INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

SECRETARIA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

REPORTE FINAL DE TESINA

RELACIÓN DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN NFKB CON PROTEÍNAS

ANTIAPOPTÓTICAS EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA

QUE PARA OBTENER EL DIPLOMA DE ESPECIALIDAD

HEMATOPATOLOGIA

PRESENTA

ABDUL FRANCISCO COBO GUZMÁN

ASESOR

DRA. RUTH ANGELICA LEZAMA PALACIOS

MÉXICO D,F DICIEMBRE 2008

ÍNDICE

Objetivo general………………………………………………………………………I

Justificación…………………………………………………………………………...I

Resumen…………….………………………………………………………………...II

Introducción…………………………………………………………………………..1

Lucemia Mieloide…………………………………………………………………….1

Clasificación……………………………………………………………………..…...1

Clasificación de la leucemia mielode aguada según la OMS…………………..7

Apoptosis……………………………………………………………………………..7

Vía extrínseca………………………………..……………………………………...10

Vía entrinseca o mitocondrial………………………………………………………11

Proteínas pro-apoptoticas multidominio…………………………………………..14

Miembros de la subfamilia BH3……………………………………………………14

Factor de transcripción NFkB………………………………………………………16

Familia REL…………………………………………………………………………..17

Activación del NFkB………………………………………………………………….18

Ruta alternativa o no cónica……………………………...…………………………20

Proteínas anti-apoptoticas en LMA………………………………………..……….20

Conclusiones……………………………………………………………………….…21

Bibliografía……………………………..………………………………………….….22

Objetivo general

Conocer en base a una revisión bibliografiíta si en la leucemia Mieloide Aguda

el factor NFkb se encuentra activado, si hay un aumento en la expresión de

proteínas anti-apoptoticas y si existe una relación entre el NFkB y estas

proteínas, lo cual estaría contribuyendo a la inhibición de la apoptosis.

Justificación

Conocer porque las células no pueden llegar a muerte celular programada y si

el factor NFkB esta relacionado y en que tipos le Leucemia Mieloides se

encuentra implicada para que se lleve este proceso celular.

I

Resumen

La leucemia mieloide aguda (LMA) se caracteriza por la acumulación de células

mieloides inmaduras en médula ósea, sangre periférica y otros órganos,

acompañada de una supresión de la hematopoyesis normal. Es una

enfermedad altamente heterogénea, razón por la cual se han definido varios

subtipos histológicos (M0 a M7 según la clasificación FAB: Franco-Americana-

Británica). Los signos y síntomas clínicos observados están estrechamente

relacionados con la infiltración de los tejidos por las células leucémicas y el

fracaso de la hematopoyesis.

La apoptosis es un proceso fisiológico critico para el crecimiento celular,

regulado por factores pro y anti-apoptóticos. Defectos en su control conllevan

a un crecimiento sin control de las células, favoreciendo el desarrollo de

patologías neoplásicas. El factor de transcripción NFkB se ha convertido en

una de las proteínas más estudiadas en diferentes tipos de enfermedades en

los últimos años. En padecimientos oncológicos, NFkB puede promover la

inhibición de la apoptosis por lo que el uso de inhibidores selectivos lleva a un

aumento de la apoptosis. El objetivo de este trabajo es realizar una revisión

bibliográfica, sobre el factor de transcripción NFkB con relación a proteínas

anti-apoptoticas en la LMA.

En la LMA tipos M1,M2 y M4 se ha reportado la actividad constitutiva NFKb. En

un trabajo se reporta la activación constitutiva de NFkB en 14 de 30 pacientes

con LMA, también menciona que la activación consiste en la translocación de

las sub-unidades p65 y p50 del NFkB al núcleo.

II

1

Introducción.

Leucemia Mieloide (LM)

La LM es un grupo de enfermedades clonales de los progenitores

hematopoyéticos que se caracterizan por un bloqueo en la diferenciación de

dichos progenitores hasta células sanguíneas maduras normales. 1 La LM es una

enfermedad grave y agresiva que se caracteriza por un comienzo rápido y un

curso terminal muy breve si no se trata.2

Las células leucémicas conservan su capacidad proliferativa, por lo que la

acumulación en la médula ósea de estas células inmaduras no funcionales, inhibe

el desarrollo de la hematopoyesis normal.1 La sobre producción de células

leucémicas en la médula ósea altera la hematopoyesis y da lugar a anemia,

trombocitopenia e infecciones.

Clasificación

Bennett y Cols, 1 propusieron por primera vez en 1976 un sistema uniforme para

clasificar la Leucemia Mieloide Aguda (LMA). Este sistema se basa en la

caracterización morfológica y citoquímica exhibida por las células de sangre

periférica o médula ósea. Un grupo de investigadores hematólogos, franceses,

americanos y británicos (FAB) 1 denominado grupo FAB, las clasifica por subtipos

adicionales gracias a la aplicación de métodos morfológicos, citoquímicos e

inmunofenotipo clasificándolas en leucemias aguda mieloide que van de MO a

M7.

M0: leucemia mieloide aguda sin diferenciación ni maduración, se asocia con un

elevado numero de incidencias de anomalías citogenéticas (trisomìa 8,

2

monosomia 5, monosomia 7, y trisonomia 13)1, puede identificarse con la

inmunofenotipificación.2 Se observan blastos en un porcentaje menor al 30%.3

Morfología y citoquímica. Los blastos leucémicos son muy indiferenciados, de

mediano tamaño, de núcleo redondo en ocasiones ligeramente indentado con uno

o mas nucleolos, el citoplasma es agranular y de basofilia variable.

Son constantemente mieloperoxidaza (MPO), negro sudán y naftol cloracatato

estereza negativo.

Inmunofenotipo. Los blastos expresan uno o más antigenos panmieloides, como

CD13, CD33 y CD117. Son negativas a los antígenos pan B y T. La anti-MPO es

negativa en la mayoría de casos. Presentan positividad para marcadores de

células hematopoyéticas primitivas, como CD34, CD38 y HLA-DR y suelen

carecer de antígenos de diferenciación mielomonocítica como CD11b, CD15,

CD14 y CD65. Se han descrito casos positivos para antígenos asociados con

diferenciación linfoide pero no específicos de línea, como CD7, CD2 o CD19, con

intensidad inferior a la que expresan las células linfoides.

M1: leucemia mieloide aguda sin maduración, inmadura mas del 90% de blastos 1,

hasta el 10% de las células pueden ser granulocitos o monocitos en maduración.

Los gránulos y presencia de cuerpos de Auer son poco frecuentes.1, 2, Se

observan un porcentaje del 90% de blastos.3

Morfología y citoquímica: los mieloblastos son de núcleo redondo, sin incisuras y

con cromatina fina y nucleolada; el citoplasma suele ser escaso, hialino o

débilmente basófilo. Presentan mas del 3% de blastos MPO o negro Sudán

Positivos.

3

Inmunofenotipo: expresan dos antígenos mielomonocitos que incluyen CD13,

CD33, CD17 y/o MPO. El CD34 suele ser positivo, los marcadores de tipo linfoide

están ausentes.

M2: leucemia mieloide aguda con maduración, los mieloblastos constituyen del

30-90% de las células no eritroides de la médula ósea, y más del 10% de las

células no eritroides son granulocitos en maduración. Los blastos muestran

gránulos azurófilos prominentes y con frecuencia hay presencia de bastones de

auer.1,2,3

Morfología y citoquímica: los blastos se acompañan de mas del 10% de

elementos con diferenciación mieloide (promielocitos a polimorfonucleares) y

menos del 20% de componentes monociticos. Los blastos pueden ser

agranulados o presentar granulación azurófila, y con frecuencia, bastones de

Auer. Los neutrofilos semimaduros y maduros suelen presentar dispoyesis como

seudo Pelger, desgranulación o gránulos seudo Chediak.

Existe una variedad ligada a la translocación o deleción del cromosoma 12p y con

la translocación t(6;9) (p22;q34)(DEK/CAN).

Inmunofenotipo: los blastos suelen presentar más de un antígeno mieloide como

CD13, CD33 y CD35. también pueden expresar CD117, CD34 y HLA-DR.

M3: leucemia promielocitica aguda, la médula ósea contiene más de 30% de

promielocitos anómalos caracterizados por la presencia de una fuerte granulación

azurófila. Los bastones de auer están presentes en casi todos los casos. 1,2,3

M4: leucemia mielomonocítica aguda, es un subtipo similar a la M2, excepto por el

hecho de que las células de estirpe monocítica, es decir, los monoblastos,

promonocitos y monocitos, constituyen más del 20% de las células proliferantes.

4

La M4Eo (variante eosinofila), se asocia con un elevado número (10-50%) de

eosinófilos en la médula y en sangre periférica, y con anomalías en el cromosama

16.1,2,3

Morfología y citoquímica: los monolastos son células de gran tamaño, con

abundante citoplasma de basofilia variable. El núcleo suele ser de contorno

regular, la cromatina fina y con uno o más nucleolos. Los promonocitos tienen un

contorno mas irregular, presentan nucléolo y el citoplasma es menos basófilo, con

fina granulación azurófila y pequeñas vacuolas. Los monocitos de sangre

periférica suelen ser más grandes que los de médula ósea.

Más del 3% de los blastos de médula ósea son positivos a la MPO. Los

monoblastos y promonocitos, en ocasiones pueden ser débilmente positivos o

incluso negativos. La tinción con la esterasa, naftol/ASD cloracetato esterasa

puede mostrar células doble positivas.

Inmunofenotipo: los blastos suelen ser HLA-DR positivos, expresan de forma

variable los antígenos CD13, CD33 y muestran marcadores de diferenciación

monocitica CD14, CD11b, CD11c, CD64, CD36 y lisozima. Con frecuencia suele

observarse una población residual de mieloblastos que expresan CD34 y

marcadores panmieloides.

M5: leucemia monocítica aguada, el 80% o más de las células no eritroides de la

medula ósea son monoblastos, promonocitos. En esta clasificación se subdivide

en dos subtipos:

Subtipo M5-A: poco diferenciado: todos los monoblastos (5%), el componente

granulocítico rara vez excede 10%.

Subtipo M5-B: diferenciado: predominio de promonocitos (5%), anomalías en el

cromosoma 1, un número pequeño de células puede tener bastones de Auer.1,2,3

5

Morfología y citoquímica: en la leucemia aguda monoblástica y en leucemia aguda

monocítica los monoblastos son de gran tamaño, núcleo redondo y citoplasma

amplio y basófilo. Los promonocitos muestran un núcleo arriñonado y citoplasma

de coloración azul-grisácea, dotado de fina granulación y, en ocasiones vacuolas.

Los bastones de Auer son poco frecuentes.

Los monoblastos y promonocitos son esterasas inespecificos positivos con

inhibición por el fluoruro sódico. La mieloperoxidasa es negativa en los

monoblastos y débilmente positiva en los promonocitos. En la variante con

eritrofagocitocisis y translocación t(8;16)(p11;p13)(MOZ/CBP), los blastos están

mediamente diferenciados y presentan imágenes de eritrofagocitos o

hemofagocitosis.

Suelen presentar actividad intensa para la mieloperoxidasa y las esterasas

inespecificas.

Inmunofenotipo: expresan antígenos mieloides CD13, CD33 y CD117, muestran

marcadores de diferenciación monocitica CD14, CD4, CD11b, CD11c, CD64,

CD68, CD36 y lisozima. HLA-DR positiva, el CD34 es frecuentemente negativo, y

el CD33 se expresa intensamente.

M6: eritroleucemia, el diagnostico se hace cuando al menos un 50% de las células

nucleadas de la médula ósea son eritroblastos, y al menos un 30% de las

restantes son mieloblastos. Un hallazgo característico de los precursores

eritroides es la presencia de diseritropoyesis en forma de células gigantes

multinucleadas, lobulación y fragmentación nuclear, megaloblastosis y

vacuolización. 1,2,3

Morfología y citoquímica: los eritroblatos jóvenes o de diferenciación intermedia

presentan importantes rasgos de diseritropoyesis, como gigantismo, rasgos

6

megalobásticos o vacuolas citoplasmáticas, en ocasiones elongadas y con

tendencia a coalescer.

Los mieloblastos suelen ser mieloperoxidasa y negro Sudán positivo. Los

eritroblastos pueden ser PAS positivo, con granularidad intensa en las formas

mas inmaduras y difusa en las mas maduras. Con la tinción de perls puede

detectarse siderblastos en anillo.

Inmunofenotipo: los mieloblastos muestran marcadores de diferenciación mieloide

como CD13, CD33, CD117 y MPO, así como CD34 y HLA-DR. El componente

eritroide presenta reacción con anticuerpos para la glicoforina A y C.

M7: leucemia megacarioblástica aguda, blastos menor a 30%, son células

indiferenciadas y pleomórficas que a veces se parecen a megacariocitos

maduros. 1,2,3

Morfología y citoquímica: los megacarioblastos suelen presentar un núcleo de

contorno muy variable, con uno o varios núcleos y citoplasma agranular. En

sangre periférica pueden observarse micromegacariocitos, que no se deben de

considerar elementos blásticos. Los micromegacariocitos son células de pequeño

tamaño, con uno o dos nucléolos de cromatina condensada y citoplasma maduro

con formación de plaquetas.

Los megacarioblastos son mieloperoxidasa y Sudán negativos.

Inmunofenotipo: los megacarioblastos presentan positividad para los anticuerpos

monoclonales contra las glicoproteínas plaquetarias de superficie, como el CD41

(glicoproteína IIb/IIIa) y CD61 (glucoproteína IIIa), y suelen ser negativas las

glicoproteínas de membrana plaquetaria de aparición más tardía, como el CD42

(glicoproteína Ib). Los marcadores mieloides como CD13, CD33 pueden ser

positivos, mientras casi siempre son negativos para CD45, CD34 y HLA-DR.

7

Otros marcadores para el diagnóstico son las proteínas que contienen gránulos

alfa, y en la superficie plaquetaria, el FVIII, la betatromboglobulina.

Otra clasificación de la leucemia mielodie aguda es la de la Organización Mundial

de la Salud (OMS) que tomó en cuenta además de los criterios que utiliza la FAB,

criterios citogenéticas y clinicos.

Clasificación de la leucemia mieloide según la OMS

Leucemias agudas mieloides con alteraciones genéticas recurrentes.

Leucemia aguda mieloide con translocación t(8:21)(q22;q22)

Leucemia aguda mieloide con eosinófilos anormales en médula ósea e

inv. (16)(p13q22) o translocación t(16;16)(p13;q22)

Leucemia aguda promielocitica con translocación t(15;17)(q22;q21) y variantes

Leucemia aguda mieloide con alteraciones en 11q23

Leucemia aguda mieloide con displasia multilínea

Precedidas por un síndrome mielodisplásico o por un síndrome mieloproliferativo

crónico/mielodisplásico. Sin antecedentes de un síndrome mielodisplásico.3

Para entender como es el proceso por el cual las células se convierten en

cancerosas es necesario considerar que estás evaden la muerte programada o

apoptosis.

Apoptosis

La muerte celular programada es un mecanismo fisiológico normal, que

desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de los tejidos. La muerte

8

celular programada es la responsable de que se mantenga el equilibrio con la

proliferación celular, y de mantener constante el número de células en aquellos

tejidos sometidos a un recambio continuo de células. La apoptosis constituye un

mecanismo de defensa mediante el que las células alteradas, potencialmente

peligrosas, son eliminadas por el bien del organismo. Las células infectadas en el

organismo por virus con frecuencia llevan a cabo este tipo de muerte, lo que evita

que se generen nuevas partículas víricas y que se propague el virus en el

organismo hospedaero. Otro tipo de alteraciones, como las lesiones en el DNA,

también inducen la muerte celular.4 Esta muerte es de vital importancia tanto

durante el desarrollo embrionario como durante la vida adulta. 5

Los mecanismos que regulan la muerte celular son esenciales para el desarrollo

normal y mantenimiento de la homeostasia. Las células crecen controladamente

gracias a la expresión de nuevos genes que inducen señales de muerte en

estadios definidos de diferenciación y en respuesta a estímulos fisiológicos

determinados.1,2

Las moléculas relacionadas con el proceso de apoptosis que se han mantenido a

lo largo de la evolución, desde organismos como el C. elegans hasta los

mamíferos, llevan a cabo un programa de apoptosis iniciado por señales que

provienen del interior celular. Estas señales responden a eventos que

comprometen el buen funcionamiento de la célula dentro del entorno donde está

situada, como: perdida de contacto con las células que la rodean, estrés celular o

señales contradictorias y simultaneas en cuanto a la puesta en marcha o no de su

ciclo de división. Ante esta situación, en que la célula es potencialmente peligrosa

para el sistema donde se encuentra integrada, se pone en marcha la maquinaria

de apoptosis y es eliminada. En la apoptosis, el mecanismo central de muerte

9

está constituido por una familia de proteasas, a las que se han denominado

"caspasas" 12, las caspasas responden al estímulo apoptótico mediante activación

de una cascada intracelular proteolítica que ocasiona la activación o inactivación

de diferentes sustratos celulares y provoca la muerte celular.

Este sistema ejecutor se ha mantenido a lo largo de la evolución y, tras su

descripción en C. elegans, se encontró el equivalente en mamíferos gracias a la

homología que presentaban ambas moléculas. Esta primera proteasa encontrada

en mamífero se denominó ICE (interleukin-1b-converting enzime) o caspasa-1

(cisteina-aspartasa-1), y es precisamente uno de los pocos miembros de la familia

al que no se le ha podido hallar relación directa con el proceso de apoptosis, sino

más bien con el de la inflamación.12

La familia de las caspasas en humanos está formada hasta el momento por 11

miembros descritos, y todos ellos tienen en común que se encuentran en forma

de zimógeno o proenzima con una estructura bien definida: a) el dominio N-

terminal es muy variable tanto en su secuencia como en su longitud y tiene

funciones de regulación y activación, b) la región catalítica está formada por dos

dominios, uno grande (20 KDa) y otro pequeño (10 KDa), que darán lugar a las

dos subunidades de la enzima una vez activada. Las caspasas se dividen en dos

grupos según la longitud de su región reguladora N-terminal o prodominio. Las

caspasas con prodominio largo como son la 1,2, 4, 5, 8, y 10 parecen estar

involucradas en funciones de regulación de la activación de la cascada. Ejemplos

bien conocidos de este grupo son las procaspasas 8 y 10 que contienen en sus

largos predominios, repeticiones de una secuencia de interacción proteina-

proteina llamada dominio efector de muerte o DED (death effector domain), y las

procaspasas 1, 2, 4, y 5 , que contienen dominios de reclutamiento de caspasas o

10

CARDs (caspase recruitment domains). La presencia en su estructura de estas

secuencias unido a su localización cercana a la membrana plasmática, hacen

posible su reclutamiento hacia el complejo formado en torno a receptores de

superficie que desencadenan la apoptosis como CD95 y TNF, activándose allí y

dando lugar al comienzo de la cascada de proteolisis. Por esta situación dentro

del proceso se les conoce como caspasas iniciadoras. El otro grupo está

compuesto por las caspasas con prodominio corto como son las caspasas 3, 6 y

7. Las cuales proteolizan sustratos celulares provocando la desorganización de la

célula y los cambios morfológicos típicos de la apoptosis.13 Los estudios

realizados sugieren que estas caspasas llamadas efectoras son las que actúan al

final de la cascada sobre los componentes celulares, proteolizándolos. Las

caspasas realizan su función enzimática de forma específica y eficaz. Cortan en el

sitio en donde se encuentran una cisteina precedida por un aspártico, cuando

existe en el sustrato una secuencia de reconocimiento compuesta de cuatro

aminoácidos y que varía significativamente entre las diferentes caspasas.

Además, es necesario que la proteína sustrato posea también una estructura

terciaria que le permita ser reconocida por las caspasas.

En cuanto a los sustratos celulares sobre los que actúan las caspasas, son un

número determinado de proteínas que pierden su función de tal manera, que la

organización celular resulta desmantelada.

La apoptosis se puede llevar a través de dos vías la extrínseca y la intrínseca.

Vía extrínseca

La vía extrínseca o de los "receptores de muerte" establece conexiones con el

espacio extracelular, recibiendo señales proapoptóticas desde el exterior y de las

11

células vecinas. Dos familias de receptores se han identificado con estas

características: receptor para la proteína Fas y receptor para el factor de

necrosis tumoral (TNF).

La proteína transmembranal Fas que su porción intracelular se une con un factor

intermedio denominado FADD (factor associated death domain), Fas que participa

activando las caspasas 8 y 10. Esta vía de Fas permanece inactiva hasta que se

produce en su parte externa el enlace con un cofactor llamado ligando Fas,

proteína que actúa como detonador que enciende una vía en que sólo las

caspasas están inactivas y el resto de la cadena está preparada para recibir el

enlace exterior. Esta característica permite actuar con gran rapidez sin necesidad

de sintetizar otros factores.5

Algo similar sucede con el otro receptor de membrana TNF. Su porción

intracelular conecta con complejos intermedios como el Tradd (TNF receptor

associated death domain) y Raidd (receptor associated interleukine death domain)

que activan caspasas "iniciadoras" de la apoptosis.

Vía intrínseca o mitocondrial

Otra vía de inducción de apoptosis es la vía llamada mitocondrial. Las proteínas

de la familia de Bcl-2 regulan la apoptosis ejerciendo su acción sobre la

mitocondria. La activación de proteínas pro-apoptóticas de la familia de Bcl-2

produce un poro en la membrana externa de las mitocondrias que permite la

liberación de numerosas proteínas del espacio intermembrana; entre ellas, el

citocromo c.

12

El citocromo c, una vez en el citosol, activa un complejo proteico llamado

"apoptosoma", que activa directamente a la caspasa-9. Una vez que la caspasa-9

está activada, ésta activa a las caspasas efectoras como la caspasa-3, lo que

desencadena las últimas fases de la apoptosis.

Las proteínas tipo multidominio pueden producir poros por si solas en liposomas,

lo que indica que probablemente son suficientes para formar el poro mitocondrial

que permite la liberación del citocromo c. Las proteínas con dominio BH3 activan

a estas proteínas, y las antiapoptóticas inhiben la formación del poro. Estas

proteínas son los reguladores más importantes del proceso de apoptosis. Una vez

activado el apoptosoma, este cliva a la procaspasa 3, activándola. Por otro lado a

la salida de citocromo c desde la mitocondria, otra proteína llamada SMAC la cual

es un inhibidor de los inhibidores de caspasas (IAPS) sale de la misma.

Por otra parte, un proceso como la apoptosis, que culmina con la muerte de las

células requiere de mecanismos de regulación de gran exactitud y seguridad en

los cuales intervienen las proteínas de la familia de Bcl-2.21

Las proteínas de la familia de Bcl-2 se agrupan en tres subfamilias: la familia de

las proteínas antiapoptóticas (Bcl-2, Bcl-Xl, Mcl-1); la familia de proteínas

proapoptóticas de tipo "multidominio" (Bax y Bak) y las proteínas proapoptóticas

con dominio BH3 (Bid, Bim, Bad y otras).

Lo que identifica a todas estas proteínas como miembros de una sola familia es la

presencia en su estructura de al menos uno de cuatro dominios consecutivo y que

se numeran desde BH1 a BH4. De estos dominios parece que BH3 está

directamente relacionado con una función pro-apoptótica y el resto de ellos con

una función anti-apoptótica. Estos dominios permiten interacciones de tipo homo y

13

heterodimerizaciones, para los miembros pro-apoptóticos del grupo BH3 que

basan gran parte de su funcionamiento en la unión a las proteínas anti-

apoptóticas alterando su actividad. Entre los miembros que componen a esta

familia tenemos:

• Bcl-2

Es la proteína prototipo de esta familia. Pesa 26 KDa y posee los cuatro dominios

que la definen (BH1-BH4). Bcl-2 es una proteína integral de membrana y se

encuentra en la cara citoplasmática de la membrana externa de la mitocondria, el

retículo endoplásmico y la membrana nuclear. En estas membranas, formar una

estructura similar a un poro, por donde pueden atravesar pequeñas proteínas a

través de ellas, interviniendo en la estabilidad del organelo. Su sobreexpresión

puede evitar o al menos retrasar, varias formas de muerte celular programada

como las inducidas por la retirada de factores de crecimiento, irradiación,

glucocorticoides y múltiples drogas

• Bcl-xL

Bcl-xL es una de las proteínas más estrechamente relacionada con Bcl-2, tanto en

su estructura como en su función. Posee los cuatro dominios BH y su peso

molecular es de 30 KDa. Su sobreexpresión puede mediar una resistencia

significativa a la muerte celular por apoptosis, dependiente de deprivación de

factor de crecimiento. Se ha estudiado la expresión del RNAm de esta molécula y

parece encontrarse en una gran variedad de tejidos, entre los que destacan

algunas poblaciones del sistema hematopoyético y el sistema nervioso central.23

Esta distribución preferencial puede sugerir algunos de los papeles fisiológicos

que puede jugar la expresión de esta proteína.24

14

Proteínas proapoptóticas multidominio.

• Bax

Esta proteína es uno de los miembros pro-apoptóticos más importantes de la

familia. Le da nombre a la subfamilia Bax, su peso molecular es de 21 KDa y

poseé los dominios BH1, BH2 y BH3 aunque son BH1 y BH2 los que guardan una

estrecha homología con Bcl-2. Bax esta ampliamente expresado en los distintos

tejidos y su sobreexpresión acelera la muerte en respuesta a distintas señales. Lo

que ha hecho recientemente a Bax objeto de estudio, es su implicación en los

fenómenos mitocondriales de la apoptosis y su capacidad de llevar a cabo una

forma de muerte celular programada independiente de muchos de los

mecanismos de regulación y ejecución de este proceso. Esto parece estar

relacionado con su capacidad para interaccionar con los canales que controlan la

permeabilidad y el flujo iónico en dicho orgánulo.25

Miembros de la subfamilia BH3

Bik, Bid, Bad, Bim, Hrk (Dp5)

Esta subfamilia está compuesta solo por miembros proapoptóticos que, excepto

por el dominio BH3, no muestran homología con Bcl-2. Para ejercer su actividad,

estas proteínas pueden formar heterodímeros con miembros antiapoptóticos de la

familia. Para ello, el dominio BH3 de los miembros de este grupo puede

introducirse en el poro hidrofóbico formado por la asociación de las regiones BH1,

BH2 y BH3 de los miembros antiapoptóticos. Un ejemplo Bid y Bik en la

mitocondria, donde inducen la liberación de citocromo c y posterior apoptosis.26

15

Otras proteínas que regulan la apoptosis son las proteínas inhibidoras de la

apoptosis (IAPs).

Las IAPs fueron originalmente identificadas en baculovirus por su capacidad de

suprimir la apoptosis en células infectadas del hospedero. En mamíferos se han

identificado ocho distintas IAPs siendo las más estudiadas la XIAP, c-IAP1, c-

IAP2, survivina y ML-IAP/Livina. La unidad funcional en las IAPs es el repetido

IAP baculoviral (BIR por Baculoviral IAP Repeat), el cual contiene 80 aminoácidos

plegados alrededor de un átomo de zinc. XIAP, c-IAP1 y c-IAP2 contienen tres

dominios BIR cada una, exhibiendo cada dominio funciones diferentes. En estas

IAPs el dominio BIR inhibe potencialmente la actividad de la caspasa 9

procesada, mientras que la región de unión entre los dominios BIR1 y BIR2 inhibe

selectivamente a las caspasa 3 y 7.

La sobreexpresion de IAPs genera resistencia celular a una ámplia gama de

estímulos apoptóticos. El punto exacto de la inhibición por IAPs es de momento

desconocido; se proponen varios modelos. Parece ser que por un lado las IAPs

inhiben la apoptosis interfiriendo directamente con la actividad catalítica de ciertas

caspasas, y por el otro, que las IAPs pueden incluso evitar el procesado o la

activación de las procaspasas u otras proteínas implicadas en su activación.

Esto último sugiere que las IAPs participen en las dos rutas mayores de la

apoptosis, la de los receptores de membrana y la dependiente de cyt c (Apaf-1).

En la ruta de los receptores de membrana, las IAPs bloquearían las

caspasas efectoras -3 y -7, parando así la cascada de apoptosis iniciada

por la caspasa-8.

En la ruta dependiente de citocromo c, las IAPs actuarían a tres niveles:

16

1. Interfiriendo directamente con la procaspasa-9 evitando su

procesamiento.

2. Mediante sus CARDs compitiendo para unir a Apaf-1.

3. Inhibiendo directamente las caspasas activadas.

Se puede concluir que las IAPs proporcionan un mecanismo de defensa contra

cualquier activación mínima del programa apoptótico. Los niveles celulares de

estas IAPs deberían determinar las diferencias en cuanto a sensibilidad a

estímulos proapoptóticos existentes en distintos tipos celulares. Por esta razón la

regulación de estos niveles resulta fundamental.

Se ha visto que las c-IAPs al igual que las proteínas antiapoptoticas son

reguladas transcripcionalmente de manera directa por el factor de transcripción

NF-kB.

Factor de transcripción NFkB

En 1986, el grupo de Baltimore y colaboradores describieron un factor nuclear

capaz de unirse al aumentador o "enhancer" la región reguladora del promotor de

la cadena pesada K de los genes que codifican para inmunoglobulinas. Se pensó

que este factor de trascripción era exclusivo de los linfocitos por haberse

encontrado en el núcleo de este tipo de células, actualmente se sabe que se

expresa de manera constitutiva en prácticamente todas las células del

organismo.27.28

Este factor nuclear regula la trascripción de muchos genes que están involucrados

17

en la respuesta inmune innata, el control de la proliferación celular y

sobrevivencia.

EI factor de transcripción NF-KB puede estar formado por homo y heterodímeros

de diferentes subunidades que han sido agrupadas dentro de la familia ReI.

FAMILIA REL.

En mamíferos se han descrito las siguientes subunidades Rel: c-Rel, p65, p50 y

p52.

Cada proteína Rel tiene una región conservada de 300 aminoácidos en la región

N-terminal llamada dominio Rel, responsable de la dimerización, la unión al DNA,

la interacción con proteínas inhibitorias de IKB. EI dímero mas abundante y el

primero descrito es el formado entre las subunidades p50 y p65, debido a que se

pueden formar heterodímeros, esto les confiere distintas actividades fisiológicas

importantes presentando distintos potenciales de transcripción.31,32

El NF-KB se encuentra de manera basal en el citoplasma en un estado inactivo,

secuestrado por una familia de proteínas inhibidoras del factor nuclear KB (IKB),

solo en las células B y sus progenitoras este factor se encuentra

constitutivamente en el núcleo.

Los pasos necesarios para la translocación de NF-KB al núcleo son:

1) activación de las cinasas en residuos de serina IKKα e IKKβ.

2) fosforilación de dos residuos de serina en las moléculas IKB.

18

3) ubiquitinización de las IKBs fosforiladas.

4) degradación de las IKBs en el proteosoma.

5) translocación del dimero NF-KB al núcleo.

6) Fosforilación de p65.

Por tanto, la regulación de la proteína cinasa que fosforila IKB, actualmente es el

centro de atención en la activación de NF-KB.

Una vez en el núcleo, el factor se une a secuencias especificas (sitios de unión

kB) en la región promotora de varios genes que incluye tanto inhibidores de la

apoptosis (Bcl-2, Bcl-kl, Bcl-w, Mcl-1, Nr12 y 1/Bfl-) como promotores de la

apoptosis (Bax, Bak Bok, Diva, Bcl-xs, Bik, Bim, Hrk, Nip3, Nix, Bad,Bid).

La variedad de estímulos que activan NF-KB sugiere que muchas vías de

transducción están involucradas en su translocación, por lo que no queda claro si

todas las vías convergen en un intermediario común, o si la fosforilación de IKB

puede proceder de distintos estímulos.33,34

Se han caracterizado al menos seis isoformas de la proteína inhibidora IKB. Las

isoformas mejor caracterizadas son IKB-α e IKB-β, las cuales se encuentran en

prácticamente todos los tipos celulares y son responsables de la mayor parte de

la regulación de NF-KB. La otra isoforma, que en los últimos años ha cobrado

importancia es IKB-є, que participa en las respuestas bifásicas y probablemente

más especificas.

19

ACTIVACION DEL NFkB

La ruta clásica de activación de NF-κB es inducida por una variedad de

mediadores de respuesta inmune innata y adaptativa, tales como citocinas

proinflamatorias (TNFa, IL-1p), la activación del receptor similar a Toll (TLR) y los

receptores de antígenos (TCR y BCR). Todas estas cascadas de señalización

convergen en la activación de las proteínas IKK y en la degradación de IKBα

permitiendo la liberación de los heterodímeros p50/ RelA y p50/c-Rel.35

En la vía de activación clásica, el evento característico es la fosforilación de IKBα

por el complejo IKKα/β. En esta ruta también interviene NEMO, el cual es

requerido para la interacción del complejo IKK con las proteínas corriente arriba

de la señal. En respuesta a la activación por TNFα e IL-1, IKKβ fosforila a IKBα.36

La activación de IKKβ por estos estímulos requiere de la proteína activadora de

mitosis cinasa-cinasa-cinasa (MAP-3K), MAPK/ERK-cinasa reguladora de señales

extracelulares (MEKK3) y cinasa activadora del factor de crecimiento

transformante p (TAK1) las cuales probablemente fosforilan directamente a

IKKβ.37

Todos estos inductores de NF-κB, a través de diferentes receptores y proteínas

adaptadoras, desencadenan señales que convergen en la activación del complejo

cinasa IkB (IKK), complejo que incluye a la molécula de andamiaje NEMO y a las

IKKα e IKKβ.38

La IKBα es fosforilada por IKKβ en el extremo amino-Terminal en residuos de

serina, lo que permite la unión de IkB con la proteína que contiene repeticiones

de transducción p (pTrCP), la cual forma parte del complejo de ligasa de

ubiquitina Skp1/Cul1/F-box (SCF). Éste cataliza la rápida poliubiquitinación de IkB

20

para su degradación por el proteosoma 26S, permitiendo la liberación de NF-κB y

la consiguiente modulación de transcripción de genes.38

Ruta alternativa o no canónica

La ruta alternativa, independiente de NEMO, es inducida en respuesta al factor

activador de células B (BAFF), LT(3, ligando CD40, virus de leucemia humana

tipo I de células T (HTLV)) y virus de Epstein-Barr (EBV), y en ella participa la

cinasa inductora de NF-κB (NIK). NIK fosforila al homodímero IKKα

desencadenando su interacción con la proteína p100 que está unida a RelB. La

fosforilación de p100 es seguida por su procesamiento en proteosoma a p52 y por

la translocación del complejo RelB/ p52 al núcleo.39

Proteínas anti-apoptoticas en LMA

El balance entre eventos pro-apoptóticos y anti-apoptóticos regulan el proceso de

muerte celular programada, las alteraciones en este delicado equilibrio ocurre en

la LMA, predominando el accionar de proteínas anti-apoptóticas lo que otorga

ventajas hacia la sobrevida promoviendo el desarrollo de neoplasias.41 en la LMA

tipo M1,M2 y M4 se ha reportado la expresión de proteinas anti-apoptoticas como

Bcl-2. Bcl-xL, Mcl-1 y XIap-1.42

Por otra parte también se ha reportado la expresión de proteinas pro-apoptoticas

como Bax o Bad relacionado con un buen pronostico para los pacientes con LMA.

Se ha relacionado la expresión de Bcl-2 con Bax, de tal forma que si el radio de

Bcl-2/Bax es alto, esta relacionado con mal pronostico, esto se ha reportado

21

mediante citometria de flujo, los niveles superiores de proteinas anti-apoptosis

Bcl-2, Bcl-x (L), Mcl-1permeabilizan la membrana y son reportados en la LMA.

Algo cointrario es la actividad pro- apoptotica proteinas como Bax o Bad permiten

la permiablización y son diagnosticado como buen pronostico en la LMA.40,41

En la LMA tipo M1,M2 y M4 se ha reportado la actividad constitutiva NFKb 39.41.

En un trabajo se reporta la activación constitutiva de NFkB en 14 de 30 pacientes

con LMA, también menciona que la activación consiste en la translocación de las

sub-unidades p65 y p50 del NFkB al núcleo.42

Por otra parte Guzmán reporto en el 2001 que la inhibición de NFkB provoca la

disminución en la expresión de proteínas anti-apoptoticas como Bcl-2, IAP-1 en

leucemias de pacientes con LMA en cultivo.39,42

La inhibición del NFkB por los inhibidores CAPE y MG-132 también producen una

disminución significativa en el numero de células lo que indicaría el importante

papel que desempeña la vía de señalización de NFkB en la sobrevida de estas

células. El efecto inhibitorio sobre la proliferación celular inducido por las drogas

estudiadas está mediado por mecanismos que indican en apoptosis celular.43

22

Conclusiones

La LMA se caracteriza por la acumulación de células mieloides inmaduras

en médula ósea, sangre periférica y otros órganos, acompañada de una

supresión de la hematopoyesis normal. Los signos y síntomas clínicos

observados están estrechamente relacionados con la infiltración de los

tejidos por las células leucémicas y el fracaso de la hematopoyesis antes

mencionado.

El factor de transcripcion NFkB se encuentra constitutivamente activo en la

LMA tipo M1, M2 y M4.

En la LMA se ha reportado la sobre expresión de proteinas anti-apoptoticas

como Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 y XIAP-1; lo cual indica que estas proteinas

pueden estar involucradas en la inhibición de la apoptosis.

Se ha reportado en la LMA que existe una relacion entre la activacion de

NFkB y el aumento en la expresión de proteinas antiapoptoticas como Bcl2

y CIAP-1.

El factor NFkB y las proteinas anti-apoptoticas estan siendo utilizadas

como moléculas blanco en el tratamiento de la LMA.

23

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