Inżynieria białek I Wykład 5 (2014/2015)

Magdalena Tworzydło Zakład Biochemii Fizycznej, WBBiB UJ

Oczyszczanie białek rekombinowanych

Rozwój metod umożliwiających uzyskanie wysokiej ekspresji białek rekombinowanych w przemyśle biotechnologicznym spowodował konieczność opracowania wydajnych procesów ich oczyszczania. Stosowane standardowo metody w większości wypadków były zbyt czasochłonne i kosztowne by można je było stosować na masową skalę. Dzięki stworzeniu całego szeregu etykietek (tags) oraz zmodyfikowanych białek fuzyjnych (fusion partners) w ostatnich dwudziestu latach szczególnego znaczenia nabrały systemy oczyszczania wykorzystujące chromatografię powinowactwa.

oczyszczanie przebiega w jednym etapie (?) przyłączone etykietki mają minimalny wpływ na strukturę

trzeciorzędową oraz aktywność oczyszczanego białka etykietki można w łatwy i selektywny sposób usunąć

w wyniku czego powstaje białko natywne (?) możliwa jest detekcja i ilościowe oznaczenie białka przy pomocy

prostych testów te same etykietki/białka fuzyjne mogą być wykorzystane do

oczyszczania różnych białek

Etykietki (metki) oraz białka fuzyjne

Pomimo wszystkich w/w zalet każda z przyłączanych sekwencji (etykietek, białek fuzyjnych) wymaga oczyszczania w charakterystycznych dla siebie warunkach (rodzaj buforu, siła jonowa, pH), które mogą mieć niepożądany wpływ na przyłączone do etykietki białko rekombinowane.

Wybór partnera fuzyjnego zależy zatem od właściwości oczyszczanego białka rekombinowanego (jego stabil-ności, hydrofobowości, rozpuszczalności) systemu ekspresyjnego, w którym zachodzi proces syntezy białka oraz celu, w jakim oczyszczone białko ma być następnie użyte.

Etykietki (metki) oraz białka fuzyjne

Etykietki liczące kilka/kilkanaście aminokwasów na ogół nie zaburzają procesu fałdowania ani właściwości białka rekombinowanego, w związku z tym w wielu wypadkach nie wymagają usunięcia.

Niektóre duże białka fuzyjne oprócz samego oczyszcza-nia mogą pozytywnie wpływać na rozpuszczalność białka rekombinowanego. Niestety ze względu na dużą masę muszą zostać usunięte (m. in. nie mogą być wykorzystywane do badań krystalograficznych, tera-peutycznych, produkcji przeciwciał).

Etykietki/białka fuzyjne mogą przyłączane do N- oraz C-końca białka (a także wewnątrz łańcucha polipepty-dowego). Wybór miejsca przyłączenia zależy od właściwości oczyszczanego białka oraz rodzaju etykietki.

Metka histydynowa (His-tag)

Chromatografia metalopowinowactwa (Immobilized metal-affinity chromatography, IMAC) oparta jest na oddziaływaniu pomiędzy jonami metali przejściowych, t.j. Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, unieruchomionymi na złożu oraz określonymi resztami aminokwasowymi (grupa fenolanowa Tyr, grupa

imidazolowa His, grupa tiolowa Cys, grupy karboksylowe Glu i Asp).

Rodzaje złóż

IDA jest grupą wywierającą niewielki efekt steryczny na pozostałe wolne miejsca koordynacyjne jonu metalu – w efekcie obniża to selektywność wiązania oczyszczanych białek.

N O

Me

CO

CO

CH2

CH2

O

X

X

X

Agaroza IDA-agaroza (ang. iminodiacetate) – złoże agarozowe, wiąże jony metalu za pośrednictwem reszt kwasu iminodioctowego (grupa ta chelatuje jony metali przy udziale 3 atomów). Chelatowany jon metalu posiada aż trzy wolne miejsca koordynacyjne, które potencjalnie mogą służyć do wiązania oczyszczonego białka.

TALON – złoże zawierające Co2+ związany z kwasem karboksymetylo-asparginowym. Ze względu na ściśle określone przestrzenne rozmieszczenie reszt histydynowych wymagane do efektywnego związania się białka z Co2+ – oczyszczanie na tym złożu jest bardziej specyficzne.

Chromatografia metalopowinowactwa (Immobilized metal-affinity chromatography, IMAC) oparta jest na oddziaływaniu pomiędzy jonami metali przejściowych, t.j. Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, unieruchomionymi na złożu oraz określonymi resztami aminokwasowymi.

Rodzaje złóż

wiązania koordynacyjne NTA kwas nitrylotri-

octowy

NTA (ang. nitrilotriacetic acid) – złoże agarozowe wiąże jony metalu za pomo-cą reszty kwasu nitrylotrioctowego. NTA posiada cztery miejsca chelatujące jon metalu. Związany przez złoże jon metalu zachowuje jeszcze dwa wolne miejsca koordynacyjne wolne. Złoże charakteryzuje się dużą siłą wiązania jonów metalu oraz stosunkowo dużą pojemnością.

Metka histydynowa (His-tag)

wiązania koordynacyjne NTA kwas nitrylotri-

octowy

Etykietka histydynowa: 2–10 reszt His, (masa 6His – 0,84 kDa), wiązanie do złoża może przebiegać w warunkach fizjologicznych lub denaturujących (w obecności GuHCl) i zależy od ilości reszt histydynowych oraz siły jonowej buforu (wysokie stężenie soli niweluje niespecyficzne oddziaływania jonowe pomiędzy naładowanymi ujemnie resztami aminokwasowymi a złożem). Elucja przebiega w gradiencie kompetytora – imidazolu (20–500 mM, pH>8), lub w niskim pH (<5, poniżej pI histydyny, w którym ulega ona protonacji).

Użycie imidazolu do elucji białek zaburza badania

NMR i krystalograficzne, może też wywołać

agregację oczyszczanego białka

Imidazol (analog histydyny)

Metka histydynowa (His-tag)

FLAG-tag

8 aminokwasowy, hydrofilowy peptyd – DYKDDDDK (1,01kDa) rozpoznawany przez przeciwciała monoklonalne M1, M2 (MDYKAFDNL) i M5 (MDFKDDDDK).

Elucja odbywa się w warunkach niedenaturujących przy pomocy buforów zawierających związki chelatujące (EDTA) lub poprzez przejściowe obni-żenie pH (3,0).

Wydajność oczyszczania wynosi około 90%.

Etykietkę można usunąć poprzez trawienie enterokinazą. Rozpoznaje ona sekwencję DDDDKX.

Złoża z immobilizowanymi przeciwciałami są mniej trwałe niż inne, co podnosi koszt tego systemu.

Strep-tag

W skład systemu Strep-tag® wchodzi: • polipeptyd Strep-tag II o sekwencji WSHPQFEK (1,06 kDa) • zmodyfikowana genetycznie streptoawidyna (z bakterii Streptomyces avidinii) – tzw. Strep-Tactin

Strep-tag II jest wiązany w kieszeni, normalnie wiążącej biotynę.

Warunki oczyszczania mogą być zmieniane w szerokim zakresie. Bufory mogą zawierać związki chelatujące, łagodne detergenty, związki redukujące oraz sole (do 1M). 6 M mocznik destabilizuje wiązanie Strep-tag – Strep-Tactin, ale nie powoduje denaturacji białka wiążącego etykietkę.

System może być wykorzystywany do badania oddziaływań białko-białko, gdyż złoże Strep-tactin ma zdolność wiązania kompleksów białkowych.

Wiązanie białka rekombinowanego zachodzi w warunkach fizjologicznych. Elucji dokonuje się przy pomocy pochodnych biotyny (detiobiotyny). Złoże jest regenerowane przez HABA (kwas 4-hydroksy azobenzeno 2-karboksylowy).

biotyna

detiobiotyna

oczyszczane białko z metką Strep

Strep-tag

W wyniku trawienia subtylizyną RNAza A zostaje pocięta na dwa fragmenty o długości 20 oraz 103 aminokwasów. Żaden z tych polipeptydów osobno nie jest w stanie hydrolizować RNA. Oba fragmenty jednak silnie oddziałują ze sobą w wyniku czego przywrócona zostaje aktywność enzymatyczna RNAzy (zjawisko komplementacji). S-tag: 15-aminokwasowy, hydrofilowy fragment RNAzy A (KETAAAKFERQHMDS – 1,75 kDa). S-protein: 103 aminokwasowy fragment RNAzy A przyłączony do złoża agarozowego.

Jeśli z jakichś powodów konieczne jest zachowanie etykietki, elucję przeprowadza się w 2M roztworze tiocyjanianu sodu (b. niskie pH, wysokie stężenie soli). Możliwe jest także oczyszczanie białka w warunkach denaturujących (wiązanie białka – 2 M mocznik, przemywanie kolumny, elucja – 2 M tiocyjanian sodu).

Jeśli białko ma zostać oczyszczone w warunkach fizjologicznych – najlepiej jest odciąć je od etykietki połączonej z białkiem S przy pomocy bioty-nylowanej trombiny. Trombina zostaje usunięta w następnym kroku w wyniku przepuszczenia przez złoże z unieru-chomioną streptawidyną.

S-tag

Peptyd S może być także wykorzystany do szybkiego oznaczenia stężenia białka rekombinowanego w próbce. Test oparty jest na aktywności nukleolitycznej odtworzonej RNAzy A. Do próbki zawierającej białko z przyłączona etykietką dodaje się białko S oraz substrat (np. polinukleotyd z przyłączonymi odpowiednio do 5’-końca oraz 3’-końca wygaszaczem fluorescencji oraz znacznikiem fluorescencyjnym). Aktywność RNAzy A oznaczana jest spektrofotometrycznie. Przy nadmiarze białka S aktywność jest proporcjonalna do stężenia białka rekombinowanego połączonego z etykietką.

S-tag

GST-tag

S-transferaza glutationowa (glutathione S-transferase) w warunkach fizjologicznych jest homodimerem. Białko wykorzystywane jako partner fuzyjny pochodzi z przywry Schistosoma japonicum, liczy 211 aminokwasów i ma masę 26 kDa.

Białka połączone z GST oczyszczane są na złożach z immobilizowanym glutationem. Elucja przebiega w warunkach niedenaturujących przy użyciu buforu zawierającego 10 mM zredukowany glutation. Oczyszczane białka są w większości dobrze rozpuszczone i tworzą dimery.

GST zwiększa stabilność białek rekombinowanych i zapobiega ich degradacji przez proteazy obecne w komórce. Ze względu na swoją wielkość GST powinno być odcięte po oczyszczeniu białka rekombinowanego.

Podobnie jak w przypadku innych etykietek istnieje możliwość oznaczenia stężenie wyznakowanego białka przy pomocy • testów enzymatycznych: reakcja barwna z użyciem glutationu oraz 1-chloro-2-4-dinitrobenzenu (CDNB) • lub immunologicznych: przeciwciała anty-GST.

MBP-tag

Białko wiążące maltozę (maltose binding protein) z E. coli składa się z 396 reszt aminokwasów (40 kDa). MBP-tag jest wykorzystywany do oczy-szczania białek rekombinowanych na złożach amylozowych.

Elucja przebiega w warunkach fizjologicznych w buforze zawierającym 10 mM maltozę. Stwierdzono, że MBP może zwiększać rozpuszczalność białek ulegających nadekspresji (dotyczy to w szczególności białek eukariotycznych). Wstawienie łącznika liczącego 10 reszt asparaginowych pomiędzy MBP a białko rekombinowane zwiększa specyficzność oddziaływania konstruktu ze złożem.

MBP dołącza się do obu końców oczyszczanego białka jednak przyłączenie do N-końca może mieć negatywny wpływ na wydajność translacji. Po zakończeniu oczyszczania MBP powinno zostać odcięte od białka rekombinowanego.

Inne białka fuzyjne zwiększające rozpuszczalność

W przypadku gdy pozyskiwane białko wytrąca się w postaci ciał inkluzyjnych można próbować zwiększyć jego rozpuszczalność poprzez przyłączenie hydrofilowego białka pochodzącego z E. coli. Do najczęściej w tym celu wykorzystywanych białek fuzyjnych zalicza się NusA (terminator/antyterminator transkrypcji), TrxA (tioredoksyna) oraz DsbA (izomeraza wiązań disiarczkowych).

W/w białek nie da się niestety wykorzystać w procesie oczyszczania dlatego często do białka rekombinowanego dołączana jest dodatkowo niskocząsteczkowa etykietka pozwalająca wykorzystać zalety chromatografii powinowactwa.

Etykietki ułatwiające rozpuszczanie są usuwane w trakcie oczyszczania białka rekombinowanego.

Enzymatyczne usunięcie etykietek

Nazwa Rozpoznawana sekwencja

Uwagi

Enterokinaza Asp-Asp-Asp-Asp-Lys X X –dowolny aa poza Pro Trawienie: 8h, 23°C, aktywna w pH 4,5–9,5

TEV (tobacco etch virus)

Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly

Trombina X4 X3 P R[K] X1 X2

X4 X3 – aa hydrofobowe X1 X2 – aa niekwasowe Trawienie: 0,3–8h, 20–37°C

Czynnik Xa Ile-Glu/Asp-Gly-Arg X1 X1 – dowolny aa poza Arg i Pro Trawienie: 4–25°C

PreSissionTM Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro

Zmod. gen. proteaza 3C rinowirusa (z dołączoną GST) Trawienie: 4°C

Odzyskiwanie białek rekombinowanych z ciałek inkluzyjnych – fałdowanie in vitro

Jeszcze 25 lat temu fałdowanie białek w układach in vitro stanowiło dla garstki specjalistów fascynujący temat do badań podstawowych. Obecnie jest to proces stosowany na skalę przemysłową przy produkcji białek wykorzystywanych w terapii, diagnostyce i przemyśle.

Problem „refoldingu” pojawił się wraz z wprowadzeniem wydajnych systemów ekspresji, dzięki którym białko rekombinowane może stanowić ponad 50% wszystkich białek obecnych w komórce gospodarza, ale też jest podatne na wytrącanie w postaci ciał inkluzyjnych.

Wyzwaniem jest przekształcenie nieaktywnego i nierozpuszczalnego białka zawartego w ciałkach

inkluzyjnych do postaci prawidłowo sfałdowanego, czynnego biologicznie produktu.

Ograniczenia …

Nie istnieje uniwersalny protokół odzyskiwania białek z ciałek inkluzyjnych i ich renaturacji. Każde białko wymaga doświadczalnego dobrania optymalnych warunków, na które składają się: wyjściowe stężenie białka, pH, temperatura, czas, siła jonowa, odpowiednio dobrany układ red-ox, ewentualna obecność kofaktorów i innych dodatków.

W przypadku produkcji przemysłowej decydujące znaczenie ma koszt uzyskania czystego, natywnego białka: wybrany sposób fałdowania in vitro musi być zatem wydajny i możliwy do zastosowania w dużej skali.

Jak oczyścić i rozpuścić ciała inkluzyjne?

Ciała inkluzyjne zawierają przede wszystkim białko, które uległo nadekspresji ale również pewną ilość zanieczyszczeń w postaci IBPs, białek błonowych, polime-razy RNA, rRNA oraz DNA plazmidowego.

Oczyszczone ciała inkluzyjne, śr. 0,5–0,8µm (SEM)

Obecność niektórych z makromolekuł może być wynikiem ko-precypitacji z białkiem rekombinowanymi, do większości zanieczyszczeń dochodzi jednak w trakcie lizy komórek gospodarza.

Izolacja ciałek inkluzyjnych • usunięcie ściany komórkowej (lizozym), rozbicie komórek

(homogenizacja, sonifikacja), usunięcie DNA (DNAza), usunięcie białek błonowych (detergent, wysokie stężenie soli).

• wirowanie (ciałka inkluzyjne ze względu na dużą gęstość – ok. 1,3 mg/ml – osadzają się na dnie, pozostałości komórek są usuwane razem z nadsączem).

• przemywanie (opcjonalnie) – zawieszenie w buforze z dodatkiem mocznika, glukozy lub detergentu, w celu usunięcia pozostałych powierzchniowych zanieczyszczeń.

Jak oczyścić i rozpuścić ciała inkluzyjne?

Rozpuszczanie ciał inkluzyjnych

W celu rozpuszczenia ciałek inkluzyjnych stosuje się najczęściej najmocniejszy z czynników denaturujących – 6 M chlorowodorek guanidyny (GuHCl) lub 8 M mocznik.

Reszty cystein obecne w białkach cytozolu występują zwykle w postaci zredukowanej, jednak w trakcie lizy komórek oraz izolacji ciałek inkluzyjnych dochodzi do ich utlenienia pod wpływem powietrza, w wyniku czego w obrębie cząsteczki białka lub pomiędzy różnymi łańcuchami polipeptydowymi tworzyć się mogą wiązania disiarczkowe. Aby zapobiec niespecyficznemu powstawaniu wiązań S-S do buforu dodawane są związki redukujące. Do najczęściej używanych zalicza się DTT, DTE oraz β-merkaptoetanol.

Oczyszczanie przed renaturacją

Na ogół ilość zanieczyszczeń obecnych w roztworze po izolacji i rozpuszczeniu ciałek inkluzyjnych jest mała i nie zaburza kolejnego etapu pracy, jakim jest renaturacja białka rekombinowanego. Jednak w niektórych przypadkach obecność zanieczyszczeń w postaci białek lub fragmentów DNA gospodarza prowadzi do wytrącania białka podczas refałdowania i w takiej sytuacji konieczne jest doczyszczenie zdenaturowanego białka.

Oczyszczanie przed renaturacją zalecane jest również wtedy, gdy proces renaturacji monitorowany jest przy pomocy: • spektroskopii fluorescencji • spektroskopii CD • DLS (dynamic light scattering)

Kontrola wydajności

Inne metody oceny wydajności renaturacji to: • pomiary turbidancji (przy dł. fali 450 nm) • pomiary aktywności np. enzymatycznej

W tym celu stosuje się: • RPHPLC • IMAC

Refałdowanie w roztworze

W układzie w którym znajduje się rozpuszczone, zdenaturowane białko rekombinowane zachodzą dwa konkurencyjne procesy:

Agregacja jest reakcją drugorzędową – oznacza to, że jej szybkość zależy od początkowego stężenia białka. Proces fałdowanie jest reakcją pierwszorzędową – nie zależy od wyjściowego stężenia białka a jedynie od czasu.

Podczas refałdowania stosuje się stężenia białek rzędu 10–50 µg/ml

Uniesfałdowane ↔ Iforma pośrednia ↔ Nnatywne

• fałdowanie do postaci natywnej (pożądane) • agregacja (niepożądana)

U ↔ I ↔ N

↕

I1 ↔ I2 → Pprecypitat

Sekwencja ma znaczenie…

Zachowanie białek w procesie refałdowania zależy od ich sekwencji aminokwasowej, a zatem może być modyfikowane za pomocą technik inżynierii genetycznej. Na polepszenie wydajności procesu fałdowania wpływa między innymi zmiana pI oraz hydrofobowości białka. Inne modyfikacje obejmują przyłączenie do białka rekombinowanego sekwencji poli-peptydowej pochodzącej z innego białka.

Wiele białek zanim poddane zostaną ostatecznej obróbce potranslacyjnej zawiera sekwencje aminokwasowe, które ułatwiają fałdowanie i przyjęcie właściwej konformacji przestrzennej, w tym również tworzenie wiązań disiarczkowych pomiędzy odpowiednimi parami reszt cysteinowych.

Niektóre białka występujące w formie natywnej w postaci hetero-oligomerów ulegają właściwemu fałdowaniu jedynie w obecności pozostałych składników kompleksu (np. hemoglobina).

Przeniesienie białka z buforu denaturującego do buforu renaturującego

dializa gwałtowne rozcieńczenie stopniowe rozcieńczenie

Jak można ograniczyć agregację?

1. Obniżając wyjściowe stężenie zdenaturowanego białka

2. Wprowadzając odpowiedni system red-ox

3. Dodając odpowiednie rozpuszalniki (artificial chaperones)

4. Zmieniając pH roztworu

5. Obniżając siłę jonową roztworu

6. Obniżając temperaturę

7. Dodając właściwe białka opiekuńcze

Renaturacja w warunkach utleniających

Zanim dojdzie do opracowania metody renaturacji określonego białka rekombinowanego należy sprawdzić czy w swojej natywnej formie zawiera ono mostki disiarczkowe.

Teoretyczna ilość możliwych kombinacji przy tworzeniu wiązań S-S rośnie eksponencjalnie wraz z ilością reszt cysteinowych obecnych w białku.

W rzeczywistości jednak jest ona znacznie niższa, gdyż wejście na właściwą ścieżkę fałdowania jest korzystne energetycznie. Proces ten jest wspomagany przez izomerazy wiązań disiarczkowych, które redukują nieprawidłowo utworzone wiązania i promują powstawanie nowych.

W układzie in vitro utlenianie i redukcja reszt cysteinowych możliwa jest dzięki wprowadzeniu odpowiedniego układu redox. Stanowią go zwykle pary: • utleniony glutation/zredukowany glutation • cystyna/cysteina

• cystamina/cysteamina

zredukowany glutation

cystyna

cystamina

Renaturacja w warunkach utleniających

Substancje korzystnie wpływające na fałdowanie białek in vitro (artificial chaperones)

Niskocząsteczkowe związki, które w przypadku niektórych białek mogą prowadzić do zwiększenia wydajności renaturacji. Działają jako czynniki wspomagające rozpuszczalność i stabilność zdenaturowanego białka, produktów pośrednich renaturacji oraz białka w formie natywnej. Zapobiegają agregacji. Substancje denaturujące (w niskim stężeniu) • GuHCl (1M) • mocznik (2M) • alkohole • amidy kwasów karboksyl. (acetamid, propioamid)

Związki zaangażowane w oddziaływania hydrofobowe • polietylenglikol • detergenty

Aminokwasy • L-Arg

(0,4–1,2 M)

Osmolity • polialkohole • cukry • tlenek trimetyl- aminy (TMAO)

Kofaktory

Białka opiekuńcze i foldazy

Dla białek, których strukturalna integralność zależy od obecności grup prostetycznych lub jonów metali, zachodzi konieczność dodania odpowiednich kofaktorów do buforu, w którym prowadzona jest renaturacja. W przypadku białek oddziałujących z DNA, ATP, NAD(P)H zamiast w/w związków bywa wykorzystywany pirofosforan (PPi).

Dodatek białek opiekuńczych (GroEL/ES, DnaK) oraz foldaz znacząco zwiększa wydajność renaturacji in vitro, jednak wykorzystanie tych białek w procesach prowadzonych na skalę przemysłową podnosi bardzo koszty produkcji i z tego powodu nie jest stosowane.

Temperatura Optymalna temperatura dla procesu refoldingu białek in vitro jest znacząco niższa niż w warunkach fizjologicznych i zawiera się w przedziale od 5 do 15°C.

Refałdowanie na podłożach stałych

Trzy różne podejścia 1. Przejściowe związanie zdenaturowanego białka z podłożem a następnie

stopniowe usuwanie czynnika denaturującego 2. Usunięcie czynnika denaturującego poprzez sączenie molekularne 3. Immobilizacja substancji „katalizującej” fałdowanie białka na złożu

Ad.1 Przyłączenie zdenaturowanego białka do złoża (IEC, IMAC, AC) ma tę główną zaletę, że zapobiega agregacji – cząsteczki białka są od siebie odseparowane w trakcie renaturacji. Metoda ta może być łatwo zautomatyzowana i wykorzystana w procesach przemysłowych.

Ad.2 Zdenaturowane białko o większym promieniu hydrodynamicznym niż

GuHCl lub mocznik szybciej przemieszcza się na kolumnie, dzięki czemu stopniowo wchodzi w strefę o coraz niższym stężeniu substancji denaturującej co sprzyja jego fałdowaniu. Ograniczeniem metody jest konieczność bardzo starannego doboru warunków refałdowania: gradientu substancji denaturującej, objętości buforu, szybkość przepływu oraz możliwość zatkania kolumny przez agregaty białkowe.