SSuullffaatt
((SSDDSS)) DDeetteerrggeenntt aanniioonniikk MMeerruussaakk mmeemmbbrraann sseell,,
mmeennddeennaattuurraassii pprrootteeiinn,, mmeenngghhaammbbaatt
aakkttiivviittaass nnuukklleeaassee
TTrriiss BBuuffffeerr MMeennjjaaggaa ppHH
C. PROSEDUR ISOLASI DNA
Sampel tanaman yang akan digunakan untuk proses isolasi DNA berasal dari
daun tanaman teh yang terletak pada bagian kedua (Gambar 1). Sampel daun
dipetik lalu dimasukkan ke dalam plastik, diberi label dan siap untuk digunakan.
Sampel yang digunakan sebaiknya dalam bentuk segar. Namun, apabila kondisi
tidak memungkinkan, maka dapat digunakan sampel tanaman yang telah dibekukan
atau dikeringkan. Adapun tahapan isolasi DNA daun tanaman teh dengan
menggunakan Dneasy Plant Mini Kit produksi Qiagen adalah sebagai berikut:
1. Helai daun muda tanaman teh dibersihkan dari tulang daun kemudian dipotong-
potong dengan ukuran 1x1 cm dan ditimbang sebanyak 0,2 gram (Gambar 2).
5
Gambar 1. Bagian Tanaman Teh yang Digunakan Sebagai Sampel Isolasi DNA
2. Potongan daun dimasukkan dalam mortar dan ditambahkan nitrogen cair hingga
seluruh daun terendam. Selanjutnya daun teh ditumbuk secepatnya hingga
halus. Penumbukan dilakukan bersamaan dengan adanya nitrogen cair dalam
mortar (Gambar 3). Apabila selama berlangsungnya proses penumbukan
nitrogen cair habis dan daun teh masih belum halus, maka perlu ditambahkan
nitrogen cair agar daun teh dapat tertumbuk halus (Gambar 4).
Gambar 2. Persiapan Sampel Daun Teh
Gambar 3. Penumbukan Sampel Daun Teh
Pada Mortar dengan Penam-bahan Nitrogen Cair
3. Hasil tumbukan diambil setengah bagian dan dimasukkan ke dalam ependorf
cup 1,5 ml yang sudah berisi 400 μl buffer AP1 dengan menggunakan spatula
(Gambar 5). Buffer AP1 pada ependorf cup 1,5 ml sudah disiapkan sebelum
penumbukan, sehingga pada saat daun telah halus secepat mungkin
dimasukkan dalam buffer untuk mencegah oksidasi akibat menguapnya nitrogen
cair. Kemudian dikocok menggunakan tangan (tapping) hingga semua partikel
daun tercampur merata dengan Buffer AP1.
6
4. Selanjutnya ditambahkan RNase sebanyak 4 μl (100 mg/mL) untuk
menghilangkan kontaminan RNA agar dihasilkan DNA bebas RNA (Gambar 6),
kemudian divortex secepatnya (Gambar 7).
5. Larutan diinkubasikan pada suhu 65oC selama 10 menit, posisi ependorf cup
dibolak balik atau diinvert.
6. Selanjutnya ditambahkan 130 μl buffer AP2 dan dihomogenkan dengan cara
insersi atau dibolak-balik, setelah itu secepatnya homogenan diinkubasikan pada
pecahan es batu selama 5 menit.
7. Homogenan disentrifuse selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm hingga
diperoleh supernatant (letak ependorf cup harus seimbang).
Gambar 4. Sampel Daun Teh yang Telah
Ditumbuk dan Siap Diguna-kan Untuk Isolasi DNA
Gambar 5. Hasil Tumbukan Daun Teh
Dimasukkan Ke Dalam Ependorf Cup 1,5 ml
Gambar 6. Penambahan Rnase
Gambar 7. Larutan Divortex
8. Supernatan (bagian berwarna bening) diambil dengan menggunakan mikropipet
secara hati-hati dan dimasukkan dalam QIA shreadder (warna ungu).
9. Supernatan - QIA Shredder disentrifuse kembali pada 13.000 rpm selama 2
menit, untuk menyaring pengotor DNA pada supernatant dengan filter QIA
Shredder. Kemudian filter QIA Shredder warna ungu dibuang.
10. Selanjutnya ditambahkan buffer AP3 sebanyak 1,5 kali volume filtrat yang
dihasilkan dari saringan supernatant. Misal volume filtrat yang dihasilkan dari
saringan supernatant 400 μl (volume awal) x 1,5 = 600 μl. Jadi total volume filtrat
7
+ buffer AP3 = 1.000 μl. Pencampuran dilakukan dengan cara pipetting (Gambar
8).
11. Kemudian diambil 600 μl dari campuran (1.000 μl) dan dimasukkan ke dalam
tube Dneasy (warna putih) selanjutnya disentrifuse selama 1 menit dengan
kecepatan 8.000 rpm. Tube DNeasy tidak akan cukup untuk menampung semua,
maka dilakukan secara bertahap misalnya terlebih dahulu diambil sebanyak 600
μl, kemudian ditambahkan sisanya. Selanjutnya larutan disentrifuse selama 1
menit dengan kecepatan 8.000 rpm. Perlakuan ini berfungsi agar DNA tersaring
dalam filter. Filtrat dibuang karena filtrat tidak lagi mengandung DNA.
Selanjutnya dimasukkan lagi sisanya dari volume total, kemudian disentrifusi
pada 8.000 rpm selama 1 menit. Filtrat juga dibuang.
12. Pada tube Dneasy ditambahkan 500 μl buffer AW dan disentrifusi pada 13.000
rpm selama 2 menit. Filtrat dibuang kembali dan disentrifuge lagi supaya tuntas.
Buffer AW berfungsi mencuci sisa-sisa campuran cairan yang berada pada filter
agar DNA benar-benar bersih.
13. Cup bagian bawah (yang berisi buffer AW dan pengotor dibuang dan diganti
dengan cup baru (ependorf cup 1,5 ml) yang berfungsi sebagai penampung DNA
yang akan diluruhkan dari filter.
14. Pada bagian tengah filter Dneasy (warna putih) ditambahkan 100 μl buffer AE
(pH: 7,6-8,5) kemudian dibiarkan selama 5 menit.
Gambar 8. Homogenasi Dengan Cara
Pipetting
Gambar 9. Hasil Akhir Isolasi DNA
15. Selanjutnya larutan pada DNeasy disentrifuse pada 8.000 rpm selama 1 menit.
FILTRAT YANG DIHASILKAN JANGAN DIBUANG. Buffer AE berfungsi
meluruhkan DNA dari filter dan melindung DNA dari kerusakan atau degradasi.
16. Kemudian ditambahkan lagi 50 μl buffer AE (pH: 7,6-8,5) pada bagian tengah
filter Dneasy dan dibiarkan selama 5 menit. Selanjutnya larutan pada DNeasy
disentrifuse kembali pada 8.000 rpm selama 1 menit.
8
17. Filtrat yang dihasilkan merupakan hasil dari isolasi DNA tanaman teh. Pemberian
buffer AE secara bertahap bertujuan untuk menjamin semua DNA yang terjerap
dalam filter dapat luruh ke dalam ependorf cup 1,5 ml.
18. DNA dapat disimpan pada refrigerator dengan suhu –20oC untuk jangka panjang
atau siap digunakan sebagai bahan amplifikasi dalam reaksi PCR (Gambar 9).
DAFTAR PUSTAKA
Arumingtyas, EL. 2011. Isolasi DNA dan RAPD. Disampaikan pada Pelatihan
Analisis DNA Fingerprinting Tanaman dengan Metode RAPD Tanggal 4-6 Juli 2011. Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya. Malang. p.1-12.
Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. Available on http://miss-purplepharmacy.blogspot. com/2010/01/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 15 Februari 2012.
Mustahib. 2012. Isolasi DNA metode “Kitchen Preparation”. Available on http:// biologi.blogsome.com/2012/02/11/isolasi-dna-metode-kitchen-preparation/. Diakses tanggal 22 Februari 2012.
Qiagen. 2010. RNeasy® Mini Handbook. www.qiagen.com. pp.79. Rizqy. 2011. Isolasi DNA. Available on http://duniasains-rizqy.blogspot.com/2011/
11/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 15 Februari 2012. Wane. 2011. Pengertian DNA dan Isolasi DNA kromosom, Isolasi DNA plasmid,
Isolasi RNA Available on http://wanenoor.blogspot.com/2011/06/ pengertian-dna-dan-isolasi-dna-kromosom.html. Diakses tanggal 15 Februari 2012.