Upload
others
View
5
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
28/10/2017
1
Dr Sabrina Boutefnouchet, Maître de ConférencesLaboratoire de Pharmacognosie,
Chimie des Substances NaturellesFaculté de Pharmacie
Université Paris-Descartes
Introduction à la Introduction à la phytochimiephytochimie, Méthodes , Méthodes innovantes d’extraction, de purification et innovantes d’extraction, de purification et
d’identification des composés d’identification des composés ((déréplicationdéréplication))
Introduction à la Introduction à la phytochimiephytochimie, Méthodes , Méthodes innovantes d’extraction, de purification et innovantes d’extraction, de purification et
d’identification des composés d’identification des composés ((déréplicationdéréplication))
Introduction à la Introduction à la phytochimiephytochimie :: les métabolites primaires et secondairesles métabolites primaires et secondaires
Méthodes appliquées à l’étude Méthodes appliquées à l’étude phytochimiquephytochimique : : Extraction, Extraction, Méthodes analytiques préliminairesMéthodes analytiques préliminairesPurification, Purification, identification des composés, identification des composés, déréplicationdéréplication
28/10/2017
2
Introduction à la Introduction à la PhytochimiePhytochimie
Phytochimie = Chimie des substances naturelles : Etude du métabolisme, de la structure, du rôle des substances produites par les végétaux
Pharmacognosie : Connaissance des matières premières à propriétés médicamenteuses
Méthodes de la Pharmacognosie et de la Chimie Méthodes de la Pharmacognosie et de la Chimie des substances des substances Naturelles (Naturelles (PhytochimiePhytochimie) )
Méthodes Méthodes analytiquesanalytiques
Méthodes Méthodes séparatives :séparatives :Purification, Purification,
IsolementIsolement
Méthodes Méthodes extractivesextractives
Analyses structurales :Spectroscopie par résonance magnétique (RMN)
Spectrométrie de Masse (SM)
Extractions classiques Nouveaux procédés d’extraction
Méthodes chromatographiques
Cristallisation
Méthodes chromatographiques-Chromatographie Couche Mince (CCM)- Chromatographie Liquide Haute Performance HPLC- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)
28/10/2017
3
métabolites primaires : essentiels, ubiquitaires
• structure
• métabolisme énergétique
sucres, lipides,
• autres fonctions essentielles à la survie et à
la reproduction
acides nucléiques, protéines
métabolites secondaires : spécialisés, inconstants,
diversité chimique importante
Chimie Chimie des substances des substances Naturelles :Naturelles :Connaissance des Métabolites primaires et secondairesConnaissance des Métabolites primaires et secondaires
Classés selon leur voies de biogénèse : classification biogénétique= selon leurs précurseurs chimiques
PyruvatePyruvateAcide Acide ShikimiqueShikimique
PolysaccharidesPolysaccharides
AcétylAcétyl--CoACoA
MalonylMalonyl--CoACoAAcides aminésAcides aminésAromatiquesAromatiques
ProtéinesProtéines Acides gras => lipidesAcides gras => lipides
O
O
OHSCA
O
COOH
OH
OH
HO
Acides aminésAcides aminés
De structure : ex. celluloseDe réserve : ex. amidon
Glycolyse
CO2, H2O
PHOTOSYNTHESE
O2
Bases puriques, pyrimidiquesBases puriques, pyrimidiquesNucléotidesNucléotidesADN, ARNADN, ARN
Sucres C3Sucres C3
Sucres C5 ribose Sucres C5 ribose
Sucres C6Sucres C6
Cycle de Krebs
-CO2
+CO2
O
OHHO
HO
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
Sucres simples, oligosaccharidesSucres simples, oligosaccharidesAcides organiquesAcides organiques
Une véritable «Une véritable « Usine ChimiqueUsine Chimique » : 1/ Métabolites Primaires» : 1/ Métabolites Primaires
NH2
R
O
OH
HN
N
N
O
N
O
OH OH
H HH H
OH
COOH
RO
NH2
OH
28/10/2017
4
PyruvatePyruvateAcide Acide ShikimiqueShikimique
AcétylAcétyl--CoACoA
MalonylMalonyl--CoACoAAcides aminésAcides aminésAromatiquesAromatiques
O
O
OH SCoA
O
COOH
OH
OH
HO
Acides aminésAcides aminés
--COCO22
+CO+CO22
MévalonateMévalonate
TerpènesTerpènes
HO
HO O
OH
Composés Composés phénoliquesphénoliques
PolyacétatesPolyacétates
AlcaloïdesAlcaloïdes
Une «Une « Usine ChimiqueUsine Chimique »»Métabolites «Métabolites « Secondaires»Secondaires»
GlucosinolatesGlucosinolates
MesoMeso--erythritolerythritolPhosphatePhosphate
(MEP)(MEP)
R1
NR3R2
NH2
R
O
OH
RO
NH2
OH
OH
R
R
R
TerpènesTerpènes
Composés Composés phénoliquesphénoliques
PolyacétatesPolyacétates
AlcaloïdesAlcaloïdes
GlucosinolatesGlucosinolates
Acides aminésAcides aminésProtéinesProtéines
Acides gras => lipidesAcides gras => lipides
Bases puriques, pyrimidiquesBases puriques, pyrimidiquesNucléotidesNucléotidesADN, ARNADN, ARN
Sucres simples, oligosaccharidesSucres simples, oligosaccharidesAcides organiques, polysaccharidesAcides organiques, polysaccharides
28/10/2017
5
polymères de sucres : oligosaccharides et polysaccharideslinéaires, ramifiés
O
OHHOO
OH
O
structure (parois), stockage
O
OHHOO
OH
O O
HO
OH
O
OH
HOOC
O OHO
HOOC
OH
H
OH
Acides uroniques : sucres avec fonction acides
HO O
HOOSO3
-
HO
Sucres sulfatéssucres avec fonctions sulfates (algues)
O
OH
H3COOC
O OHO
H3COOC
H
OH
Esters méthyliquesPectines (degré de méthylation variable)
polysaccharides homogènesPolymère de glucose = glucanePolymère de galactose = galactanePolymère de mannose = mannane
Polymères hétérogènes :Galoctose + mannose = galactomannaneGlucose + mannose = glucomannane etc....
linéaire
ramifié
1 – Les Polysaccharides
Psyllium, IspaghulPlantago psyllium, P. ovataPlantaginaceaeHétéroxylane : Xylose-Arabinose-a-D-galacturonyl(1->4)xylose
Avoine (Fruit)Avena sativaPoaceaeb-glucane : (1->3),(1->4)-b-D-glucose
Konjac (tubercule)Amorphophallus konjacAraceaeGlucomannane : b-(1->4) gluco-b-(1->4) mannose
1 1 –– Les PolysaccharidesLes PolysaccharidesPolysaccharides de réserve (graines, racines, tubercules)Polysaccharides de réserve (graines, racines, tubercules)
Gomme guar = graine broyée de CyamopsistetragonoglobusFabaceaeGalactomannane : a-(1->6)-galacto-b-(1->4) mannose
Chicorée (Racine)Cichoriumintybus, AsteraceaeFructosane = inuline
28/10/2017
6
1 1 –– Les PolysaccharidesLes PolysaccharidesPolysaccharides d’alguesPolysaccharides d’algues
alginates / acide alginiques :
Laminaria, Ascophyllum, Macrocystis,
Fucus
polymères linéaires d’acide D-
mannuronique ou L-guluronique
agarose, « agar-agar »
Gelidium (Gelidaceae), Gracilaria
(Gracilariaceae)
Polymères linéaires de D- et L-
galactose, - liés en 13, 14,
carraghénanes
Chondrus crispus
Polymères linéaires de
galactoses mono ou
poly-sulfatés, parfois
anhydro.
O O
O
O
HOOH
OSO3HO
O3SOO
OSO3
κ-carraghénane
λ-carraghénane
soluble eau chaude, gélifiant
Soluble à froid, non gélifiant
AcétylAcétyl--CoACoA
MalonylMalonyl--CoACoA
Acides grasAcides gras
OH
O
+CO2
33 -- Acides gras Acides gras –– Huiles végétalesHuiles végétales
O
O
O
CO
CO
CO
Triglycérides
Lécithines = Phosphatidyl cholines
Fraction saponifiable (> 90%)
Fraction insaponifiable
ǂ esters d’acides gras
Pigments : CaroténoïdesTocophérols (vit E)PhytostérolsPolyphénolsSqualèneEtc…
O
O
CO
CO
OH
CiresCOOH
28/10/2017
7
2 – Acides gras Graines et fruits oléagineux, sources d’huiles végétales, exemples
Olive Argan
g/100gg/100g Lin Colza Tournesol Olive Calophylle
Argan Palme Karité Ricin
AGAG saturéssaturés 9.4 7.3 10.3 13.8 32.5 - 49.3 28-45 90% acide ricinoléique
AG monoAG mono--insaturésinsaturés
20.2 63.2 19.5 73 36 43 37 42-60
AG AG polypoly--insaturésinsaturés
66 28.1 65.7 10.5 25.6 36 9.3 3-9
InsaponifiableInsaponifiable - Phytostérols
Phytostérols
PolyphénolsStérols Caroténoides
Phytostérolsautres
0.3-0.8 Caroténoïdes
7-10
LinLinus usitatissimumLinaceae
ColzaBrassica napusBrassicaceae
TournesolHelianthusannusAsteraceae
OliveOlea europeaeOleaceae
CalophylleCalophylleCalophyllum InophyllumClusiaceae
PalmePalme
KaritéKaritéVitellariaParadoxaSapotaceae
ArganArganArgania spinosaSapotaceae
RicinRicinRicinuscommunisEuphorbiaceae
PalmePalmeElaeis guineensisArecaceae
33–– Acides aminés protéinesAcides aminés protéines
FenugrecTrigonella foenum-graecumFabaceae
SojaGlycine maxFabaceae
GriffoniaGriffonia simplicifoliaFabaceaeSource de 5-HTP = 5-hydroxytryptophanePrécurseur de sérotonine
Pois MascateMucuna pruriensFabaceaeSource de L-DOPA =DihydroxyphenylalaninePrécurseur de Dopamine
Fabaceae sources d’acides aminés précurseurs de neurotransmetteurs
Fabaceae sourcesDe protéines
28/10/2017
8
Composés azotés Composés azotés : Pseudo: Pseudo--AlcaloïdesAlcaloïdesBases PuriquesBases Puriques
N
N N
N
O
O
R3
R2
R1
Caféine : R1, R2, R3 = CH3
Théobromine : R1=H, R2, R3= CH3
Théophylline : R1,R2=CH3, R3= H
HN
N
N
O
N
O
OH OH
H HH H
OH
Inosine monophosphate IMP
Caféine : Stimulant SNCLipolytique
Caféine 3,6-5,8
Théobromine
0.02-0.06
Théophylline
-
MateIlexparaguaiensisAquifoliaceae
Caféine 0,2-2%
Théobromine
0.4-0.9
Théophyllin -
GuaranaGuaranaPaulliniaPaullinia guaranaguaranaSapindaceaeSapindaceae
ThéThéCamellia Camellia sinensissinensisTheaceaeTheaceae
KolaKolaCola Cola nitidanitida, , MalvaceaeMalvaceae
Caféine 1-3%
Théobromine
-
Théophylline
Caféine 2-4%
Théobromine
Théophylline
CaféCaféCoffeaCoffea spsp..RubiaceaeRubiaceae
Caféine 1-2,5%
Théobromine
traces
Théophylline
-
CacaoTheobromacacaoMalvaceae
Caféine 0.03-0.2
Théobromine
1-3%
Théophylline
-
28/10/2017
9
TerpènesTerpènes
Composés Composés phénoliquesphénoliques
PolyacétatesPolyacétates
AlcaloïdesAlcaloïdes
GlucosinolatesGlucosinolates
Acides aminésAcides aminésProtéinesProtéines
Acides gras => lipidesAcides gras => lipides
Bases puriques, pyrimidiquesBases puriques, pyrimidiquesNucléotidesNucléotidesADN, ARNADN, ARN
Sucres simples, oligosaccharidesSucres simples, oligosaccharidesAcides organiques, polysaccharidesAcides organiques, polysaccharides
TerpènesTerpènes
Composés Composés phénoliquesphénoliques
PolyacétatesPolyacétates
AlcaloïdesAlcaloïdes
GlucosinolatesGlucosinolates
AcidesAcides--phénolsphénols
LignanesLignanes
FlavonoidesFlavonoides
AnthraquinonesAnthraquinones
CoumarinesCoumarines
Dérivés du phénylpropane
Origine mixte
Dérvés de l’acétate
TaninsTanins
StilbènesStilbènes
28/10/2017
10
OH
OHHO
COOH
COOH
OH
R
COOH
OH
OH
HO
acide shikimique
R = H : acide cinnamiqueR = OH : acide caféique
acide gallique
tanins galliques et ellagiques (= hydrolysables)
Dérivés du Phénylpropane (C6-C3)Acides PhénolsLignanesCoumarines
Origine MixteFlavonoïdesFlavonoïdesIsoflavonoidesAnthocyanesStilbénoïdesXanthones
tanins catéchiques(condensés)
COOH
NH2
OH
tyrosine
1234
56
1
2 3
Dérivés du Dérivés du phénylpropanephénylpropane : issus de la voie du : issus de la voie du shikimateshikimate
Tanins
Structure Phényl-propane
C6-C3
Dérivés du Dérivés du phénylpropanephénylpropane : Acides: Acides--phénols esters de l’acide caféiquephénols esters de l’acide caféique
COOHHO
HOAcide caféique
HO
HO
O
O
HOOC O
OH
OH
OH
OH
OAcide Chlorogénique Acide dicaffeyl-quinique
= Cynarine
Artichaut (feuille),Cynara scolymus,AsteraceaeDigestion (cholérétique, cholagogue)
HO
HO
O
O
HOOC OH
OH
OH
Café (graine),Coffea sp.,Rubiaceae
HO
HO
O
OCOOH
OH
OH
Acide Rosmarinique
Romarin (feuille),Rosmarinus officinalisLamiaceae
Autres Lamiaceae :Melisse, Menthe, Lavande, etc…« Tanins des Labiées »
AntioxydantsCholérétiques, cholagogues
28/10/2017
11
Mélilot,Melilotusofficinalis,FabaceaeVeinotonique, sédatif
Composés phénoliques dérivés du Composés phénoliques dérivés du phénylpropanephénylpropane ::Coumarine volatileCoumarine volatile
Fève Tonka,DipterixodorataFabaceae
Cannelier de Chine, Cinnamomumcassia +++(Cannellier de Ceylan, Cinnamomum verum J. Presl., = C. zeylanicum Nees, très peu)
Odeur de « Foin »Inodore
!! PhotosensibilisantesDermites de contact…cancers cutanés
O O
furocoumarinesApiaceae, Rutaceae
RO
coumarines
OPP
O O
Sites de Prénylation :Liaison à une unité isoprénique
O
Coumarines Coumarines prényléesprénylées
Angélique officinale, (fruit, racine)(Tiges comestibles)Angelica archangelicaApiaceae
Bergamote (fruit)Citrus bergamiaRutaceaeAmmi sp.
Ammi majus, Ammi visnagaApiaceae
O OO
O
xanthotoxine8-Methoxypsoralène
O OO
O
Bergaptène5-Methoxypsoralène
=>Débergapténisation
PUVAthérapieVitiligo, Psoriasis
!! Interactions médicamenteuses Pamplemousse liées à la présence de furocoumarines
28/10/2017
12
Composés phénoliques dérivés du Composés phénoliques dérivés du phénylpropanephénylpropaneLignanesLignanes
Lin (graine)Linum usitatissimumLinaceaeLignanes(secoisolaricirésinol, matairésinol)PhytoestrogènesSchisandra, graine aux 5 saveurs
Schisandra sinensisLignanesSchisandrine et dérivésAdaptogène
TerpènesTerpènes
Composés Composés phénoliquesphénoliques
PolyacétatesPolyacétates
AlcaloïdesAlcaloïdes
GlucosinolatesGlucosinolates
AcidesAcides--phénolsphénols
LignanesLignanes
FlavonoidesFlavonoides
AnthraquinonesAnthraquinones
CoumarinesCoumarines
Dérivés du phénylpropane
Origine mixte
Dérvés de l’acétate
TaninsTanins
StilbènesStilbènes
28/10/2017
13
Composés phénoliques : Composés phénoliques : Origine MixteOrigine Mixte
COOH
OH
OHacide caféique
OH
O
acide acétique
métabolites mixtes phénylpropaniques / acétiques
O
OOH
HO
OH
OH
OH
flavonoïdes
quercétol
O
O
HO
OHOH
génistéine
tanins condensés
isoflavonoïdes
OH
HO
OH
resvératrol
stilbénoïdes
23
23
FlavonoidesFlavonoides largo sensulargo sensu
FlavonoidesFlavonoidesstricto sensustricto sensu
26
OOH
HO
OH
R
O
OH
HO
OH
R
OH
chalcone
anthocyane
flavonolflavone
flavanonedihydroflavonol
aurone(rare)
R = H : kaempférolR = OH : quercétol
Flavonoïdes : structuresFlavonoïdes : structures
O
OOH
HO
OH
R
colorationflavan-3-ol
O
OH
HO
OH
R
OH
28/10/2017
14
O
OOH
HO
OH
OH
123456
78
Ose
Ose
Ose
Ose
Ose
OH
Sous forme génine = aglycone, ne sont pas substitués par une partie osidique (sucres). Ils sont apolaires.
Les formes hétérosidiques sont très fréquemment retrouvées. Différentes positions peuvent être substituées par une partie osidique plus ou moins complexe.
Les hétérosides présentent une solubilité très différente des génines, ils sont beaucoup plus polaires. Cf §Extraction
Flavonoïdes : structuresFlavonoïdes : structures
C-hétérosidesO-hétérosides
Flavonoïdes : Flavonoïdes : FlavonesFlavones, exemples, exemples
Sophora (fleur)Stiphnolobium japonicumFabaceaeVeinotonique
Très répandus, présents dansTrès répandus, présents dansde nombreuses espèces de nombreuses espèces
alimentairesalimentaires
28/10/2017
15
Ecorces de fruits de CitrusCitrus spRutaceaeveinotonique
Nom latin Nom français
Citrus aurantium L. Oranger amer=Bigaradier
Citrus sinensis Oranger doux
Citrusxclementina Clémentine
Citrus reticulata Mandarine
Citrus limon Citron
Citrus maxima, Citrus x paradisi Pamplemousse
Citrus bergamia Bergamote
Flavonoïdes : Flavonoïdes : CitroflavonoïdesCitroflavonoïdes -- flavonesflavones et et flavanonesflavanones
Exemples : sources de catéchines (Exemples : sources de catéchines (flavanflavan--33--olol))
Thé vert (feuille)Camelia sinensisTheaceae
Cacao (graine)Theobroma cacaoMalvaceae (Sterculiaceae)
R1 R2
(-)-épicatéchine EC OH H
(-)-Epigallocatéchine EGC OH OH
(-)- Epicatéchine gallate ECG
Galloyl
H
(-)-Epigallocatéchine Gallo OH
R1 R2
(+)-catéchine C OH H
(+)-gallocatéchine GC OH OH
(+)- Gallocatéchinegallate GCG
Galloyl
H
28/10/2017
16
Flavonoïdes : Propriétés
• Rôles variés :
Signalisation / facteurs de transcription chez les végétaux
Coloration (fleurs, nombreux fruits - anthocyanes) : attraction de pollinisateurs
Communication chimique
Caractère antioxydant, photoprotecteur
Métabolites défensifs
• Propriétés biologiques
-Veinotoniques (inhibition de la COMT au niveau veineux) - Données Cliniques
- Antioxydants
-Antiinflammatoires (diminution de la production de cytokines pro-inflammatoires)
31
Flavonoïdes : propriétés Flavonoïdes : propriétés antioxydantesantioxydantesGroupements impliqués dans l’activité Groupements impliqués dans l’activité antioxydanteantioxydante
Quercétine
Williams et al., 2004
Activités antiradicalairesChélation des ions métalliques
Groupement catéchol
28/10/2017
17
Anthocyanes, anthocyanosides – Variation de la couleur en fonction du
pH (flavonoïdes largo sensu)
O
OH
HO
OH
R
OH
A B
C
Vigne rouge, Vitisvinifera var.
tinctoria, Vitaceae (feuille)
34
Anthocyanes, anthocyanosides
Emploi : veinotonique
Bleuet (fleur)Centaurea cyanusAsteraceaeAstringent
Sureau noir (fleurs, fruits, écorce)Sambucus nigraAdoxaceaesudorifique
Airelle-Myrtille (feuilles, fruits)Vaccinium vitis-idaeVaccinium corymbosumEricaceaeVeinotonique, « antioxydant »
28/10/2017
18
Kudzu (racine)Pueraria lobataFabaceaePropriétés phytoestrogéniquesSevrage alcoolique
Plantes à Plantes à isoflavonesisoflavones ((FlavonoidesFlavonoides largo sensu)largo sensu)FabaceaeFabaceae +++ +++
Soja (Graine)Glycine max
Système hormonal féminin
R1 R2
Daidzéine H H
Glycitéine OCH3 H
Génistéine H OH
R1 R2 R3
Génistine H OH H
Glycitine OCH3 H H
Daidzine H H H
Malonyl-génistine
H OH COCH2COOH
Malonyl-glycitine
OCH3 H COCH2COOH
Malonyl-daidzine
H H COCH2COOH
Acétyl-génistine
H OH COCH3
Acétyl-glycitine
OCH3 H COCH3
Acétyl-daidzine
H H COCH3
aglycones
Formes glycosylées
O
O
HO
OHR2
R1
O
OOH
R2
R1
O
H
HO
H
HO
H
OOHH
H
OR3
TerpènesTerpènes
Composés Composés phénoliquesphénoliques
PolyacétatesPolyacétates
AlcaloïdesAlcaloïdes
GlucosinolatesGlucosinolates
AcidesAcides--phénolsphénols
LignanesLignanes
FlavonoidesFlavonoides
AnthraquinonesAnthraquinones
CoumarinesCoumarines
Dérivés du phénylpropane
Origine mixte
Dérivés de l’acétate
TaninsTanins
StilbènesStilbènes
28/10/2017
19
Proanthocyanidines (PAC) = Oligomères procyanidoliques (OPC)
Tanins condensés
O
OHOH
HO
OH
OH
O
OHOH
HO
OH
OH
O
OH
OH
HO
OH
OH
O
OHOH
HO
OH
OH
O
OHOH
HO
OH
OH
HO
O
OH
HO
O
OH
Cassis (Feuille, fruit)Ribes nigrumGrossulariaceaeProanthocyanidines =ProdelphininesVeinotonique, antiinflammatoire
Oligomères : liaison de 2 ou 3 unités anthocyane
Type A ou Type B
Vaccinium oxycoccus(airelle canneberge, canneberge ou atocas)Europe
Vaccinium macrocarpon(airelle à gros fruits, canneberge à gros atocasAmerican CranberryAmérique du Nord
Inhibent l’adhésion d’E. coli Au niveau urinaire
Type A
Type B
38
Dérivés de l’acide gallique tanins « hydrolysables » : Esters
punicallagine
GrenadePunica granatum(Lythraceae)
Galle du Chêne :
Tumeur formée à la suite d’une piqûre d’insecte, riche en tanins hydrolysables
Colorant, veinotonique
Acide gallique Acide ellagique
Les molécules d’acide gallique sont fixée à une molécule de glucose
28/10/2017
20
TerpènesTerpènes
Composés Composés phénoliquesphénoliques
PolyacétatesPolyacétates
AlcaloïdesAlcaloïdes
GlucosinolatesGlucosinolates
AcidesAcides--phénolsphénols
LignanesLignanes
FlavonoidesFlavonoides
AnthraquinonesAnthraquinones
CoumarinesCoumarines
Dérivés du phénylpropane
Origine mixte
Dérivés de l’acétate
TaninsTanins
StilbènesStilbènes
Composés phénoliques issus de la voie des acétatesComposés phénoliques issus de la voie des acétates
O O O
HO
O O O O
SCoA
HOOC
O
SCoA
O
SCoA
x7
Acétyl-CoA x 1
OHOHOH
HO
anthrone
anthraquinone(i.e. forme oxydée)
OHOOH
HO
O
SCoA
O
O
O
OH
OHHO
O
O O
Phloroglucinol
Malonyl-CoA
+
x3
Phlorotannins des alguesPhloroglucinols prénylés, acylés...
28/10/2017
21
O OHOH
O
b-D-GlucoseH
Aloïne A
a-L-Rhamnose
Aloès (suc)
Aloe spp. (ex : A. ferox,
Aloès du cap = A.
barbadensis = A. vera (suc)
Asphodelaceae,
Xanthorrhoreaceae
41
COO
OOC
O
O
O
HO
O
OH
OHOse
OHOse
Ose
Ose
séné de l’Inde (foliole, gousse)Cassia angustifoliaFabaceae
Bourdaine, (écorce)Rhamnus frangulaRhamnaceaeanthrones
O
O
O
O
OHGlc-b-D
Rha-a-L
glucofranguline A
44--Composés phénoliques issus de la voie des acétatesComposés phénoliques issus de la voie des acétatesPlantes à Plantes à hydroxyanthracéniqueshydroxyanthracéniques laxatifs stimulantslaxatifs stimulants
sennosides
TerpènesTerpènes
Composés Composés phénoliquesphénoliques
PolyacétatesPolyacétates
AlcaloïdesAlcaloïdes
GlucosinolatesGlucosinolates
Acides aminésAcides aminésProtéinesProtéines
Acides gras => lipidesAcides gras => lipides
Bases puriques, pyrimidiquesBases puriques, pyrimidiquesNucléotidesNucléotidesADN, ARNADN, ARN
Sucres simples, oligosaccharidesSucres simples, oligosaccharidesAcides organiques, polysaccharidesAcides organiques, polysaccharides
28/10/2017
22
TerpènesTerpènes
Composés Composés phénoliquesphénoliques
PolyacétatesPolyacétates
AlcaloïdesAlcaloïdes
GlucosinolatesGlucosinolates
MonoterpènesMonoterpènesIridoïdesIridoïdes
DiterpènesDiterpènes
TriterpènesTriterpènes
SesquiterpènesSesquiterpènes
Dérivés Dérivés terpéniques terpéniques
Les dérivés terpéniques sont issus de l’unité isoprène (5 atomes de carbone = C5), l’association de plusieurs unités isopréniquesaboutit à plusieurs classes de composés.
OPP
OPP
diméthylallyldiphosphate
isopentényldiphosphate
unités en C5 : isoprènes"activés" x2
monoterpènes : C10
diterpènes : C20
x2
tétraterpènes : C40
triterpènes : C30
sesquiterpènes : C15
x2x3
stérols, saponosides
composants d'huiles essentielles
chlorophylles,résines, latex...
caroténoïdes
lactones sequiterpéniques
P
O
OOO
OP
O
O
P
O
OOO
OP
O
O
P
O
OOO
OP
O
O
iridoïdes
28/10/2017
23
MonoterpènesMonoterpènes –– Cyclisation d'un précurseur en Cyclisation d'un précurseur en C10C10
Iridoïdes: « Principes amers »
Iridoides et séco-iridoïdes
Gentianaceae, Oleaceae,…
Monoterpènesvolatiles :
Plantes aromatiques productrices d’huiles essentielles
Lamiaceae, Apiaceae, Myrtaceae, Pinaceae, Cupressaceae…
Cyclisation
P
O
OOO
OP
O
O
MonoterpènesMonoterpènes volatiles volatiles –– Huiles EssentiellesHuiles Essentielles
Synthèse des huiles essentielles : spécialisation de
structures
Gymnospermes : canaux à résine
Angiospermes : laticifères / poils / canaux sécréteurs /
autres structures glandulaires
Myrtaceae : poche schizogène
Rutaceae : poches sécrétrices schizolysigènes
Plusieurs familles aromatiques: poils sécréteursEx : Lamiaceae
28/10/2017
24
LavandeLavandula angustifolia Mill.Lamiaceae
Fleur
Feuille
Ecorces d’agrumesCitrus sp. Rutaceae
Fruits de carvi
CarviCarum carvi L.Apiaceae
MonoterpènesMonoterpènes volatiles : classification?volatiles : classification?
CHO
citronellal
CHO
neral
CHO
geranial
citrals
O
(-)-carvone (+)-3-thuyone
OO
(+)-camphre
OH
thymol
OH
carvacrol
( -) -a-pinène ( +) -b-pinène ( -) -limonène
OH
( -) -menthol
CH2OH
géraniol linalol
HO
a-terpineol
OH
OH
(-)bornéol
acétate de linalyle
AcO
OAc
(-)-acétate de bornyle
CH2OAc
acétate de géranyle
OAc
( -) acétate de menthyle
O
1,8-cinéole
Non fonctionnalisés
Alcools
Esters
Ether(oxyde)
Phénols
Cétones
Aldéhydes
28/10/2017
25
zeste ‘épicarpe et mésocarpe’ :HE à limonène + furocoumarines!
FleursHe = « HE de Néroli »Anthranilate de méthyle
FeuillesHe = « HE de Petit Grain Bigarade»
BigaradierBigaradierCitrus Citrus aurantiumaurantium spsp..
RutaceaeRutaceaeEucalyptus à 1,8-cinéole=« eucalyptol »Myrtaceae
E. globulus : 70-75%E. polybrachteaE. radiata : 62-72%
Thyms :Thymus vulgarisLamiaceaeCT (chimiotype)… À géraniolÀ linalolÀ paracymèneÀ thuyanolÀ thymol
ExemplesExemples
Autres Autres MonoterpènesMonoterpènes : Les : Les IridoïdesIridoïdes
O
O
O
HO
OOH
OHOH
HO
Iridoïdes : « Principes amers »
Essentiellement sous forme glycosylée. Ils ne sont pas volatils et ne se retrouvent donc pas dans les huiles essentielles.
Famille des Lamiacées,Verbénacées, Plantagnacées, Scrofulariées...
Propriétés antimicrobiennes, digestives, antiinflammatoires
P
O
OOO
OP
O
O
28/10/2017
26
O
O
O
HO
OOH
OHOH
HO
Plantes Plantes à à secoseco--IridoïdesIridoïdes
Gentiane jaune (racine),Gentiana luteaGentianaceae
Olivier (feuille)Olea europaeOleaceae
Petite CentauréeCentaurium erythreaGentianaceaeApéritive
swertiamarine
oleuropéine
gentiopicroside
O
HO OH
HO-Glc
O
O
harpagoside
Harpagophytum (racine secondaire),Harpagophytum procumbensPedaliaceaeAntiinflammatoire
Plantain (p aer),Plantago sp.PlantaginaceaeAntiinflammatoire
Plantes Plantes à à iridoïdesiridoïdes
O
H
O
O
O
O
O
O
O
Valériane (parties soputerraines),Valeriana officinalis, Caprifoliaceae, anc.-ValerianaceaeSédatif
O
HO OH
HO-Glc
AucubosideHO
Valépotriates
28/10/2017
27
Dérivés Dérivés terpéniques terpéniques
Les dérivés terpéniques sont issus de l’unité isoprène (5 atomes de carbone = C5), l’association de plusieurs unités isopréniquesaboutit à plusieurs classes de composés.
OPP
OPP
diméthylallyldiphosphate
isopentényldiphosphate
unités en C5 : isoprènes
x2
monoterpènes : C10
diterpènes : C20
x2
tétraterpènes : C40
triterpènes : C30
sesquiterpènes : C15
x2x3
stérols, saponosides
composants d'huiles essentielles
chlorophylles,résines, latex...
caroténoïdes
lactones sequiterpéniques
P
O
OOO
OP
O
O
P
O
OOO
OP
O
O
P
O
OOO
OP
O
O
iridoïdes
Sesquiterpènes Sesquiterpènes –– Cyclisation d'un précurseur en C15Cyclisation d'un précurseur en C15
O
Ogermacranolide
1
2
3 4
56 7
8
910
11
13
14
15
O
O
O
O
O
O
1
5
15
1
5
15
O
Oélémanolidepseudoguaianolide
guaianolide eudesmanolide
(-)-zingibérène
H
(-)-ß-bisabolène
P
O
OOO
OP
O
O
farnésyl-diphosphate
Lactones sesquiterpéniques : « Principes amers »
Famille des Astéracées+++
Pissenlit, Artichaut
Sesquiterpènes volatils :
Plantes aromatiques productrices d’huiles essentielles
Gingembre
Camomille, matricaire
Cyclisation
28/10/2017
28
Camomille romaine, capitulesChamamaelum nobileDigestion Digestion -- ORL ORL
Plantes à sesquiterpènes Plantes à sesquiterpènes –– Lactones Lactones sesquiterpéniquessesquiterpéniquesProduction d’azulènes : huiles essentielles bleuesProduction d’azulènes : huiles essentielles bleues
Matricaire, Camomille allemande
Matriarca chamomilla (Asteraceae)
activités anti-inflammatoires et anti-ulcéreuses
(-)-α-bisabolène
H
(-)-β-bisabolène
ProazuleneAzulène
Dérivés Dérivés terpéniques terpéniques
Les dérivés terpéniques sont issus de l’unité isoprène (5 atomes de carbone = C5), l’association de plusieurs unités isopréniques aboutit à plusieurs classes de composés.
OPP
OPP
diméthylallyldiphosphate
isopentényldiphosphate
unités en C5 : isoprènes
x2
monoterpènes : C10
diterpènes : C20
x2
tétraterpènes : C40
triterpènes : C30
sesquiterpènes : C15
x2x3
stérols, saponosides
composants d'huiles essentielles
chlorophylles,résines, latex...
caroténoïdes
lactones sequiterpéniques
P
O
OOO
OP
O
O
P
O
OOO
OP
O
O
P
O
OOO
OP
O
O
iridoïdes
28/10/2017
29
DiterpènesDiterpènes : précurseur C20: précurseur C20
Romarin (feuille),Rosmarinus officinalisLamiaceae
ColeusColeus forskolii(= Plectranthusbarbatus)Lamiaceae
Germandrée Petit-ChêneTeucrium chamaedrysLamiaceae=> Liste B, toxique
Carnosol, acide carnosiqueAntioxydants
ForskolineAmaigrissement
Teucrine A!! Diterpènes furaniquesHépatotoxiques
P
O
OOO
OP
O
O
Dérivés Dérivés terpéniques terpéniques
Les dérivés terpéniques sont issus de l’unité isoprène (5 atomes de carbone = C5), l’association de plusieurs unités isopréniquesaboutit à plusieurs classes de composés.
OPP
OPP
diméthylallyldiphosphate
isopentényldiphosphate
unités en C5 : isoprènes
x2
monoterpènes : C10
diterpènes : C20
x2
tétraterpènes : C40
triterpènes : C30
sesquiterpènes : C15
x2x3
stérols, saponosides
composants d'huiles essentielles
chlorophylles,résines, latex...
caroténoïdes
lactones sequiterpéniques
P
O
OOO
OP
O
O
P
O
OOO
OP
O
O
P
O
OOO
OP
O
O
iridoïdes
28/10/2017
30
TriterpènesTriterpènes : cyclisation d'un précurseur en C30: cyclisation d'un précurseur en C30
Formes hétérosidiques = saponosides(ou saponines)
Génines tetracycliques :stérols, stéroides...
Génines pentaycliquesTriterpénoïdes
A B
C D
A B
C DE
Génine Apolaire (Hydrophobe)Partie osidique Polaire(hydrophile)
Formes hétérosidiques = saponosides(ou saponines)
Propriétés tensio-actives, pouvoir moussant
28/10/2017
31
Lierre grimpant, Hedera helix, Araliaceae (bois)Expectorant, antispasmodique de la toux
O
O
O
b-D-Glc b-D-Glc a-L-Rha
Ara-a-LRha-a-LOH hédéracoside C
Réglisse Glycyrrhiza glabra
FabaceaeEdulcorant, antiulcéreux
expectorant
Acide glycyrrhizique = glycyrrhizine
génine : acide glycyrrhétique
édulcorant
mucolytique ; adoucissant
hyperaldostéronisme secondaire
TriterpènesTriterpènes : : exemplesexemples
TerpènesTerpènes
Composés Composés phénoliquesphénoliques
PolyacétatesPolyacétates
AlcaloïdesAlcaloïdes
GlucosinolatesGlucosinolates
Dérivés du tryptophane=Dérivés du tryptophane=AlcaloidesAlcaloides indoliquesindoliques
Dérivés de la tyrosine : Dérivés de la tyrosine : AlcaloidesAlcaloides isoquinoléiquesisoquinoléiques
Dérivés de la lysineDérivés de la lysine
Dérivés de l’Dérivés de l’ornithineornithine
28/10/2017
32
Composés azotés : AlcaloïdesComposés azotés : Alcaloïdesmétabolisme des acidesmétabolisme des acides--aminésaminés
N
indolizidines
N
quinolizidinesNH
pyridines
COOH
OH
OH
HO
acide shikimique
COOH
NH2
OH
L-tyrosine
NR
tétrahydro-isoquinoléines
COOH
NH2
NH
L-tryptophane
NH2
COOH
acide anthranilique
NH2
NH2
COOH
L-lysine
NH2NH2
COOH
L-ornithine
NH
pipéridines
N
pyrolizidines
N
tropanes
alcaloïdes indoliques sensu lato
alcaloïdes divers
Krebs
Les plantes à alcaloïdes sortent du champ d’application de la phytothérapie du fait de leur activité très marquée et de leur marge thérapeutique étroite.
Quelques plantes à dérivés isoquinoléiques et indoliquessont utilisées.
Composés Composés dérivés d’acides aminés:dérivés d’acides aminés:Les Les GlucosinolatesGlucosinolates
Chou de BruxellesBrassica oleraceavar. gemmifera
Chou-Fleur, RomanescoBrassica oleraceavar. botrytis
RutabagaBrassica napusvar. napobrassica
BrocoliBrassica oleraceavar. italica
Chou chinoisBrassica rapa L. subsp. pekinensis
Raifort sauvage, Armoraciarustica, Brassicaceae(racines)
Radis Noir, Raphanus niger, Brassicaceae (racines)
moutarde noire,Brassica nigraBrassicaceae
cochléaire,Cochlearia officinalisBrassicaceae
28/10/2017
33
Méthodes de la PharmacognosieMéthodes de la Pharmacognosieet de la Chimie et de la Chimie des substances des substances Naturelles Naturelles
((PhytochimiePhytochimie))
Les classiquesLes classiques
Les innovantes Les innovantes
Méthodes de la Pharmacognosie et de la Chimie Méthodes de la Pharmacognosie et de la Chimie des substances des substances Naturelles (Naturelles (PhytochimiePhytochimie) )
Méthodes Méthodes analytiquesanalytiques
Méthodes Méthodes séparatives :séparatives :Purification, Purification, IsolementIsolement
Méthodes Méthodes extractivesextractives
Analyses structurales :Spectroscopie par résonance magnétique (RMN)
Spectrométrie de Masse (SM)
Extractions classiques Nouveaux procédés d’extraction
Méthodes chromatographiques
Cristallisation
Méthodes chromatographiques-Chromatographie Couche Mince (CCM)- Chromatographie Liquide Haute Performance HPLC- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)
28/10/2017
34
EXTRACTION
EXTRACTIONEXTRACTION
Extrait
Extraction
Plante(drogue végétale)
Mise en contact avec un solvant++ ==
Etat de la plante (frais / sec)Degré de fragmentation de la planteTempérature d’extractionNature du solvant (polarité)Durée
Les paramètresLes paramètres
Dessication : pour une teneur en eau résiduelle < 10%Afin de limiter les risques de contamination microbienneConditions douces : 40 à 45°C / Conditions très douces : 25°C (Principes volatils : (Anis, Badiane, fenouil, rose rouge..)...
A l'air : Dans un hangar aéré, sur claies à plat ou 'bouquets' séchésEn plein air : dans certaines zones géographiques, ! aléas
climatiques...
A l'étuve : séchage rapide, quelques heures
Conditions de séchage
28/10/2017
35
Degré de fragmentation : Broyage Degré de fragmentation : Broyage
Broyeurs à billes, à couteaux, à marteaux…
!! Echauffement important : perte des molécules volatiles Et dégradation des composés sensibles à la chaleur
Broyeur à couteaux(Fritsch)
CryobroyageCryobroyageBroyage à basse température sous
azote liquide (-196°C) maintient à -80°-50°C avant conditionnement
Conservation des principes thermosensibles
Intéressant pour les plantes fraîches : broyage plus simple car durcissement des tissus
MicroextractionMicroextraction par par homogénéiseurshomogénéiseurs: broyage par des microbilles de : broyage par des microbilles de céramiquecéramique
Intéressant pour un nombre important d’échantillons(24 échantillons à la fois)
Faibles quantités de plantes (100-200 mg)
Idéal pour des analyses HPLC
Plante pré-fragmentée+ solvant
+ microbilles
Lyse cellulaire, extraction plus performante
28/10/2017
36
Température d'extractionTempérature d'extraction
Percolation
Macération Digestion Infusion Décoction
Solvant maintenu à ébullition
Solvant bouillantSolvant tièdetempérature
ambiante
Température d’extraction : Certains composés sont difficilement extraits à froid et nécessitent un chauffage pour passer dans le solvant d’extraction.
Facteurs influençant l’étape d’extraction :La La température d'extractiontempérature d'extraction
Fragments grossiers, coriaces (racines) : décoction
Plantes à huiles essentielles : éviter la décoction : macération / infusion
Sucres polysaccharides
Sels
Formes hétérosidiques
Dérivés non glycosylés
(non liés à une partie sucrée)
Acides grasDérivés
terpéniquesCaroténoïdes
Eau
Composés phénoliques
MélangesEau-alcools
Moyennement polaires (alcools purs, acétate d’ethyle, acétone, Dichlorométhane)…
Facteurs influençant l’étape d’extraction :Le Le solvant solvant d'extraction classiquesd'extraction classiques
Polarité du solvant: Les métabolites vont être extrait en fonction de leur affinité pour un solvant. Les composés très polaires sont solubles dans l’eau (polaires, hydrosolubles), les moins polaires sont solubles dans les alcools forts, voire huiles végétales (apolaire, liposolubles, ou hydrophobes)
).
Polaire Apolaire
CyclohexaneEther de pétroleHuiles…
28/10/2017
37
La La température température d'extraction / la pressiond'extraction / la pressionL’ASE (L’ASE (AcceleratedAccelerated SolventSolvent Extraction) / Extraction) /
PSE (PSE (PressuredPressured solventsolvent extractionextraction
Extraction dans des cellules en inox soumises au solvant sous pression (100 bars)
Cycles de 15-20 minutes
Economie de solvant et de temps
Le Le solvant solvant d'extraction : les nouveaux solvantsd'extraction : les nouveaux solvantsSolvants ioniques et NADESSolvants ioniques et NADES
«« Chimie verteChimie verte , Eco, Eco--extractionextraction »»
Liquides ioniques : sels à l’état liquidesObtenus par synthèse : (sels d’imidazolium-MIM, sels de pyridinium, les anions étant des tertafluoroborate,…) Points de fusions bas, très visqueuxConsidérés comme polaires Très chers…
Les NADES (Natural Deep EutecticcSolvents) : Liquides eutectiques profonds : solvants « propres » - biodégradables+++
obtenus par mélange de corps pursUrée, chlorure de cholineMélanges de sucres , ou d’acides et de sucres (acide citrique, glucose)
Caractère ionique, gamme de composés extraits très large
28/10/2017
38
Les Huiles essentielles : un procédé d’extraction particulierLes Huiles essentielles : un procédé d’extraction particulierL’entraînement à la vapeur d’eauL’entraînement à la vapeur d’eau
IndirectIndirect
Huiles Essentielles : procédés d’obtention Huiles Essentielles : procédés d’obtention Entrainement à la vapeur d’eau directEntrainement à la vapeur d’eau direct
28/10/2017
39
Huiles Essentielles : procédés d’obtention Huiles Essentielles : procédés d’obtention Expression mécanique à froid: écorces d’agrumesExpression mécanique à froid: écorces d’agrumes
CitrusCitrus spsp. famille des . famille des RutaceaeRutaceae
Principe : Le CO2 est maintenu sous forme liquide dans des conditions de pression et de température spécifique (c’est le point critique). Dans ces conditions, il peut extraire une partie des métabolites de la plante. Lors du retour aux conditions de température et de pression normales, le CO2 est évaporé et il ne reste plus que l’extrait « sec ». Le CO2 est alors recyclé et peut re-servir à une nouvelle extraction.
Extraction par des Extraction par des Fluides Fluides SuperSuper--CritiquesCritiques
28/10/2017
40
Méthodes de la Pharmacognosie et de la Chimie Méthodes de la Pharmacognosie et de la Chimie des substances des substances Naturelles (Naturelles (PhytochimiePhytochimie) )
Méthodes Méthodes analytiquesanalytiques
Méthodes Méthodes séparatives :séparatives :Purification, Purification, IsolementIsolement
Méthodes Méthodes extractivesextractives
Analyses structurales :Spectroscopie par résonance magnétique (RMN)
Spectrométrie de Masse (SM)
Extractions classiques Nouveaux procédés d’extraction
Méthodes chromatographiques
Cristallisation
Méthodes chromatographiques-Chromatographie Couche Mince (CCM)- Chromatographie Liquide Haute Performance HPLC- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)
Purification classique par chromatographie solide/Purification classique par chromatographie solide/lquidelquidesur gel de silice sur gel de silice
(Flash (Flash ChromatographyChromatography / VLC vacuum / VLC vacuum liquidliquid chromatographychromatography))
Colonne remplie de phase stationnaire constituée de siliceSéparation des composés basée sur leur polarité
Les produits les plus polaires sont retenus et donc sont éluésmoins rapidement
28/10/2017
41
Purification classique par chromatographie sur gel de silice Purification classique par chromatographie sur gel de silice (Flash (Flash ChromatographyChromatography / VLC vacuum / VLC vacuum liquidliquid chromatographychromatography))
1- Préparation de la phase stationnaire=gel de silice
2- Dépôt du mélange de composés
3- Elution avec la phase mobile
4- Isolement des produits purs
Analyse structurale
KD > 1
KD = 1
KD < 1 lower
upperD
AA
K ][][
=
Concentration of A in upper phase
Concentration of A in lower phase
Ampoule à décanter
Phase supérieure
La plus légère
Purification par CPC : Chromatographie de partagePurification par CPC : Chromatographie de partagecentrifugecentrifuge
Chromatographie liquideChromatographie liquide--liquide liquide
Séparation des composés en mélange dans deux phases non misciblesEn fonction de leur affinité pur chaque phase= coefficient de partage
Phase inférieure
La plus lourde
28/10/2017
42
HistoryHistory
Separatory funnel RLCC
HSCCC
CPC
DCCC: Droplet Counter Current Chromatography
RLCC: Locular liquid Counter Current chromatography
HSCCC: High Speed Counter Current Chromatography
CPC: Centrifugal Partition Chromatography
Craig DCCC
Purification par CPC : Chromatographie de partagePurification par CPC : Chromatographie de partagecentrifugecentrifuge
Chromatographie liquideChromatographie liquide--liquide liquide
Séparation des composés en mélange dans deux phases non miscibles
28/10/2017
43
Heaviest phase : mobile phase
KD > 1
KD = 1
KD < 1 low
upD
AA
K ][][
=
1- Mise au point du système de solvant biphasique1’ – Préparation de plusieurs litres du mélange biphasique2 – Chargement de la phase stationnaire (la plus dense, en bas) dans la CPC3 - injection du mélange de composés dans la CPC4- élution par la phase mobile (la plus légère, au dessus)
KD > 1
KD = 1
KD < 1 low
upD
AA
K ][][
=Heaviest phase :
mobile phase
1 Separatory funnels in series,2 Loading of stationary lightest phase in all separatory funnel 3 Injection of sample (mixture of three molecules)4 Loading of mobile phase in the first funnel, shaking, separation5 Transfer of lower mobile phase from the first to the second funnel, loading of fresh mobile phase in the first funnel
Chromatographic phenomena in liquid liquidChromatographic phenomena in liquid liquid
28/10/2017
44
Heaviest phase : mobile phase
1 Separatory funnels in series,2 Loading of stationary lightest phase in all separatory funnel 3 Injection of sample (mixture of three molecules)4 Loading of mobile phase in the first funnel, shaking, separation5 Transfer of lower mobile phase from the first to the second funnel, loading of fresh mobile phase in the first funnel6 Step 5 repeat until the last funnel
KD > 1
KD = 1
KD < 1 low
upD
AA
K ][][
=
Chromatographic phenomena in liquid liquidChromatographic phenomena in liquid liquid
Heaviest phase : mobile phase
1 Separatory funnels in series,2 Loading of stationary lightest phase in all separatory funnel 3 Injection of sample (mixture of three molecules)4 Loading of mobile phase in the first funnel, shaking, separation5 Transfer of lower mobile phase from the first to the second funnel, loading of fresh mobile phase in the first funnel6 Step 5 repeat until the last funnel
KD > 1
KD = 1
KD < 1 low
upD
AA
K ][][
=
Chromatographic phenomena in liquid liquidChromatographic phenomena in liquid liquid
28/10/2017
45
Heaviest phase : mobile phase
1 Separatory funnels in series,2 Loading of stationary lightest phase in all separatory funnel 3 Injection of sample (mixture of three molecules)4 Loading of mobile phase in the first funnel, shaking, separation5 Transfer of lower mobile phase from the first to the second funnel, loading of fresh mobile phase in the first funnel6 Step 5 repeat until the last funnel
KD > 1
KD = 1
KD < 1 low
upD
AA
K ][][
=
Chromatographic phenomena in liquid liquidChromatographic phenomena in liquid liquid
Heaviest phase : mobile phase
1 Placing separatory funnels in line,2 Loading of stationary lightest phase in all separatory funnel 3 Injecting sample (mixture of three molecules)4 Loading of mobile phase in the first funnel, shaking, separation5 Transfering of lower mobile phase from the first to the second funnel, loading of fresh mobile phase in the first funnel6 Step 5 repeated until the last funnel
KD > 1
KD = 1
KD < 1 low
upD
AA
K ][][
=
Chromatographic phenomena in liquid liquidChromatographic phenomena in liquid liquid
28/10/2017
46
Heaviest phase : mobile
1 Separatory funnels in series,2 Loading of stationary lightest phase in all separatory funnel 3 Injection of sample (mixture of three molecules)4 Loading of mobile phase in the first funnel, shaking, separation5 Transfer of lower mobile phase from the first to the second funnel, loading of fresh mobile phase in the first funnel6 Step 5 repeat until the last funnel
KD > 1
KD = 1
KD < 1 low
upD
AA
K ][][
=
Chromatographic phenomena in liquid liquidChromatographic phenomena in liquid liquid
Heaviest phase : mobile phase
Time
1 Separatory funnels in series,2 Loading of stationary lightest phase in all separatory funnel 3 Injection of sample (mixture of three molecules)4 Loading of mobile phase in the first funnel, shaking, separation5 Transfer of lower mobile phase from the first to the second funnel, loading of fresh mobile phase in the first funnel6 Step 5 repeat until the last funnel
KD > 1
KD = 1
KD < 1 low
upD
AA
K ][][
=
Chromatographic phenomena in liquid liquidChromatographic phenomena in liquid liquid
28/10/2017
47
Heaviest phase : mobile phase
Time
1 Separatory funnels in series,2 Loading of stationary lightest phase in all separatory funnel 3 Injection of sample (mixture of three molecules)4 Loading of mobile phase in the first funnel, shaking, separation5 Transfer of lower mobile phase from the first to the second funnel, loading of fresh mobile phase in the first funnel6 Step 5 repeat until the last funnel
KD > 1
KD = 1
KD < 1 low
upD
AA
K ][][
=
Chromatographic phenomena in liquid liquidChromatographic phenomena in liquid liquid
Heaviest phase : mobile phase
Time
1 Separatory funnels in series,2 Loading of stationary lightest phase in all separatory funnel 3 Injection of sample (mixture of three molecules)4 Loading of mobile phase in the first funnel, shaking, separation5 Transfer of lower mobile phase from the first to the second funnel, loading of fresh mobile phase in the first funnel6 Step 5 repeat until the last funnel
KD > 1
KD = 1
KD < 1 low
upD
AA
K ][][
=
Chromatographic phenomena in liquid liquidChromatographic phenomena in liquid liquid
28/10/2017
48
Heaviest phase : mobile phase
Time
1 Separatory funnels in series,2 Loading of stationary lightest phase in all separatory funnel 3 Injection of sample (mixture of three molecules)4 Loading of mobile phase in the first funnel, shaking, separation5 Transfer of lower mobile phase from the first to the second funnel, loading of fresh mobile phase in the first funnel6 Step 5 repeat until the last funnel
KD > 1
KD = 1
KD < 1 low
upD
AA
K ][][
=
Chromatographic phenomena in liquid liquidChromatographic phenomena in liquid liquid
Mobile phase = heaviest phase
Temps
KD > 1
KD = 1
KD < 1 lower
upperD
AA
K ][][
=
Elution extrusionElution extrusion
28/10/2017
49
Mobile phase = lightest phase
Temps
KD > 1
KD = 1
KD < 1 lower
upperD
AA
K ][][
=
Elution extrusionElution extrusion
Temps
KD > 1
KD = 1
KD < 1 lower
upperD
AAK ][
][=
Elution extrusionElution extrusion
Mobile phase = lightest phase
28/10/2017
50
Temps
KD > 1
KD = 1
KD < 1 lower
upperD
AAK ][
][=
Elution extrusionElution extrusion
Mobile phase = lightest phase
Temps
KD > 1
KD = 1
KD < 1 lower
upperD
AAK ][
][=
Elution extrusionElution extrusion
Mobile phase = lightest phase
28/10/2017
51
KD > 1
KD = 1
KD < 1 lower
upperD
AAK ][
][=
Temps
Mobile phase = lightest phase
Analyse structurale
Méthodes de la Pharmacognosie et de la Chimie Méthodes de la Pharmacognosie et de la Chimie des substances des substances Naturelles (Naturelles (PhytochimiePhytochimie) )
Méthodes Méthodes analytiquesanalytiques
Méthodes Méthodes séparatives :séparatives :Purification, Purification, IsolementIsolement
Méthodes Méthodes extractivesextractives
Analyse structurale du produit purSpectroscopie par résonance magnétique (RMN)
Spectrométrie de Masse (SM)
Extractions classiques Nouveaux procédés d’extraction
Méthodes chromatographiques
Cristallisation
Méthodes chromatographiques-Chromatographie Couche Mince (CCM)- Chromatographie Liquide Haute Performance HPLC- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)
28/10/2017
52
Spectrométrie de masse : de la masse moléculaire à la formule bruteSpectrométrie de masse : de la masse moléculaire à la formule brute
L’electrospray (ESI) est une méthode d’ionisation La solution est nébullisée dans un champ électrique Les molécules ionisées sont ensuite séparées en fonction de leur masse
Les masses des ions sont alors enregistrées
Les molécules à analyser sont mises en solution puis injectées dans l’appareil
On obtient des valeurs de m/z qui peuvent être des adduits. En mode positif : l’adduit le plus courante est la molécule protonnée, on mesure doncla masse de l’ion [M+H]+ (masse du composé + masse du proton)
On en déduit alors la masse moléculaire de notre composé => Formule bruteCarbone, Hydrogène, Azote, Oxygène
CxHyNzO…
On peut aussi voir la masse des fragments du composé si l’énergie d’ionisation est élevée
m/z 77
m/z 105
m/z 121
[M+H]+
fragments
Spectrométrie de masse : Spectrométrie de masse : De la valeur de m/z à la formule bruteDe la valeur de m/z à la formule brute
28/10/2017
53
Analyse par spectroscopie de résonance magnétiqueAnalyse par spectroscopie de résonance magnétique
Enregistrement de signaux émis par des atomes à nombre d’électrons impairs quand ils -Proton : H-1-Carbone : C-13(fluor, azote…)
Chaque proton (H1) ou carbone (C13) sur lamolécule émet un signal qui est enregistré
En fonction de son voisinage, le signal sera différent
L’électron libre tourne dans le champ magnétique ce qui émet un signal avec une fréquence (Hertz)Le signal est transformé et est mesuré en ppm (partie par million)
Echelles des déplacements chimiques en ppm
Signaux plus ou moins grands, proportionnels au nombre de protonsSignaux dédoublés en fonction du voisinage : multiplicité
Spectres RMN à une dimension, Spectres RMN à une dimension, RMN du proton, RMN du carboneRMN du proton, RMN du carbone
Spectre Carbone
Spectre Proton
Thymol
28/10/2017
54
RMN à deux dimensionsRMN à deux dimensions
Ex. COSY , permet de visualiser les protons voisins
nombreuses expériences de RMN
Informations différentes selonl’expérience
Identification structurale
Aide avec les données de la littérature
Analyse d’un mélange complexe : Analyse d’un mélange complexe : Vers la Vers la déréplicationdéréplication
28/10/2017
55
la Chromatographie su couche mince
1- Technique de Chromatographie Couche Mince* CCM
Elle consiste à déposer sur une plaque de gel de silice un extrait à analyser (T) et des
substances de références connues de la plante (A, B). La plaque est ensuite placée dans
une cuve contenant un solvant (=phase mobile qui entraîne les différents constituants.
Après migration et révélation, on identifie les constituants. Une substance qui a migré au
même niveau qu'une substance de référence et ayant la même couleur après révélation est
alors identifiée comme étant cette substance.
C'est la plus utilisée dans les monographies de contrôle de la Pharmacopée
TA B T
A
B
A
A
B B
Cuve remplie de Phase mobile
Gousse de Séné
Feuille de séné
sennoside A
sennoside B
Révélateur 1 : HNO3/KOH
Exemple du séné avec différents type de révélation
SénéDrogue végétale = gousse et
feuillesCassia angustifolia, Cassia
senna,
Utilisation de réactifs de révélation spécifiques
28/10/2017
56
Technique de Chromatographie Liquide Haute
Performance (CLHP)
C’est une phase mobile liquide qui entraine les
composés à analyser
L'extrait est injecté dans un appareil constitué d'un
colonne ou la phase mobile passe sous très haute
pression, ceci permet de mieux séparer les
constituants qui apparaissent sous forme de pic sur
un Chromatogramme. L'aire du pic est relative à la
quantité présente dans l'extrait.
Analyse HPLC
Détection UV : les molécules doivent
absorber dans l’UV pour être détectées
Contrôle Et traitement des données
SolvantsPompe
Passeur d’échantillon ou boucle d’injection
Colonne de CLHP+/- Four
Collecteur de Fractions
Poubelle
Détecteur
Analyse HPLC
28/10/2017
57
• Choix d’une colonne de phase stationnaire– Colonnes contenant des particules fines de phase stationnaire solide
• Silice greffée C-18, la plus courante pour les produits naturels
• Autres : phenyl-hexyl, cyano etc…
– Taille des particules : 5µ mais plutôt 4.5
– Pression dans la colonne : environ 100 bars
– UPLC : ultra-haute performance chromatography
• Particules < 2µM
• Choix de la phase mobile :– Sélection du mélange de solvants
– Sélection du gradient (proportion de solvants, durée…)
– Température de la colonne
• Utilisation de standards de référence
Analyse HPLC : mise au point d’une méthode
CPG : Chromatographie en Phase GazeusePour des composés volatils
Les molécules à analyser sont volatilisées La phase mobile est un gaz
Paramètres : Choix de la colonne, et de la température
28/10/2017
58
CPG –FID et CPG-MS
Détecteur FID
Détecteur MS : permet la déréplicationPar comparaison à une base de donnée
DéréplicationDéréplication : identification de composés déjà : identification de composés déjà connus dans un mélange complexeconnus dans un mélange complexe
28/10/2017
59
Analyse HPLC couplée à la spectrométrie de masse
Le détecteur détermine la masse des ions m/z
Masse haute résolution
28/10/2017
60
Chromatogramme LC-MS/MS
Valeurs de m/z des différents ions identifiés
Déréplication par comparaison aux bases de données
Identification des composés connus
Déréplication des extraits – Identification des molécules connues
Biological source : nom de la plante+ Accurate mass : mass exacte déduite de la spectrométrie de masse
28/10/2017
61
!! Nombreux résultats
Analyse HPLC couplée à la spectrométrie de masse avec fragmentation
-Si correspondance de la masse exacte et des fragments=> Niveau de preuve élevé pour conclure sur l’identité d’une molécule
28/10/2017
62
Fragmentation des flavonoides
Mise en évidence de Réseaux moléculaire( Molecular Networking )
• Dorrestein et al. Ont développé un système de visualisation des données de LC-MS/MS d’intérêt majeur en phytochimie,
• Les données de fragmentation en LC-MS/MS permettent d’établir des liens entre différents ions. On obtient ainsi des « réseau moléculaires » de molécules apparentées.
La visualisation de ces groupes de métabolites permet:D’identifier rapidement les composés inconnus issus d’une famille phytochimique.De comparer les différents chémotypesPeut être appliqué à la comparaison d’espèces
Molecular Networking as a dereplication strategy,Dorrestein et al,2013,76(9),pp 1686-1699
28/10/2017
63
Processus du Moléculaire Networking
1 23
45
Expanding the Described Metabolome of the Marine Cyanobacterium Moorea producens JHB through Orthogonal Natural Products Workflows , Boudreau PD et al . PC, Gerwick WH - PLoS ONE (2015).
Le paramètre: Cosine