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INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL
PERFIL MICROBIOLÓGICO E DE RESISTÊNCIA DOS STAPHYLOCOCCUS
COAGULASE NEGATIVA ISOLADOS DE NOVILHAS TRATADAS NO PRÉ-
PARTO
Lucas Eduardo Pilon
Nova Odessa
Fevereiro de 2012
ii
iii
GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL
Perfil microbiológico e de resistência dos Staphylococcus Coagulase negativa isolados de
novilhas tratadas no pré-parto
Lucas Eduardo Pilon Orientadora: Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro
Nova Odessa
Fevereiro de 2012
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação do Instituto de Zootecnia, APTA/SAA, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Produção Animal Sustentável.
iv
Ficha elaborada pelo Núcleo de Informação e Documentação do Instituto de Zootecnia
Bibliotecária responsável – Ana Paula dos Santos Galletta - CRB8/7166
P643p Pilon, Lucas Eduardo
Perfil microbiológico e de resistência dos Staphylococcus coagulase negativa isolados de novilhas tratadas no pré-parto. / Lucas Eduardo Pilon. Nova Odessa - SP, 2012.
57p. : il.
Dissertação (Mestrado) - Instituto de Zootecnia. APTA/SAA.
Orientadora: Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro.
1. Mastite animal. 2. Novilhas - Doenças. I. Arcaro, Juliana Rodrigues Pozzi. II. Título.
CDD 636.089692
v
GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO
SECRETARIA DA AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO
PERFIL MICROBIOLÓGICO E DE RESISTÊNCIA DOS
STAPHYLOCOCCUS COAGULASE NEGATIVA ISOLADOS DE
NOVILHAS TRATADAS NO PRÉ-PARTO
LUCAS EDUARDO PILON
Orientadora: Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro
Aprovado como parte das exigências para obtenção de título de MESTRE em Produção
Animal Sustentável, pela Comissão Examinadora:
_____________________________
Drª.Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro
__________________________ Drª. Cecília José Verissimo
______________________________
Dr. Roberto Bellizia Raia Júnior
Data da realização: 03 de Fevereiro de 2012
Presidente da Comissão Examinadora Prof. Drª. Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro
vi
vii
Dedicatória
Dedico este trabalho aos meus queridos pais:
Adair Pilon (in memorian) e Maria Alice Malpeli Pilon,
que nunca mediram esforços para que seus filhos
aprendessem o que há de mais belo, o estudo; aos
meus irmãos: José Angelo Pilon e Carlos Eduardo Pilon
e a minha sobrinha Natalia Ferreira Pilon.
A minha orientadora Drª. Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro,
pelos ensinamentos e pelas experiências que me
foram passadas durante o período em que trabalhamos juntos.
viii
Pensamentos
A nossa maior glória, não reside no fato
de nunca cairmos, mas sim em levantarmos
sempre depois de uma queda.
Confúcio
Nunca ande pelo caminho traçado, pois ele conduz até onde os outros foram.
Alexandre Graham Bell
ix
Agradecimentos
Gostaria de agradecer primeiramente a Deus e Nossa Senhora Aparecida, por ter me dados forças nessa caminhada, em busca de mais um sonho. Agradeço a toda a minha família, Maria Alice Malpeli Pilon, minha querida mamãe, que sofreu e sorriu junto comigo durante todo esse período em que passei fora de casa, aos meus queridos irmãos José Angelo Pilon, Carlos Eduardo Pilon e minha querida sobrinha Natália Ferreira Pilon, pelo apoio e incentivo durante esta caminhada em busca de mais um sonho. Não posso deixar de citar o Sr. Adair Pilon, o meu querido papai, seu fã e me espelho em você pai, gostaria de poder sorrir junto com o senhor esse momento tão especial, que está se concretizando em minha vida. Agradeço a minha namorada Sabrina Souza da Costa, pelo incentivo, paciência, pelo carinho, pelos esforços que tem feito para podermos nos ver, só tenho a agradecer, te amo. À Professora Drª. Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro, pela oportunidade, pelos ensinamentos, incentivos durante esta caminhada. Aos professores do Conselho de Pós-Graduação do Instituto de Zootecnia (IZ), pelos ensinamentos que transmitiram a todos os alunos. Ao Drº. Luiz Alberto Ambrósio, pelos ensinamentos estatísticos e pelas análises realizadas. À Mariana, Thiago e a Lívia pelo apoio durante as coletas nas propriedades e nas análises laboratoriais. Ao Drº. José Victor de Oliveira, pelo confiança, pelos conselhos e ensinamentos durante esta caminhada. Ao Professor Drº. Irineu Arcaro Junior e Drª. Luciandra Macedo de Toledo pela oportunidade, amizade e pelos ensinamentos. Aos colegas de pós-graduação, Juliano, Ana Claudia, Marco Aurélio, pelos momentos de descontração. Colegas da república, Giani, Joana, Claiton, pela amizade e experiências trocadas. Aos funcionários da CAPTA Bovino de Leite (setor palmeira), Tereza, Ana Baião, Creusa, Donizete e Edmar, pela amizade, companheirismo e que sem dúvida não mediram esforços para ajudar na realização deste projeto.
x
Aos proprietários das propriedades por permitirem a inclusão de dados neste trabalho, aos funcionários pelo apoio, compreensão e paciência durante as coletas. À todos que colaboraram de forma direta ou indireta na realização deste projeto. À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), pela bolsa concedida durante a execução do projeto.
xi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURA..................................................................................................................... xiii
LISTA DE TABELA..................................................................................................................... xv
RESUMO .................................................................................................................................... xvii
ABSTRACT ................................................................................................................................. xix
1 – INTRODUÇÃO......................................................................................................................... 1
2 – REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................. 3
2.1 – Mastite ................................................................................................................................ 3
2.2 – Prejuízos econômicos causados pela mastite...................................................................... 5
2.3 – Mastite em novilhas............................................................................................................ 5
2.4 – Mastite por Staphylococcus coagulase negativa................................................................. 8
2.5 – Perfil de resistência aos antimicrobianos ........................................................................... 9
2.5 – Produção de (slime) biofilme pelos Staphylococcus coagulase negativo......................... 10
3 – MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................... 13
3.1 – Rebanhos estudados.......................................................................................................... 13
3.2 – Manejos ............................................................................................................................ 13
3.3 – Manejo de ordenha ........................................................................................................... 15
3.4 – Delineamento experimental e tratamentos ....................................................................... 16
3.5 – Colheita do material biológico das novilhas .................................................................... 17
3.5.1 – Período pré-parto ....................................................................................................... 17
3.5.2 – Parição ....................................................................................................................... 17
3.5.3 - Dez dias após a data de parição.................................................................................. 18
3.6 – Análises Laboratoriais ...................................................................................................... 19
3.6.1 - Isolamento e identificação de microrganismos .......................................................... 19
3.6.2 - Identificação dos Staphylococcus coagulase negativa ............................................... 20
3.6.3 - Teste de sensibilidade a antimicrobianos................................................................... 20
3.6.4 - Ensaio para a verificação da produção da cápsula mucosa (slime)............................ 21
3.7 – Amostragem e análises estatísticas............................................................................... 21
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 23
4.1 – Perfil microbiológico........................................................................................................ 23
xii
4.2 – Perfil antimicrobiano dos Staphylococcus coagulase negativa. ....................................... 35
4.3 - Produção de biofilme (slime) pelos Staphylococcus coagulase negativa.......................... 38
5 – CONCLUSÃO......................................................................................................................... 41
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS..................................................................................... 43
xiii
LISTA DE FIGURA
Figura 1: Colheita de leite para análise laboratorial..................................................................... 18
Figura 2: Placa de ágar sangue com crescimento bacteriano. ...................................................... 19
Figura 3: Antibiograma com os discos que continham os princípios ativos – Furazolidona
(acima) e Bacitracina (abaixo)....................................................................................................... 20
Figura 4: Placa de Antibiograma.................................................................................................. 21
Figura 5: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase negativa (SCN),
Staphylococcus coagulase positiva (SCP) e Staphylococcus aureus, isolados das secreções das
glândulas mamàrias, colostro e das amostras de leite, durante o período de coleta na (Fazenda 1),
São Paulo, Brasil, 2011. ................................................................................................................ 25
Figura 6: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase positiva (SCP), Staphylococcus
coagulase negativa (SCN) e Staphylococcus aureus, durante todas as colheitas realizadas nos
animais pertencentes ao grupo não tratado. Fazenda 2, São Paulo, Brasil, 2011.......................... 27
Figura 7: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase positiva (SCP), Staphylococcus
coagulase negativa (SCN) e Staphylococcus aureus, durante todas as colheitas realizadas nos
animais pertencentes ao grupo tratado. Fazenda 2, São Paulo, Brasil, 2011................................. 28
Figura 8: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase positiva (SCP), Staphylococcus
coagulase negativa (SCN) e Staphylococcus aureus, durante todas as colheitas realizadas nos
animais pertencentes ao grupo não tratado. (Fazenda 3), São Paulo, Brasil, 2011. ......................30
Figura 9: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase positiva (SCP), Staphylococcus
coagulase negativa (SCN) e Staphylococcus aureus, durante todas as colheitas realizadas nos
animais pertencentes ao grupo tratado. (Fazenda 3), São Paulo, Brasil, 2011.............................. 31
xiv
xv
LISTA DE TABELA
Tabela 1: Frequência absoluta (FA) e relativa (FR) dos microrganismos isolados da secreção da
glândula mamária, colostro e leite das novilhas tratadas durante o período pré–parto na Fazenda
1, São Paulo, Brasil, 2011. ............................................................................................................ 24
Tabela 2: Frequência relativa (FR) dos patógenos isolados das amostras coletadas dos tetos das
novilhas durante todo o período do experimento, animais pertencentes aos grupos tratado e não
tratado e o valor do Qui-quadrado, (Fazendas 2 e 3), São Paulo, Brasil, 2011............................. 32
Tabela 3: Frequência absoluta, valor do Odds-Ratio e Intervalo de confiança (IC) do Odds-Ratio,
dos patógenos isolados das novilhas pertencentes aos grupos não tratadas e tratadas, (Fazendas 2
e 3), São Paulo, Brasil, 2011. ........................................................................................................ 33
Letras iguais, não diferem nas frequências entre si. ...................................................................... 33
Tabela 4: Frequência absoluta (FA) e frequência relativa (FR) das espécies de Staphylococcus
coagulase negativa (SCN) identificados dos quartos mamários das novilhas pertencentes aos
grupos tratados e não tratados, durante todo o período de colheita, nas (Fazendas 1, 2 e 3), São
Paulo, Brasil, 2011. ....................................................................................................................... 34
Tabela 5: Perfis antimicrobianos de Staphylococcus coagulase negativa, isolados de amostras
coletadas dos quartos mamários no pré-parto, pós-parto e durante a lactação das fazendas 1, 2 e 3,
São Paulo, Brasil, 2011. ................................................................................................................ 36
Tabela 6: Resultado das estirpes de Staphylococcus coagulase negativa, submetidas ao teste do
ágar Vermelho Congo, para diagnosticar ou não a produção de biofilme (slime) das amostras
coletadas dos quartos mamários no pré-parto, pós-parto e durante a lactação das fazendas 1, 2 e 3,
São Paulo, Brasil, 2011. ................................................................................................................ 39
xvi
xvii
RESUMO
Perfil microbiológico e de resistência dos Staphylococcus coagulase negativa isolados de
novilhas tratadas no pré-parto.
A mastite, processo inflamatório da glândula mamária, é responsável por grandes prejuízos aos produtores. O trabalho teve como objetivos: avaliar o tratamento pré-parto nas novilhas sobre os Staphylococcus coagulase negativa (SCN); o perfil antimicrobiano; verificar a produção de biofilme e identificar as espécies (SCN) em novilhas primíparas. Foram utilizados 87 animais, distribuídos em três propriedades: Fazenda (1), com 40 novilhas, (Descalvado, SP), todas tratadas no pré-parto; Fazenda (2), (Pindamonhangaba, SP), com 18 novilhas; fazenda (3), com 29 animais, (Nova Odessa, SP). Nas Fazendas 2 e 3 os animais foram divididos em grupos tratadas e não tratadas no pré-parto. Os resultados mostraram que na Fazenda 1 ocorreu predominância dos SCN no pré-parto (30,16%) e no parto (1,57%). Na Fazenda 2 ocorreu predominância dos SCN no pré-parto (88,89%) e no parto (60%) no grupo de novilhas não tratadas; no grupo tratado, a ocorrência no pré-parto dos SCN foi de 100% e, no parto, os Staphylococcus coagulase positiva (SCP) (50%). Na fazenda 3 prevaleceram os (SCP), tanto no pré-parto e parto para o grupo não tratado (69,24% e 39,38%, respectivamente), e igualmente no grupo tratado (100% e 39,28%, respectivamente). Ocorreram diferenças significativas quando se comparam os grupos não tratado e tratado na fazenda 2 em relação S. aureus (P=0,004), Corynebacterium spp. (P=0,05), e Fazenda 3 para os SCP (P=0,0001) e S. aureus (P=0,029). O Staphylococcus simulans prevaleceu nas Fazendas 1, 2 e 3 (51,02%, 68,97% e 50%, respectivamente). No antibiograma, as fazendas apresentaram as seguintes resistências: Fazenda 1 – 16,98% ampicilina, 13,21% penicilina e 2,83% oxacilina; fazenda 2 – 31,03% penicilina e 17,24% oxacilina e Fazenda 3 – 52,22% pencilina e 13,33% oxacilina.
Palavra chave: antimicrobiano, glândula mamária, leite, parto, pré-parto.
xviii
xix
ABSTRACT
Microbiological and resistence profile of the coagulase-negative Staphylococci, isolated
heifers treated precalving.
Mastitis inflammation of the mammary gland is responsible for great economic loss to dairy farmers. The objectives of the present study were to evaluate the treatment in pre-partum heifers on coagulase-negative Staphylococcus (SCN); the antimicrobial profile; check the production of biofilm and identify species (SCN) in primiparous heifers. We used 87 animals, divided into three farms: Farm (1), 40 heifers (Descalvado, SP), all treated in the pre-partum; Farm (2), (Pindamonhangaba, SP), with 18 heifers; Farm (3), with 29 animals (Nova Odessa, SP). On farms 2 and 3 the animals were divided into treated and untreated groups in the pre-partum. The results showed that the Farm 1 was a predominance of SCN in the pre-partum (30.16%) and partum (1.57%). On the Farm 2 there was a predominance of two SCN in the pre-partum (88.89%) and partum (60%) of heifers in the group not treated, the treated group, the occurrence in the pre-partum SCN was 100% and in the partum, Staphylococcus coagulase positive (CPS) (50%). Prevailed on the Farm 3 (SCP), both pre-partum and partum to the untreated group (69.24% and 39.38%, respectively), and also in the treated group (100% and 39.28% respectively.) There were significant differences when comparing the untreated and treated groups at the farm 2 for S. aureus (P = 0.004), Corynebacterium spp. (P = 0.05), and Farm 3 for PCS (P = 0.0001) and S. aureus (P = 0.029). Staphylococcus simulans prevalent in Farm 1, 2 and 3 (51.02%, 68.97% and 50% respectively). In the antibiogram, the farms had the following strengths: farm 1 to 16.98% ampicillin, 13.21% penicillin and 2.83% oxacillin; farm 2 to 31.03% penicillin, 17.24% oxacillin and, farm 3- 52.22% penicillin and 13.33% oxacillin.
Key words: antimicrobial, calving, mammary gland, milk, precalving
xx
1
1 – INTRODUÇÃO
O leite é uma mistura complexa, estável e nutritiva de proteínas, gorduras e outros
elementos sólidos, que se encontram suspensos em água e constituem a composição que define a
qualidade do leite. Animais que recebem uma alimentação adequada, equilibrada e são
manejados corretamente produzem leite de boa qualidade (GIANOLA et al., 2004).
Dentre os principais problemas que afetam os animais produtores de leite, destaca-se a
mastite, processo inflamatório da glândula mamária, que leva a alterações na composição do
leite. As perdas econômicas ocasionadas pelo leite descartado de animais portadores de mastite
superam os prejuízos causados por doenças reprodutivas ou infertilidade. Essas perdas foram
equivalentes a seis vezes a produção média diária por vaca, para cada teto portador de mastite
clínica, segundo Holanda Junior et al. (2005).
Apesar da mastite ser considerada a principal doença que afeta os rebanhos leiteiros no
mundo, não há estudos aprofundados com novilhas primíparas, baseado no conceito de que esses
animais estariam livres de infecções. Entretanto, foi demonstrado em vários países e no Brasil
que novilhas primíparas podem parir com a doença (CALVINHO et al., 2007). Nos últimos 20
2
anos, diversas pesquisas têm sido realizadas com o objetivo de determinar a mastite em novilhas,
derrubando o dogma de que as novilhas são livres dessa doença.
Os objetivos deste trabalho foram: identificar Staphylococcus coagulase negativa (SCN),
presentes nas glândulas mamárias de novilhas primíparas tratadas e não tratadas no pré-parto e
traçar o perfil antimicrobiano. Traçar o perfil microbiológico dos agentes causadores de mastite
em novilhas, no pré-parto, parto e lactação; estabelecer a ocorrência de SCN no pré-parto, parto e
durante a lactação de novilhas; verificar a eficiência do tratamento de vaca seca utilizado nas
novilhas, quanto à redução de SCN; identificar as espécies de SCN, por meio de testes
bioquímicos; determinar o perfil de sensibilidade antimicrobiana in vitro dos SCN, isolados
frente aos antibióticos mais frequentemente utilizados na clínica médica veterinária; avaliar a
produção de biofilme das estirpes de SCN pela técnica de Agar Vermelho Congo.
3
2 – REVISÃO DE LITERATURA
2.1 – Mastite
Dentre as várias patologias que acometem os animais produtores de leite, a mastite (do
grego mastos) ou mamite (do latim mammae) bovina é considerada a doença que causa prejuízos
à produção leiteira, reduzindo em quantidade e qualidade o leite e os derivados lácteos
(SANTOS, 2003; RUEGG, 2003; ZAFALON et al., 2007).
A mastite é definida como o processo inflamatório da glândula mamária, essa inflamação
acarreta alterações na composição do leite. Diversas razões podem levar ao aparecimento da
mastite, sendo a mais comum a infecção do úbere por microrganismos (SOUTO, 2006). Segundo
Pinheiro et al. (2009), mesmo com a implantação de programas de prevenção da mastite, será
necessário continuar o monitoramento dessa afecção, e até mesmo implantar novas medidas de
controle.
A ocorrência de mastite pode resultar em perdas não só na lactação atual, mas também na
lactação seguinte, comprometendo a produção total do animal. Os prejuízos ocasionados pela
4
mastite na produção leiteira por lactação podem variar de 10 a 30% (AULDIST e HUBBLE,
1998).
A mastite pode ser classificada em: mastite clínica e subclínica, e essas definições
permitem diferenciar o processo inflamatório. A mastite clínica caracteriza-se por modificações
visíveis no leite, como a presença de grumos, fibrina ou secreção purulenta, e muitas vezes
alterações na glândula mamária como aumento de volume, presença de dor, aumento de
temperatura e rubor. Dentre os vários métodos de diagnóstico da mastite clínica, o teste da caneca
de fundo escuro ou caneca telada é o mais utilizado, sendo interpretado segundo os diferentes
escores observados nos primeiros jatos de leite retirados da glândula mamária, momento antes do
início da ordenha, com a interpretação realizada da seguinte maneira, segundo (DOMINGUES,
1993).
• Escore zero, leite normal (ausência de partículas);
• Escore um, leite ligeiramente descolorido com presença de grumos finos e delicados;
• Escore dois, leite com muitos grumos;
• Escore três, secreções não semelhantes ao leite, apresentado pus e/ou sangue, e/ou fibrina,
ou ainda aspecto viscoso, similar ao colostro.
A mastite subclínica não apresenta sinais clínicos evidentes, pois o leite apresenta aspecto
macroscópico normal, e não há sinais visíveis de inflamação do úbere, podendo ser detectada
somente por provas indiretas com o leite, como o (“California Mastitis Test” - CMT) (COSTA et
al., 1995). A realização do CMT consiste na comparação do escore de viscosidade da mistura
(leite acrescido de reagente próprio) e a intensidade do processo inflamatório na glândula
mamária. O escore é interpretado sob a forma de escala, que varia da seguinte maneira 0
(resultado negativo) a 3 (resultado máximo da inflamação) (SCHALM e NOORLANDER, 1957).
A mastite subclínica alastra-se silenciosamente entre o rebanho, não apresentando
alterações macroscópicas à inspeção do úbere ou no leite secretado, necessitando receber uma
maior atenção (BARBALHO e MOTA, 2001). A principal característica que a mastite subclínica
5
apresenta é o aumento na contagem de células somáticas (CCS), e valores acima de 200.000
células/ml indicam resposta inflamatória na glândula mamária (SMITH, 2001).
2.2 – Prejuízos econômicos causados pela mastite
Diante de todas as doenças microbianas, a mastite pode ser considerada a que causa maior
impacto no ponto de vista econômico, tanto para os produtores como para as indústrias de
produtos lácteos e, geralmente, os produtores adotam medidas preventivas para as vacas em
lactação, considerando os animais jovens refratários à infecção (HALLBERG et al., 1995).
Segundo Miller et al., (1993), os custos para realizar a prevenção da mastite pode ser de US$
14,50 vaca/ano, enquanto que os custos com mastite clínica aos produtores foi de US$ 37,91 vaca
ano.
No Brasil, estima-se que as perdas na produção variam de 12 a 15%, significando uma
perda de 2,8 bilhões de litros/ano, valores estes referentes a uma produção anual de 20 bilhões de
litros (CARVALHO et al., 2004).
Nos rebanhos brasileiros, a mastite subclínica atinge entre 20 e 43% das vacas em
lactação, provocando uma redução de cerca de 7,69% da produção de leite (900 milhões de
litros/ano). Quando se adotam medidas de controle da mastite, essas perdas se reduzem a 3,1%
(CHAPAVAL e PIEKARSKI, 2000).
2.3 – Mastite em novilhas
Até pouco tempo atrás acreditava-se que as taxas de infecções intramamárias em novilhas
vazias e gestantes eram baixas, porque para a maioria dos produtores esses animais eram
considerados sadios e a presença da mastite não era notada até o início da produção de leite ou
até o primeiro episódio clínico na lactação.
O desenvolvimento maior do tecido secretor de leite ocorre na primeira gestação, sendo
assim a mastite prejudica o desenvolvimento do tecido da glândula mamária, fazendo com que a
6
mesma não atinja o pleno desenvolvimento, prejudicando as lactações futuras (CERQUEIRA et
al., 2009).
Durante as décadas de 20 e 30, foram relatados os primeiros casos de mastite em novilhas
(STABELFORTH et al., 1935) e nos últimos 20 anos, diversas pesquisas foram realizadas com o
objetivo de descrever a natureza da mastite em novilhas, derrubando o dogma de que esses
animais seriam livres dessa doença (FOX, 2009). A partir dos anos 70 essa categoria animal
passou a receber mais atenção (MUNCH-PETERSEN, 1970; OLIVER e MITCHELL, 1983;
FOX et al., 1995).
Segundo Cerqueira et al. (2009), as novilhas podem tornar-se susceptíveis aos patógenos
causadores da mastite quando começam a produzir secreções intramamárias, por volta dos 6 a 8
meses de idade. Não se sabe ao certo como as novilhas se infectam, mas existem algumas
hipóteses que podem estar relacionadas ao aparecimento da doença: a presença de bactérias na
microbiota da pele dos tetos, a presença de bactérias que habitam a cavidade oral das bezerras
que mamam em outras, bactérias presentes no ambiente, nas camas, estercos e no solo ou ainda
veiculadas por moscas, e bezerras que são alimentadas com leite mastítico.
Alguns animais livram-se das infecções nas primeiras semanas pós-parto em
consequência dos procedimentos de ordenha, mas um número elevado de vacas primíparas
permanecem infectadas por longos períodos, acarretando diminuição na produção de leite
(MATTHEWS et al., 1992).
Diversos patógenos foram isolados de glândulas mamárias de novilhas, dentre esses
patógenos destacam-se Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae, Staphylococcus
coagulase negativa, e coliformes (MCDONALD 1982; OLIVER e MITCHELL 1983; DANIEL
et al., 1986; OLIVER 1987).
Oliver e Mitchell (1983) avaliaram os quartos mamários de 32 novilhas aos 14 e 7 dias
pré-parto e 7 e 14 dias pós-parto, verificaram que 67,1% dos quartos foram bacteriologicamente
negativos e 15,7% estavam infectados com Staphylococcus coagulase negativa, 8%
7
Staphylococcus coagulase positiva, 4,4% Streptococcus spp., 3,8% coliformes e 1%
Corynebacterium bovis.
Em trabalho realizado por Nickerson et al. (1995), no qual avaliaram a ocorrência de
mastite em rebanhos que adotavam medidas de controle contra moscas, observou-se que cerca de
70% das novilhas que apresentavam algum tipo de lesão na pele dos tetos, como por exemplo,
pequenas feridas ou abrasão, provavelmente causados por moscas, possuíam infecções
intramamárias, enquanto somente 30% das novilhas que apresentavam tecidos íntegros possuíam
infecções intramamárias. Os resultados obtidos pelos autores para os rebanhos com controle de
moscas foram: 32,9% Staphylococcus coagulase negativa, 5,6% Staphylococcus aureus, 3,7%
Streptococcus spp. 2,2,% Coliformes, enquanto que os resultados obtidos com os rebanhos sem
controle de moscas foram: 41,4% Staphylococcus coagulase negativa, 55,2% Staphylococcus
aureus, 20,7% Streptococcus spp. e 3,4% Actinomyces pyogenes.
Fox et al. (1995) analisaram amostras colhidas de novilhas em idade de reprodução e
imediatamente após o parto em quatro estados dos Estados Unidos da América, durante quatro
estações do ano. Tanto no pré-parto como no pós-parto ocorreu predominância dos
Staphylococcus coagulase negativa, nas quatro estações, em todos os estados, e a maior
ocorrência foi observada, no pré-parto no inverno na Lousiania (35,6%) e no pós-parto, na
primavera no estado de Vermont (36%).
Parker et al. (2007) analisaram amostras da secreção láctea de quartos mamários de 255
novilhas, obtidas quando os animais estavam com aproximadamente 31 dias pré-parto. As
frequências de isolamentos de Staphylococcus coagulase negativa no pré e pós-parto foram de
11,9% e 4,9%, respectivamente. Sampinom et al. (2009) colheram amostras de leite dos quartos
mamários de 185 novilhas durante o parto e 14 dias pós-parto e encontraram prevalências de
Staphylococcus coagulase negativa de 32% e 15%, respectivamente.
Paradis et al. (2010) avaliaram amostras colhidas de 1691 novilhas com
aproximadamente 30 dias pós-parto e relataram maior frequência de isolamentos dos
Staphylococcus coagulase negativa (9,9%), seguidos pelo Staphylococcus aureus (5,3%).
8
Levantamento realizado por Laffranchi et al. (2001) em quatro rebanhos leiteiros, localizados na
região norte do estado do Paraná, encontraram nas amostras de leite colhidas ao longo dos 120
primeiros dias de lactação de 457 quartos mamários de 88 vacas primíparas, (68,05%) de
Staphylococcus coagulase negativa, (12,25%) Corynebacterium bovis, (8,10%) Streptococcus
spp. Os autores concluíram que houve alta incidência de infecções intramamárias em vacas
primíparas, com predominância dos SCN, e que o leite dos quartos infectados apresentou alta
Contagem de Células Somáticas (CCS), comparado com os não infectados.
No Brasil, Costa et al. (1996), examinando 467 glândulas mamárias de 120 novilhas, de 6
(seis) rebanhos leiteiros, verificaram que 80% das novilhas apresentavam infecções
intramamárias, com 57% dos quartos mamários infectados, sendo que desse total, 49,2% eram
Staphylococcus spp., 95% foram caracterizados como SCN, Corynebacterium spp., correspondeu
a 7% dos isolamentos, 4% de Streptococcus spp. e microrganismos da Família Enterobacteriacea
(Klebsiella spp. e Escherichia coli) em 2% das glândulas mamárias infectadas .
2.4 – Mastite por Staphylococcus coagulase negativa
No passado pouco se sabia sobre a epidemiologia e patogenia das infecções
intramamárias por Staphylococcus coagulase negativa por serem considerados patógenos
secundários ou menores e, portanto, de pouca importância para o controle da mastite (HOGAN et
al. 1987). Atualmente são considerados os principais patógenos isolados nas amostras de leite de
animais com mastite. O termo coagulase negativa se refere ao teste laboratorial que diferencia
este grupo do Staphylococcus coagulase positivo. A maior parte dos pesquisadores não classifica
os SCN como agentes ambientais ou contagiosos, designando-os como “Microbiota oportunista
da pele do teto”, uma vez que esses agentes são normalmente encontrados na pele do teto, e dessa
forma podem ter acesso ao interior da glândula mamária resultando em infecção intramamária
(TRINDAD et al., 1990).
Staphylococcus coagulase negativo (SCN) são agentes de grande ocorrência na mastite
contagiosa. Diversas espécies já foram isoladas de amostras de leite de quartos mamários com
infecção. Dentre os mais importantes estão: S. epidermides, S. saprophyticus, S. haemolyticus, S.
9
warneri, S. hominis, S. simulans, S. lugudinensis, S. capitis, S. auricularis. S. pasteuri, S. caprae,
S. cohnii, S. xylosus, S. sacccharolyticus, S. sciuri, S. chromogenes, S. gallinarum, S. lentus, S.
equorum, S. felis, S. vitulinus, S. muscae, S. kloosii, S. arlettae, S. piscifermentans, S. condimenti,
S. succinus, S. fleurettii, S. carnosus (WINN et al., 2007).
Laffranchi et al. (2001), colheram amostras de leite ao longo dos 120 primeiros dias de
lactação, encontrando Staphylococcus chromogenes (4,08%), Staphylococcus haemolyticus
(4,08%) e Staphylococcus simulans (2,04%). Waage et al. (1999) analisaram amostras de leite
colhidas de quartos mamários de novilhas que apresentaram mastite até 14 dias pós-parto e
encontraram Staphylococcus simulans em 53,7% das amostras.
2.5 – Perfil de resistência aos antimicrobianos
O descobrimento dos antibióticos foi um grande avanço na terapêutica, tanto na medicina
veterinária quanto na medicina humana (ASCHBACHER, 1978). Com a utilização dos
antimicrobianos, na década de 1950, iniciaram as resistências bacterianas e, a partir desse período
essas resistências passaram a representar importância considerável em saúde pública (NAWAZ,
2002; RAPINI et al., 2004).
Muitas fazendas utilizam os antibióticos de maneira indiscriminada para diversos fins
terapêuticos, principalmente visando à cura da mastite. O abuso destes medicamentos pode ser
corrigido por meio de informações suficientes e exatas aos usuários, veiculadas por cooperativas
e centro de apoio técnico governamental, a difusão de boas práticas agrícolas e veterinárias, como
orientação aos produtores sobre o uso de antimicrobianos pode levar a uma melhor
conscientização das pessoas e deixar de ser um problema de saúde pública (MINIUSSI, 1992). A
escolha do antibiótico apropriado para a patologia é de extrema importância para o animal e para
a saúde da glândula mamária (SUMANO e OCAMPO, 1992), o que evita problemas com
resistência.
10
Beloti et al. (1997) avaliaram 150 amostras de leite de vacas positivas ao CMT e
encontraram 12,54% SCN, sendo que 30,30% foram resistentes a lincomicina, 27,27%
tetraciclina, 18,18% penicilina e novobiocina e 15,15% ampicilina e eritromicina.
Machado (2006) isolou 109 cepas de SCN de vacas em lactação e testou os perfis de
resistência a vários antimicrobianos, encontrando pelo menos uma cepa resistente a um
antibiótico, e a maior resistência foi observada contra a penicilina (93,5%), seguida pela
sulfonamida (88,9%), novobiocina (88,6%), ampicilina (85,3%), oxacilina (80,7%) e lincomicina
(76,1%).
Segundo Trabulsi e Alterthum (2005) as estirpes de Staphylococcus coagulase negativa
que apresentarem resistência à oxacilina, são consideradas resistentes a todos os antimicrobianos
pertencentes ao grupo dos beta-lactâmicos.
Em unidades de terapia intensiva neonatal já foram encontrados 80% de cepas de S.
epidermidis (SCN) e 60% S.aureus (SCP), resistentes aos antibióticos beta-lactâmicos (KNAUS
et al., 1985; CERCENADO et al., 1990).
Diversos autores encontraram uma elevada resistência em estirpes de SCN isoladas da
epiderme e de cateter venoso central de UTI, principalmente as neonatais (DIENER Jr. et al.,
1996; BALTIMORE 1998; MALIK et al., 1999; CUNHA e LOPES 2002; BERNARDI et al.,
2007).
2.5 – Produção de (slime) biofilme pelos Staphylococcus coagulase negativo
O biofilme é considerado importante fator de virulência, pois aumentam a capacidade das
estirpes aderirem e colonizarem as superfícies (AGUILLAR et al., 2001). São formados por
macromoléculas como polissacarídeos, proteínas, DNA, sais minerais, lipídeos, e no seu estado
hidratado podem conter cerca de 99% de água, protegendo as células da desidratação
(FIGUEIREDO, 2000). Podem ser constituídos de microrganismos de uma única espécie,
11
espécies e gêneros diferentes, e ficam alojados dentro da matriz polimérica auto-produzida, as
quais são aderidas em qualquer superfície, inerte ou viva (CONSTERTON et al., 1999).
Vários estudos mostraram que os Staphylococcus coagulase negativa produzem uma
substância extracelular que facilita a aderência e formação dos biofilmes (CHRISTENSEN et al.,
1982; PFALLER et al., 1988; COSTERTON et al., 1999). A formação do biofilme pode ser
determinada por diferentes métodos, entre eles o teste da microplaca, que avalia
espectrofotometricamente o filme bacteriano corado. Outro método utiliza o ágar vermelho
Congo, para identificar Staphylococcus spp produtores de biofilme, o qual se baseia no cultivo de
Staphylococcus spp sobre um meio de ágar sólido, suplementado com o corante Vermelho
Congo, e os Staphylococcus spp, são classificados como produtores ou não produtores de
biofilme conforme coloração apresentada pelos patógenos (CHRISTENSEN et al., 1982;
BASELGA et al., 1993).
Estudos “in vitro” realizados por Amorena et al. (1999) demonstraram que as bactérias
nos biofilmes tornaram-se de 10-1.000 vezes mais resistentes aos efeitos dos agentes
antimicrobianos quando comparadas com as células livres das mesmas estirpes. Os mecanismos
responsáveis pela resistência dos microrganismos nos biofilmes aos agentes antimicrobianos são:
demora na penetração dos agentes antimicrobianos através das matrizes dos biofilmes, taxa de
multiplicação alterada de organismos nos biofilmes, mudanças fisiológicas com o crescimento
dos biofilmes incluindo as células persistentes (MELO, 2008).
O ágar Vermelho Congo foi proposto como método alternativo para detectar a produção
de biofilme em Staphylococcus coagulase negativa, o que se confirmou em 77,7% das estirpes
(FREEMAN et al., 1989).
O estudo realizado com 27 cepas de Staphylococcus coagulase negativa isoladas de
cateter venoso central de pacientes de um hospital no interior do Estado de São Paulo mostrou
que 77,7% foram positivas para a produção de biofilme, por meio do método ágar Vermelho
Congo (BERNARDI et al., 2007).
12
13
3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – Rebanhos estudados
Foram utilizadas 87 novilhas, 348 glândulas mamárias, dos quais 40 animais são
pertencentes a uma propriedade localizada no município de Descalvado, estado de São Paulo
(fazenda 1), 18 novilhas pertencentes ao Pólo Regional Vale do Paraíba, localizado no município
de Pindamonhangaba (fazenda 2), 29 animais pertencentes ao Centro Apta Bovinos de Leite do
Instituto de Zootecnia, localizado no município de Nova Odessa (fazenda 3). O experimento foi
conduzido durante o período compreendido entre agosto de 2009 a setembro de 2011.
As análises foram conduzidas no Laboratório da Qualidade do Leite, pertencente ao
Centro Apta Bovinos de Leite do Instituto de Zootecnia, localizado no município de Nova Odessa
– SP.
3.2 – Manejos
4.2.1 - Fazenda 1:
14
Após o diagnóstico de gestação com confirmação de prenhes positiva, os animais foram
levados para uma área formada com gramíneas Tifton, e receberam uma dieta no cocho,
formulada segundo o (NRC, 2001) para atender as exigências nutricionais das novilhas em fase
de crescimento e gestação.
Com aproximadamente 60 dias pré-parto os animais receberam antibiótico intramamário,
selante interno nos tetos a base de subnitrato de bismuto, vacinas contra clostridioses, diarreia e
pneumonia bacterianas neonatais, diarreias virais e bacterianas neonatais, mastite ambiental e
uma dose de produto a base de Ivermectina 1%. Aos 30 dias antes da data prevista do parto
receberam a segunda dose das seguintes vacinas: diarreia e pneumonia bacterianas neonatais,
diarreias virais e bacterianas neonatais, mastite ambiental e vacinas contra doenças respiratórias,
reprodutivas e digestivas. Os animais foram alojados em piquetes próximos à maternidade e
receberam uma dieta no cocho, formulada segundo o (NRC, 2001); próximo à data de parto as
novilhas foram alojadas em baias individuais onde permaneceram até a parição.
3.2.2 - Fazenda 2:
Após serem inseminadas as novilhas foram encaminhadas para uma área formada por
capim-Vitória (Brachiaria brizantha, cv. Vitória), onde foram manejadas sob controle de lotação,
permanecendo até aproximadamente 60 dias pré-parto. A dieta durante este período foi composta
de cana-de-açúcar picada com uréia e concentrado, e formulada segundo o (NRC, 2001), para
atender às exigências nutricionais das novilhas em fase de crescimento e gestação.
Com 60 dias pré-parto, as novilhas foram trazidas para o piquete maternidade, formado
por capim-Vitória (Brachiaria brizantha cv. MG5 Vitória), e receberam dieta total no cocho,
composta por silagem de sorgo, capim picado e 2 Kg de concentrado/animal/dia. A dieta foi
formulada segundo o (NRC, 2001) para atender as exigências nutricionais das novilhas em fase
de crescimento e gestação. Após a parição a dieta foi formulada para atender as exigências
nutricionais de novilhas na 1ª lactação.
3.2.3.- Fazenda 3.
15
As novilhas após serem inseminadas permaneceram em sistema rotacionado formado por
capim-Tanzânia (Panicum maximum cv. Tanzânia) ou capim-Vitória (Brachiaria brizantha cv.
Vitória), permanecendo até 60 dias antes da data prevista do parto.
Com aproximadamente 60 dias pré-parto as novilhas foram trazidas para o piquete
maternidade, formada por gramínea do gênero Cynodon, onde recebiam a dieta total nos cochos.
A dieta era composta de silagem de milho e 3 Kg de concentrado a base de milho triturado, farelo
de soja, farelo de algodão e sal mineral, formulada para atender as exigências nutricionais das
novilhas em fase de crescimento e gestação (NRC, 2001).
3.3 – Manejo de ordenha
3.3.1 - Fazenda 1.
As novilhas foram ordenhadas logo após a parição, independente do horário que ocorreu o
parto, sendo ordenhadas novamente às 5:00 e às 14:00 horas, permanecendo neste setor
aproximadamente até 10 dias de paridas, em seguida, foram transportadas até o “free-stall”, onde
foram distribuídas nos lotes já existentes e ordenhadas 3 vezes ao dia, com intervalo de 8 horas
entre as ordenhas. Era realizado o pré-dipping imergindo-se os tetos em solução de cloro a 10% e
em seguida secando-os com papel toalha descartável (uma folha para cada teto), o pós-dipping foi
realizado com a mesma solução utilizada no pré-dipping.
3.3.2 - Fazenda 2.
Os animais foram ordenhados com ordenhadeira mecânica tipo Tandem, duas vezes ao
dia, às 6:00 e 15:00 horas, e receberam 1,5 Kg de concentrado durante o período de ordenha. Os
tetos foram lavados com água e sabão e secos com papel toalha descartável (uma folha para cada
teto). Após o término da lavagem foi realizado o teste de Tamis que tem como finalidade detectar
a presença de mastite clínica, após a ordenha realizava-se o pós-dipping, com solução de iodo
glicerinado a 0,5%.
16
3.3.3.- Fazenda 3
As ordenhas foram realizadas duas vezes ao dia, sendo nos horários das 7:00 e 15:00
horas, com ordenhadeira mecânica tipo Tandem. Os tetos eram lavados com água corrente e
secos com papel toalha descartável (uma folha para cada teto). Após a lavagem e secagem dos
tetos era realizado o teste de Tamis para identificar os animais com mastite clínica. Após a
ordenha, foi realizado o pós-dipping com solução de iodo glicerinado a 0,5%.
3.4 – Delineamento experimental e tratamentos
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado e os animais foram
distribuídos aleatoriamente nos tratamentos.
3.4.1 - Fazenda 1:
Por se tratar de fazenda comercial optou-se por não modificar o manejo adotado na
propriedade, portanto todas as novilhas foram tratadas com Cefalônio 0,25g, antimicrobiano
semi-sintético de infusão intramamária com ação bactericida, recomendado para o tratamento de
vaca seca e pertencente ao grupo dos beta-lactâmicos.
3.4.2 - Fazenda 2:
As novilhas foram divididos nos seguintes grupos:
� 10 animais não tratados – Grupo Controle;
� 8 animais tratados – Grupo tratados; antibiótico de infusão intramamário
recomendado para vaca-seca, (Composição química: Sulfato de Gentamicina
677mg).
3.4.3 - Fazenda 3:
17
As novilhas foram divididas nos seguintes grupos:
� 14 animais não tratados - Grupo controle;
� 15 animais tratados - Grupo tratado; antibiótico de infusão intramamário
recomendado para vaca-seca, (Composição química: Penicilina G Potássica
500.00 UI, Penicilina G Procaína 1.000.000 UI, Neomicina 0,732g).
3.5 – Colheita do material biológico das novilhas
3.5.1 – Período pré-parto
Sessenta dias antes da data estimada do parto, as secreções dos quartos mamários das
novilhas foram coletadas, obedecendo a uma rigorosa antissepsia. Após o término das colheitas,
os animais pertencentes aos grupos tratados receberam o antibiótico por infusão intramamária
recomendado para vaca seca de eliminação e absorção lenta.
As amostras de secreção foram colhidas individualmente em tubos de ensaio esterilizados,
previamente identificados com o nome ou número dos animais e do quarto mamário, após a
lavagem dos tetos com água e sabão, secos com papel toalha descartável e antissepsia do óstio
papilar com álcool etílico 70% GL, conforme recomendação do “National Mastitis Council”
(NMC) (HARMON et al., 1990). O material foi acondicionado em caixas de material isotérmico
com cubos de gelo e levadas ao laboratório para isolamento e identificação das bactérias.
3.5.2 – Parição
No dia do parto, foram colhidas amostras de colostro dos quartos mamários das 87
novilhas, de acordo com as recomendações do National Mastitis Council” (NMC) (HARMON et
al., 1990).
18
3.5.3 - Dez dias após a data de parição
Decorridos 10 dias após a data de parição, amostras de leite de todos os quartos mamários
foram colhidas individualmente em tubos de ensaio, de acordo com as recomendações do
“National Mastitis Council” (NMC) (HARMON et al., 1990), e os tubos foram identificados com
o nome ou número do animal. Após o término das colheitas o material foi acondicionado em
caixas de material isotérmico com cubos de gelo e levadas ao laboratório para isolamento e
identificação das bactérias.
3.5.4 – Colheitas mensais
Após a parição, amostras de leite de todas as novilhas foram colhidas individualmente em
tubos de ensaio esterilizados, identificados com o nome ou número do animal e o quarto
mamário, (Figura 1), as colheitas foram realizadas de acordo com as recomendações do “National
Mastitis Council” (NMC) (HARMON et al., 1990). O material foi acondicionado em caixa de
material isotérmico com cubos de gelo e levadas ao laboratório para isolamento e identificação
das bactérias. As colheitas mensais foram realizadas aproximadamente até 305 dias de lactação.
Figura 1: Colheita de leite para análise laboratorial.
19
3.6 – Análises Laboratoriais
3.6.1 - Isolamento e identificação de microrganismos
Alíquotas de 100 µL de leite foram cultivadas em placas de ágar sangue de ovino 5%,
incubadas por aerobiose em estufa bacteriológica a 37ºC e analisadas após 24 e 48 horas.
Figura 2: Placa de ágar sangue com crescimento bacteriano.
Após a incubação, foram registradas as características de crescimento das colônias em
ágar sangue, como produção de hemólise, tipo de desenvolvimento e pigmentação das colônias
(Figura 2), e produção da catalase. Em seguida, observaram os caracteres morfo-tintoriais,
utilizando a técnica de coloração de Gram. As colônias que se revelaram catalase positiva e cocos
Gram positivos foram submetidas às provas da coagulase lenta com plasma de coelho
(HOLMERG, 1973). As leituras para a verificação da produção de coagulase foram realizadas
uma, duas, três, quatro e 24 horas após a incubação das amostras a 37ºC (GARCIA; MORENO;
BERGDOLL, 1980).
As colônias que revelaram-se como catalase positiva e bastonetes gram positiva foram
classificadas como Corynebcaterium spp, segundo Collins e Cumminis (1986).
20
3.6.2 - Identificação dos Staphylococcus coagulase negativa
As estirpes que se revelaram catalase positiva e coagulase negativa foram submetidas à
prova da Oxidação e Fermentação da Glicose (EVAN et al., 1955), e antibiograma para verificar
se as amostras eram resistentes à bacitracina (0,04 U), indicada pela ausência de halo de inibição
ou formação de halo de até 9 mm, e pela sensibilidade à furazolidona (100 µg) caracterizada por
halos de inibição maior que 15 mm de diâmetro (BAKER, 1984.) (Figura 3).
Figura 3: Antibiograma com os discos que continham os princípios ativos – Furazolidona
(acima) e Bacitracina (abaixo).
Para diferenciar as espécies de Staphylococcus coagulase negativa as colônias foram
submetidas a provas bioquímicas, utilizando os seguintes açúcares: xilose, arabinose, sacarose,
trealose, manitol, maltose, lactose, xylitol, ribose e frutose. Além da caracterização de
hemolisinas, foram realizadas provas de redução de nitrato, segundo metodologia preconizada
por (Kloss e Schleifer, 1975) e kloos e Bannerman (1999).
3.6.3 - Teste de sensibilidade a antimicrobianos
Após a identificação das espécies de Staphylococus Coagulase negativa, estas
mesmas foram submetidas a testes de sensibilidade aos antimicrobianos, de acordo com os
padrões do “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS, 2005) utilizando-
21
se discos impregnados com os seguintes princípios ativos: Ceftiofur (30 µg), Neomicina (10 µg),
Cefalexina (30 µg), Gentamicina (10 µg), Penicilina (10 µg), Florfenicol (30 µg), Oxacilina (1
µg), Ampicilina (10 µg) e Cefaclor (30 µg) (Figura 4). O crescimento das zonas de inibição foi
avaliado de acordo com os padrões do “National Committee for Clinical Laboratory Standards”
(WOODS e WASHINGTON, 1995).
Figura 4: Placa de Antibiograma.
3.6.4 - Ensaio para a verificação da produção da cápsula mucosa (slime)
A produção da cápsula mucosa por estirpes de Staphylococcus coagulase negativa foi
determinada pelo cultivo em placas de (CRA) Ágar Vermelho Congo de acordo com as
recomendações de Freeman et al. (1989). As placas de CRA com as bactérias foram incubadas a
37ºC por 24 horas, com posterior estocagem à temperatura ambiente por 48 horas. A produção de
colônias negras rugosas por estirpes de Staphylococcus coagulase negativa produtoras de mucosa
foi determinada como positiva.
3.7 – Amostragem e análises estatísticas
22
As novilhas amostradas para colheita de material foram selecionadas por um processo não
probabilístico constituído de todos os animais acessíveis no período de colheita em cada
propriedade.
Para a descrição das frequências dos patógenos usou-se as frequências absolutas e
relativas por grupos de novilhas tratadas e não tratadas apresentadas em tabelas e gráficos.
Para comparar as diferenças entre as prevalências de patógenos nos grupos tratados e não
tratados, usou-se o teste Z para duas proporções ao nível de 95% de confiança. A hipótese nula
do teste Z considera a igualdade entre as proporções e a hipótese alternativa considera que as
proporções diferirem entre si. Para o teste Z bi-caudal para duas proporções tem-se:
H0: p1 - p2 = p0
H1: p1 - p2 ≠ p0
Onde, p1 (grupo das novilhas não tratadas) e p2 (grupo das novilhas tratadas), são as
proporções de amostras de leite positivas para a ocorrência de patógenos na população p1 e p2,
respectivamente, que representam as vacas primíparas e p0 indica que a diferença entre as duas
proporções é igual a zero. O Software Minitab v. 13 foi usado para análise estatística.
O odds ratio (OR), que é uma medida de intensidade de associação foi utilizado para
calcular quantas vezes a prevalência do patógeno no grupo tratado é menor que a prevalência dos
patógenos no grupo não tratado, conforme (RUMEL, 1986). O odds ratio é calculado pela razão:
(a/b)/(c/d) ou (ad)/(bc), no apêndice (a) apresenta-se em forma didática. Calcula-se uma
estimativa do seu intervalo de confiança de 95% associado ao Odds ratio.
Foi realizado o estudo estatístico, utilizando o teste do Qui-quadrado, para avaliar se
houve diferença significativa a nível de 95% de confiança, quando comparou-se os grupos de
novilhas não tratadas e tratadas durante o pré-parto. O teste foi realizado no Software Minitab v.
13.
23
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 – Perfil microbiológico
Na tabela 1 podemos observar predominância de Staphylococcus coagulase negativa
isolados das amostras da secreção da glândula mamária, colostro e amostras de leite das novilhas
tratadas no pré-parto pertencentes ao rebanho leiteiro denominado de Fazenda 1. Das 160
amostras colhidas no pré-parto, foram isolados patógenos em 64 (40,02%) amostras, sendo
71,85% de SCN.
24
Tabela 1: Frequência absoluta (FA) e relativa (FR) dos microrganismos isolados da secreção da
glândula mamária, colostro e leite das novilhas tratadas durante o período pré–parto na Fazenda
1, São Paulo, Brasil, 2011.
PATÓGENOS
SCN SCP Strep. Cory. spp Cocos G - S. aureus Bacilos G- COLHEITAS
FA (FR) FA (FR) FA (FR) FA (FR) FA (FR) FA (FR) FA (FR)
Pré-parto 46 (28,75) 11 (6,88) 0 0 3 (1,88) 1 (0,63) 3 (1,88)
Parto 2 (1,25) 0 0 0 0 0 0
3ª 3 (1,88) 0 1 (0,63) 0 0 1 (0,63) 0
4ª 3 (1,88) 0 1 (0,63) 1 (0,63) 0 0 0
5ª 8 (5,0) 0 0 0 0 0 0
6ª 8 (5,0) 0 1 (0,63) 1 (0,63) 0 0 0
7ª 7 (4,38) 0 1 (0,63) 1 (0,63) 0 0 0
8ª 6 (3,75) 0 0 0 1 (0,63) 0 0
9ª 5 (3,13) 0 0 0 0 0 0
10ª 4 (2,5) 0 3 (1,88) 2 (1,25) 1 (0,63) 2 (1,25) 0
11ª 4 (2,5) 0 0 0 0 0 0
12ª 2 (1,25) 0 0 0 0 0 0
13ª 0 0 0 0 0 0 0
SCN = Staphylococcus coagulase negativa; SCP = Staphylococcus coagulase positiva; Strep = Streptococcus; Cory = Corynebacterium spp; Cocos G-. = Cocos Gram negativos; S. aureus = Staphylococcus aureus; Bacilo G - = Bacilos Gram negativos.
Nas 160 amostras de secreção dos quartos mamários colhidas das novilhas no pré-parto
verificou-se maior ocorrência dos Staphylococcus coagulase negativa (28,75%), seguido dos
Staphylococcus coagulase positiva (6,88%), (figura 5), valores estes inferiores aos encontrados
por Laffranchi et al., (2001), que ao realizarem levantamento microbiológico em amostras de
leite de 88 vacas primíparas, oriundas de quatro rebanhos leiteiros, durante os 120 dias pós-parto,
encontraram Staphylococcus coagulase negativa em 69,14% das amostras. Segundo os autores as
infecções por Staphylococcus coagulase negativa e Streptococcus spp. decrescem ao longo das
primeiras semanas pós-parto.
Após o parto, verifica-se maior ocorrência dos Staphylococcus coagulase negativa,
durante as 5ª e 6ª colheitas, período compreendido aos meses de fevereiro e março,
correspondentes ao final do verão e início do outono, estações do ano que apresentam baixa
quantidade de chuva.
25
1,25 1,88
5 5
4,38 3,75 3,132,5 2,5 1,25
28,75
1,880
5
10
15
20
25
30
35
Pré-p
arto
Parto 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 10
ª11
ª12
ª13
ª
Coletas
%
SCN
SCP
S. aureus
Figura 5: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase negativa (SCN),
Staphylococcus coagulase positiva (SCP) e Staphylococcus aureus, isolados das secreções das
glândulas mamàrias, colostro e das amostras de leite, durante o período de coleta na (Fazenda 1),
São Paulo, Brasil, 2011.
No pré-parto ocorreu 28,75% de Staphylococcus coagulase negativa, valores inferiores
aos encontrados por Parker et al., (2007) que avaliaram 255 novilhas divididas em dois grupos,
tratadas e não tratadas, com um medicamento, selante interno de teto, a base de subnitrato de
bismuto, com 31 dias pré-parto e encontraram maior prevalência dos Staphylococcus coagulase
negativa (10,4%) nas amostras. Os autores verificaram que houve redução no isolamento de SCN
(4,5% de isolamento no parto), nos animais que receberam selante, esses resultado foram
superiores aos encontrados na fazenda 1 (1,25%), provavelmente em razão do tempo de infusão
do selante que na fazenda 1 foi de 60 dias pré-parto.
Com aproximadamente 15 dias de lactação ocorreu predominância dos Staphylococcus
coagulase negativa (1,88%), enquanto que Parker et al., (2008), analisando amostras de leite de
animais com 14 dias pós-parto, encontraram 6,9% de Staphylococcus coagulase negativa nos
quartos mamários com mastite; os autores investigaram em 1.067 novilhas o efeito da infusão do
26
selante interno de teto, e três aplicações intramusculares do antimicrobiano a base de tilosina 5g
(antibiótico de ação bacteriostática, pertencente à classe dos macrolídeos). O resultado
encontrado no pós-parto no presente estudo está abaixo dos valores encontrados pelos autores,
diferença esta que pode estar relacionada ao princípio ativo e o modo de ação dos medicamentos
e as amostras analisadas, uma vez que os autores trabalharam somente com quartos mamários
portadores de mastite.
Segundo Costa et al. (2004), em propriedades onde a infecção de quartos mamários é baixa
durante o pré-parto, não se justifica o uso de antimicrobianos durante este período, o que evita
gastos desnecessários com medicamentos, além de riscos de resíduos de antibióticos no leite. Os
autores recomendam que para adotar medidas de tratamento com antimicrobianos em novilhas, é
necessário realizar exames microbiológicos, verificar se os animais apresentam mastite subclinica
ou clinica durante o parto, já que existe uma diminuição da ocorrência de patógenos logo após a
parição, e a aplicação de antimicrobianos intramamário em todos os animais pode levar ao
surgimento de estirpes resistentes, trazendo prejuízos futuros.
A figura 6 mostra a frequência relativa dos Staphylococcus coagulase positiva (SCP),
Staphylococcus coagulase negativa (SCN) e Staphylococcus aureus, isolados durante todo o
período de coleta, nos animais que não receberam antimicrobiano durante o pré-parto, na fazenda
2.
Podemos observar na figura 6 predominância de Staphylococcus coagulase negativa
(88,89%) isolados das amostras da secreção da glândula mamária no pré-parto nos animais não
tratados pertencentes á Fazenda 2.
27
88,89
62,5
2528,57
42,86
60
0
20
40
60
80
100
120
Pré-p
arto
Parto 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 10
ª11
ª12
ª13
ª14
ª15
ª
Coletas
%
SCP
SCN
S. aureus
Figura 6: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase positiva (SCP), Staphylococcus
coagulase negativa (SCN) e Staphylococcus aureus, durante todas as colheitas realizadas nos
animais pertencentes ao grupo não tratado. Fazenda 2, São Paulo, Brasil, 2011.
Nos quartos mamários das novilhas tratadas observou-se 100% de isolamentos de
Staphylococcus coagulase negativa no pré-parto, enquanto que no parto prevaleceram os
Staphylococcus Coagulase positiva 50% (Figura 7).
A figura 7 mostra que a ocorrência dos Staphylococcus coagulase negativa isolados com
aproximadamente uma semana de lactação foi 40%, enquanto que Pardo et al. (1998) avaliando
332 amostras de leite dos quartos mamários de novilhas na primeira semana após o parto,
encontraram 20,4% de mastite clínica em um ou mais quartos e a maior ocorrência foi de
Staphylococcus coagulase negativa (35,2%). A menor frequência de Staphylococcus coagulase
negativa observada por Pardo et al. (1998) pode ser atribuída à realização dos isolamentos
microbiológicos somente dos quartos mamários que apresentavam mastite clínica, diferente do
procedimento realizado no presente estudo, no qual foram feitos isolamentos nas amostras de
leite de todos os quartos mamários.
28
100
33,33
40
14,29
25
10
0
20
40
60
80
100
120
Pré-p
arto
Parto 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 10
ª11
ª12
ª13
ª14
ª15
ª
Coletas
%
SCP
SCN
S. aureus
Figura 7: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase positiva (SCP), Staphylococcus
coagulase negativa (SCN) e Staphylococcus aureus, durante todas as colheitas realizadas nos
animais pertencentes ao grupo tratado. Fazenda 2, São Paulo, Brasil, 2011.
Sampinon et al., (2009) avaliando o efeito da Cloxacilina 600 mg (medicamento
bactericida de pequeno espectro, pertencente ao grupo dos beta-lactâmicos), aplicado entre 8 e 10
semanas pré-parto em 369 novilhas, encontraram maior ocorrência de Staphylococcus coagulase
negativa no parto, no grupo tratado (32%) e no grupo não tratado (42%). No presente estudo, nas
colheitas realizadas durante o parto, o patógeno que apresentou maior ocorrência no grupo
tratado foi o Staphylococcus coagulase positiva (50%), enquanto que no grupo não tratado foi o
Staphylococcus coagulase negativa (60%), resultados estes que não condizem com os
encontrados pelos autores, entretanto com 10 e 14 dias pós-parto a frequência dos Staphylococcus
coagulase negativa encontrada pelos autores foi de (15% e 19%) para os grupos tratados e não
tratados, em nosso estudo o patógeno que apresentou maior ocorrência aos 10 dias pós-parto no
grupo não tratado foi o Staphylococcus coagulase positiva (42,9%) e no grupo tratado foi
Staphylococcus coagulase negativa (30,7%). Os resultados foram semelhantes somente para o
grupo de novilhas tratadas.
29
Com aproximadamente 30 dias de lactação a ocorrência dos Staphylococcus coagulase
negativa nos grupos não tratado e tratado foi 30% e 27,7%, respectivamente, enquanto que no
levantamento microbiológico realizado por Paradis et al. (2010) no Canadá, envolvendo 1.691
novilhas, com uma média de 30 dias pós-parto, foram encontradas 24,5% das novilhas com
infecções intramamárias, tendo como patógeno de maior frequência os Staphylococcus coagulase
negativa (9,9%). Essa menor ocorrência encontrada por estes autores pode estar relacionada às
amostras colhidas dos quartos mamários somente com mastite clínica, pois as análises somente
desses quartos pode deixar de identificar os patógenos que possivelmente poderiam estar
presentes nas glândulas mamárias sem provocar infecções nos períodos de colheita.
Na fazenda 2, as variações dos patógenos mostrados nas figuras 6 e 7, pode estar
relacionado a falta de higiene durante a ordenha, pois não é realizado o pré-dipping,
procedimento que tem como finalidade eliminar os patógenos presentes na epiderme dos tetos,
diminuir a contaminação dos equipamentos de ordenha, que consequentemente diminuíra a
disseminação dos microrganismos entre os animais.
As figuras 8 e 9 apresentam as ocorrências dos agentes microbiológicos isolados das
novilhas no pré-parto, parto e lactação da fazenda 3.
Na fazenda 3, Staphylococcus coagulase positiva prevaleceram no pré-parto e no parto
para o grupo de novilhas não tratadas (69,2% e 39,3%) e tratadas (100% e 39,3%), enquanto que
os Staphylococcus coagulase negativa apresentaram maior ocorrência quando os animais estavam
com 200 dias de lactação.
Staphylococcus coagulase negativa são considerados agentes de baixa patogenicidade, e
as infecções causadas pelo patógeno manifestam-se de forma subclínica, mas as infecções
intramamárias em animais de primeira lactação podem atingir cerca de 10 a 20% dos quartos
mamários. De acordo com Santos (2009) novilhas podem apresentar alta ocorrência de mastite
causada pelo Staphylococcus coagulase negativa após o parto, com um rápido declínio dos casos
após a segunda semana de lactação, fato que não foi observado neste estudo, pois conforme se
30
visualiza nas Figuras 8 e 9, os Staphylococcus coagulase negativa prevaleceram durante a
lactação.
60
44,4440
57,14
30
41,18
30
18,19
35,71
28,58
15,38
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Pré-p
arto
Parto 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 10
ª11
ª12
ª13
ª14
ª15
ª
Coletas
%
SCN
SCP
S. aureus
Figura 8: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase positiva (SCP), Staphylococcus
coagulase negativa (SCN) e Staphylococcus aureus, durante todas as colheitas realizadas nos
animais pertencentes ao grupo não tratado. (Fazenda 3), São Paulo, Brasil, 2011.
Conforme se ilustra a Figura 9, Staphylococcus coagulase negativa apresentaram
ocorrência ao parto (28,58%), e permaneceram sendo isolados por toda a lactação com exceção
da 12ª até a 15ª colheita, com um pico de 80% de isolamentos aos 200 dias de lactação. Segundo
Mcdonald (1982), Munch-Petersen (1970) e Oliver e Sordillo (1988), as glândulas mamárias de
novilhas poderiam conter bactérias no pré-parto, observação que pode ser confirmada através dos
resultados encontrados no presente estudo.
Os resultados obtidos no presente estudo na fazenda 3 estão abaixo dos encontrados por
Compton et al. (2007), que analisaram amostras de colostro e leite de quartos mamários de 708
31
novilhas e encontraram três semanas antes do parto predominância dos Staphylococcus coagulase
negativa (13,5%), com diminuição na ocorrência do patógeno 5 dias após o parto (9,7%).
10
50
60
42,85
80
71,44
50
50
27,2725
30,7525
0
20
40
60
80
100
120
Pré-p
arto
Parto 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 10
ª11
ª12
ª13
ª14
ª15
ª
Coletas
%
SCN
SCP
S. aureus
Figura 9: Frequência Relativa (%) dos Staphylococcus coagulase positiva (SCP), Staphylococcus
coagulase negativa (SCN) e Staphylococcus aureus, durante todas as colheitas realizadas nos
animais pertencentes ao grupo tratado. (Fazenda 3), São Paulo, Brasil, 2011.
A tabela 2 mostra os valores do qui-quadrado, e se houve diferença significativa quando
se comparou os grupos de novilhas não tratadas com as novilhas tratadas, nas fazendas 2 e 3,
respectivamente.
Podemos observar na tabela 2, quanto aos isolamentos de Staphylococcus coagulase
positiva e Staphylococcus coagulase negativa, não houve diferença significativa a nível de 5% de
probabilidade pelo teste do qui-quadrado, na fazenda 2, enquanto na fazenda 3, houve diferença
significativa somente para Staphylococcus coagulase positiva.
32
Tabela 2: Frequência relativa (FR) dos patógenos isolados das amostras coletadas dos tetos das
novilhas durante todo o período do experimento, animais pertencentes aos grupos tratado e não
tratado e o valor do Qui-quadrado, (Fazendas 2 e 3), São Paulo, Brasil, 2011.
Fazenda 2 Fazenda 3
Patógenos Grupo de Novilhas Positivo
(FR%) Qui-
Quadrado P Positivo (FR%)
Qui-Quadrado
P
Não Tratadas 18 56 S. coagulase positiva
Tratadas 13 0,358 ns 0,549
26 12,174* 0,0001
Não Tratadas 24 47 S. coagulase negativa
Tratadas 14 1,629 ns 0,202
43 0,274 ns 0,601
Não Tratadas 22 18 S. aureus
Tratadas 43 8,512 * 0,004
8 4,767* 0,029
Não Tratadas 34 ---------- Corynebacterium spp.
Tratadas 17 3,829 * 0,05
---------- ------------- -------
Não Tratadas 0 40 Streptococcus spp.
Tratadas 2
-------------
--------
43 0,064 ns 0,8
Não Tratadas ---------- 12 Cocos G -
Tratadas ---------- ------------- --------
5 3,044 ns 0,081
Não Tratadas 2 6 Bacilos G -
Tratadas 3
0,317 ns 0,574
11
1,397 ns 0,23
SCP: Staphylococcus coagulase positiva; SCN: Staphylococcus coagulase negativa; S. aureus: Staphylococcus aureus; Cocos G -: Cocos Gran negativos; Bacilos G -: Bacilos Gran negativos. * = Teste de Qui-quadrado para a independência da ocorrência de patógeno nos tetos dos nos grupos tratado e não tratado foi significativo a 5% de probabilidade. ns = Teste de Qui-quadrado para a independência da ocorrência de patógeno nos tetos nos grupos tratado e não tratado foi não significativo a 5% de probabilidade. ----- = valores iguais a zero. P: valor da probabilidade calculada, no teste do Qui-quadrado.
Conforme mostra a tabela 3 quando houve diferença significativa para a proporção de
patógenos ao nível de 5% de probabilidade pelo teste Z, calculou-se através do Odds ratio, a
probabilidade de ocorrência dos patógenos nos grupos não tratados em relação aos tratados.
Assim, na fazenda 2 o Odds ratio da prevalência do Staphylococcus aureus para os grupos de
novilhas não tratadas e tratadas foi significativo a 5% de probabilidade igual a 0,46.Portanto, a
probabilidade de prevalência do Staphylococcus aureus no grupo não tratado foi de 46% em
33
relação ao grupo tratado. O Odds ratio da prevalência para o patógeno Corynebacterium spp não
foi significativo para o grupo não tratado e tratado na fazenda 2. Na fazenda 3 o Odds ratio da
prevalência do Staphylococcus coagulase positiva para os grupos de novilhas não tratadas foi de
2,29 vezes a prevalência do patogeno no grupo tratado. E, para o patógeno Staphylococcus
aureus, o Odds ratio de sua prevalência foi significativo a 5% de probabilidade e igual a 2,45.
Portanto, a prevalência do patógeno no grupo não tratado foi de 2,45 vezes a prevalência do
grupo tratado. No apêndice (b) apresentam-se os resultados do teste Z para comparar as
proporções, que confirmam as significâncias observadas no cálculo do Odds ratio.
Tabela 3: Frequência absoluta, valor do Odds-Ratio e Intervalo de confiança (IC) do Odds-Ratio,
dos patógenos isolados das novilhas pertencentes aos grupos não tratadas e tratadas, (Fazendas 2
e 3), São Paulo, Brasil, 2011.
Fazenda. 2 Fazenda. 3
Patógeno Não Tratados
Tratados
Odds Ratio (OR)
IC 95% Não
Tratados
Tratados Odds Ratio (OR)
IC 95%
S. coagulase positiva 18 a 13 a 1,25 0,60-2,58 56 a 26 b 2,29 1,42-3,68
S. coagulase negativa 24 a 14 a 1,54 0,79-3,03 47 a 43 a 1,12 0,73-1,72
S. aureus 22 a 43 b 0,46 0,27-0,78 19 a 8 b 2,45 1,07-5,64
Corynebacterium spp 34 a 17 b 1,8 0,99-3,27 0 0 ------- ------------
Streptococcus spp 0 2 ------- -------- 40 a 43 a 0,94 0,61-1,47
Cocos G - . 0 0 ------- -------- 12 a 5 a 2,47 0,86-7,04
Bacilos G - . 2 a 3 a 0,6 0,10-3,61 6 a 11 a 0,55 0,2-1,50
TOTAL 455 410 ----------------------- 765 779 ------------------------
Letras iguais, não diferem nas frequências entre si.
As espécies de SCN identificadas das 225 estirpes isoladas durante todo o período de
colheita das amostras dos quartos mamários de novilhas tratadas e não tratadas são apresentados
na tabela 4.
34
Tabela 4: Frequência absoluta (FA) e frequência relativa (FR) das espécies de Staphylococcus
coagulase negativa (SCN) identificados dos quartos mamários das novilhas pertencentes aos
grupos tratados e não tratados, durante todo o período de colheita, nas (Fazendas 1, 2 e 3), São
Paulo, Brasil, 2011.
Espécies de SCN Fazenda 1 Fazenda 2 Fazenda 3
S. xylosus 3 (3,06%) 0 3 (3,33%) S. cohni 1 (1,02%) 0 1 (1,11%) S. capitis 4 (4,08%) 0 3 (3,33%)
S. epidermidis 10 (10,20%) 0 2 (2,22%)
S. saprophyticus 13 (13,27%) 1 (3,45%) 0
S. haemolyticus 9 (9,18%) 0 0 S. warneri 0 0 9 (10%) S. hominis 8 (8,16%) 8 (27,59%) 27 (30%) S. simulans 50 (51,02%) 20 (68,97%) 45 (50%)
Total 98 (100%) 29 (100%) 90 (100%)
Staphylococcus simulans foi a espécie que apresentou maior ocorrência nas fazendas 1, 2
e 3, (51,02%%, 68,97% e 50%, respectivamente). Staphylococcus coagulase negativa são
considerados um dos principais patógenos isolados de animais com mastite (TRINDAD,
NICKERSON e ALLEY, 1990), podendo ser encontrado nos quartos mamários de novilhas que
não apresentam sinais clínicos de mastite, fato que foi observado neste estudo.
Os S. epidermidis, S. chromogenes e S. simulans, são considerados os principais
Staphylococcus coagulase negativa causadores de mastite em novilhas (NADER FILHO et al.,
1985; LANGONI et al., 1991), Laffranchi et al., (2001), encontraram Staphylococcus
chromogenes (4,08%), Staphylococcus haemolyticus (4,08%) e Staphylococcus simulans (2,04%)
em quartos mamários de vacas, ao longo dos 120 dias de lactação.
Nickerson et al. (1995) analisaram amostras coletadas de secreções das glândulas
mamárias de novilhas 31 dias pré-parto, e encontraram Staphylococcus hominis (6%),
Staphylococcus simulans (6,0%), Staphylococcus xylosus (1,1%), Staphylococcus warneri
(3,0%), Staphylococcus epidermidis (3,0%). A frequência do Staphylococcus simulans
35
encontrada pelos autores foi menor do que a encontrada no trabalho, os autores possivelmente
tenham encontrado uma menor ocorrência de Staphylococcus simulans porque coletaram
amostras somente das secreções das glândulas mamárias no pré-parto, não realizando colheitas
quando os animais estavam em lactação.
Waage et al. (1999) encontraram Staphylococcus simulans de quartos mamários de
novilhas que apresentaram mastite até 14 dias pós-parto (53,7%), no presente estudo a ocorrência
dos Staphylococcus simulans foi de 50,94%, 68,97% e 50%, nas fazendas 1, 2 e 3,
respectivamente, a alta frequência das espécies de Staphylococcus coagulase negativa
identificadas nas três propriedades mostra que os profissionais e os produtores devem dar mais
atenção a esta categoria animal, principalmente durante o pré-parto e parto.
Staphylococcus coagulase negativa representam o maior componente da microbiota
cutânea e por viverem em equilíbrio com esse ecossistema foram descritos como microrganismos
avirulentos. Durante a última década, houve um progresso na identificação de gênero, espécies e
subespécies de patógenos, permitindo aos clínicos identificarem as variedades de SCN presentes
em amostras clínicas e os implicarem como agentes etiológicos de uma série de processos
infecciosos, sendo considerado um dos principais patógenos isolados dos quartos mamários de
animais portadores de mastite (BONNA et al., 2007; PARADIS et al., 2010).
As infecções causadas pelos Staphylococcus coagulase negativa vêm aumentando com o
passar do tempo, fato este que levou os profissionais a estudarem as espécies existentes, pois
estas são responsáveis por diversas patologias em animais. Staphylococcus coagulase negativa
têm sido isolados com grande frequência em pessoas que estão em UTI e portadoras de cateter
venoso central (DIENER JR. et al., 1996; BALTIMORE, 1998; MALIK et al., 1999; CUNHA &
LOPES, 2002; BERNARDI et al., 2007;).
4.2 – Perfil antimicrobiano dos Staphylococcus coagulase negativa.
Na tabela 5 podemos observar os perfis de resistências de Staphylococcus coagulase
negativa isolados das amostras da secreção da glândula mamária, colostro e amostras de leite das
36
novilhas tratadas e não tratadas no pré-parto pertencentes aos rebanhos leiteiros das fazendas 1, 2
e 3.
Tabela 5: Perfis antimicrobianos de Staphylococcus coagulase negativa, isolados de amostras
coletadas dos quartos mamários no pré-parto, pós-parto e durante a lactação das fazendas 1, 2 e 3,
São Paulo, Brasil, 2011.
FAZENDA 1
PERFIL
Resistente Intermediário Sensível Princípios Ativos
F.A F.R (%) F.A F.R (%) F.A F.R (%)
Florfenicol 30 µg 4 3,77 2 2,12 100 94,34
Ampicilina 10 µg 18 16,98 - ----- 88 83,02
Cefalexina 30 µg 4 3,77 - ----- 102 96,23
Ceftiofur30 µg 3 2,83 - ----- 103 97,17
Penicilina 10 µg 14 13,21 - ----- 92 86,79
Neomicina 10 µg - ----- - ----- 106 100,00
Oxacilina 1 µg 3 2,83 - ----- 103 97,17
Gentamicina 10 µg 4 4.24 - ----- 102 96,23
FAZENDA 2
Florfenicol 30 µg 5 17,24 - ----- 24 82,76
Ampicilina 10 µg 5 17,24 - ----- 24 82,76
Cefalexina 30 µg 5 17,24 - ----- 24 82,76
Ceftiofur30 µg 5 17,24 2 6,90 22 75,86
Penicilina 10 µg 9 31,03 - ----- 20 68,97
Neomicina 10 µg 0 0,00 1 3,45 28 96,55
Oxacilina 1 µg 5 17,24 - ----- 24 82,76
Gentamicina 10 µg 5 17,24 - ----- 24 82,76
FAZENDA 3
Florfenicol 30 µg 12 13,33 - ----- 78 86,67 Ampicilina 10 µg 12 13,33 - ----- 78 86,67 Cefalexina 30 µg 12 13,33 - ----- 78 86,67 Ceftiofur30 µg 12 13,33 6 6,67 72 80,00
Penicilina 10 µg 47 52,22 - ----- 43 47,78 Neomicina 10 µg 1 1,11 2 2,2 87 96,67
Oxacilina 1 µg 12 13,33 - ----- 78 86,67 Gentamicina 10 µg 12 13,33 - ----- 78 86,67
R: resistente; I: Intermediário e S: sensível.
37
Os animais que apresentarem estirpes de Staphylococcus coagulase negativa, resistentes à
oxacilina, não responderam a terapias realizadas com antimicrobianos pertencentes ao grupo dos
beta-lactâmicos (TRABULSI e ALTERTHUM., 2005).
Dentre as estirpes de Staphylococcus coagulase negativa isoladas na fazenda 1,
percentuais de resistências foram observadas contra a ampicilina (16,98%), penicilina (13,21%) e
gentamicina (4,24%), assim como também uma importante resistência à oxacilina 2,83%.
Machado (2006) trabalhou com vacas em lactação e encontraram alta resistência das
estirpes de Staphylococcus coagulase negativa a vários antimicrobianos: penicilina (93,5%),
ampicilina (85,3%) e oxacilina (80,7%), resultados estes bem superiores aos encontrados no
presente estudo, realizado com novilhas que podem vir a aumentar sua carga microbiana
resistente com o decorrer do tempo.
Na fazenda 2 observou-se elevada resistência à penicilina (31,03%), enquanto que
17,24% das estirpes foram resistentes à oxacilina e conseqüentemente, a todos os antibióticos do
grupo dos beta-lactâmicos. Bonna et al. (2007) encontraram estirpes resistentes à penicilina
(79,2%), amoxicilina (21,8%), ampicilina (54,3%), e sendo que 100% das estirpes foram
sensíveis à oxacilina, resultados estes superiores aos do presente estudo, no qual foi encontrada
considerável resistência à oxacilina.
Na fazenda 3, ocorreu elevada resistência à penicilina 52,22%, enquanto que 13,33% das
estirpes apresentaram resistência a oxacilina, consequentemente esses animais não responderiam
à terapia realizada com antimicrobianos do grupo dos beta-lactâmicos segundo Trabulsi e
Alterthum (2005). O antibiótico utilizado no tratamento pré-parto das novilhas foi a base de
penicilina, principio ativo que os Staphylococcus coagulase negativa apresentaram alta resistência
52,22%, esse resultado pode estar relacionado a baixa resposta aos tratamentos das novilhas do
grupo tratado quando se compara com o grupo não tratado, nas colheitas pré-parto e parto. A
utilização de antibióticos intramamários no pré-parto não deve ser feita, indiscriminadamente,
como rotina, sem saber o perfil microbiológico e de sensibilidade aos antibióticos.
38
Beloti et al. (1997) encontraram 18,18% de estirpes resistentes à penicilina e novobiocina,
seguida da ampicilina e eritromicina (15,15%), em quartos mamários de vacas positivas no teste
do CMT, resultados não muito diferentes dos obtidos no presente estudo, nas fazendas 1, 2 e 3, e
que mostram a importância que devemos dar às novilhas, por serem consideradas o futuro do
rebanho não podem apresentar alta frequência de estirpes resistente no inicio da lactação.
A elevada resistência apresentada pelos patógenos nas três propriedades é um alerta aos
profissionais durante a prescrição de antimicrobianos para animais portadores de mastite. A
terapia realizada nas novilhas durante o pré-parto poderá selecionar estirpes de Staphylococcus
coagulase negativa resistentes a antimicrobianos, acarretando assim prejuízos aos animais e
produtores, e se tornar problema de saúde pública.
4.3 - Produção de biofilme (slime) pelos Staphylococcus coagulase negativa
O ágar Vermelho Congo permite identificar as modificações nas colônias de
Staphylococcus coagulase negativa, sendo caracterizadas como positivas as colônias que
apresentarem coloração negra e negativa as colônias de cor vermelha.
A tabela 6 mostra que não ocorreu produção de (slime), através do ágar Vermelho Congo
(CRA), pois todas as estirpes de Staphylococcus coagulase negativa apresentaram colônias
vermelhas sendo consideradas como não produtoras de biofilme.
39
Tabela 6: Resultado das estirpes de Staphylococcus coagulase negativa, submetidas ao teste do
ágar Vermelho Congo, para diagnosticar ou não a produção de biofilme (slime) das amostras
coletadas dos quartos mamários no pré-parto, pós-parto e durante a lactação das fazendas 1, 2 e 3,
São Paulo, Brasil, 2011.
Resultados
Propriedades
Positivo Negativo
Fazenda 1 --------- 100%
Fazenda 2 --------- 100%
Fazenda 3 --------- 100%
As bactérias presentes no interior dos biofilmes podem permanecer aderidas e sobreviver
por longos períodos após procedimento de higienização, tornando-se contaminantes para os
alimentos e comprometendo a qualidade do produto final (ROSSI & PORTO, 2009). Apesar das
estirpes não serem produtoras de biofilme pelo ágar Vermelho Congo, não podemos afirmar que
estas não possuem gene responsável pela produção do slime, uma vez que elas podem não
expressar o gene através da técnica do ágar Vermelho Congo (CRAMTON et al., 1999).
40
41
5 – CONCLUSÃO
Podemos concluir de acordo com os resultados obtidos nesta pesquisa que:
O isolamento de agentes infecciosos, causadores de mastite, na secreção da glândula
mamaria de novilhas no pré-parto e parto comprovam que as novilhas podem tornar-se fonte de
infecção para o rebanho.
A presença de Staphylococcus coagulase negativa resistentes à oxacilina em novilhas,
provavelmente, irá afetar os tratamentos de mastite nas lactações subsequentes.
Staphylococcus coagulase negativa resistentes à oxacilina, em amostras de secreção da
glândula mamaria no pré-parto, parto e lactação, pode se tornar um problema de saúde pública
pelo consumo de leite in natura.
A utilização de antibióticos intramamários no pré-parto deve ser realizada com critério,
devendo ser procedidos por exames microbiológicos e antibiogramas para que se faça o uso do
antimicrobiano correto, obtendo melhor resposta do tratamento. Os antibióticos não devem ser
utilizados indiscriminadamente como rotina nas fazendas.
42
43
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS:
AGUILAR, B. et al. Binding of a surface protein of Staphylococcus aureus to cultured ovine
mammary gland epithelial cells. Veterinary Microbiology, v.82, p.165-175, 2001.
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53
APÊNDICES
54
Apêndice (a)
ODDS RATIO
Definição:
O "odds ratio" é uma medida introduzida por Snow em seu trabalho de identificação do
fator de risco da propagação da cólera em Londres, em 1853 (Rumel, 1986). O "odds ratio" é
utilizado como medida de associação causal, em estudos transversais controlados (que é o
método utilizado nesta pesquisa). O odds ratio indica quantas vezes a prevalência do patógeno no
grupo tratado é menor que a prevalência dos patógenos no grupo não tratado. Por exemplo,
usando os dados como mostrado na tabela a seguir o "odds ratio" é igual a (a/b)/(c/d) ou (ad)/(bc)
e por isto é também chamado de razão de produtos cruzados; onde a é frequência de patógenos
positivos e b é a frequência de patógenos negativos no grupo não tratado; onde c é frequência de
patógenos positivos e d é a frequência de patógenos negativos no grupo tratado.
Tabela de contingência para a prevalência do patógeno SCP na Fazenda 3.
Fator de
Risco
Patógeno,
positivo
Patógeno,
negativo Total
Não Tratado A 56 b 709 765
Tratado C 26 d 753 779
Total N1 82 n2 1462 1544
Odds Ratio = (56/709)/(26/753)= 2,29.
Interpretação. A prevalência do patógeno no período de lactação é 2,29 vezes maior na
amostra não tratada em relação à amostra tratada.
O odds ratio calculado está associado a uma estimava do seu intervalo de confiança de
95% (IC95%): se o extremo inferior do IC 95% exceder o valor de 1, a hipótese H0 do valor do
OR ser igual a 1 é rejeitada e o teste é considerado significativo aceitando o valor calculado da
55
OR como sendo a diferença de frequência de patógenos entre os grupos. Se o IC95% incluir o
valor 1, a H0 é rejeitada e não se aceita o valor calculado como sendo diferente do valor 1. O
valor 1 indica que os dois grupos comparados possuem a mesma frequência de patógenos
positivos.
56
Apêndice (b)
Teste e intervalo de confiança para comparar duas proporções
FAZENDA 2
Comparação entre as isolados de SCP nos grupos não tratados e tratados:
Grupos F. A. N PROPOÇÃO
Não tratados p(1) 18 455 0,039560
Tratados p(2) 13 410 0,031707
Estimate for p(1) - p(2): 0,00785312
95% CI for p(1) - p(2): (-0,0168136; 0,0325198)
Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = 0,62 P-Value = 0,533
Comparação entre as isolados de SCN nos grupos não tratados e tratados:
Grupos F. A. N PROPORÇÃO
Não tratados p(1) 24 455 0,052747
Tratados p(2) 14 410 0,034146
Estimate for p(1) - p(2): 0,0186009
95% CI for p(1) - p(2): (-0,00843331; 0,0456351)
Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = 1,35 P-Value = 0,177
57
Comparação entre as isolados de S. aureus nos grupos não tratados e tratados:
Grupos F. A. N PROPORÇÃO
Não tratados p(1) 22 455 0,048352
Tratados p(2) 43 410 0,104878
Estimate for p(1) - p(2): -0,0565264
95% CI for p(1) - p(2): (-0,0921364; -0,0209164)
Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = -3,11 P-Value = 0,002
Comparação entre as isolados de Corynebacterium nos grupos não tratados e tratados:
Grupos F. A. N PROPORÇÃO
Não tratados p(1) 34 455 0,074725
Tratados p(2) 17 410 0,041463
Estimate for p(1) - p(2): 0,0332619
95% CI for p(1) - p(2): (0,00234060; 0,0641831)
Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = 2,11 P-Value = 0,035
Comparação entre as isolados de Bacilos G- nos grupos não tratados e tratados:
Grupos F. A. N PROPORÇÃO
Não tratados p(1) 2 455 0,004396
Tratados p(2) 3 410 0,007317
Estimate for p(1) - p(2): -0,00292147
95% CI for p(1) - p(2): (-0,0131686; 0,00732563)
Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = -0,56 P-Value = 0,576
58
FAZENDA 3
Comparação entre as isolados de SCP nos grupos não tratados e tratados:
Grupos F. A. N PROPORÇÃO
Não tratados p(1) 56 765 0,073203
Tratados p(2) 26 779 0,033376
Estimate for p(1) - p(2): 0,0398265
95% CI for p(1) - p(2): (0,0174709; 0,0621821)
Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = 3,49 P-Value = 0,0001
Comparação entre as isolados de SCN nos grupos não tratados e tratados:
Grupos F. A. N PROPORÇÃO
Não tratados p(1) 47 765 0,061438
Tratados p(2) 43 779 0,055199
Estimate for p(1) - p(2): 0,00623894
95% CI for p(1) - p(2): (-0,0171434; 0,0296213)
Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = 0,52 P-Value = 0,601
Comparação entre as isolados de S. aureus nos grupos não tratados e tratados:
Grupos F. A. N PROPORÇÃO
Não tratados p(1) 19 765 0,024837
Tratados p(2) 8 779 0,010270
Estimate for p(1) - p(2): 0,0145670
95% CI for p(1) - p(2): (0,00146200; 0,0276721)
Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = 2,18 P-Value = 0,029
59
Comparação entre as isolados de Streptococcus spp. nos grupos não tratados e tratados:
Grupos F. A. N PROPORÇÃO
Não tratados p(1) 40 765 0,052288
Tratados p(2) 43 779 0,055199
Estimate for p(1) - p(2): -0,00291139
95% CI for p(1) - p(2): (-0,0254061; 0,0195833)
Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = -0,25 P-Value = 0,800
Comparação entre as isolados de Cocos G-. nos grupos não tratados e tratados:
Grupos F. A. N PROPORÇÃO
Não tratados p(1) 12 765 0,015686
Tratados p(2) 5 779 0,006418
Estimate for p(1) - p(2): 0,00926779
95% CI for p(1) - p(2): (-0,00117163; 0,0197072)
Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = 1,74 P-Value = 0,082
Comparação entre as isolados de Bacilos G-. nos grupos não tratados e tratados:
Grupos F. A. N PROPORÇÃO
Não tratados p(1) 6 765 0,007843
Tratados p(2) 11 779 0,014121
Estimate for p(1) - p(2): -0,00627753
95% CI for p(1) - p(2): (-0,0166566; 0,00410154)
Test for p(1) - p(2) = 0 (vs not = 0): Z = -1,19 P-Value = 0,236