Introdu˘c~ao - USP · 2007-06-19 · Introdu˘c~ao Gen^omica Gen etica Schadt et al. (2003) Considera˘c~oes Finais Sum ario 1 Introduc~ao Mapeamento de QTL’s Microarranjos de

IntroducaoGenomica Genetica

Schadt et al. (2003)Consideracoes Finais

Sumario

1 IntroducaoMapeamento de QTL’sMicroarranjos de DNACombinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL’s

2 Genomica GeneticaJansen e Nap (2001)eQTLExemplo: Jansen (2003)

3 Schadt et al. (2003)CamundongosMilhoHumanos

4 Consideracoes FinaisDesafios AtuaisPerspectivasSoftwares disponıveis

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Mapeamento de QTL’sMicroarranjos de DNACombinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL’s

IntroducaoMapeamento de QTL’s

QTL’s (”Quantitative Trait Loci”) sao regioes cromossomicas queinfluenciam a variacao de caracteres quantitativos.

Mapeamento de QTL’s: estimar numero de locos, posicao, efeitos einteracao (epistasia) entre regioes.

O conceito de mapeamento e relativamente antigo (Sax, 1923; Thoday,1961), porem publicacoes sobre este tema tornaram-se mais frequentes apartir de 1990.

As principais razoes para o aumento das publicacoes:

Amplo desenvolvimento e utilizacao dos marcadores moleculares;Desenvolvimento de metodologias para construcao de mapas de ligacao(Lander e Green, 1987);

Desenvolvimento de metodologias capazes de mapear QTL’s

eficientemente (Lander e Botstein, 1989);

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IntroducaoMapeamento de QTL’s: Adaptado de Doerge (2002)

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Acreditava-se nesta epoca que a descoberta de QTL’s levariamrapidamente ao descobrimento dos genes que envolvidos no controlegenetico de caracteres quantitativos de importancia economica.

Contudo, esta expectativa nao foi confirmada!

Flint et al. (2005) citam que no banco de dados do NCBI apenas 20 genescandidatos foram identificados em roedores, enquanto havia 2750 QTL’s.

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Wayne e McIntyre (2002) comentam que a principal dificuldade emcaminhar do nıvel de QTL para nıvel de genes deve-se a ausencia demetodologias que permitam este tipo de estudo.

O controle genetico de caracteres quantitativos esta associado a inumeroslocos, mas trabalhos de comprovacao e validacao somente sao viaveispara um numero reduzido de genes.

Logo, necessitam-se avancos para a deteccao de genes, e nao para adeteccao em QTL’s (Flint et al., 2005).

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IntroducaoMapeamento de QTL’s: Adaptado de Doerge (2002)

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IntroducaoMicroarranjos de DNA

Os avancos obtidos nas areas de genomica, permitiram o desenvolvimentoda tecnologia de microarranjos de DNA.

Um microarranjo de DNA (chip de DNA) consiste em um arranjopre-definido de moleculas de DNA quimicamente ligadas a uma superfıciesolida.

Isto permite a deteccao e quantificacao de acidos nucleicos (mRNA naforma de cDNA) quando hibridizadas com o DNA fixado no array(hibridacao por complementariedade de bases).

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IntroducaoMicroarranjos de DNA Fonte: Karp (2005)

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IntroducaoMicroarranjos de DNA Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/DNA microarray

Exemplo de chip de DNA contendo a expressao de aproximadamente 40000 cDNAs

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IntroducaoMicroarranjos de DNA

A principal contribuicao desta tecnologia e a possibilidade de estudar aexpressao simultanea de milhares de genes.

Wayne e McIntyre (2002) comentam que o estudo de expressao genicacombinada com marcadores moleculares trata-se de uma valiosaferramenta que permitiriam o entendimento de caracteres quantitativo emnıvel genico.

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IntroducaoMicroarranjos de DNA Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/DNA microarray

cDNA cor comp. de onda (µm)

1 verde 5002 amarelo 5653 verde 5424 vermelho 7005 vermelho 6666 amarelo 587...

......

10000 verde 508

Resultado hipotetico para um experimento de microarranjos de DNA:A expressao genica e interpretada como variavel quantitativa.

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IntroducaoCombinacao de microarranjos de DNA com mapeamento de QTL’s

ind. cDNA - comp. de onda (µm)1 2 3 4 5 6 ... 10000

1 500 565 542 700 666 587 ... 5082 605 618 627 613 692 526 . . . 6243 696 552 577 701 573 563 . . . 5634 577 600 595 612 664 624 . . . 526...

......

......

......

...n 616 594 562 502 544 617 . . . 662

Representacao de uma populacao segregante composta por n indivıduos e comfenotipagem atraves de m cDNAs.

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IntroducaoCombinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL’s

ind. Fenotipos Marcadores Moleculares

Alt.(cm) Prod.(g) NR T.Oleo (gkg−1) A B C . . .

1 113 55 17 48 aa BB Cc . . .2 103 62 13 51 AA BB cc . . .3 98 49 10 33 Aa bb cc . . .4 127 67 15 69 Aa Bb cc . . ....

......

......

......

...100 111 72 12 43 aa Bb CC . . .

Populacao para mapeamento de QTL’s considerando algumas caracterısticasfenotıpicas (agronomicas) e diversos marcadores moleculares.

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ind. cDNA Marcadores Moleculares1 2 3 4 A B C . . .

1 500 565 542 700 aa BB Cc . . .2 605 618 627 613 AA BB cc . . .3 696 552 577 701 Aa bb cc . . .4 577 600 595 612 Aa Bb cc . . ....

......

......

......

...100 616 594 562 502 aa Bb CC . . .

Populacao para mapeamento de QTL’s considerando algumas caracterısticasfenotıpicas obtidas com microarranjos de DNA e diversos marcadoresmoleculares.

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ind. cDNA Fenotipos Marcadores Moleculares

1 2 3 4 Alt.(cm) Prod.(g) NR T.Oleo A B C . . .1 500 565 542 700 113 55 17 48 aa BB Cc . . .2 605 618 627 613 103 62 13 51 AA BB cc . . .3 696 552 577 701 98 49 10 33 Aa bb cc . . .4 577 600 595 612 127 67 15 69 Aa Bb cc . . .

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.100 616 594 562 502 111 72 12 43 aa Bb CC . . .

Populacao para mapeamento de QTL’s considerando algumas caracterısticasfenotıpicas (agronomicas e microarranjos de DNA) e diversos marcadoresmoleculares.

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IntroducaoCombinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL’s Fonte: Schadt et al. 2003

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Jansen e Nap (2001)eQTLExemplo: Jansen (2003)

Genomica GeneticaJansen e Nap (2001)

Jansen e Nap (2001) foram os primeiros autores que reconheceram opotencial de aplicar mapeamento de QTL’s em dados de microarrays.

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Jansen e Nap (2001) propoem a reconstrucao de rotas metabolicas(”networks”), a partir da associacao entre marcadores e cDNA.

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Genomica GeneticaeQTL

Schadt et al. (2003) definiram o termo eQTL (QTL expresso).

O mapeamento de eQTL’s permite identificar regioes do genoma quecontrolam (regulam) a expressao genica. Cada ”spot”de ummicroarranjo de DNA e um carater quantitativo.

Os eQTL’s podem atuar na regulacao de um gene atraves de duas

formas:

Acao em cisAcao em trans

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Acao em cis: O nıvel de transcricao e regulado por polimorfismo do DNAdo proprio gene (eQTL e gene proximos).

Acao em trans: O nıvel de transcricao e regulado por polimorfismo emuma regiao, a qual o gene nao esta fisicamente localizado.

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Fatores de transcricao podem ter eQTL em cis, mas como estaoenvolvidos na expressao de outros genes, podem tambem ser detectadoscomo eQTL’s atuando em trans.

eQTL’s com maiores valores de LOD tendem a apresentar acao em cis.

Por outro, lado eQTL’s de efeito moderado tendem a indicar acao em

trans.

Variacoes de primeira ordem (devido ao proprio gene) sao mais faceis de

se detectar, em relacao a efeitos secundarios (eQTL de um gene atuando

na expressao de outros genes) (Schadt et al., 2003).

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Genomica GeneticaExemplo: Jansen (2003)

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CamundongosMilhoHumanos

Schadt et al. (2003)

Objetivo: realizar um estudo compreensivo para a expressao genica,atraves de eQTL’s, utilizando camundongos, plantas e humanos.

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Schadt et al. (2003)

Camundongos:

Quantos genes apresentavam expressao diferencial;Distribuicao dos eQTL’s ao longo do genoma;Explicacao molecular para presenca do eQTL;

Combinacao de expressao genica com mapeamento;

Milho:

Visualizacao de epistasia;

Humanos:

Associacao entre camundongos e seres humanos;

Algumas analises em humanos (Potencial);

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Schadt et al. (2003)Camundongos

Populacao segregante: 111 indivıduos F2 obtido atraves do cruzamentodas linhagens C57BL/6J e DBA/2J:

O mapa genetico foi construıdo com marcadores microssatelites, cuja adensidade media era de 13 cM;

Realizou-se Mapeamento por Intervalo;

O chip de DNA disponıvel para camundongos continha (23574 genes);

Avaliaram-se celulas do Tecido Hepatico e Massa de Gordura na Pata(medida de obesidade);

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Schadt et al. (2003)Quantificacao dos eQTL’s

Foram detectados:

11021 genes com LOD superior a 3;

3701 genes com LOD superior a 4,3;

965 genes com LOD superior a 7;

Para os genes disponıveis no chip de DNA, 18460 (78%) podiam ser

mapeados fisicamente:

34% dos eQTL’s com LOD superior a 4,3 apresentavam acao em cis.

71% dos eQTL’s com LOD superior a 7 apresentavam acao em cis.

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Schadt et al. (2003)Distribuicao dos eQTL’s

Os autores dividiram o genoma de camundongos em 920 bins (2cM) epara cada posicao calculou-se a frequencia de eQTL’s presentes em cadabin.

Os cromossomos 2, 6, 7, 9, 10, 12, 16 e 17 contem regioes com mais de1% do numero total de eQTL (hotspots).

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Schadt et al. (2003)Polimorfismo molecular

Para a compreensao dos eQTL’s buscou-se identificar as causas que levariam adeteccao de eQTL’s. Logo, 3 genes podem ser destacados.

Gene C5: delecao em 2 pb na regiaocodante para linhagem DBA que reduzrapidamente a transcricao emcomparacao com B6;

Gene ALAD esta duplicado em DBA;

Gene St7 sofre splicing diferenciado: em

B6 ha splicing, enquanto nao ocorre em

DBA.

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Schadt et al. (2003)Combinando mapeamento e expressao genica

Os autores desejavam associar a expressao genica com caracteresquantitativos (obesidade).

Para isto selecionaram-se os 280 genes (pronunciada expressaodiferencial), e realizaram-se agrupamento com os indivıduos de fenotiposextremos.

Diferentemente do esperado houve a separacao da populacao demapeamento em 3 grupos: nao obesos e 2 subgrupos de indivıduos obesos

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Ao realizar o mapeamento de QTL’s com essas subpopulacoes verifica-se que

nos cromossomos 2 e 19 os QTL’s se expressam de forma diferencial dentro

destes subgrupos, o que indica a complexidade de caracteres quantitativos como

obesidade.

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Schadt et al. (2003)Milho

Assim, utilizou-se uma populacao F2:3 composta por 76 plantasprovenientes do cruzamento de materiais de diferentes grupos heteroticos:”stiff stalk”e ”Lancaster”.

O mapa genetico de milho foi construıdo com marcadores microsatelitescuja distancia media era de 12 cM.

Resultados:

6481 genes apresentavam ao menos 1 QTL’s com LOD superior a 3.

7322 eQTL’s foram detectados

80% dos eQTL’s com LOD superior a 7 apresentavam acao em cis.

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Schadt et al. (2003)Epistasia

Utilizando genes de cromossomos distintos e sem acao em trans espera-seausencia de correlacao para a expressao genica.

No entanto, algumas interacoes foram identificadas - epistasia.

Aproximadamente 10% dos genes apresentavam este tipo de interacao.

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Schadt et al. (2003)Epistasia

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Schadt et al. (2003)Humanos

Alguns resultados obtidos com camundongos podem ser extrapoladospara seres humanos, uma vez que a regiao que contem o locos nocromossomo 2 de camundongos apresenta homeologia com o cromossomohumano 20q12-q13.12 (regioes associadas a obesidade).

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Schadt et al. (2003)Humanos

Um estudo preliminar em humanos foi realizado com famılias de

referencias do CEPH (Centre d’Etude du Polymorphisme Humain):56 indivıduos oriundos de 4 famılias de referencia;

Informacoes de pais e avos;

Chips de DNA para humanos (2726 genes com expressao diferencial)

Celulas do sistema imune humano;

O tamanho amostral e muito pequeno para realizar analises maiselaboradas.

Acredita-se, no mımino 30% dos genes expressos podem ter eQTL’sdetectados.

Estudos de expressao genica em celulas do sistema imunologico emhumanos podem ser alvos futuros para terapia genica.

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Desafios AtuaisPerspectivasSoftwares disponıveis

Consideracoes FinaisDesafios Atuais

Elevado volume de dados ainda compromete analises mais elaboradas.

Como lidar com falsos positivos;

Como validar eQTL’s com acao em trans? (importancia para estudo deepistasia, rotas metabolicas);

Estudos consideram a possibilidade de utilizar FDR para estabelecer nıvel

de significancia, porem nao ha um consenso.

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Consideracoes FinaisDesafios Atuais

Atualmente, ha modelos que permitem realizar o mapeamento de QTL’s

para multiplas caracterısticas, mas nao ha modelos com a capacidade de

absorver esse excessivo numero de variaveis;

Analises conjuntas x Analises individuais: tempo de processamento aindae fator limitante;

Opcoes em utilizar tecnicas de analise multivariada (nao ha consenso);

Estudos de rotas metabolicas:

Jansen e Nap (2001) reconhecem que a abordagem proposta por eles e

limitante para analise de conjunto de dados reais.

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Consideracoes FinaisPerspectivas

Jansen (2003):

Experimentos para ”perturbacao de sistemas”como knockout de genes,

transgenia e mutagenese podem ser aplicados varios organismos, mas o

conceito de genomica-genetica (mapear eQTL’s) e o unico meio de

realizar estudo em seres humanos;

Darvasi (2003 e 2006):

Esta abordagem aproxima-se cada vez mais na identificacao eentendimento dos genes que controlam caracteres quantitativos (75% davariacao genetica).

Espera-se que o entendimento da base genetica das doencas traga muita

contribuicao para a medicina.

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Consideracoes FinaisPerspectivas

Gibson e Weir (2005) destacam:

Novas ferramentas estatısticas e modelos devem ser desenvolvidos paramanipular transcritos com estruturas de covariancias e nao aditividade detranscritos;

Estudos de eQTL’s fornecem somente uma visao restrita, uma vez que

nao ha estudos de comportamento de eQTL’s em populacoes naturais.

O conhecimento futuro de rotas metabolicas permitirao o estudo deepistasia em caracteres quantitativos de uma forma que atualmente nao epossıvel.

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Consideracoes FinaisSoftware disponıveis

Programas para construcao de mapas de ligacao e mapeamento de

QTL’s.Mapmaker/Exp e Mapmaker/QTL;JoinMap;QTL Cartographer;Rqtl (programa R);

WebQTL;

Programas que permitem manipular e avaliar dados de mapeamento de

eQTL’s.eQTL Viewer (Zou et al., 2007);eQTL explorer (Mueller et al., 2006) - integrado com o WebQTL eQTLexpress;

WinQTLcart;

MOM model (Kendziorski et al., 2006): scripts desenvolvidos para R.

Mapeamento de eQTL via modelo de mistura com marcadores

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Referencias

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DOERGE, RW. Mapping and analysis of quantitative trait loci in experimental populations. Nat. Rev.Genetics, v.3, p.43-52, 2002.

FLINT, J; VALDAR, W; SHIFMAN, S; MOTT, R. Strategies for mapping and closing quantitative traitgenes in rodents. Nat. Rev. Genetics, v.6, p.271-286, 2005.

GIBSON, G; WEIR, B. The quantitative genetics of transcription. TRENDS in Genetics, v.21, p.616-623,2005.

JANSEN, RC; NAP, JP. Genetical Genomics: the added value from segregation. TRENDS in Genetics,v.17, p.399-391, 2001.

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KARP, G. Biologia celular e molecular: conceitos e experimentos, 3aedicao, Manole, p.786, 2005.

KENDZIORSKI, C; CHEN, M; YUAN, M; LAN, H; ATTIE, AD. Statistical Methods for ExpressionQuantitative Trait Loci (eQTL) Mapping. Biometrics 62, 19-27, 2006

MUELLER, M; GOEL, A; Thimma, M; Dickens, NJ; Aitman, TJ; Mangion, J. eQTL Explorer: integratedmining of combined genetic linkage and expression experiments, Bioinformatics, v.22, p.509-511. 2006.

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