INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIÉRREZ EVALUACIÓN … · 2.2 Ingeniería de vías metabólicas para la producción de etanol con E. coli.....10 2.2.1 Escherichia coli KO11

SEP SEIT DGIT

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIÉRREZ

EVALUACIÓN DE LA SOBREEXPRESIÓN DE GENES DEL METABOLISMO CENTRAL DE

Escherichia coli ETANOLOGÉNICA USANDO XILOSA COMO FUENTE DE CARBONO

OPCIÓN III

PROYECTO DE INVESTIGACIÒN

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

INGENIERO BIOQUÍMICO

P R E S E N T A

JOSÉ UTRILLA CARRERI

Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, 15 Junio 2004

i

METABOLISMO XILOSA COMO

ii

en e

d

Para

El presente trabajo se realizó bajo la dirección del

Dr. Alfredo Martínez Jiménez l Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis

del Instituto de Biotecnología

e la Universidad Nacional Autónoma de México.

la realización del mismo se contó con el financiamiento

del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

(CONACyT) a través del proyecto Z-003.

iii

AGRADECIMIENTOS:

A mi Familia por su apoyo en todos los sentidos.

A Mara por estar conmigo y el apoyo en todo momento.

Al Dr. Alfredo Martínez Jiménez por aceptarme en su laboratorio para realizar esta

estancia, por su asesoria y por todas sus atenciones.

Al M.C. Gerardo Huerta Beristain por toda su ayuda en la realización de este trabajo.

A la M.C. Lucia Maria Cristina Ventura Canseco por darme la oportunidad de

participar en el VIII Verano de la Investigación del Pacifico

A mi comité de Evaluación:

Dr. Federico Antonio Gutiérrez Miceli

M.C. Julio Evaristo Ballinas Díaz

IBQ. Javier Ramírez Díaz

Por sus consejos para la realización de presente trabajo.

A mis compañeros de Generación por su apoyo y amistad durante la realización de

la carrera.

GRACIAS.

iv

ÍNDICE GENERAL.

ÍNDICE DE FIGURAS. ..............................................................................................viii

ÍNDICE DE TABLAS. ................................................................................................. ix

NOMENCLATURA. ..................................................................................................... x

Resumen..................................................................................................................... 1

1.-INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 2

1.1 Energía a partir de fuentes renovables.............................................................. 2

1.2 Etanol ................................................................................................................ 3

1.3 Potencial para la producción de Etanol a partir de residuos agroindustriales. .. 5

2.- ANTECEDENTES.................................................................................................. 8

2.1 Organismos etanologénicos silvestres. ............................................................. 9

2.1.1 Saccharomyces cerevisiae ......................................................................... 9

2.1.2 Zymomonas mobilis .................................................................................... 9

2.2 Ingeniería de vías metabólicas para la producción de etanol con E. coli......... 10

2.2.1 Escherichia coli KO11 ............................................................................... 11

2.2.2 Evaluación de E.coli B y KO11 en medio mínimo-glucosa........................ 13

2.3 Puntos de Regulación de la Glucólisis ............................................................ 15

2.4 Comparación de la expresión de genes glicolíticos en KO11.......................... 15

2.5 Sobreexpresión de genes del metabolismo central de carbono como una

estrategia para aumentar el flux glicolítico en E. coli etanologénica...................... 18

2.6 Evaluación de la sobreexpresión de genes usando glucosa como fuente de

carbono.................................................................................................................. 19

3.-PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO .................................................. 20

4.- HIPÓTESIS.......................................................................................................... 21

5.- OBJETIVOS......................................................................................................... 22

OBJETIVO GENERAL........................................................................................... 22

OBJETIVOS ESPECÍFICOS. ................................................................................ 22

6.- METODOLOGÍA .................................................................................................. 23

6.1 Cepas .............................................................................................................. 23

6.2 Condiciones y medios de cultivo ..................................................................... 23

v

6.2.1 Inóculos para cultivos................................................................................ 23

6.2.2 Medios de cultivo. ..................................................................................... 24

6.2.3 Condiciones de cultivo. ............................................................................. 24

6.3 Métodos analíticos........................................................................................... 26

6.3.1 Concentración celular ............................................................................... 26

6.3.2 Determinación de azúcares y ácidos orgánicos. ....................................... 26

6.3.3 Determinación de etanol. .......................................................................... 27

6.3.4 Determinación de proteínas y actividades enzimáticas............................. 27

6.4 Evaluación de parámetros. .............................................................................. 28

6.5 Análisis de resultados...................................................................................... 28

7.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 29

7.1 Evaluación de E. coli B y KO11 en medio mineral-xilosa y de actividad

enzimática de PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm. ........................................................... 29

7.1.1 Comparación de parámetros cinéticos entre E. coli B y KO11 creciendo en

medio mineral-xilosa .......................................................................................... 29

7.1.2 Valores de actividad enzimática de PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm en cepas

transformadas de KO11. .................................................................................... 35

7.2 Efecto de la sobreexpresión de galPEc, pfkEc, pgkEc, pykBs y pdcZm en la fase de

crecimiento exponencial ........................................................................................ 37

7.2.1 Efecto sobre la velocidad específica de crecimiento................................. 37

7.2.2 Efecto sobre la velocidad específica de consumo de Xilosa..................... 39

7.2.3 Efecto sobre la velocidad especifica de producción de etanol y ácidos

orgánicos. .......................................................................................................... 41

7.3 Efecto de la sobreexpresión de galPEc, pfkEc, pgkEc, pykBs y pdcZm en E. coli

KO11 durante la fase estacionaria ........................................................................ 43

7.3.1 Efecto sobre la velocidad especifica de consumo xilosa, de formación de

etanol y sobre la producción de ácidos acético, fórmico y láctico. ..................... 43

7.4 Análisis de flujos y balance de carbono........................................................... 46

7.5 Efecto sobre el rendimiento de conversión de xilosa en etanol ....................... 49

8.- CONCLUSIONES ................................................................................................ 50

9.- PERSPECTIVAS ................................................................................................. 51

vi

10.- REFERENCIAS ................................................................................................. 52

11. APÉNDICES ....................................................................................................... 60

11.1 Método de Azúcares reductores (DNS) ......................................................... 60

11.2 Ensayos Enzimáticos..................................................................................... 60

11.3 Evaluación de parámetros ............................................................................. 64

11.3.1 Corrección por factor de dilución............................................................. 64

11.3.2 Calculo de la velocidad específica de crecimiento. ................................. 64

11.3.3 Cálculo de rendimientos y de formación de productos............................ 65

11.3.4 Cálculo de la velocidad específica de consumo de azúcar y de formación

de productos. ..................................................................................................... 65

11.3.5 Cálculo de flujos y balance de carbono................................................... 66

11.4 Datos de curvas de calibración...................................................................... 66

11.5 Cinéticas de crecimiento, consumo de azúcar, producción de etanol, y ácidos

orgánicos. .............................................................................................................. 67

vii

ÍNDICE DE FIGURAS.

Figura 1.3.1 Proceso para obtener etanol a partir de residuos agroindustriales con el uso de microorganismos mejorados genéticamente. .................................................. 6

Figura 2.1 Composición de la lignocelulosa. .............................................................. 9

Figura 2.2.1Metabolismo de pentosas y hexosas en E. coli KO11 en condiciones anaeróbicas............................................................................................................... 12

Figura 2.3.1 Esquema de la glicólisis y la desviación de piruvato a etanol, incluyendo la regulación enzimática, consumo y generación de ATP y NAD, y cambios de ∆G´°................................................................................................................................... 16

Figura 2.4.1 Análisis de sobreexpresión de genes de la vía glicolítica en condiciones anaeróbicas con la cepa etanologénica KO11 en xilosa........................................... 17

Fig. 6.2.1 Sistema de Minifermentadores o Fleakers................................................ 25

Figura 7.1.1 Cinéticas de crecimiento, consumo de azúcar y producción de etanol y ácidos orgánicos para E. coli B y KO11, cultivadas en condiciones anaeróbicas en medio mineral 4% xilosa. .......................................................................................... 31

Figura 7.1.3 Comparación de actividades enzimáticas de las construcciones evaluadas con la cepa control................................................................................... 36

Figura 7.2.2 Comparación de la velocidad especifica de consumo de xilosa en la cepa KO11 sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm. .......................... 40

Figura 7.2.3 Comparación de velocidades específicas de producción de etanol, acético, láctico y fórmico en la cepa KO11 (Ec B: E. coli B y C: cepa control) sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm ............................................. 41

Figura 7.3.1 Comparación de la velocidad especifica de consumo de xilosa en la cepa KO11 sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm ........................... 45

Figura 7.3.2 Comparación de la velocidad especifica de producción de etanol en la cepa KO11 sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm. .......................... 45

Figura 11.5.1 Cinéticas de Consumo de xilosa, producción de etanol y biomasa de la cepas; A) control KO11/pTrcA, B) KO11/pTrcgalPEc, C) KO11/pTrcpfkEc, D) KO11/pTrcpgkEc ........................................................................................................ 68

Figura 11.5.2 Cinética de Consumo de xilosa, producción de etanol y biomasa de la cepas: A) KO11/pTrcpykBs, B) KO11/pTrcpdcZm, C) KO11, y D) E. coli B................. 69

Figura 11.5.3 Cinética de producción de ácido acético y ácido láctico para las cepas evaluadas.................................................................................................................. 70

Figura 11.5.4 Cinética de producción de ácido fórmico y ácido succínico para las cepas evaluadas ....................................................................................................... 71

viii

ÍNDICE DE TABLAS.

Tabla 1.2.1 Ventajas de la utilización del etanol como oxigenante y combustible ...... 4

Tabla 2.2.1 Productos de fermentación reportados para KO11 y E. coli B bajo diferentes condiciones. ............................................................................................. 13

Tabla 2.2.2 Comparación de parámetros cinéticos y rendimiento de etanol entre E. coli B y KO11 en medio mineral - glucosa. ............................................................... 14

Tabla 7.1.1 Comparación de parámetros cinéticos y rendimiento de etanol entre E. coli B y KO11. ........................................................................................................... 32

Tabla 7.5.1 Rendimiento de conversión de xilosa en etanol respecto al teórico, resultado de la sobreexpresión de genes del metabolismo de E. coli etanologénica. Los datos mostrados son el promedio de dos replicas con su respectivo error estándar .................................................................................................................... 49

Tabla 11.4.1 Curva de calibración de azúcares, glicerol y etanol. ............................ 66

Tabla 11.4.2 Curvas de calibración de ácidos orgánicos.......................................... 67

ix

NOMENCLATURA. GENERALES

Símbolo Definición Amp Ampicilina cat Gen que codifica la enzima cloramfenicol acetiltransferasa Cm Cloramfenicol CmR Cloramfenicol resistente

DOnm Densidad óptica a determinada longitud de onda E. coli Escherichia coli HPLC Cromatografía líquida de Alta Resolución (por sus siglas en

ingles: High Performance Liquid Chromatography) IPTG Inductor gratuito de la expresión del operón de lactosa

(isopropil ß-D-tiogalactopiranósido) KOH Hidróxido de potasio Km Constante de Michaelis-Menten lacIq Gen que codifica la proteína del operón de lactosa. El

promotor de este gen lleva una mutación puntual en la caja –35 que cambia una C por una T en la posición 5; lo cual provoca un incremento en la expresión a partir de este promotor, que se traduce en aproximadamente 10 veces más concentración del represor

LB Medio de cultivo Luria-Bertani P Promotor ó Producto p Plásmido PTS Sistema de la fosfotransferasa S Sustrato, fuente de carbono, azúcares: glucosa o xilosa trc promotor híbrido que contiene la región regulatoria –35 de trp

y la región correspondiente a la caja –10 del promotor lacUV5

TCA ciclo de los ácidos tricarboxílicos :: Inserción D Eliminación

x

ENZIMAS Y GENES

Enzima Gen Definición ACK ack Acetatocinasa ADH y ADH II adh y adhB Alcohol deshidrogenasa

homóloga y heteróloga ALDH aldh Acetaldehído

deshidrogenasa ENO eno Enolasa FBA fbaA Fructosa-1,6-bis-fosfato

aldolasa FHL fhl Formato hidrogenoliasa FRD frd Fumarato reductasa FUM fum Fumarasa Gal P galP Galactosa permeasa GAPDH gapdh Gliceraldehído-3-fosfato

deshidrogenasa GLK glk Glucocinasa GPDH Gpdh Glicerol fosfato

deshidrogenasa LDH ldh Lactato deshidrogenasa MDH mdh Malato deshidrogenasa PDC pdc Piruvato decarboxilasa PDH pdh Piruvato deshidrogenasa PFK pfk Fosfofructo cinasa PFL pfl Piruvato formato liasa PGI pgi Fosfoglucosa isomerasa PGK pgk Fosfoglicerato cinasa PGM yip Fosfogliceratomutasa PPC ppc Fosfoenolpiruvato

carboxilasa PTA pta Fosfotransacetilasa PYK pykA, pykF Piruvato cinasa RPE rpe Ribosafosfato epimerasa TPI tpiA Triosafosfato isomerasa XYLB xylB Xilulosa isomerasa

xi

METABOLITOS

Metabolito Definición AcAld Acetaldehído ADP Adenosin difosfato AMP Adenosin monofosfato ATP Adenosin trifosfato CoA Coenzima A DHAP Deoxiarabinoheptolosona

to-7-fosfato EtOH Etanol F-6-P Fructosa-6-fosfato F-1,6-BP Fructosa-1,6-bifosfato GA1,3DP Gliceraldehído-1,3-

difosfato GA3P Gliceraldehído-3-fosfato G6P Glucosa-6-fosfato Glc Glucosa Lac Lactato NAD+ Nicotin-adenin

dinucleotido oxidado NADH+H Nicotin-adenin

dinucleotido reducido PEP Fosfoenolpiruvato Pi Fosfato inorgánico 2PG 2 fosfoglicerato 3PG 3 fosfoglicerato PTA Fosfotransacetilasa PIR Piruvato Xil Xilosa

xii

PARÁMETROS DE CULTIVO

Símbolo Definición Unidades µ Velocidad específica de

crecimiento. h-1

DG´° Energía libre de Gibbs KJ/mol DCW Peso seco de células (por sus

siglas en inglés: Dry Cellular Weight).

gDCW/l

qP Flux (velocidad específica) de formación de producto.

gP/gDCW.h

qS Flux (velocidad específica) de consumo de sustrato.

gS/ gDCW .h

UI Unidades internacionales de actividad enzimática

µmolesSUSTRATO transformados/min

XMAX

Biomasa máxima alcanzada durante la fase de crecimiento exponencial.

gDCW/l

YP/S Rendimiento producto / sustrato. gP/ gS

YX/S Rendimiento biomasa / sustrato. gDCW/ gS

YP/S Rendimiento producto / sustrato. gP/ gS

SUBINDICES

Bs Bacillus stearothermophilus

Ec Escherichia coli

Glc Glucosa

Xyl Xilosa

Zm Zymomonas mobilis

xiii

RESUMEN _________________________________________________________________________________________________________

Resumen.

El futuro agotamiento del petróleo plantea la necesidad de producir combustibles a

partir de materiales renovables. Los hidrolizados de residuos agroindustriales

proporcionan grandes cantidades de azúcares que pueden ser convertidos en etanol

por cepas de Escherichia coli modificadas por ingeniería metabólica. Después de la

glucosa, la xilosa es el azúcar más abundante en dichos hidrolizados, por tal razón en

este estudio se llevó a cabo empleando xilosa como fuente de carbono en condiciones

anaeróbicas. Se evaluó el efecto de sobreexpresar genes del metabolismo central de

E. coli etanologénica KO11 (la cual contienen los genes pdc y adhII de Zymomonas

mobilis integrados al cromosoma), sobre la velocidad específica (flux) de formación de

etanol. K011 se transformó con derivados del vector pTrc99A conteniendo genes

homólogos (Ec= E. coli) y heterólogos (Bs= Bacillus stearothermophilus, Zm= Z.

mobilis), que codifican para las enzimas: permeasa de galactosa (GALPEc), fosfofructo

cinasa (PFKEc), fosfoglicerato cinasa (PGKEc), piruvato cinasa (PYKBs) y piruvato

decarboxilasa (PDCZm).

Los resultados obtenidos muestran que en KO11: 1) la sobreexpresión de galpEc o

pgkEc no afecta su comportamiento fisiológico; 2) la sobreexpresión de pfkEc o pykBs

ocasiona decrementos en el flux de formación de consumo de xilosa y de formación de

etanol; 3) como respuesta a un incremento en la disponibilidad de piruvato y actividad

limitante de PdcZm en la formación de etanol, el incremento en la actividad de pykBs

origino un aumento en la producción de ácido láctico; y 4) de manera relevante con la

sobreexpresión de PdcZm se lograron incrementar los flujos de consumo de xilosa y de

formación de etanol, así como una marcada reducción en los flujos de síntesis de

ácidos orgánicos, como consecuencia se logró incrementar el rendimiento teórico de

conversión de xilosa en etanol de 60% a 80%. Los resultados obtenidos permiten

plantear la sobreexpresión simultánea de pdcZm con pfkEc o pykBs para mejorar el

rendimiento de etanol y los flujos glicolítico y de formación de etanol en KO11.

1

INTRODUCCIÓN _________________________________________________________________________________________________________

1.-INTRODUCCIÓN

1.1 Energía a partir de fuentes renovables En el contexto actual de incrementos de precios, disminución de reservas y falta de

certeza en el suministro del petróleo; la necesidad de conservar y buscar nuevas

fuentes de energía se ha convertido en una necesidad para las principales actividades

de la humanidad. Entre las posibles opciones para obtener fuentes alternas de energía,

destaca la obtención de energía a partir de biomasa (residuos agroindustriales o

energía almacenada en forma de carbohidratos en material vegetal) es una opción que

ha recibido atención especial en varias partes del mundo. La biomasa es una fuente de

energía que tiene varias ventajas, no obstante su característica renovable es el punto

clave. Los equipos y sistemas diseñados por los humanos para colectar y almacenar

energía solar son costosos e ineficientes si se les compara con el almacenamiento de

energía en la biomasa mediante la fotosíntesis. La biomasa también tiene una

versatilidad única, la lista de especies de plantas, sub-productos y materiales de

desecho que pueden ser utilizados es casi interminable. Con las tecnologías que

actualmente se encuentran en desarrollo, se podrán producir combustibles renovables,

que sustituyan a los combustibles fósiles en gran parte de sus roles actuales (Martínez

et al., 2002).

Los intentos para utilizar a la biomasa como fuente de energía no es nueva, los

combustibles tales como madera, carbón, rastrojos etc., han sido empleados como

fuente de calor durante miles de años. De hecho en nuestros días, en los países en

vías de desarrollo, una gran parte de las personas usan formas de energía

relacionadas con la biomasa, siendo ésta la principal fuente de energía que consumen.

2

INTRODUCCIÓN _________________________________________________________________________________________________________

1.2 Etanol

Probablemente uno de los retos más difíciles de la presente búsqueda de sustitutos de

combustibles derivados del petróleo son los carburantes líquidos alternos. La

producción de etanol a partir de la biomasa es una de las pocas opciones que es viable

actualmente (Mielenz, 2001). Existen tecnologías que están en proceso de maduración;

se pueden utilizar una gran variedad de materias primas; y el etanol producido es un

compuesto valioso y versátil, ya que puede ser utilizado como oxigenante, carburante,

solvente o ser transformado, mediante tecnologías ya establecidas, en otros

combustibles (p. ej. biodiesel) (Bungay, 2004).

El programa más grande de producción de etanol por tecnologías biológicas

sustentables ha sido desarrollado por Brasil. La producción de etanol ha sido

promovida desde 1975, cuando el Programa Nacional de Alcohol (Pro-alcohol) fue

establecido con el fin de reducir el déficit generado por las compras de petróleo y por

las alzas del precio de éste durante la década de los setentas. En ese país en 1981

mas de 450 000 automóviles funcionaban con etanol anhidro o etanol al 96% (Vergara

y Castello-Branco, 1981). Hoy en día, Brasil produce más de 15 mil millones de litros de

etanol al año y el 40% de los automóviles que circulan emplean mezclas de gasolina-

etanol que contienen 95% (v/v) de etanol (combustible conocido como E95), el resto

utiliza mezclas que contienen 22% (v/v) del mismo alcohol.

El etanol puede ser usado para una gran variedad de aplicaciones, la principal

aplicación discutida en esta tesis es la de carburante líquido que permita oxigenar,

sustituir o complementar a los combustibles fósiles que actualmente se utilizan en los

motores de combustión interna. Otras aplicaciones del etanol son como combustible en

calderas industriales, lámparas, estufas, turbinas, etc.

Comparados en términos volumétricos, el contenido energético del etanol es de

aproximadamente dos tercios de la energía contenida en la gasolina o diesel. Sin

3

INTRODUCCIÓN _________________________________________________________________________________________________________

embargo, el etanol tiene un alto valor de número de octano, lo cual ocasiona que los

motores que usan mezclas gasolina-etanol tengan una mejor eficiencia. Las mezclas

que contienen hasta un 22% (v/v) de etanol pueden ser usadas exitosamente en los

motores a gasolina actuales, esto es sin la necesidad de realizar modificaciones a los

motores de combustión interna.

Otra alternativa de uso del etanol es la de oxigenante. Con el fin de mejorar la

combustión y reducir los niveles producidos de monóxido de carbono, las gasolinas

necesitan elevar su octanaje sin utilizar plomo, para ello se han venido usando

alcoholes y ésteres. Actualmente en México se usan los éteres de terbutilo, de los

cuales el metil terbutil éter (MTBE) es el más utilizado. No obstante, hoy día se sabe

que estos compuestos se pueden acumular en los mantos freáticos, que son

recalcitrantes a la degradación química o biológica, y que en concentraciones de partes

por millón son cancerígenos para los humanos. Cabe señalar que en el año 2000 el

gobierno del estado de California (EUA) prohibió su uso y su completa sustitución en el

2003, y que dicha prohibición fue prolongada para el año 2005. El uso de etanol en

mezclas con gasolina ha sido evaluado por investigadores del Instituto Mexicano del

Petróleo (IMP) y cumple con los requisitos de un oxigenante de alta calidad (Schifter et

al., 2001). En la Tabla 1.2.1 se muestran las ventajas que el etanol tiene como

oxigenante de la gasolina con respecto al MTBE.

Tabla 1.2.1 Ventajas de la utilización del etanol como oxigenante y combustible

•Mayor octanaje que la gasolina

•Biodegradable

•En mezclas gasolina-etanol sustituye el uso

de oxigenantes

•No es cancerígeno

•Alto contenido de oxígeno (34.8%)

•Reducción de emisiones de CO2

•Renovable

•Producción por tecnología sustentable

4

INTRODUCCIÓN _________________________________________________________________________________________________________

1.3 Potencial para la producción de Etanol a partir de residuos

agroindustriales. El etanol puede ser obtenido de materiales renovables como la sacarosa de caña, de

remolacha, melazas, suero de leche, almidones, cereales (maíz, trigo, sorgo o cebada)

en los cuales, previo tratamiento de la materia prima, la glucosa es la fuente de

carbono que las levaduras, como Saccharomyces cerevisiae, pueden utilizar a manera

de sustrato para crecer, obtener energía y producir etanol. Otra alternativa es la

utilización de materiales lignocelulósicos (residuos agroindustriales) que constituyen

una fuente barata y viable, en los que se incluyen, entre otros, rastrojo de maíz, paja de

arroz, papel, residuos de madera y bagazo de caña (Ingram et al., 1999).

En el caso de México, a diferencia de otros países como EUA, la obtención de Etanol a

partir de maíz u otros cereales no es una alternativa viable, ya que además de que

algunos son utilizados en el consumo humano no se producen en cantidades

suficientes para cubrir las necesidades de alimentación del país. Tampoco la sacarosa

proveniente de la caña de azúcar, y que en Brasil es utilizada en el programa

ProAlcohol, constituye una materia prima alterna para nuestro país, debido a que la

demanda requerida de etanol carburante es elevada (Martínez et al., 2002). Sin

embargo, la biotecnología moderna posee herramientas que ofrecen alternativas, como

la utilización de microorganismos mejorados genéticamente, que pueden degradar los

desechos agroindustriales. Por esta razón se están planteando proyectos para aplicar y

desarrollar tecnologías que permiten incorporar los residuos agroindustriales.

5

INTRODUCCIÓN _________________________________________________________________________________________________________

Figura 1.3.1 Proceso para obtener etanol a partir de residuos agroindustriales con el uso de microorganismos mejorados genéticamente.

SSF: Sacarificación y Fermentación Simultánea. L/S: Líquido/Sólido.

Los residuos agroindustriales están constituidos por una gran cantidad de azúcares

almacenados en forma de polímeros, los cuales al ser hidrolizados potencialmente

pueden ser fermentados a etanol. La lignocelulosa esta compuesta de celulosa,

hemicelulosa y lignina, en la figura 1.3.1 se muestra el proceso propuesto para la

obtención de etanol a partir de residuos agroindustriales. En este diagrama, primero se

genera un jarabe de hemicelulosa mediante la hidrólisis con ácido diluido. En el caso

particular del bagazo de caña –residuo agroindustrial que es abundante en nuestro

país-, éste está compuesto de 30-40% de hemicelulosa y de 30-50% de celulosa

(Ingram et al., 1999). Específicamente, la hemicelulosa contiene, además de glucosa y

manosa, un 85% de pentosas (Martínez et al., 2000; Martínez et al., 2001),

6

INTRODUCCIÓN _________________________________________________________________________________________________________

principalmente xilosa y pequeñas cantidades de arabinosa. Dicho jarabe no puede ser

fermentado por los organismos etanologénicos silvestres como S. cerevisiae o

Zymomonas mobilis, dado que estos microorganismos no tienen la capacidad de

metabolizar pentosas (Hahn-Hagerdal et al., 1993). Por tal razón se ha hecho uso de la

ingeniería de vías metabólicas para diseñar organismos que sean capaces de

metabolizar pentosas y producir etanol con rendimientos cercanos al teórico.

Actualmente en México la industria azucarera tiene como subproducto 14.1 millones de

toneladas de bagazo de caña al año, los cuales pueden ser convertidos con el uso de

herramientas biotecnológicas en 7.05 millones de litros de etanol al día, que

representaría aproximadamente el equivalente energético del 4.7% del mercado de

gasolina consumida al día (Martínez et al., 2002). En consecuencia, en el

Departamento Ingeniería Celular y Biocatálisis de la Universidad Nacional Autónoma de

México se trabaja en un proyecto para producir etanol carburante a partir del bagazo de

caña. En este proyecto se pretenden desarrollar biotecnologías y procesos químicos

para convertir de manera eficiente ese residuo en etanol y aprovechar de forma integral

la caña de azúcar. Además, dentro de este contexto, el uso del bagazo de caña podría

ayudar a revitalizar la industria azucarera nacional y, por otro lado, a futuro se evitaría

una crisis energética en México, pues ayudaría a aplazar el agotamiento de las

reservas de petróleo en México, las cuales están estimadas para agotarse en el año

2025 – 2030 (PEMEX, 2002).

7

ANTECEDENTES _________________________________________________________________________________________________________

2.- ANTECEDENTES

La lignocelulosa representa aproximadamente el 90% del peso seco de la mayoría del

material vegetal, es un recurso renovable en el cual se almacena la energía solar en

forma de carbohidratos (celulosa, hemicelulosa, pectina, etc.; Figura 2.1.) o polímeros

aromáticos (lignina) (Ingram et al., 1999). La celulosa, que constituye del 20 – 50 % del

peso seco, es un homopolímero de celobiosa que a su vez es un dímero de glucosa. La

hemicelulosa constituye del 20 – 40 % del peso seco, es un heteropolímero complejo

que esta formado por una mezcla de pentosas (xilosa, arabinosa), hexosas (glucosa,

manosa, galactosa), y grupos acetilo, entre otros. La pectina que constituye del 2 - 20%

del peso seco es un homopolímero metilado del ácido poligalacturónico. Estos tres

polímeros de carbohidratos son fuentes potenciales de azúcares que pueden ser

fermentados para la producción de etanol. La lignina es un termoplástico biológico

compuesto por residuos aromáticos que no puede ser fermentado a etanol, pero puede

ser usado como combustible o bien como plástico biodegradable. Los polímeros de

carbohidratos primero deben ser hidrolizados en azúcares solubles para poder ser

fermentados. En contraste con el almidón, el cual es términos relativos es fácilmente

despolimerizado (por calor y bajas cantidades de amilasas), la lignocelulosa ha

evolucionado para proveer a la célula de una mejor protección contra bacterias u

hongos, de esta forma se explica la dificultad para ser hidrolizada de forma eficiente por

enzimas. Este hecho plantea la necesidad de realizar algún tratamiento químico o físico

para facilitar la hidrólisis enzimática de la celulosa y hemicelulosa. No obstante la

hidrólisis enzimática de la hemicelulosa es muy compleja y poco eficiente, pero se sabe

que la hidrólisis con ácidos diluidos es el tratamiento que tiene mejores rendimientos.

De esta manera, de la hidrólisis con ácido sulfúrico diluido (1-2%) a temperaturas de

120 – 200 oC se obtienen jarabes con concentraciones totales de azúcar en el intervalo

de 70 – 110 g/l (Grohmann et al., 1985; du Prezz, 1994; Mc Millan, 1994). En estos

jarabes se obtiene una mezcla de pentosas y hexosas, siendo la xilosa la más

abundante (hasta un 85%) (Martínez et al., 2000).

8

ANTECEDENTES _________________________________________________________________________________________________________

Hemicelulosa 20-40%

Celulosa 20-50%

Pectina 2% Otros 8%

Lignina 10-20%

Figura 2.1 Composición de la lignocelulosa. (Ingram et al., 1999).

2.1 Organismos etanologénicos silvestres. 2.1.1 Saccharomyces cerevisiae

Es el organismo que tradicionalmente se usa para la producción de etanol a partir de

glucosa, proveniente de la hidrólisis del almidón de granos y de sacarosa, proveniente

de caña de azúcar o remolacha. Este microorganismo carece de la habilidad para

metabolizar pentosas (Hahn-Hagerdal et al., 1993).

2.1.2 Zymomonas mobilis

Es una bacteria Gram negativa, tiene la habilidad nativa para producir etanol con

buenos rendimientos, debido a sus características metabólicas, entre las que destacan

dos actividades enzimáticas muy eficientes: piruvato decarboxilasa (Pdc) y alcohol

deshidrogenasa (Adh), que convierten el piruvato en acetaldehído y etanol,

9

ANTECEDENTES _________________________________________________________________________________________________________

respectivamente. Sin embargo, como también sucede con S. cerevisiae, Z. mobilis está

limitada en los azúcares que puede metabolizar; únicamente puede utilizar sacarosa,

glucosa y fructosa, y no utiliza a la xilosa. Se han hecho intentos para lograr que Z.

mobilis metabolize pentosas, cuatro genes de E. coli necesarios para el metabolismo

de xilosa fueron introducidos a Z. mobilis usando promotores glicolíticos para dirigir la

expresión (Zang et al., 1995). El resultado fue exitoso pero no se han lograron obtener

los altos rendimientos esperados, ni las elevadas velocidades, en la conversión de

xilosa a etanol, de hecho, la cepa recombinante resultante produjo niveles inferiores de

etanol a partir de xilosa que los logrados anteriormente con las cepas modificadas de

E. coli. Además las cepas modificadas de Z. mobilis todavía carecían de la habilidad

para fermentar otros azúcares presentes en los hidrolizados de hemicelulosa y son

particularmente sensibles a los inhibidores presentes en dichos hidrolizados.

2.2 Ingeniería de vías metabólicas para la producción de etanol con E. coli.

La ingeniería de vías metabólicas permite el mejoramiento directo de las propiedades

celulares a través de la modificación de reacciones bioquímicas específicas o la

introducción de nuevas usando tecnología de ADN recombinante (Stephanopoulos,

1999). El mejoramiento de las técnicas de biología molecular para la recombinación de

ADN introduce una nueva dimensión para la modificación de vías metabólicas. La

ingeniería genética permite la introducción de genes que codifican para enzimas que

habilitan la modificación de reacciones específicas en las vías metabólicas. Estas

herramientas han sido usadas para crear cepas etanologénicas capaces de

metabolizar los azúcares presentes en los hidrolizados de los residuos agroindustriales

y convertirlos en etanol.

Escherichia coli es una enterobacteria que tiene la habilidad de metabolizar una amplia

variedad de hexosas (glucosa, fructosa, manosa y galactosa, entre otros) y pentosas

(xilosa, arabinosa, ribosa, entre otros), adicionalmente tiene una ruta para producir

etanol de manera silvestre, sin embargo la cantidad de alcohol que se produce por esta

vía es muy baja: Además produce una mezcla de productos de fermentación, entre los

10

ANTECEDENTES _________________________________________________________________________________________________________

que se encuentran los ácidos acético, fórmico, succínico, y láctico (Tao et al., 2001;

Gonzales et al., 2002; Dien et al., 2003; Lawford y Rousseau 1996; Lawford y

Rousseau, 1997), y mediante el uso de la Ingeniería de vías metabólicas se ha logrado

desviar el flujo de carbono hacia una vía heteróloga de producción de etanol en E. coli

B, obteniendo cepas capaces de dar buenos rendimientos en la fermentación de

glucosa o xilosa a etanol (Otha et al, 1991).

2.2.1 Escherichia coli KO11

La cepa KO11, es la cepa etanologénica derivada de E. coli B, obtenida por integración

en cromosoma del operon pet, el cual contiene los genes pdc y adhB de Z. mobilis bajo

el control de la región de regulación de la piruvato formato-liasa (pfl). (Ingram, et al.

1999, Ohta et al. 1991). El operon pet fue integrado interrumpiendo el gene pfl, de

manera que la cepa KO11 produce etanol expresando los genes pdc y adhII integrados

en cromosoma, (Ingram et al. 1998). Además, la cepa KO11 contiene una interrupción

en el gen que codifica para la fumarato reductasa (frd), lo cual permitió disminuir la

producción de ácido succínico (Ingram et al. 1999).

En la figura 2.2.1 se observan los productos de fermentación que se han obtenido al

cultivar a E. coli KO11 bajo diferentes condiciones. La redirección del flujo de carbono

hacia la formación de etanol se lleva a cabo por varias razones en KO11: PDC tiene un

valor de Km casi 18 veces más bajo que LDH y más bajo que cualquier otra enzima

que compita por el piruvato en condiciones anaeróbicas; además esta enzima se

produce en grandes cantidades junto con ADHII (Ingram et al., 1999). Cabe aclarar que

la expresión del complejo de la piruvato deshidrogenasa (PDH), la cual tiene una alta

afinidad por el piruvato, está regulada por los niveles de oxígeno y su expresión, y por

consiguiente actividad enzimática, es reducida en condiciones no aireadas. En KO11 el

principal producto de fermentación es el etanol y en condiciones no aireadas y medio

rico suplementado con glucosa o xilosa el rendimiento de conversión de xilosa o

glucosa a etanol es mayor al 90% del teórico (0.51 gEt-OH/gAZÚCAR) y se reduce

drásticamente la producción de ácidos orgánicos (Ver Tabla 2.2.1). Este cambio en los

11

ANTECEDENTES _________________________________________________________________________________________________________

productos de fermentación y en el flujo de producción de etanol conduce a un

incremento en el flujo glicolítico. En comparación con su cepa progenitora (E. coli B), en

KO11 se observan incrementos del 34%, 30% y 30% en la producción de biomasa,

velocidad específica de crecimiento y flux glicolítico (Tao et al., 2001).

Fumarato

E. coli KO11

Embden-Meyerhof-Parnas Entner-Doudoroff Vía de las Pentosas

PIRUVATOLactato

Acetato

Acetil-CoA

CO2 H2

Etanol

PDH (0.4 mM)

LDH (7 mM)

PFL (2 mM)PDC (0.4mM)

Acetaldehído +CO2

ADHII (0.012mM)

Vía heteróloga proveniente de Zymomonas mobilis

Formato

Etanol

HEXOSAS + PENTOSAS

KO11:E. coli B: pfl::pdc adhB cat,

Dfrd

Otha et al, 1993; Böck y Sawers 1996; Ingram et al., 1998; Ingram et al., 1999

Malato

MDH

FUM

FRD

Oxalacetato

FOSFOENOLPIRUVATO

TCA

PPC

Succinato

Citrato

CitratoACK

PTAADH FHL

Fumarato

E. coli KO11

Embden-Meyerhof-Parnas Entner-Doudoroff Vía de las Pentosas

PIRUVATOLactato

Acetato

Acetil-CoA

CO2 H2

Etanol

PDH (0.4 mM)

LDH (7 mM)

PFL (2 mM)PDC (0.4mM)

Acetaldehído +CO2

ADHII (0.012mM)

Vía heteróloga proveniente de Zymomonas mobilis

Formato

Etanol

HEXOSAS + PENTOSAS

KO11:E. coli B: pfl::pdc adhB cat,

Dfrd

Otha et al, 1993; Böck y Sawers 1996; Ingram et al., 1998; Ingram et al., 1999

Malato

MDH

FUM

FRD

Oxalacetato

FOSFOENOLPIRUVATO

TCA

PPC

Succinato

Citrato

CitratoACK

PTAADH FHLxxx

Figura 2.2.1Metabolismo de pentosas y hexosas en E. coli KO11 en condiciones anaeróbicas

Km (en milimoles, valores entre paréntesis) de las enzimas que compiten por el piruvato en KO11 y productos de fermentación (en recuadros). Nomenclatura: ACK, acetato cinasa; ADH, alcohol deshidrogenasa homóloga; ADHII, alcohol deshidrogenasa heteróloga; FHL, formato hidrógeno liasa; FUM, fumarasa; FRD, fumarato reductasa; LDH, lactato deshidrogenasa; MDH, malato deshidrogenasa;

12

ANTECEDENTES _________________________________________________________________________________________________________

PDC, Piruvato decarboxilasa; PDH, piruvato deshidrogenasa; PFL, piruvato formato liasa; PPC Fosfoenolpiruvato carboxilasa; PTA, fosfotransacetilasa.

Tabla 2.2.1 Productos de fermentación reportados para KO11 y E. coli B bajo diferentes condiciones.

(CSL: Sólidos de licor de maíz).

Medio/Cepa Concentración de Producto (mM) Referencia

Luria-Glc 20% Etanol Acético Fórmico Láctico Succínico

E. coli B 87 66 16.7 266 2.9 Ohta et al. 1991; Lawford y

Rousseau, 1996

KO11 1148 4 11 32.1 2 Ohta et al., 1991; Lawford

y Rousseau, 1997

Luria-Xil 10%

E. coli B 38.6 12.6 13.6 3 2.2 Gonzalez et al., 2003

KO11 904 6 18 3 0 Gonzalez et al., 2003

CSL-Xil 10%

E. coli B 71 90.4 94.3 18.1 53.1 Underwood et al., 2002a

KO11 150 23 18.6 2.6 0.2 Underwood et al., 2002a

2.2.2 Evaluación de E.coli B y KO11 en medio mínimo-glucosa.

Como ya se ha mencionado KO11 presenta rendimientos de conversión de xilosa o

glucosa mayores al 90% del teórico, y la producción de ácidos orgánicos se reduce

drásticamente, cuando es cultivada en condiciones no aireadas y en medios ricos

suplementados con glucosa o xilosa; sin embargo en términos económicos no es

factible el uso de medios ricos para la producción industrial de etanol (Martinez et al.,

1999). La tabla 2.2.2 muestra la comparación de parámetros cinéticos y rendimiento de

etanol entre E. coli B y KO11 en medio mineral con aproximadamente 4% de glucosa

(Huerta-Beristain, 2004). En dichas condiciones, durante la fase exponencial de

crecimiento KO11 presenta velocidades específicas de crecimiento, de consumo de

13

ANTECEDENTES _________________________________________________________________________________________________________

glucosa, de producción de etanol y de consumo de base 2, 6, 6.8 y 2.3 veces mayores

con respecto a E. coli B. Durante la fase estacionaria los flujos de consumo de glucosa

y base son similares para ambas cepas, sin embargo el de formación de etanol es 4.3

veces mayor para KO11. A diferencia del rendimiento previamente reportado para

KO11 en medio rico (mayor a 90%), donde los componentes del medio son utilizados

para que la célula crezca y la fuente de carbono es usada para formar los productos de

fermentación y energía, el rendimiento global de conversión de glucosa en etanol para

KO11 fue únicamente del 71% en medio mineral con glucosa (Huerta-Beristain, 2004).

Tabla 2.2.2 Comparación de parámetros cinéticos y rendimiento de etanol entre E. coli B y KO11 en medio mineral - glucosa.

Los datos son el promedio de dos réplicas con su respectivo error estándar (Tomado de: Huerta-Beristain, 2004).

Parámetro Fase exponencial E. coli B KO11

Fase estacionaria E. coli B KO11

µ (h-1) 0.23 ± 0.01 0.49 ± 0.02 ----- ---- qS (gGlc/ gDWC.h) 0.76 ± 0.01 4.64 ± 0.61 0.82 ± 0.10 0.87 ± 0.10 qP (gEt-OH/gDWC.h) 0.15 ± 0.01 1.02 ± 0.11 0.085± 0.03 0.36 ± 0.06 qKOH (mlKOH/.h) 2.05 ± 0.06 4.77 ± 0.84 0.40 ± 0.03 0.57 ± 0.13

Rendimiento global de conversión de glucosa a etanol (% del teórico) E. coli B = 25.1% KO11 = 70.5%

Adicionalmente en las mismas condiciones indicadas en el párrafo anterior, Huerta-

Beristain (2004) encontró que incrementando la actividad de Pdc o Pdc-AdhII en KO11

se logra incrementar en rendimiento de conversión de glucosa en etanol hasta 85%.

Este dato sugiere que la actividad de Pdc aún es limitante en KO11 para convertir

glucosa en etanol y que es necesario evaluar que comportamiento se presenta cuando

se evalúa la producción de etanol en medio mineral suplementado ahora con xilosa.

14

ANTECEDENTES _________________________________________________________________________________________________________

2.3 Puntos de Regulación de la Glucólisis

Se ha sugerido que el control del flujo glicolítico está en los puntos de la utilización de

azúcar, o de las reacciones que catalizan enzimas tales como la hexo cinasa, la

fosfofructo cinasa (Pfk) o la piruvato cinasa (Pyk) (Galazzo y Bailey 1990, Cortassa y

Aon 1994, Stryer, 1999). Las enzimas fosfofructo cinasa, fosfoglicerato cinasa y

piruvato cinasa son enzimas que intervienen en el consumo y generación de ATP,

catalizan las reacciones que presentan los mayores valores absolutos de ∆G′°

exergónicos de la glicólisis y dos de estas enzimas están reguladas alostéricamente

(Figura 2.3.1). La fosfofructo cinasa, cataliza la reacción irreversible de fructosa 6

fosfato a fructosa 1,6 difosfato: es inhibida por ATP y por fosfoenolpiruvato y es

estimulada por AMP, ADP y fructosa6-fosfato, además tiene una ∆G′ de –14.2 kJ·mol-1.

La piruvatocinasa, genera ATP a través de la reacción que forma piruvato a partir de

fosfoenolpiruvato: es activada por AMP y ribosa 5 fosfato y tiene el valor mas alto de

∆G′° (-31.4 kJ/mol). La fosfoglicerato cinasa cataliza la conversión de glicerato 1,3

difosfato en 3 fosfoglicerato y ATP, reacción que es parcialmente reversible y que tiene

una ∆G′ de –18.5 kJ·mol-1.

2.4 Comparación de la expresión de genes glicolíticos en KO11

Los estudios de microarreglos genéticos permiten cuantificar los niveles de expresión

de muchos genes a la vez y ofrecen, entre otra información, una oportunidad única

para investigar las consecuencias de la ingeniería metabólica. Su análisis provee

información respecto al nivel de expresión genética en comparación con una condición

de referencia, lo cual permite postular, p. ej. cómo está regulado un gen, cómo afecta

una mutación la expresión de otros genes, cómo afecta la sobreexpresión de uno a

varios genes los niveles de expresión de muchos genes del metabolismo central del

carbono, etc. En un estudio de microarreglos genéticos de KO11 creciendo en

condiciones anaeróbicas en medio rico suplementado con xilosa, en comparación con

la cepa progenitora E. coli B, se observó que se sobreexpresan significativamente 14

genes de la vía de xilosa a piruvato y seis de estos corresponden a la glucólisis (pfkA,

15

ANTECEDENTES _________________________________________________________________________________________________________

fbaA, tpiA, gapA, pgk y pykF) (Tao et al., 2001), esto sugiere que uno o más de estas

enzimas puede potencialmente limitar el flujo glicolítico en KO11 (Figura 2.4.1).

GLUCOSA

G6P

F6P

F-1,6-DP

GA2P

PEP

PYR

pyk

pfkA

pgk

ATP

ADP

ADP

ATP

yib

eno

DHAP

GA1,3DP

GA3P

GA3P tpiA

ATP ADP

NAD+ + Pi NADH+ + H+

gapA

fbaA

AcAld

CO2

pdc

NADH+ + H+

4.4

7.5

-18.5

-31.4

+AMP

+F1,6DP

-ATP

1.7

∆G’0

(kJ/mol)

-14.2

23.8

6.3

-16.7

7.5

+AMP

+ADP -PEP

-G6P

adhB Etanol

NAD+ + Pi

pgi

-ATP

Figura 2.3.1 Esquema de la glicólisis y la desviación de piruvato a etanol, incluyendo la regulación enzimática, consumo y generación de ATP y NAD, y cambios de ∆G´°.

Los símbolos en las elipses indican; (+) activadores e (–) inhibidores (Nelson y Cox 2000, Fraenkel, 1996).

16

ANTECEDENTES _________________________________________________________________________________________________________

GLUCOSA GLUCOSA- 6-P

FRUCTOSA-6-P

FRUCTOSA-1,6-DP

1,3-DIFOSFOGLICERATO

3-FOSFOGLICERATO

2-FOSFOGLICERATO

FOSFOENOLPIRUVATO

PIRUVATO

*pykF

*pfkA

ETANOL

*pdc adhB

XILULOSA

XILULOSA-5-P

RIBULOSA-5-P

XILOSA

*pgk

ACETALDEHIDO

*tpiA

ATP

ATP

ADP

ADP

ATP

ADP

NAD+ + Pi

ATP

NADH + H+

PIR

ADP

PEP

PTS

*gapA

yib

eno

xylB

rpe

CO2Tao, et al. 2001*GENES SOBREEXPRESADOS

VÍA DE LAS PENTOSAS

*fbaA

NADH+H+ NAD+

DIHIDROXI-ACETONA-FOSFATO

GLICERAL-DEHIDO-3P

XylE

XylDGH

GLUCOSA GLUCOSA- 6-P

FRUCTOSA-6-P

FRUCTOSA-1,6-DP

1,3-DIFOSFOGLICERATO

3-FOSFOGLICERATO

2-FOSFOGLICERATO

FOSFOENOLPIRUVATO

PIRUVATO

*pykF

*pfkA

ETANOL

*pdc adhB

XILULOSA

XILULOSA-5-P

RIBULOSA-5-P

XILOSA

*pgk

ACETALDEHIDO

*tpiA

ATP

ATP

ADP

ADP

ATP

ADP

NAD+ + Pi

ATP

NADH + H+

PIR

ADP

PEP

PTS

*gapA

yib

eno

xylB

rpe

CO2Tao, et al. 2001*GENES SOBREEXPRESADOS

VÍA DE LAS PENTOSAS

*fbaA

NADH+H+ NAD+

DIHIDROXI-ACETONA-FOSFATO

GLICERAL-DEHIDO-3P

XylE

XylDGHXylDGH

Figura 2.4.1 Análisis de sobreexpresión de genes de la vía glicolítica en condiciones anaeróbicas con la cepa etanologénica KO11 en xilosa.

17

ANTECEDENTES _________________________________________________________________________________________________________

2.5 Sobreexpresión de genes del metabolismo central de carbono como una estrategia para aumentar el flux glicolítico en E. coli etanologénica

La sobrexpresión de genes de la vía glicolítica ha sido una estrategia bastante

estudiada para incrementar el flujo de carbono en varios microorganismos,. En el caso

de E. coli etanologénica se han hecho estudios con células en reposo (resting cells:

células en las cuales se detiene la síntesis de proteínas y por ende el crecimiento por la

adición de cloramfenicol u otro agente químico, manteniendo activas las enzimas)

(Emmerling et al., 1999, Emmerling et al., 2000). En esos trabajos se ha estudiado la

sobreexpresión individual y simultánea de genes de la glicólisis en diferentes

condiciones. Los resultados más relevantes por estos investigadores los obtuvieron con

las cepas etanologénicas de E. coli cosechadas en la fase exponencial de cultivos

aeróbicos e incubadas en anaerobiosis. Al sobreexpresar la piruvato cinasa heteróloga

de Bacillus stearothermophilus (PykBs) se observan incrementos del 10% en el

consumo de glucosa y 15% en la producción de etanol, además de una reducción del

50% del flujo hacia la producción de D-Lactato. La sobreexpresión simultánea de la

fosfofructo cinasa (PfkEc) y piruvato cinasa (PykEc) homólogas de E. coli dieron como

resultado un aumento del 25% y 35% de consumo de glucosa y producción de etanol

respectivamente, sin afectar la producción de D-Lactato (Emmerling et al.,2000). No

obstante es importante aclarar que cuando las células de E. coli son incubadas en

anaerobiosis a partir de células cosechadas en la fase exponencial de cultivos

aeróbicos, la expresión del gen de la lactato deshidrogenasa es prácticamente nula y

en consecuencia la sobreexpresión de los genes indicados permite que los incrementos

de actividad enzimática obtenidos generen mayores flujos de producción de etanol

debido a que el flujo de carbono no se desvía hacia la producción de ácido láctico.

Adicionalmente, dichos estudios con células en reposo permiten comprender

parcialmente desde el punto de vista de control de flujo que sucede con las reaciones

dentro de la célula, sin embargo para la utilización de E. coli etanologénica en la

producción comercial de etanol, el uso de cultivos aeróbicos para generar inóculos

presenta una desventaja económica en comparación con las levaduras, y el uso de

18

ANTECEDENTES _________________________________________________________________________________________________________

células en reposo no es factible, dado el uso de cloranfenicol y las elevadas cantidades

a producir de etanol

2.6 Evaluación de la sobreexpresión de genes usando glucosa como fuente de carbono.

Al evaluar la sobreexpresión de genes de la vía glicolítica pfkEc, pgkEc y pykBs, de

transporte de azucares galPEc, y de conversión de piruvato en acetaldehído pdcZm en

cultivos en medio mineral-glucosa 4% (Huerta-Beristain, 2004), se observó que la

sobreexpresión de pfkEc y pykBs redujeron las velocidades específicas de producción de

etanol y de consumo de glucosa, sin afectar la velocidad específica de consumo de

base para la fase exponencial. Para la fase estacionaria se observaron los mismos

efectos con excepción de que la velocidad específica de consumo de base se

incremento con la sobreexpresión de pykBs, demostrando con esto un aumento en el

flux de carbono hacia la producción de ácidos orgánicos. Al sobreexpresar pdcZm se

observó un aumento del 41% y 37.4% en la velocidad específica de de producción de

etanol y de consumo de glucosa en fase estacionaria, respectivamente y una reducción

del 51.7% en la velocidad específica de consumo de base. También se obtuvo un

incremento del 70% al 84% en el rendimiento de conversión de glucosa a etanol.

19

PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO _________________________________________________________________________________________________________

3.-PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO

En el presente proyecto se plantearon las siguientes preguntas relacionadas con el

crecimiento y producción de etanol por KO11 en medio mineral suplementado con

xilosa:

¿Cuáles son los principales productos de fermentación de KO11 en condiciones no

aireadas?

¿Es posible incrementar el flujo glicolítico y/o el flux de formación de etanol en KO11

mediante la sobre-expresión individual de alguna de las enzimas de la glicólisis y/o de

la conversión de piruvato en etanol?

Si se incrementa el flux de formación de etanol, ¿es posible disminuir el flux de

formación de ácidos orgánicos?

¿Cuál es la reacción del metabolismo central o fermentativo que podría estar limitando

el flux hacia la formación de etanol?

¿Es posible incrementar el rendimiento de conversión de xilosa cuando se incrementa

el flux de formación de etanol en medio mineral?

20

HIPÓTESIS _________________________________________________________________________________________________________

4.- HIPÓTESIS

En este trabajo se propone como hipótesis que incrementos individuales en la actividad

de enzimas clave involucradas en el transporte de xilosa (GalPEc), y/o del metabolismo

en la glicólisis (PfkEc, PgkEc y PykBs) de E. coli KO11, podrían modificar –incrementar o

disminuir- el flux de carbono hacia la formación de etanol, mediante modificaciones en

el flujo glicolítico. También se plantea que incrementos en la actividad de piruvato

decarboxilasa permitirían aumentar el flux de carbono de piruvato hacia la formación de

etanol, incrementando a la vez el flujo glicolítico y de consumo de xilosa en E. coli

KO11, en condiciones similares a las que se podría llevar a cabo la producción

comercial de etanol a partir de hidrolizados de la fracción hemicelulósica de los

residuos agroindustriales, es decir utilizando medios minerales simples suplementados

con xilosa y células activas en cultivos lote.

21

OBJETIVOS _________________________________________________________________________________________________________

5.- OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL.

Evaluar el efecto de la sobreexpresión de genes del metabolismo de Escherichia coli

etanologénica, relacionados con la conversión de piruvato en acetaldehído y el

consumo y generación de ATP, sobre la velocidad específica de formación de etanol

usando xilosa como fuente de carbono en condiciones anaeróbicas.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

- Evaluar y caracterizar el efecto del incremento individual de las siguientes actividades

enzimáticas: galactosa permeasa (GalPEc), fosfofructo cinasa (PfkEc), fosfoglicerato

cinasa (PgkEc), piruvato cinasa (PykBs) y piruvato decarboxilasa (PdcZm), sobre

parámetros cinéticos y estequiométricos de crecimiento, consumo de xilosa, producción

de ácidos orgánicos y etanol, durante las fases de crecimiento exponencial y

estacionaria de cultivos no aireados en medio mineral-xilosa 40 g/l.

- Determinar los incrementos de actividad enzimática en las construcciones evaluadas.

- Cuantificar la producción de ácidos orgánicos por cromatografía de líquidos de alta

resolución.

- Realizar análisis de flujos y balances de carbono para cada una de las cepas

evaluadas.

METODOLOGIA _________________________________________________________________________________________________________

6.- METODOLOGÍA

6.1 Cepas

En el presente trabajo se utilizaron las cepas de E. coli B (ATCC 11303) y su derivada

etanologénica KO11, la cual tiene integrada en el cromosoma los genes que codifican

para la piruvato decarboxilasa (pdcZm) y la alcohol deshidrogenasa B (adhBZm) de

Zymomonas mobilis (Zm), esta cepa tiene como marcador de selección un gen que le

confiere resistencia a cloramfenicol (Ohta et al. 1991). Para evaluar el efecto de la

sobreexpresión de los genes selectos KO11 fue transformada con derivados del vector

pTrc99a (Pharmacia), conteniendo de manera individual diferentes genes homólogos

(Ec= E. coli) o heterólogos (Bs= Bacillus stearothermophilus, Zm= Z. mobilis), los

cuales codifican para las enzimas GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm. Estos plásmidos

fueron construidos y transformados en KO11 previamente en el laboratorio de

Ingeniería de Vías Metabólicas del Instituto de Biotecnología de la UNAM (Huerta-

Beristain, 2004). El promotor que contiene pTrc99A, trc es inducible por IPTG, además

este vector tiene como marcador de selección un gen que le confiere resistencia a

ampicilina a las cepas que son transformadas con el mismo.

6.2 Condiciones y medios de cultivo

6.2.1 Inóculos para cultivos

A partir de las células congeladas en glicerol (40%) se estriaron placas conteniendo

agar (15 g/L), medio Luria, 20 g/l de Glucosa, Cm 40 mg/l y Amp 200 mg/l, se

incubaron a 35°C de 20 – 24 h y se resembraron de manera sucesiva por 2 días. A

partir de estas células se toman tres colonias grandes, se resuspenden en un tubo de

vidrio con 3 ml de medio LB y se adicionan al matraz que contiene el medio de cultivo

para el inóculo. El crecimiento del inóculo se realizó en matraces de 500 ml,

conteniendo 200 ml de medio mínimo (M9), con 20 g/l de xilosa como fuente de

carbono, temperatura de 35°C y con una agitación de 120 rpm. Los inóculos se

23

METODOLOGIA _________________________________________________________________________________________________________

incubaron durante 14 h, hasta alcanzar una DO600 de aproximadamente 1.3. Todos los

cultivos fueron inoculados centrifugando (5000 rpm, 10 min y temperatura ambiente) la

cantidad suficiente de inóculo para obtener una DO600 inicial de 0.1 (0.037 gDCW/l), las

células fueron transferidas a cada cultivo resuspendiéndolas en el medio respectivo (la

variación de la concentración inicial celular en todos los cultivos se debe al error

experimental).

6.2.2 Medios de cultivo.

La composición del medio mínimo M9 (Maniatis et al., 1982) para cultivo en mini-

fermentadores, contiene por litro: 6 g Na2HPO4; 3 g KH2PO4; 1 g NH4Cl; 0.5 g NaCl; 2

ml de MgSO47H2O 1M; 0.1 ml de CaCl4 0.1M; 0.1 ml de Tiamina 1 mg/ml (esterilizada

por filtración); 40 g de glucosa o xilosa como fuente de carbono; y ampicilina (para

mantener la presión de selección de los plásmidos) 50 mg/l. El medio Luria (Maniatis et

al., 1982) contiene por litro: 10 g Bactotritpona; 5 g extracto de levadura; y 5 g NaCl.

6.2.3 Condiciones de cultivo.

Los cultivos anaeróbicos se realizaron en sistemas de mini-fermentadores o mini-

fleakers (Beall et al., 1991), con un volumen de trabajo de 200 ml. La temperatura se

controló a 35°C y el pH a 7.0 mediante la adición automática de KOH 2N. Para

garantizar el mezclado de los nutrientes, los cultivos se mantuvieron a una velocidad de

agitación de 100 rpm. Las actividades enzimáticas fueron verificadas en extractos

celulares cosechados durante el crecimiento exponencial (8 h). Todos los experimentos

se llevaron a cabo por duplicado. En los resultados se muestran valores promedio y su

error experimental.

El sistema de mini-fermentadores o Fleakers consta de (Ver figura 6.2.1):

a) Un control de temperatura, el cual está integrado por un baño de agua, un sensor de

temperatura y un termo-circulador de agua.

24

METODOLOGIA _________________________________________________________________________________________________________

b) Un control de pH, el cual está integrado por 6 electrodos, 6 controladores y 6

válvulas (solenoides) para la adición de base.

c) Un sistema de agitación o parrilla magnética para 6 magnetos (rango de 100-850

rpm)

d) 6 Mini-fermentadores o fleakers con un volumen nominal de 250 ml y de trabajo de

200 ml, cuyo sistema de agitación consiste en un agitador magnético en forma de cruz

de 1 pulgada.

Fig. 6.2.1 Sistema de Minifermentadores o Fleakers.

25

METODOLOGIA _________________________________________________________________________________________________________

6.3 Métodos analíticos.

6.3.1 Concentración celular

La densidad óptica fue medida a 600 nm en un espectrofotómetro Beckman (DU-70) y

convertida a peso seco de células (DCW: dry cellular weigth), de acuerdo a una curva

de calibración: 1 DO600 = 0.37 gDCW/l. Todas las muestras fueron centrifugadas (5,000

rpm y temperatura ambiente); el paquete celular se desechó y el sobrenadante se

congeló para su posterior análisis.

6.3.2 Determinación de azúcares y ácidos orgánicos.

La determinación de xilosa se llevó a cabo mediante el método de azúcares reductores

del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS; Chaplin y Kennedy, 1987) (Apéndice 9.1). Los

resultados fueron confirmados por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).

Los productos de fermentación, ácidos orgánicos (acético, fórmico, succínico, láctico,

pirúvico, etc.) y glicerol también fueron determinados por HPLC.

Las determinación por HPLC, se llevaron a cabo por cromatografía isocrática con

H2SO4 5 mM como fase móvil a un flujo de 0.5 ml/min en una columna Aminex HPX-

87H (Biorad) a 50°C. La detección de los compuestos separados, se llevó a cabo

simultáneamente con un detector de arreglo de diodos (Waters 996) y un detector de

índice de refracción (Waters 410). El análisis y procesamiento de datos se realizó con

el sistema Milenium (Versión 3.01 Waters). Las temperaturas interna y externa de la

columna fueron ajustadas a 45 y 50ºC respectivamente. Los sobrenadantes de las

muestras a analizar se filtraron con membranas de 0.45 µm y se inyectaron

automáticamente con ayuda del autoinyector (Waters 717). Para la confirmación de los

azúcares y los productos analizados por HPLC se inyectaron estándares de xilosa,

ácidos orgánicos, alcoholes e intermediaros metabólicos. En las tablas 11.4.1 y 11.4.2

del apéndice se muestran los datos de las curvas de calibración que se obtuvieron para

26

METODOLOGIA _________________________________________________________________________________________________________

calcular la concentración de dichos compuestos. Los datos obtenidos de las

concentraciones de cada uno de los compuestos medidos, se calcularon con un

método de calibración-Interpolado del mismo software.

6.3.3 Determinación de etanol.

La determinación de etanol se realizó por cromatografía de gases (Cromatógrafo de

Gases Agilent, Serie 6850, Wilmington, D.E.) utilizando como estándar interno 1-

butanol. Se utilizó He como fase móvil (5.0 ml/min, 19.05 psi y 65 cm/s) a través de una

columna capilar (Innowax 19091N-133E, de 30 m de longitud 0.25 mm de diámetro

interno y con un espesor de película de 0.25 µm, J&W Scientific), y 0.2 µl de

sobrenadante inyectados automáticamente. La detección de los compuestos

separados, se lleva a cabo con un detector de ionización de llama (FID-1A) a 250oC. El

análisis y procesamiento de datos se realizó con el programa Agilent Cerity QA/QC.

Las temperaturas del horno fueron ajustadas con rampas de temperatura de 80°C

hasta 200°C y la del detector a 250°C.

6.3.4 Determinación de proteínas y actividades enzimáticas.

La determinación de proteínas se llevó a cabo por el método de Lowry (Lowry et al.

1951). Los ensayos enzimáticos fueron realizados mediante métodos descritos

anteriormente (Maitra y Lobo 1971; Bergmeyer y Gawehn 1974; Hoppner y Doelle

1983; Sakai et al., 1986; Martínez et al. 1999) (Apéndice 11.2). Después de 8 horas de

cultivo en los mini-fermentadores, las células se ajustan a una DO600 de

aproximadamente 1, se cosechan por centrifugación, se lavan una vez en amortiguador

de fosfato de sodio 50 mM, estas células se resuspenden en 1 ml del mismo

amortiguador; las preparaciones libres de células fueron obtenidas por sonicación (4

pulsos de 14-16 micrones cada uno separados por 1 min) manteniendo al tubo que

contiene las preparaciones en hielo con etanol, para finalmente por centrifugación (10

min, 4°C) obtener un extracto de proteína que se utiliza para llevar a cabo las

determinaciones enzimáticas, Estas determinaciones se llevan a cabo mediante

27

METODOLOGIA _________________________________________________________________________________________________________

reacciones oxido-reducción acopladas a otras enzimas, monitoreando la oxidación o

reducción de NADH+H+ o NAD a 340 nm durante 3 min a 30°C en el espectrofotómetro

Beckman DU-70 (Beckman instrument, Inc. Fullerton, CA.).

6.4 Evaluación de parámetros.

Los parámetros evaluados fueron: velocidad específica de crecimiento (µ); rendimiento

biomasa/sustrato (YX/S); velocidad específica de consumo de azúcar-xilosa (qS);

productos de fermentación formados, así como la velocidad específica de formación de

productos (qP), los cuales se determinaron, por separado durante las fases de

crecimiento exponencial y estacionaria. Las concentraciones fueron corregidas por

factor de dilución en función de la base o ácido adicionado a los cultivos para el control

de pH (Apéndice 11.3.1)

6.5 Análisis de resultados.

Para evaluar si existe una diferencia estadísticamente significativa se llevó a cabo un

análisis de datos aplicando una prueba t de Students no apareada y considerando

distribución de una cola. En la sección de resultados se indican únicamente los valores

de variables que fueron significativamente diferentes a un nivel de confianza del 95%.

28

RESULTADOS Y DISCUSIÓN _________________________________________________________________________________________________________

7.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En esta sección se resumen y analizan los resultados obtenidos en el presente trabajo,

en el apéndice (sección 11) se muestran las cinéticas (con el promedio de dos replicas

y su correspondiente error estándar) de: crecimiento, consumo de xilosa, producción de

etanol y producción de ácidos orgánicos para cada una de las construcciones

evaluadas. Esta evaluación incluye a la cepa no etanologénica (E. coli B), la cepa

etanologénica con los genes pdcZm y adhBZm integrados en cromosoma (KO11); y

KO11 transformada con los siguientes plásmidos: a) pTrc99A (vector control sin

inserto); b) pTrcgalPEc; pTrcpfkEc, pTrcpgkEc, pTrcpykBs y pTrcpdcZm. Los efectos

estudiados se comparan con experimentos control llevados a cabo con la cepa KO11

transformada con el vector pTrc99A sin inserto alguno.

7.1 Evaluación de E. coli B y KO11 en medio mineral-xilosa y de actividad enzimática de PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm.

7.1.1 Comparación de parámetros cinéticos entre E. coli B y KO11 creciendo en medio mineral-xilosa

Como se cita en los antecedentes, KO11 es capaz de convertir concentraciones elevas

de glucosa o xilosa (por ej. 100 g/L) en etanol con rendimiento mayores al 90%

respecto al teórico (>45 g/L de etanol) cuando se emplean medios de cultivo ricos,

además la producción de ácidos orgánicos se reduce drásticamente en comparación

con su cepa progenitora. No obstante, en términos económicos el uso de medios ricos

no es factible para la producción industrial de etanol carburante (Martínez et al., 1999).

Además, no existen reportes donde se evalúe el desempeño de KO11 en medio

mineral metabolizando xilosa.

Por consiguiente como parte inicial del presente trabajo, se caracterizó el catabolismo

de xilosa por E. coli B y KO11 en medio mínimo conteniendo 4% de xilosa. Bajo estas

condiciones, se puede observar (Figura 7.1.1 y Tabla 7.1.1) que durante la fase de

29


crecimiento exponencial (de 0 – 12 h del cultivo), la cantidad de biomasa formada y las

velocidades de crecimiento, de consumo de xilosa, de producción de etanol y de ácidos

orgánicos (excluyendo el succínico, el cual es producido en cantidades mínimas en

KO11 ya que tiene interrumpido el gen que codifica para la fumarato reductasa, Figura

2.2.1) son similares para ambas cepas. Este hecho contrasta con los resultados

reportados para la utilización de xilosa en medio rico, para los cuales con KO11 se

incrementan en promedio un 33% la formación de biomasa, la velocidad específica de

crecimiento y el flux consumo de xilosa, además de que la velocidad volumétrica de

producción de etanol se incrementa en 1 orden de magnitud en comparación con su

cepa progenitora (Tao et al., 2001). El comportamiento obtenido en el presente trabajo -

con medio mineral-xilosa-, también contrasta con los resultados obtenidos cuando

KO11 es cultivada en medio mineral 4% glucosa, donde durante la fase de crecimiento

exponencial: la velocidad específica de crecimiento es del doble; el flux de consumo de

glucosa es 6 veces más elevado; y, en proporción, el flux de formación de etanol es 6.8

veces mayor con respecto a E. coli B. Estos resultados sugieren que existe una

diferencia importante en cuanto a los flujos metabólicos en la glicólisis, y por supuesto

en la vía de las pentosas, cuando se utiliza xilosa como fuente de carbono para cultivar,

en condiciones no aireadas, a E. coli B y KO11, en comparación cuando se utiliza

glucosa en medios minerales.

Los datos de la tabla 7.1.1 muestran que en valores absolutos la velocidad específica

de crecimiento es similar para la cepa silvestre (E. coli B) cuando crece utilizando xilosa

o glucosa, sin embargo la velocidad específica de consumo de azúcar es 3.6 veces

mayor (en términos másicos o de milimoles de carbono por g de biomasa por hora)

cuando se usa xilosa. Este resultado indica que E. coli B necesita consumir xilosa a

mayor velocidad para lograr una velocidad de crecimiento similar a la que obtiene

cuando utiliza glucosa como fuente de carbono.

30


0.01

0.1

1

0

10

20

30

40

Bio

mas

a (g

/L) Xilosa (g/L)

0

4

8

12

16

Etan

ol (g

/L)

0

2

4

6

8

Acé

tico

(g/L

)

0.0

2.5

5.0Fó

rmic

o (g

/L)

0 12 24 36 48 600.0

1.5

3.0

Tiempo (h)

Láct

ico

(g/L

)

0 12 24 36 48 600.00

0.75

1.50

Tiempo (h)

Sucí

nico

(g/L

)

Figura 7.1.1 Cinéticas de crecimiento, consumo de azúcar y producción de etanol y ácidos orgánicos para E. coli B y KO11, cultivadas en condiciones anaeróbicas en medio mineral 4% xilosa.

31


Símbolos vacíos KO11, Símbolos llenos E. coli B.

Tabla 7.1.1 Comparación de parámetros cinéticos y rendimiento de etanol entre E. coli B y KO11.

Este trabajo -.xilosa: datos en la parte superior de cada panel en negritas. Huerta-Beristain (2004).- glucosa: datos en la parte inferior de cada panel. Los datos son el promedio de dos réplicas con su respectivo error estándar.

Parámetro Fase exponencial E. coli B KO11

Fase estacionaria E. coli B KO11

µ (h-1) 0.28 ± 0.004 0.23 ± 0.01

0.30 ± 0.01 0.49 ± 0.02

----- ----

qS (gGlc/ gDWC.h) 2.72 ± 0.07 0.76 ± 0.01

2.57 ± 0.52 4.64 ± 0.61

0.43 ± 0.01 0.82 ± 0.10

0.49 ± 0.04 0.87 ± 0.10

qP (gEt-OH/gDWC.h) 0.39 ± 0.01 0.15 ± 0.01

0.45 ± 0.06 1.02 ± 0.11

0.062 ± 0.02 0.085 ± 0.03

0.20 ± 0.02 0.36 ± 0.06

qKOH (mlKOH/ gDCW.h) 3.97 ± 0.12 2.05 ± 0.06

3.82 ± 0.36 4.77 ± 0.84

0.62 ± 0.07 0.40 ± 0.03

0.22 ± 0.04 0.57 ± 0.13

qAcético (gAcet/gDCW.h) 0.12 ± 0.02

0.06 ± 0.02 0.02 ± 0.00

Rendimiento global de conversión de glucosa a etanol (% del teórico) E. coli B = 30.2 KO11 = 60.0 (% del teórico) E. coli B = 25.1 KO11 = 70.5

La figura 7.1.2 muestra un esquema de la glicólisis y de la vía de las pentosas en E.

coli, así como un balance de ATP generado hasta la formación de piruvato para ambos

casos. Tomando en consideración que: por cada mol de xilosa consumida se producen

0.67 moles de ATP, y 2 moles de ATP por cada mol de glucosa; el peso molecular de

ambos azúcares y las velocidades de crecimiento reportadas en la tabla 7.1.1, se

obtiene que el rendimiento de formación de biomasa (gDCW) por cada mol de ATP

sintetizado en estas condiciones es de 23 y 27 para xilosa y glucosa, respectivamente,

los cuales en términos prácticos son equivalentes y muestran que la mayor velocidad

de consumo de xilosa se justifica desde el punto de vista energético, es decir que el

microorganismo necesita metabolizar xilosa a una mayor velocidad para lograr

aproximadamente la misma eficiencia de generación de biomasa por moléculas de ATP

generado.

32


33

. Figura 7.1.2 Metabolismo de glucosa y xilosa para la formación de etanol en E. coli y

RibulosaRibulosa--5P5P

6 Xilosa 6 Xilosa

Glucosa Glucosa XilosaXilosa XilulosaXilulosa XilulosaXilulosa--5P5P

ATP ADP

--- 6 ATP 6 ATP 6 ATP

--- 6 ATP 6 ATP 6 ATP RibosaRibosa --5P5P

PTPTPTS GlucosaGlucosa – – 6P 6P PEP PEP Piruvato Piruvato --- 1 ATP 1 ATP 1 ATP

Dihidroxiacetona Dihidroxiacetona --PP

FructosaFructosa-- 1,6 1,6 bisfosfatobisfosfato

GliceraldehídoGliceraldehído -- 3P (GAP)3P (GAP)

1,31,3-- DifosfogliceratoDifosfogliceratoADPATP

NAD +

NADH+H + +10 +10 +10 NADH

+10 ATP +10 ATP +10 ATP

Fructosa Fructosa--6P6PATP

ADP --- 4 ATP 4 ATP 4 ATP --- 1 ATP 1 ATP 1 ATP

+2 ATP +2 ATP +2 ATP

+2 NADH

333--- fosfogliceratofosfogliceratofosfoglicerato

Fosfoenolpiruvato Fosfoenolpiruvato Fosfoenolpiruvato (PEP)(PEP)(PEP)ADPATP

+2 ATP +2 ATP +2 ATP +2 ATP +10 ATP +10 ATP +10 ATP +10 ATP

SedoheptulosaSedoheptulosa--7P 7P EritrosaEritrosa --4P4P

GAPGAP

XilulosaXilulosa--5P5P

PiruvatoPiruvato

CO2

Acetaldehído

NADH+ NAD Etanol

2 NADH Acetil CoA Acetil CoA Acetil Acetil PP

Acetato Acetato ADP +2 ATP +2 ATP +2 ATP

CoA

Balance de ATP

De Xilosa

--a

Balance REDOX

-- 6 ATP por transporte--+20 ATP producidos

Rendimiento neto: 0.67 ATP por xilosa4 ATP por 6 moléculas de xilosa

-- 2 ATP por activación

2 ATP por molécula de glucosa

a Piruvato

De Xilosa a Etanol De Glucosa a Etanol

--

De Piruvato a Acético: +2 ATP

De Glucosa a Piruvato

Balance de NADH

+2 NADH en glicólisis 2 NADH en producción de etanol

Balance REDOX

10 NADH en producción de etanol +10 NADH en glicólisis

Por cada 6 moléculas de xilosa

10 ATP por activación +4 ATP producidos

Por molécula de glucosa

Rendimiento neto: 2 ATP por Glucosa

ATP


balance de ATP y NADH. Adaptado de: Fraenkel (1996) Hernández-Bustos (2003) y

Tao et al. (2001) Simbología:

Los símbolos abiertos corresponden al metabolismo de glucosa y los rellenos al metabolismo de xilosa.

Consumo o producción de ATP Consumo o producción de NADH

Dado que en comparación con la glucosa E. coli silvestre necesita consumir xilosa a

una mayor velocidad, las velocidades específicas de síntesis de etanol y de ácidos

orgánicos (evaluados como la velocidad especifica de adición de KOH 2N para

neutralizar la producción total de ácidos: qKOH) durante la fase de crecimiento

exponencial, y el rendimiento teórico de conversión de xilosa en etanol, se

incrementaron 2.6, 1.9 y 1.2 veces, respectivamente en comparación cuando

metaboliza glucosa (Tabla 7.1.1).

De manera interesante, durante la fase de crecimiento exponencial la versión

etanologénica de E. coli B (KO11) genera biomasa y consume xilosa a la misma

velocidad que la versión silvestre (Figura 7.1.1), lo cual sugiere que en este medio y

condiciones ambientales E. coli se encuentra muy cercano a su capacidad límite de

velocidad para catabolizar xilosa. Además, en comparación con el crecimiento en

glucosa, donde las velocidades específicas de crecimiento y de consumo de glucosa si

incrementan significativamente (Tabla 7.1.1), se puede concluir que parte de esta

limitación en los flujos de consumo de xilosa se deben probablemente a su transporte

y/o metabolismo en la vía de las pentosas y no al catabolismo de la fructosa-6-fosfato y

el gliceraldehído-3-fosfato (figura 7.3.2) en la vía de Embden-Meyerhof-Parnas, y en

consecuencia la velocidad de formación de etanol y ácidos orgánicos no incrementa en

la cepa etanologénica en comparación con su cepa progenitora (Tabla 7.1.1).

Para la fase estacionaria, contrario a lo que sucede durante la fase de crecimiento

exponencial, los flujos de consumo de azúcar (glucosa) y de formación de etanol son

34


1.9 y 1.4 veces mayores, respectivamente a los obtenidos cuando E. coli B es cultivada

con xilosa, lo cual sugiere que en estas condiciones de estado pseudoestable E. coli no

es capaz de metabolizar xilosa a gran velocidad y por tanto tiene que sintetizar acético

a una mayor velocidad (mayores qKOH y qKAcético;Tabla 7.1.1) para producir más ATP

(figura 7.1.2) a partir del piruvato generado de la xilosa. Por otro lado, la velocidad

específica de consumo de xilosa de la cepa etanologénica (KO11) es similar a la de la

progenitora, la velocidad de síntesis de ácidos (qKOH) se redujo 2.8 veces y

congruentemente la velocidad de producción de etanol se incrementó 3.23 veces con

respecto a E. coli B. No obstante, durante esta fase la velocidad de producción de

etanol es 1.8 menor cuando se utiliza xilosa en comparación con el empleo de glucosa

y exactamente la xilosa es utilizada a una velocidad 1.8 veces menor que la glucosa. Al

igual que para la cepa silvestre, KO11 sintetiza acético (Tabla 7.1.1) durante la fase

estacionaria para producir más ATP (Figura 7.1.2) a partir del piruvato generado de la

xilosa.

Finalmente, a diferencia del rendimiento elevado obtenido en medio rico (donde los

componentes del medio rico –aminoácidos, vitaminas y factores de crecimiento- son

utilizados para que la célula crezca y la fuente de carbono es usada para formar los

productos de fermentación y energía), el rendimiento global de conversión de xilosa en

etanol para KO11 fue únicamente del 60% respecto al teórico, revelando que este

parámetro es factible de ser mejorado bajo estas condiciones.

7.1.2 Valores de actividad enzimática de PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm en cepas transformadas de KO11.

Con el propósito de determinar el grado de amplificación de actividades enzimáticas a

probar y su efecto sobre los parámetros mencionados en el párrafo anterior, en las

cepas transformadas con los respectivos plásmidos se evaluó la actividad enzimática

específica (Unidades internacionales por mg de proteína) de PfkEc, PgkEc, PykBs y

PdcZm. Las determinaciones de actividad enzimática se realizaron para los cultivos

35


respectivos cosechando células durante la fase exponencial de crecimiento (a las 8 h

de cada cultivo). En la figura 7.1.3 se muestran los incrementos en la actividad

enzimática, usando IPTG a una concentración de 0.1 mM, de las cepas evaluadas con

respecto a la cepa control KO11/pTrc99A. Los incrementos observados fueron de 1.3

veces para Pgk, 15 veces para Pfk, 27 veces para Pyk y 5 veces para Pdc, todos con

respecto a la cepa control.

Control Pfk0

10

A

UI/m

g PRO

T

Control Pgk0

1

2

B

UI/m

g PRO

T

Control Pyk0

10

20 C

UI/m

g PRO

T

Control Pdc0

2

4 D

UI/m

g PRO

T

Figura 7.1.3 Comparación de actividades enzimáticas de las construcciones evaluadas con la cepa control. A) fosfofructo cinasa, B) fosfoglicerato cinasa, C) piruvato cinasa, D) piruvatodecarboxilasa. Concentración de IPTG usada: 0.1 mM

Cabe mencionar que, con excepción de PgkEc, incrementos equivalentes fueron

obtenidos por Huerta-Beristain (2004) evaluando las mismas cepas en condiciones

similares, pero usando 40 g/l de glucosa como fuente de carbono. Este hecho indica,

como era de esperarse, que la sobreexpresión de los genes evaluados usando el

vector pTrc99A no depende de la fuente de carbono usada para crecer las células.

36


Además, por datos reportados (Emmerling et al., 1999 y 2000), aparentemente el nivel

de sobreexpresión, medido como incrementos en la actividad enzimática, de genes del

metabolismo central del carbono en E. coli usando pTrc99A, aparte de la concentración

de IPTG y de las condiciones de cultivo (temperatura y pH), no depende de si el cultivo

es aeróbico a anaeróbico (no aireado, como es el caso del presente estudio). No

obstante los niveles básales de actividad enzimática de proteínas glicolíticas (por ej.

Pfk y Pyk) son mayores en condiciones anaeróbicas (Emmerling et al., 1999 y 2000),

debido probablemente a que el flujo glicolítico es mayor en estas condiciones que en

cultivos aerobios. Finalmente, cabe aclarar que dadas las características de

construcción de los plásmidos, la secuencia del gen, el espaciamiento entre la región

promotora del vector y el codón de inicio del gen a expresar, el aumento en la actividad

enzimática no es igual para diferentes genes sobreexpresados en las mismas

condiciones (Kammerer et al., 1986)

7.2 Efecto de la sobreexpresión de galPEc, pfkEc, pgkEc, pykBs y pdcZm en la fase de crecimiento exponencial

En esta parte del trabajo se reporta el efecto que ocasionó la sobreexpresión de galPEc,

pfkEc, pgkEc, pykBs o pdcZm durante la fase de crecimiento exponencial sobre las

velocidades específicas de: a) crecimiento; b) consumo de xilosa; c) producción de

etanol; y d) producción de ácidos orgánicos de E. coli KO11

7.2.1 Efecto sobre la velocidad específica de crecimiento

Con excepción de pfkEc que ocasionó un decremento del 23% en la velocidad

específica de crecimiento, comparando la velocidad obtenida con la cepa control

(KO11/pTrc99A) no se observó diferencia significativa en este parámetro al

sobreexpresar los otros genes (Figura 7.2.1). No obstante que por un análisis visual de

la figura 7.2.1 parecería que la sobreexpresión de pykBs provoca una disminución en la

velocidad de crecimiento, el análisis estadístico mediante la prueba t de Students

37


permite concluir que no hay una disminución estadísticamente significativa a un nivel

de confianza del 95%, debido a que los datos experimentales obtenidos con esa

construcción tienen una varianza grande. La disminución en la velocidad específica de

crecimiento en KO11/pTrcpfkEc podría deberse a la acumulación de intermediarios

como la fructosa 1,6 fosfato y ATP, que por regulación alostérica inhiben la actividad de

la piruvato cinasa o por la acumulación de fosfoenolpiruvato y ATP, los cuales por

regulación alostérica tiene un efecto negativo sobre la misma fosfofructo cinasa (Figura

2.3.1). No obstante esta acumulación de intermediarios podría reducirse si se

incrementa de manera simultánea la actividad de enzimas que compiten por el piruvato

y restableciendo los niveles de cofactores reducidos (Gennis y Stewart, 1996; Guedon

et al., 2002, San et al., 2002; Yang et al., 2001; Nichols et al., 2003). Sin embargo, cabe

citar que la sobreexpresión de los genes evaluados (incluyendo a pfkEc) no tuvo efecto

sobre la velocidad de crecimiento cuando se uso glucosa como fuente de carbono

(Huerta-Beristain 2004). Un análisis detallado del metabolismo de la xilosa al ser

catabolizada por la vía de las pentosas (Figura 7.1.2) genera, por cada 6 moléculas de

xilosa, 4 de gliceraldehído 3 fosfato y 3 moléculas de fructosa 6 fosfato, estas últimas

son convertidas en otras 6 moléculas de gliceraldehído 3 fosfato, hasta este punto el

consumo neto de ATP es de 0.67 moles por mol de xilosa, mientras que para el

catabolismo de glucosa se tiene un consumo de 2 moles de ATP por mol de glucosa, lo

cual permite concluir que la acumulación de ATP y/o la acumulación de la fructosa 1,6

fosfato o fosfoenolpiruvato no son los factores que ocasionan esta reducción en la

velocidad de crecimiento cuando se usa xilosa como fuente de carbono, esta discusión,

referente al efecto de PfkEc, será retomada en la sección 7.2.4

38


Control galP pfk pgk pyk pdc0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

µ (h

-1)

Figura 7.2.1 Comparación de la velocidad específica de crecimiento en la cepa KO11 sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm.

7.2.2 Efecto sobre la velocidad específica de consumo de Xilosa

El análisis estadístico de los datos mostró que la velocidad especifica de consumo de

xilosa se ve afectada positivamente, en un 59% con respecto a la cepa control,

únicamente cuando se sobreexpresa pdcZm (Fig.7.2.2) dicho efecto puede deberse a

una mayor velocidad de consumo de piruvato debido a la alta afinidad que tiene la

PdcZm por el piruvato y a la alta actividad enzimática establecida a través del plásmido

pTrcpdcZm (3.47 UI/mgPROT), al consumirse el piruvato a una mayor velocidad y

reducirse la producción de ácido acético (sección 7.2.4), los niveles intracelulares de

ATP, fosfoenolpiruvato y fructosa 1,6 fosfato se reducen, reduciendo los efectos

inhibitorios sobre las dos enzimas reguladas alostéricamente (Figura 7.1.2), y en

consecuencia la bacteria puede metabolizar los intermediarios de la glicólisis y de la vía

de las pentosas a una mayor velocidad. Además, al redirigir el flujo de carbono hacia la

producción de etanol se restablece el nivel de cofactores reducidos. También, el

aumento del flux de consumo de xilosa con la sobreexpresión de pdcZm, puede

explicarse como una respuesta a la actividad limitada de PdcZm. En cultivos con

glucosa la sobreexpresión de pdcZm no produjo efecto alguno sobre la velocidad

39


específica de consumo de azúcar durante la fase exponencial (Huerta-Beristain, 2004),

pero como ya se discutió en la sección 7.1.1, la glucosa es metabolizada a una

velocidad 1.8 veces mayor con respecto a la xilosa por KO11 (4.6 vs 2.6

gAZÚCAR/gDCW.h). En dicha sección se postulaba que la velocidad de consumo de xilosa

probablemente estaba cercana a su máxima capacidad, sin embargo con la

sobreexpresión de pdcZm se logró incrementar el consumo de azúcar hasta 3.9

gXILOSA/gDCW.h, es decir únicamente 15% por debajo de la velocidad obtenida con

glucosa. Aparte de lo mencionado anteriormente en este párrafo, es probable que el

incremento en la velocidad de consumo de NADH+H+ (Figura 2.3.1), ocasionado

indirectamente por el incremento de actividad de PdcZm en la vía heteróloga de KO11,

origine que este cofactor tenga que regenerarse a una mayor velocidad dentro de la

glicólisis y en consecuencia estimule una generación de ATP a una mayor velocidad

dentro de la vía de Embden-Meyerhof-Parnas y al estar este último disponible a una

mayor velocidad facilitar la disponibilidad de energía para transportar y fosforilar la

pentosa a una mayor velocidad (Figura 7.1.2)

Control galP pfk pgk pyk pdc0

1

2

3

4

5

q S(g

XIL

/gD

CW

h-1)

Figura 7.2.2 Comparación de la velocidad especifica de consumo de xilosa en la cepa KO11 sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm.

40


7.2.3 Efecto sobre la velocidad especifica de producción de etanol y ácidos orgánicos.

La velocidad específica de producción de etanol se ve afectada negativamente por la

sobreexpresión de pfkEc y pykBs (con reducciones del 65 y 25%, respectivamente), y

positivamente (incremento del 31%) para PdcZm, para el caso de GalPEc y PgkEc no se

observo efecto estadísticamente significativo. Como ya ha sido reportado para S.

cerevisiae, la sobreexpresión de pgk no incrementa el flux de etanol (Hauf et al., 2000).

Estos resultados son consistentes a los reportados para cultivos con glucosa, donde la

sobreexpresión de pfkEc y pykBs originaron decrementos en la producción de etanol y la

sobreexpresión de pdcZm causó un incremento significativo (Huerta-Beristain, 2004).

Ec B C galP pfk pgk pyk pdc0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

q EtO

H (g

EtO

H /

g DC

W.h

)


0.2

0.4

0.6

0.8

q ACE

(gAC

E / g

DC

W.h

)


0.02

0.04

0.06

q LAC

(gLA

C /

g DC

W.h

)


0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

q FO

R (g

FOR /

g DC

W.h

)

Figura 7.2.3 Comparación de velocidades específicas de producción de etanol, acético, láctico y fórmico en la cepa KO11 (Ec B: E. coli B y C: cepa control) sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm .

41


La cuantificación de metabolitos por técnicas de HPLC permitió detectar en los

sobrenadantes de los cultivos la acumulación de acético, láctico y fórmico en algunas

de las cepas (Figura 7.2.3), succínico únicamente en la cepa silvestre, y no se logró

detectar: glicerol, pirúvico o fumárico. En fase exponencial la velocidad específica de

producción de ácido acético no mostró diferencia significativa en las cepa control y la

cepa que sobreexpresa galPEc y pgkEc con respecto a E. coli B, con el resto de las

cepas (las que tienen actividad incrementada en Pfk, Pyk y Pdc) si se observó

reducción significativa en la producción de este ácido con respecto a E.coli B y la cepa

control.

En el caso del ácido láctico las cepas que sobreexpresan pfkEc y pykBs mostraron una

velocidad especifica de producción semejante a E. coli B, mientras que las demás

cepas –incluyendo la cepa control- no produjeron láctico. Estos resultados concuerdan

con los reportados por Emmerling et al., (1999) quienes con el uso de pTrc99A y

células en reposo, incrementaron la actividad de PfkEc y PykBs en una cepa isogénica

de KO11 (E. coli KO20), individual y simultáneamente en condiciones anaeróbicas,

encontrando incrementos en el flux de formación de láctico.

Para el caso del ácido fórmico se observa un efecto similar al ácido acético en el que

las cepas control y GalPEc no muestran diferencia estadísticamente significativa con

respecto a E. coli B, mientras que cuando se incrementaron las actividades de PfkEc,

PykBs y PdcZm se encontró una reducción significativa respecto a la cepa control.

El análisis de estos resultados muestra que la sobreexpresión de pdcZm ocasiona

incrementos en los flujos de consumo de xilosa y de producción de etanol y reducción

en los de producción de acético, láctico y fórmico, indicando que el incremento de esta

actividad permite redirigir el flujo hacia la formación de etanol y en consecuencia

reducir la formación de ácidos orgánicos, de hecho aboliendo la producción de láctico,

que se puede atribuir a la competencia que se establece por la disponibilidad de

NADH+H+ que se requiere para formar ambos productos. Por otro lado los incrementos

de actividad de PfkEc o PykBs provocan reducciones en la formación de etanol, acético y

42


fórmico, y una notable formación de láctico. En conjunto este análisis permite concluir

que, tal y como sugerían los datos de la sección anterior, en KO11 aún existe una

actividad limitada de PdcZm ya que cuando hay una mayor disponibilidad de piruvato, al

sobreexpresar pfkEc o pykBs se favorece la formación de lactato en lugar de etanol y

viceversa al sobreexpresar pdcZm.

7.3 Efecto de la sobreexpresión de galPEc, pfkEc, pgkEc, pykBs y pdcZm en E.

coli KO11 durante la fase estacionaria

7.3.1 Efecto sobre la velocidad especifica de consumo xilosa, de formación de etanol y sobre la producción de ácidos acético, fórmico y láctico.

En la fase estacionaria (estado quasi-estable) la velocidad específica de consumo de

xilosa no presentó variación significativa con respecto al control KO11/pTrc99A, con

excepción de la cepa que sobreexpresa pdcZm en la que se observó un aumento del

35% con respecto al control (Figura 7.3.1). La velocidad específica de formación de

etanol muestra un aumento del 44% para Pdc y una disminución del 38% para Pfk. Los

demás casos no mostraron efecto significativo en dicha velocidad específica (Figura

7.3.2). En el efecto sobre la producción de ácidos orgánicos, la velocidad específica de

producción de ácido acético muestra una disminución significativa de todas las

construcciones evaluadas con respecto a E. coli B a excepción de Pyk que no muestra

diferencia significativa, con respecto al control no se encontró diferencia

estadísticamente significativa con ninguna cepa, debido a que los datos experimentales

arrojados por la cepa control tienen una varianza grande (Figura 7.3.3). En cuanto a la

cantidad producida de dicho ácido, todas las construcciones evaluadas fueron

inferiores en 13-20% respecto al control, y destacan Pfk y Pdc menores en un 32% y

73%, respectivamente. En cuanto al ácido láctico la velocidad especifica de producción

respecto al control es significativamente menor para las cepas que sobreexpresan pfkEc

y pdcZm, y significativamente mayor para galPEc y pykBs, en cuanto a la cantidad

producida del mismo fue 79 y 80% menor para las cepas que sobreexpresan pfkEc y

43


pdcZm respectivamente y 0.34 y 2.86 veces mayor para galPEc y PykBs respectivamente.

Para el ácido fórmico las velocidades especificas de producción no fueron

significativamente diferentes entre la cepa control y las cepas sobreexpresando los

genes evaluados, sin embargo todas fueron menores respecto a E. coli B. Para la

cantidad producida del mismo Pfk, Pyk y Pdc mostraron una reducción del 35, 28 y

79% respectivamente en la producción de dicho ácido comparando con el control.

Los resultados presentados en el párrafo anterior indican que la sobreexpresión de Pfk

tiene un efecto negativo sobre los parámetros evaluados, reduciendo el flux glicolítico

que podría atribuirse a la acumulación de fosfoenolpiruvato y ATP. En el caso de la

sobreexpresión de pykBs los resultados indican un mayor flujo de carbono hacia la

producción de ácidos, en especial de ácido láctico, esto es consistente con lo

observado por Huerta-Beristain (2004) en presencia de glucosa y lo discutido en la

sección anterior. Y confirma que en KO11 la actividad de PdcZm está limitada y da la

pauta para proponer que la sobreexpresión simultánea de estas enzimas podrían tener

un efecto positivo sobre el flux de etanol.

Con la sobreexpresión de pdcZm se logró aumentar la velocidad específica de consumo

de xilosa, de producción de etanol y se redujo significativamente la producción de

ácidos orgánicos, este efecto puede ser atribuido a una mejor canalización del carbono

hacia la producción de etanol por la enzima piruvato decarboxilasa y a un

reestablecimiento de cofactores reducidos. Esto reafirma que en KO11 la actividad de

Pdc no es suficiente y la sobreexpresión de la misma logra aumentar el flux de

consumo de xilosa y el de formación de etanol al dirigir el flujo de carbono hacia la

producción de etanol.

44



0.25

0.50

0.75

q XIL

(gX

il / g

DC

W.h

)

Figura 7.3.1 Comparación de la velocidad especifica de consumo de xilosa en la cepa KO11 sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm


0.1

0.2

0.3

0.4

q EtO

H (g

EtoH

/ g D

CW

.h)

Figura 7.3.2 Comparación de la velocidad especifica de producción de etanol en la cepa KO11 sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm.

45


E.coli BControl galP pfk pgk pyk pdc0.00

0.05

0.10

0.15A

q AC

E (g

AC

E / g

DC

W.h

)


0.025

0.050

0.075

0.100B

q LA

C (g

LAC /

g DC

W.h

)


0.025

0.050

0.075

0.100C

q FO

R (g

FOR /

g DC

W.h

)

Figura 7.3.3 Comparación de la velocidad especifica de producción de: A) A. acético, B) A. láctico, C) A. fórmico en la cepa KO11 sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm.

7.4 Análisis de flujos y balance de carbono

En esta sección se muestran los resultados del análisis de flujos y balance de carbono,

los productos de fermentación fueron cuantificados por cromatografía de gases y

HPLC, los principales productos detectados fueron: Etanol, acetato, formato y lactato.

En el Apéndice 11.3.5 se muestra como se estimaron los flux de carbono

(mmolc/gDCWh) y los balances de carbono. En la figuras 7.4.1 y 7.4.2 se muestra un

esquema comparando los flujos de carbono y la recuperación de carbono en los

46


productos cuantificados. La recuperación fue bastante cercana al 100% y este balance

muestra la consistencia de los resultados obtenidos. Este análisis confirma que la

sobreexpresión de pykBs aumenta el flujo de carbono hacia la producción de Lactato y

pdcZm aumenta el flujo de carbono hacia la formación de etanol y su reducción en la

producción de ácidos orgánicos.

6.04 %0.07 1.30 %1.07

3.61 % 12.87 %

0.950.333.19

(99.56 %)

KO11/pTrc99A

10.71% 5.72 %

KO11/pTrc99A-GalPEc

KO11/pTrc99A-pdcZm

Glicerol

Acetil-CoA

XILOSA

Acetato Formato

Figura 7.4.1 Análisis de flujos y balasobreexpresando galPEc, y pdcZm. AnálisLos números al lado izquierdo de la flemmolc/gDCW.h. Los números a la drecuperado con respecto al contenido paréntesis indican el total del carbono rcada grupo corresponden a la cKO11/pTrc99pdcZm y los de la parte infe

15.45
20.8417.02
0.29 %9.21

26.03 %28.13 %

1.45 %

1.48

0.52

(90.73 %)

ld

2.04 % 24.45 %

(86.57 %)

CO2 Lactato

F-1,6-BP

PIRUVATO

nce de carbono para la cepis en fase estacionaria.

cha indican los valores del aerecha indican los porceninicial del medio de cultivo. Lecuperado. Los valores de laepa KO11/pTrc99A, los rior a KO11/pTrc99galPEc

9.27AcA

52.47 %
13.08 38.06 % 8.82
0.13
1.57 8.52
11.64

Etan

a con

nálisistajes os nú parte

de e

39.05 %

ol

trol y KO11

de flujos en de carbono meros entre superior de

n medio a

47


16.40 (89.50 %) (102.32 %)

3.35 12.26 % 1.87 0.86 1.36

9.04

4.16 %3.37

5.72 %10.47% 4.45 % 19.11 %0.97 % 5.89 % 47.83 % 30.12 %

9.31 % 0.32 % 16.89 %0

KO11/pTrc99A-pfkEc

AcAld

0.581.67 11.59

18.5016.22

1.48 4.57

(99.53 %)

KO11/pTrc99A-pykBs

KO11/pTrc99A-pgkEc

Glicerol

Acetil-CoA

Etanol

24.39 %

9.23 27.8 %

5.779.14

CO2

XILOSA

Acetato Formato Lactato

F-1,6-BP

PIRUVATO

Figura 7.4.2 Análisis de flujos y balance de carbono para KO11 sobreexpresando pfkEc, pgkEc y pykBs . Análisis en fase estacionaria. Los números al lado izquierdo de la flecha indican los valores del análisis de flujos en mmolc/gDCW.h. Los números a la derecha indican los porcentajes de carbono recuperado con respecto al contenido inicial del medio de cultivo. Los números entre paréntesis indican el total del carbono recuperado. Los valores de la parte superior de cada grupo corresponden a la cepa KO11/pTrc99pfkEc, los de en medio a KO11/pTrc99pgkEc y los de la parte inferior a KO11/pTrc99pykBs.

48


7.5 Efecto sobre el rendimiento de conversión de xilosa en etanol

Tabla 7.5.1 Rendimiento de conversión de xilosa en etanol respecto al teórico, resultado de la sobreexpresión de genes del metabolismo de E. coli etanologénica. Los datos mostrados son el promedio de dos replicas con su respectivo error estándar

Cepa % respecto al teórico

KO11/pTrc99A 59.2±3.5 KO11/pTrc99A-pdcZm 80.1±1.4 KO11/pTrc99A-pfkEc 36.8±0.3 KO11/pTrc99A-pgkEc 54.3±8.9 KO11/pTrc99A-galPEc 59.7±0.7 KO11/pTrc99A-pykBs 42.9±1.7

La sobreexpresión de genes del metabolismo de E. coli etanologénica ocasionó

algunos cambios en el rendimiento de producción de etanol a partir de xilosa. Cuando

se incrementó la actividad de Pfk, Pyk y Pdc se observaron cambios significativos. Con

el incremento en la actividad de Pfk y Pyk se observó una reducción en el rendimiento

de conversión de xilosa en etanol. De forma relevante, la sobreexpresión de pdcZm

ocasionó un aumento del 20.93 ± 3.727% en el rendimiento de conversión de xilosa a

etanol respecto al teórico, comparando con la cepa control, lo cual corrobora la

hipótesis de que la manipulación del metabolismo central del carbono y/o de las vías

fermentativas permite modificar la distribución de flujos e incrementar o reducir los

rendimientos de conversión de sustratos en productos.

49

CONCLUSION _________________________________________________________________________________________________________

8.- CONCLUSIONES

1.- En Escherichia coli etanologénica KO11 el flux de la glucólisis no se encuentra

controlado individualmente por Pfk, Pgk o Pyk, no se descarta que se encuentre

controlado en alguna de las enzimas no estudiadas o por la sobreexpresión simultánea

de dos o más enzimas.

2.- La actividad enzimática de Pdc es limitada para dirigir el flujo de piruvato hacia

etanol en E. coli etanologénica KO11.

3.- La sobreexpresión de Pdc logró aumentar la velocidad específica de formación de

etanol, consumo de xilosa y disminuyó la velocidad específica de consumo de base, lo

que sugiere que el control del flux glicolítico en E. coli etanologénica KO11 se

encuentra fuera de la vía de Embden-Meyerhof-Parnas.

4.- Incrementos en la actividad de Pfk y Pyk mostraron una reducción en la velocidad

específica de crecimiento debido probablemente a efectos de regulación alostérica por

la acumulación de intermediarios metabólicos y una resultante reducción en el

rendimiento de conversión de xilosa a etanol.

5.-Los incrementos en la actividad de Pyk mostraron un aumento en la producción de

ácido lactico

6.- El aumento en la actividad enzimática de Pdc logró incrementar sustancialmente el

rendimiento teórico de conversión de xilosa en etanol.

50

PERSPECTIVAS _________________________________________________________________________________________________________

9.- PERSPECTIVAS

1.- Dado que los resultados obtenidos con la sobreexpresión individual de enzimas no

muestran resultados favorables para la mayoría de ellas, analizar la sobreexpresión

simultánea de dos enzimas y evaluar los efectos sobre el flux glicolítico.

2.- Integrar a cromosoma otra copia de Pdc y hacer un estudio de flux glicolítico con

ese fondo.

3.- Reducir la producción de ácidos orgánicos mediante la interrupción de los genes

que codifican para las enzimas que llevan acabo la producción de los mismos.

4.- Probar otras versiones mas activas de Pdc.

51

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59

APENDICES _________________________________________________________________________________________________________

11. APÉNDICES

11.1 Método de Azúcares reductores (DNS)

El método de azúcares reductores (DNS), consiste en agregar 1.0 ml del reactivo de

DNS a un volumen de 0.1 ml de muestra o estándar, calentar a ebullición durante 10

min, una vez terminado el tiempo de reacción enfriar durante 5 min en un baño de agua

a temperatura ambiente y leer la absorbancia a 570 nm. Las mediciones se realizaron

en un espectrofotómetro Beckman (DU-70). El reactivo de DNS se prepara disolviendo

75 g de tartrato de sodio y potasio en 100 ml de agua destilada, agregando después 50

ml de NaOH 2M y 75 ml de agua destilada caliente, entonces se adiciona lentamente

0.25 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico hasta disolver por completo.

11.2 Ensayos Enzimáticos

FOSFOFRUCTOCINASA (EC 2.7.1.11). Reacción:

PFK

Fructosa-6-fosfato + ATP Fructosa-1,6-bifosfato + ADP

PYK

ADP + PEP ATP + Piruvato

LDH

Piruvato + NADH + H+ L – Lactato + NAD+

Mezcla de reacción: MgSO4 7H2O / KCl 1.4 mM / 0.71 mM, Fosfoenolpiruvato 0.71 mM, Fructosa-1,6-

difosfato 0.64 mM, Fructosa-6-fosfato 1.8 mM, NADH+ 0.4 mM, Piruvato cinasa 4.2 U,

LDH 10 U, ATP 1.1 mM a pH 8.5

60

APENDICES _________________________________________________________________________________________________________

Definición de unidad: Cantidad de fosfofructocinasa que transfiere 1 µmol de fosfato del ATP a Fructosa-1,6-

bifosfato en 1 min a 30°C y pH de 8.5, en consecuencia este ensayo consume un 1

µmol de NADH por cada µmol de Fructosa-1,6-bifosfato fosforilado.

FOSFOGLICERATO CINASA. (EC 2.7.2.3). Reacción:

PGK

3-fosfoglicerato + ATP ADP + 1,3-difosfoglicerato

GAPDH

1,3-difosfoglicerato + NADH + H+ Gliceraldehído-3-P+ NAD+

Activador: MgCl2.

Mezcla de reacción: NADH+ 0.03 mM, ATP 1 mM, Cisteína 5 mM, 3-Fosfoglicerato 1 mM, GAPDH 1U.

Amortiguador para el ensayo enzimático: 50 mM Trietanolamina y 10 mM MgCl2 a pH

7.4

Definición de unidad: Cantidad de fosfoglicerato cinasa que transfiere 1µmol de fosfato del ATP a 3-

fosfoglicerato en 1 min a 30°C y pH de 7.4, este ensayo consume un 1 µmol de NADH

por µ mol de 3-fosfoglicerato fosforilado.

61

APENDICES _________________________________________________________________________________________________________

PIRUVATO CINASA (EC 2.7.1.40). (HETERÓLOGA de B. stearothermopillus). Reacción:

PYK ADP + PEP ATP + Piruvato

LDH

Piruvato + NADH + H+ L – Lactato + NAD+

Activadores: Fructosa-1,6-difosfato, AMP y Ribosa-5-P.

Mezcla de reacción: KCl 50 mM, MgCl2 5 Mm, ADP 2 mM, NADH+ 0.2 mM, Fosfoenolpiruvato 1 mM

Fructosa-1,6-difosfato 1 mM, AMP 1 mM, Ribosa-5-P 1 mM, LDH 1 U.

Amortiguador para el ensayo enzimático: 0.1 M Imidazol-HCl pH 7.2

Definición de unidad: Cantidad de Piruvato cinasa que produce 1 µmol de piruvato a partir de PEP en 1 min a

30°C y pH de 7.2, este ensayo consume un 1 µmol de NADH por µmol de Piruvato

formado.

62

APENDICES _________________________________________________________________________________________________________

PIRUVATO DECARBOXILASA (EC 2.7.1.40). Reacción:

PDC

Piruvato Acetaldehído + CO2

ADH

Acetaldehído + NADH + H+ NAD+

+ Etanol

Mezcla de reacción: NADH+ 0.15 mM Pirofosfato de tiamina (TPP) 0.1 mM, Piruvato 5.0 mM, ADH 10U.

Amortiguador para el ensayo enzimático: MES 50 mM-MgCl2 5 mM pH 6.5

Definición de unidad: Cantidad de Piruvato decarboxilasa que produce 1 µmol de acetaldehído en 1 min a

30°C y pH de 6.5, este ensayo consume un 1µmol de NADH por µmol de Piruvato

formado.

CÁLCULOS:

Actividad volumétrica:

UENZIMA/ ml = [(∆A340nm / min)(1ml)] / [(6.22)( VEC)].

6.22 = coeficiente de extinción milimolar de NADH a 340 nm.

VEC = Volumen del extracto celular empleado, (0.05 o 0.1 ml).

Actividad específica:

UI mgproteína / = (actividad volumetrica UI / ml) / (mgproteína / ml)

63

APENDICES _________________________________________________________________________________________________________

11.3 Evaluación de parámetros

Los parámetros evaluados fueron: velocidad específica de crecimiento (µ); rendimiento

biomasa/sustrato (YX/S); velocidad específica de consumo de azúcar (qS); producto

final, así como la velocidad específica de formación de productos (qP), los cuales se

determinaron durante la fase de crecimiento exponencial y fueron corregidos por factor

de dilución en función de la base o ácido adicionado a los cultivos para el control de pH

11.3.1 Corrección por factor de dilución

La concentración de biomasa, azúcar consumida y productos obtenidos fueron

corregidos en función del volumen de base adicionada a cada tiempo mediante un

factor de dilución (FD). El tiempo (t) al cual se toma la muestra, se mide el volumen de

base adicionada (Vb) al cultivo y se suma al volumen inicial del cultivo (Vi), con estos

datos se calcula el factor de dilución (FD) de la siguiente forma:

FD = Vi+ Vb

Vi

A partir del valor de FD obtenidos para cada tiempo, los datos fueron corregidos de la

siguiente manera:

Biomasa = Biomasa(g/l) ti * FDti

Concentración de azúcar = Azúcar(g/l)ti * FDti

Producto = Producto(g/l)ti * FDti

11.3.2 Calculo de la velocidad específica de crecimiento.

La velocidad de crecimiento específica, fue calculada de la siguiente manera:

µ = Ln ( Xf – Xi)

∆T

64

APENDICES _________________________________________________________________________________________________________

11.3.3 Cálculo de rendimientos y de formación de productos.

Los rendimientos YX/S, YP/S y YX/P, durante la fase de crecimiento exponencial fueron

calculados de la siguiente manera:

XMAX = Biomasa producida durante la fase de crecimiento exponencial.

YX/S = g de Biomasa producida (XMAX) g de ázucar consumida

YP/S = g de Producto g de ázucar consumida

YP/x = g de Producto

g de Biomasa(X MAX)

11.3.4 Cálculo de la velocidad específica de consumo de azúcar y de formación de productos.

Las velocidades específicas de consumo de azúcar y de obtención de productos fueron

calculadas para las dos fases de los cultivos: La exponencial y la estacionaria.

Para la fase exponencial:

qS = µ YX/S

qP = YP/S * µ

En el caso de la fase estacionaria: se eligió el intervalo de tiempo a evaluar: inicio de la

fase estacionaria al agotamiento del azúcar, y se calculó la concentración de biomasa

promedio (XPROM) así como el consumo de azúcar o la producción de etanol en dicho

65

APENDICES _________________________________________________________________________________________________________

intervalo (T), con los datos obtenidos, el cálculo de qS y qP se llevó acabo de la siguiente

manera:

q S = azúcar consumida

T (h)* XPROM

qP = producto

T (h)*X PROM

11.3.5 Cálculo de flujos y balance de carbono.

La determinación de los flujos de carbono, en milimoles de carbono por gramo de

célula por hora (mmolC/gDCWh), durante la fase estacionaria de cultivos seleccionados

(sección 7.4), se realizó a partir de los valores de los flujos de consumo de glucosa y de

formación de productos (etanol, fórmico, acético y CO2). Los cuales fueron convertidos

a moles de carbono considerando el peso molecular y el número de carbonos

contenido en cada especie considerada. El balance de carbono (en porcentaje respecto

a la xilosa) para los mismos experimentos, se lleva a cabo dividiendo los flux de

carbono de cada compuesto dividido entre el flux de carbono de consumo de glucosa y

multiplicado por cien. Para el caso del bióxido de carbono, por balance estequiométrico,

se asumió que se produjo un mol de CO2 por la suma de cada mol de etanol y acetato

producido.

11.4 Datos de curvas de calibración Tabla 11.4.1 Curva de calibración de azúcares, glicerol y etanol.

Detector de índice de refracción. Compuesto Pendiente Ordenada al

origen r2 Tiempo de

elusión (min) Xilosa 0-40 g/l

1943000

± 43480 -417500

± 1053000 0.9979 10.49

Glicerol 0-1 g/l

312500

± 2337 195.8

± 1098 0.9998 17.7

Etanol 0-10 g/l

813148.9

± 14481.63 67959.10

± 96060.24 0.9990 26.9

66

APENDICES _________________________________________________________________________________________________________

Tabla 11.4.2 Curvas de calibración de ácidos orgánicos.

Detector de arreglo de diodos a 210 nm. Ácido Pendiente Ordenada al

origen r2

Tiempo de elusión (min)

Acético 0-5 g/l

1857896

± 26011.01 74138.20

± 86268.77 0.9994 17.31

Fórmico 0-5 g/l

1516913

± 24355.58 74766.30

± 80778.32 0.9976 16.04

Láctico 0-1 g/l

1089395

± 14577.47 4249.700

± 48348.00 0.9994 14.59

Pirúvico 0-1 g/l

1440671

± 40162.20 20033.51

± 26640.59 0.9976 11.96

Succínico 0-1 g/l

1476365

± 25858.79 13527.21

± 17152.78 0.9990 13.55

11.5 Cinéticas de crecimiento, consumo de azúcar, producción de etanol, y ácidos orgánicos.

En esta sección se presentan las cinéticas de todos los experimentos reportados,

Figuras 11.6.1 a 11.6.8. Los datos incluidos son: formación de biomasa, consumo de

xilosa, producción de etanol y producción de ácidos orgánicos. En todos los casos los

datos que se presentan están corregidos por dilución por la base adicionada a los

cultivos. En cada corrida se incluía un experimento control con KO11 y/o

KO11/pTrc99A, y los experimentos con la construcción a evaluar se llevaron a cabo, en

la todos los casos, por duplicado.

67

APENDICES _________________________________________________________________________________________________________

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40Biomasa

Etanol

Xilosa

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (h)

Xilo

sa, E

tano

l (g/

L) Biom

asa (g/L)

B

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40Biomasa

Etanol

Xilosa

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (h)

Xilo

sa, E

tano

l (g/

L) Biom

asa (g/L)

C

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40Biomasa

Etanol

Xilosa

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (h)

Xilo

sa, E

tano

l (g/

L) Biom

asa (g/L)

D

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40Biomasa

Etanol

Xilosa

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (h)

Xilo

sa, E

tano

l (g/

L) Biom

asa (g/L)

A

Figura 11.5.1 Cinéticas de Consumo de xilosa, producción de etanol y biomasa de la

cepas; A) control KO11/pTrcA, B) KO11/pTrcgalPEc, C) KO11/pTrcpfkEc, D) KO11/pTrcpgkEc

68

APENDICES _________________________________________________________________________________________________________

0 10 20 30 40 50 60

0

10

20

30

40Biomasa

Etanol

Xilosa

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (h)

Xilo

sa, E

tano

l (g/

L) Biom

asa (g/L)

A

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40Biomasa

Etanol

Xilosa

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (h)

Xilo

sa, E

tano

l (g/

L) Biom

asa (g/L)

B

40

30

20

10

0 10 20 30 40 50 60

0

Biomasa

Etanol

Xilosa

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (h)

Xilo

sa, E

tano

l (g/

L) Biom

asa (g/L)

C

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40Biomasa

Etanol

Xilosa

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (h)

Xilo

sa, E

tano

l (g/

L) Biom

asa (g/L)

D

Figura 11.5.2 Cinética de Consumo de xilosa, producción de etanol y biomasa de la

cepas: A) KO11/pTrcpykBs, B) KO11/pTrcpdcZm, C) KO11, y D) E. coli B

69

APENDICES _________________________________________________________________________________________________________

-1 9 19 29 39 49 590.0

2.5

5.0

7.5galP

pfk

pgk

pyk

pdc

E. coli B

KO11/pTrc99a

Tiempo (h)

A. A

cétic

o g/

L

9 19 29 39 49 590

1

2

3

4galP

pfk

pgk

pyk

pdc

E. coli B

KO11/pTrc99A

Tiempo (h)

A. L

áctic

o (g

/L)

Figura 11.5.3 Cinética de producción de ácido acético y ácido láctico para las cepas

evaluadas

70

APENDICES _________________________________________________________________________________________________________

71

-1 9 19 29 39 49 590.0

2.5

5.0galP

pfk

pgk

pyk

pdc

E. coli B

KO11/pTrc99a

Tiempo (h)

A. F

órm

ico

(g/L

)

-1 9 19 29 39 49 59

0

1

galP

pfk

pgk

pyk

pdc

E. coli B

KO11/pTrc99a

Tiempo (h)

A. S

uccí

nico

(g/L

) Figura 11.5.4 Cinética de producción de ácido fórmico y ácido succínico para las cepas

evaluadas

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIÉRREZ EVALUACIÓN … · 2.2 Ingeniería de vías metabólicas para la producción de etanol con E. coli.....10 2.2.1 Escherichia coli KO11