Institut de Génétique et Microbiologie

LES CRISPRS, INSTRUMENTS D'ETUDE DE L'EVOLUTION INTER ET INTRA-SPÉCIFIQUE

CHEZ LES MICROORGANISMES

Soutenance de thèse, le 24 Juin 2008, IGM

Ibtissem GRISSA

Introduction Résultats Discussion Perspectives

2

PLAN

Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux But de la thèse

Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie

Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie

Perspectives Les metagenomes

Introduction : Les CRISPRs avant 2006Etat des lieuxBut de la thèse

RésultatsInvestigation des CRISPRsLe CRISPR pour la phylogénie

DiscussionInvestigations du CRISPRUtilisation du CRISPR pour la phylogénie

Perspectives Améliorer les outils Les métagénomes

Introduction Résultats Discussion Perspectives

Introduction Résultats Discussion Perspectives

3

DRLeader

spacers DR dégénéré

TTAGGGTTACGTCCCCCCCGATTCTTGTGACCCTCTTTTTATCACTATGACTAACGTATTGATTTTTATGCTACTCAGGTATTTCACTAAAAAAAGGGTTTTTACGCATTTTGCGCCATTGCTCATTGATAAACATCGGGTTATCCGTATTATCTTACGTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAAATGTTCGACGATTTATTTTATTTGTATTTCAGGTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAAATTTATTAAAGATGCTGACAAAAAGAACTTAAGTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAAGTCAACGCTTCACTCCCTGCGCGGGGTATAACGTTCACTGCCGCACAGGCAGCCCAATAA

Yersinia pestis CO92 (NC_003143_2 )

1ère observation : Escherichia coli (Ishino 1987) succession de séquences répétées de 29pb espacées de séquences

uniques de 32-33pb. 2 locus séparés de 24 kb (14 et 7 répétitions)

Introduction La découverte des CRISPRs (1)

Introduction Résultats Discussion Perspectives

4

1991 : découverte d’un CRISPR dans le complexe Mycobacterium tuberculosis

Introduction

Structure présente chez tous les membres du complexe M. tuberculosis

Marqueur génétique assez polymorphe pour différencier les souches

1996 : Le spoligotypage pour le typage épidémiologique de M. tuberculosis (Membrane d’oligonuclétides composée de 43 spacers)

La découverte des CRISPRs (2)

Obeservations chez les archées : 2 Haloferax volcanii et H. mediterranei (Mojica et col. 1993, 1995) Sulfolobus (She 1994)

Introduction Résultats Discussion Perspectives

5

L’acronyme CRISPR TREP Tandem Repeat SRSR Short Regularly Spaced Repeats DVR Direct Variable Repeat LCTR Long Cluster of Tandem Repeat SPIDR Spacers Interspaced Direct Repeats

E. coli DR : 29bp, spacer : 32-33pb CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTC

H. mediterranei et H. volcanii DR : 30bp, spacer : 33-39pb GTTACAGACGAACCCTAGTTGGGTTGAAGC

M. tuberculosis DR : 36pb spacer : 35-41pb GTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC

CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic RepeatJansen 2002

Introduction

Introduction Résultats Discussion Perspectives

6

Un groupe de gènes associés

DRLeader

spacers DR dégénérégènes cas

Le système CASS : CRISPR + cas

Jansen 2002cas1 : réparation de l’ADNcas2 : transposasecas3 : hélicasecas4 : recB exonuclease

Makarova 2002 20 gènes impliqués dans la réparation de l’ADN

Etude phylogénétique des gènes cas Présence du même DR chez des espèces éloignées

Transfert horizontal

Introduction

Introduction Résultats Discussion Perspectives

7

Tang et col. PNAS 2002 Identification of 86 candidates for small non-messenger RNAs from the archeon Archaeoglobus fulgidus.

Introduction

Transcription du locus CRISPR

Introduction Résultats Discussion Perspectives

8

Origine des spacers

Acquisition du spacer à partir d’éléments génétiques préexistants d’origine extrachromosomique (phages, plasmides) ou chromosomique

Génomes analysés

Spacers analysés

Spacers reconnus

phages plasmides chromosome

67 4500 88 (2%) 47 (54%) 10 (11%) 31 (35%)

(Mojica 2005)

2005 : origine des spacers et suggestions sur le rôle du CRISPR

Mojica 2005 Pourcel 2005 Bolotin 2005

67 procaryotes

Streptococcus thermophilusS. vestibularis

Yersinia pestisY. pseudotuberculosisStreptococcus pyogenes

Corrélation avec la résistance aux phages

Hypothèse : Le CRISPR est un système immunitaire chez les procaryotes utilisant l’interférence ARN

Introduction

Introduction Résultats Discussion Perspectives

9

Un système de résistance par interférence ARN

sp4Leader DR’DR sp2sp3 sp1

ADN invasif

Cas

Dégradation du phage

phage

Protéines CassRNA

sRNA

CasCas

ARNTranscription

Modèle d’action du CRISPR

Introduction

Introduction Résultats Discussion Perspectives

10

Evolution de la structure CRISPR

Acquisition polarisée adjacente à la séquence leader Perte interstitielle de spacers Les spacers communs renseignent sur un ancêtre commun

Le polymorphisme des spacers est un indicateur phylogénétique

DR’DR sp2sp3Leader sp1

sp4Leader

ADN invasif

DR’DR sp2sp3 sp1

++

=

CasCas

Introduction

Introduction Résultats Discussion Perspectives

11

Problématique

Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son

parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur

de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure

minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences

adjacentes sur le même génome

Introduction

Outils informatiques pour faciliter l’exploration, la compréhension et l’utilisation des CRISPRs

Introduction Résultats Discussion Perspectives

12

PLAN

Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse

Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie

Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie

Perspectives Les metagenomes

Introduction : Les CRISPRs avant 2006Etat des lieux But de la thèse

RésultatsInvestigation des CRISPRsLe CRISPR pour la phylogénie

DiscussionInvestigations du CRISPRUtilisation du CRISPR pour la phylogénie

Perspectives Les metagenomes

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

13

Outils informatiques créés

Analyse systématique de tous les CRISPRs

des génomes séquencés

Analyse systématique de tous les CRISPRs

des génomes séquencés

Utilisation du CRISPR pourla phylogénie intra-espèce

Utilisation du CRISPR pourla phylogénie intra-espèce

• Créer une base de donnéesAnalyser les séquences flanquantesStocker les DRStocker les spacers (tronçons de virus) Effectuer des BLAST

CRISPRdb

• Analyse de la microévolutionComparaison des CRISPRsIdentifier les spacersConstruire un catalogue par espèce

CRISPRcompar

Données Gold Oct. 2005315 génomes complets

804 procaryotes en cours

Introduction

Identifier les CRISPRs

Introduction Résultats Discussion Perspectives

14

Les programmes utilisés

Patscan

p1=24...47 15...70 p1

Consensus pattern (60 bp):GTGTTCCCCGCGCATCGCGGGGGTTGAAGGGTCAGGTCTGCATCAACGATCGCCCACTCC TRF

Repeat size

Start position

Programmes non spécifiques aux CRISPRs Besoin de traitement manuel supplémentaire

Besoin d’automatisation Définition des limites du DR

REPuter

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

15

Création de CRISPRFinder

CRISPRFinderA Aa cb d

Utilisation de Vmatch (Reputer)

-Liste des répétitions maximales ayant une taille bien définie, séparées par des séquences de taille prédéfinie

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

16

Les bornes du DR: DR consensus

GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA ATGTTCGACGATTTATTTTATTTGTATTTCAG

GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA ATTTATTAAAGATGCTGACAAAAAGAACTTAA

GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA GTCAACGCTTCACTCCCTGCGCGGGGTATAAC

GTTCACTGCCGCACAGGCAGCCCAATAA

CRISPRFinder : difficultés (1)

29 pb

Y. pestis C092 Positions : 1773655-1773862

!

La taille des spacers

Clostridium botulinum A3 Positions : 131045- 131754

30 pb Entre 21 et 37 pb

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

17

CRISPRFinder : difficultés (2)

1 AGGTTTTGCTGCCTTTTCGGCGGGTATC TCAAAGTCAACTTGTAAATGACGATTTTCACG 32

2 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC AGTTTGGGGCTGAGTTTGCCATTTTCCTAAAT 32 3 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC GATGAAGCAGACCACCTCGATTACCCCACGCT 32 4 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC ACTATTTATCAAGACCTTCTTTAAAATCAAAC 32 5 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC AGTTTGGGGCTGAGTTTGCCATTTTCCTAAAC 32 6 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC

(4626121)

(4626448)

** ** * * **

Shewanella sp. ANA-3 (CRISPR_2)

Yersinia pestis KIM (CRISPR_4)

1 TTATTGGGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC GTTATACCCCGCGCAGGGAGTGAAGCGTTGAC 32

2 TTTCTAAGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC TTAAGTTCTTTTTGTCAGCATCTTTAATAAAT 32 3 TTTCTAAGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC CTGAAATACAAATAAAATAAATCGTCGAACAT 32 4 TTTCTAAGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC

(2875721)

(2875928)

** **

Sulfolobus tokodaii str. 7 (CRISPR_2)

7 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG TGATTGATCACAATGAGAAGACTGTAAAGCTGATAAAC 38 8 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG TGTTGAGGCATAAATTAATCTATCCTTAATGAAAAAT 37 9 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG TTCTTCCTCAGCCTCCATTTTGTTTATGATTTGTAGTGCC 40 10 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG TTCAATAATCTCTATCTTTCCAAAATCTGTAAATGAAGAC 40 109 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG AAAGCACAGTCAATAACGTTATCTGGTATCATATTATCAAA 41 110 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG CTTTCTCCTTCCCTCTGATCTCTCGCTGAATTGAAAAGA 39 111 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG GTAAGTATTGATGCTAACATTGACTTCGCTGTCCCAGGGGC 41 112 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAGG AAGTATAATAACGATAGTACTAAAATTAATTGATCC 36

113 GATGATTCTCAAAAGGAATTGATAA * * ***

(32702)

(39896)

Le DR dégénéré

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

18

CRISPRFinder : difficultés (3)

Aquifex aeolicus VF5 NC_000818_6, positions : 988518-988611

GTTCCTAATGTACCGTGTGGAGTTGAAAC TTTTCGTAAGCTCTTGAAGCGCTTGTTTAAGTTCCT GTTCCTAATGTACCGTGTGGAGTTGAAAC

Alignement des leader

Les petits CRISPRs

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

19

Les grandes étapes de CRISPRFinder

Sequence(s)

Localisations possibles

DR DR23bp - 55bp

25bp - 60bp

DR’ DR DR

23bp - 55bp

[0.6DR - 2.5DR]

2

3 DR DR[ , ]

Vérification de la structure

Elimination desRépétitions en

tandem

Identification des DR candidatsCRISPRsputatifs

CRISPRs confirmés

?

Vérification des DR aux extrémités

Répétition maximale

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

20

Création de la base CRISPRdb

Filtres ajoutés pour la base

Télécharger les génomes complets sur le site NCBI

ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria

Vérification manuelle

Appliquer CRISPRFinder

Blast des DR et vérification de la terminaison

Vérification de la taille des DR et spacers

Filtres sur les CRISPRs putatifs

Validation

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

21

Bilan CRISPRdb

Mise à jour du 05/06/2008

Des CRISPRs de un à presque 300 motifs de long (moyenne : 23) (22 pour les bactéries et 27 pour les archées)

Une espèce peut posséder jusqu’à 20 CRISPRs (Methanocaldococcus jannaschii)

2 ou plusieurs CRISPRs de DR identiques ou différents

Les CRISPRs constituent presque 1% du génome qui les portent (1,1% chez Sulfolobus tokodaii)

Les souches d’une même espèce ne partagent pas toujours les mêmes CRISPRs

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

22

PLAN

Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse

Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie

Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie

Perspectives Les metagenomes

Introduction : Les CRISPRs avant 2006Etat des lieux jusqu’à fin 2005But de la thèse

RésultatsInvestigation des CRISPRsLe CRISPR pour la phylogénie

DiscussionInvestigations du CRISPRUtilisation du CRISPR pour la phylogénie

Perspectives Améliorer les outils Les métagénomes

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

23

Le CRISPR pour la phylogénie intra-espèce

Mécanisme d’évolution par délétion ou par insertion polarisée

Analyse de multiples allèles de différentes souches pour un locus CRISPR donné

Lorsque l’espèce contient un ou plusieurs CRISPRs Lorsque le CRISPR présente un polymorphisme intra-

espèce important

Espèces jeunes (Y. pestis, M. tuberculosis) ou complexes clonaux (Pseudomonas aeruginosa) contrairement aux espèces plus anciennes (Y. pseudotuberculosis, M. canetti)

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

24

Investigations (1)

Identification d’un (plusieurs) CRISPRs Consultation de la base CRISPRdb Utilisation de CRISPRFinder

Quantifier le polymorphisme du CRISPR

Utilisation de CRISPRcomparison MyCRISPRdb

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

25

Investigations (3)

Choisir les amorces PCR : 20-30pb à 40 pb du CRISPR

Flankalign CRISPRcomparison

sp4Leader DR’DR sp2sp3 sp1

F1 R1 R2

Résultats

Manipulations techniques sur une collection représentative d’une espèce (amplification PCR et séquençage)

Introduction Résultats Discussion Perspectives

26

Analyse des données (1) Constituer un catalogue de spacers

http://crispr.u-psud.fr/crispr/Dict/Dict.php

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

27

Analyse des données (2)

TableCodedAlleles

Fichier binaire

Strain Ref-Seq Spacers1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Microtus NC_005810 1 1 1CO92 NC_003143 1 1 1 1 1 1 1 1KIM NC_004088 1 1 1Antiqua NC_008150 1 1 1 1 1 1Nepal516 NC_008149 1Pestoides-F NC_009381 1 1 1 1 1 1

Organisation des locus CRISPR dans six souches Y. pestis

Fichiers de sortie

Résultats

Introduction Résultats Discussion Perspectives

28

PLAN

Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse

Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie

Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie

Perspectives Les metagenomes

Introduction : Les CRISPRs avant 2006Etat des lieux jusqu’à fin 2005But de la thèse

RésultatsInvestigation des CRISPRsLe CRISPR pour la phylogénie

DiscussionInvestigations du CRISPRUtilisation du CRISPR pour la phylogénie

Perspectives Améliorations des outils Les métagénomes

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

29

Comparaison de PILER-CR, CRT et CRISPRFinder

PILER-CRRapiditéPeu de faux positifs

CRTRapiditéTrouver le DR dégénéréDéfinition du DR consensus

MaisDR dégénéréDR consensusPetits CRISPRs

Faux positifsChevauchement de CRISPRsPlusieurs propositionsPetits CRISPRs

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

30

Comparaison de PILER-CR, CRT et CRISPRFinder

Streptococcus sanguinis SK36,

TTTGCAGTCCCCTCTCGAGGTGACTGGGG TTTCTGACATAATCAGGATGGTGTTTATAGTTATGCAGAAAAAGG

GTTTCCGTCCCCTCTCGAGGTGATTGGGG GTTCTAAATGTTTTGAAGATGTTTCTATGAATCCATCTAGTAT

ATTTCTGTCCTCTTTAGAGGTGAATTGGG GTTGTTACAAACCTATTTACATATAAGTTTCTAGGTAGTAAGTA GTTTCCGTCCCCTTTCGAGGTAACTGGGG TGAATTACTGATTACATTGTATTTAAAAATCATTGGTCTAGCGGA GTTTCCGCCCCCTTTCGAGGTGACTGGGG GTTCTAACAGACTAGAGTATTACAGTTACCGAGAACAAACAGACAT

GTTTCCGCCCCCTCTCGAGGTGACTGGGG GGTCTTACCTATCTTGCTGCTGTTCTTATACACGCTAATGCCGTCTA GTTTCCGTTCCCTCTCGAGGTGAATGGGG GTTCTTACAAAATATACTACCGAAGTAAAAGTAGGTAACATTTCATA

GTTTCAGTACCCTCCCGAGGTCACTGGGG GTTCTTACTGAAGCGCTCACATCTAACTCCAAATTAAAGCAA GTTTCCGCCCCCTCTCGAGGTGAATGGGA GGTCTTACGAAAGCCAGGAAGACCTAAAGGAAGGACAAAATTTCC GTTTTCGTCCCCTCCCGAGGTGAATGGGG GGTCTTACATCGCTTGAAACTAAAAGATAGTTATTTTGGAGAAGAA

GTTTCCGTACCCTCTCGAAGTGAATGGGG ATTCTTACGCTAGAAAATTGAAACAACAACGTAAAACCTCC GTTTCCGTACCCTCGCGAGATGAATGGAG TTCTTACACAAAGACGAACACGGCGTATCTCAATTAGGACTTA

GTTCCCGTACCCTATCGAGCTGACTGGGG TTTCTTACAAAGACGTTGCTGTTCCTGTCCTTATTGGCGTTACTAG TTTTCCGTACCCTTCCGAGGTGAATGGGG GTTCTGACCGATTGAGAGTAAAGAGGGCGAAGAAAACTGCTAG GTTTCCGTCCCCTCTCGAGGTGTTTGAGG TTTCTTACTCAAACTGTACCTAACCTTTATACAGAAGAGAATAT

GTTTCCGTACCCTTGCGAGATAACCGAGA GCTCTCACATAAAGTAGAGATTGTCAAGACTTAAATGAGCAAG GTTTCCGCCCCCTCGCGAGGTGATTGGGG TGTCTTACATTCAGGCATTGGAATTTTAGAACTTGATGATTT

GTTCCCGTACCCTCCCGAGGAGACTGGGG GTTCTAACCTTTTGACAAAAAACTAGATACTGAATATCTGGAACT GTTTCCGTACCCTCCCGAGGAGACTGAGG GTTCTTACCAAGACAAAGTTGAAGTGTCTGAAGACTTCCTGGC TTTTCCGTCCCCTCTCAAGGAGACTGGGA GGTCTTACAAGCTTGCTCACTATGTCTATGAGACTAAGACCTATTT

GTTTCCGCCCCCTCCCGAGGTGAATGGGA

PILER-CR CRT

NON NON

Oui, mais Oui, mais

NON NON

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

31

Problématique

Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son

parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur

de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure

minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences

adjacentes sur le même génome

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

32

Organisation du CRISPR (1)

Structure secondaire (kunin 2008)Clustering des DR (12 groupes) (kunin 2008, Horvath 2008)

DR

DRLe DR :

Espèce taille DRBacteroides fragilis 47 GCTGTTTCCAATGGTTCAAAGATACTAATTTGAAAGCAAATCACAACStreptococcus pyogenes 36 GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAAC Mycobacterium tuberculosis 36 GTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAACEscherichia coli 29 CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCYersinia pestis 28 GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA Pyrobaculum aerophilum 25 CCAGAAATCAAAAGATAGTTGAAAC

Thermotoga petrophila 30 GTTTCAATAGTTCCTTAGAGGTATGGAAAC

Taille : 23-47pb, terminaison particulière : (C/G)AA(A)(G/C)

Diversité d’un CRISPR à l’autre (533 DR distincts pour 873 CRISPRs) Conservation presque parfaite au sein d’un même CRISPR

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

33

Organisation du CRISPR (1)DR

Verminephrobacter eiseniae : 294 DRs exactement identiques

Un système de maintenance de l’intégrité du DR?

GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CGATCAGCTTGACGATCGTGGAGTGTATTACCGACTTCTGCTCCTCGG

GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CGTAGTGGTAATCTCTAATCTCTCTAATGATGTCCTCATTCTCCA GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CTTCATGACCGCATTAAATATATCGGGGTCTTGCATTGCTAC

GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CCTCGAGGAAGGCGTGGGGATCCCTGGCCAGCAGCTCAGCC GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG TTTAACCGCAGAAACTTGTCGATAACTGAAAAAACGGGGTTG

GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG TTGTACTCTTATAGAAACGTATTGTGGCCACCTTACGGCGGAGTG GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CAGTCTCCGCGGATGCTTGTGCATCGTTCGGCGCCGACAACTCA GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG ATCTTCACAGCGTAGTACACCTGCGTGTGGCTGAGGGAGAG

GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CGTCTAGGACGAGGGGCACTATCATTATGCGCCTGTCC GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CTCAGCTTGTAGACGTTCTCCATGTATTCATCGATATAGTACA

GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CTCCACCAACGTCCTTATCTCTTTTAGGCATATTTCCATGTATTGG GAATCTCAAAAAGAGGATTGAAAG CAAATACATGTAATACGTTGCAGTATTCTTATACAGCCTACTCTTTAC GAATCTCAAAAAGAGGATTGAAAG AATTGCCCCACGACTTGGGGGAGAGAAACGGCGGCGTGGGGGT

GAATCTCAAAGAGAGGATTGAAAG AGGAGAGCGGCGTCGACGACGTCCGCCCTTCCGGGGAACTTGGGA GAATCTCAAAAAGAGGATTGAAAG ATAACATCCATAAGGTTTATTGGTCGTGCGAATGGCACCTCTTCATTGGGCAGA

GAATCTCAAAGAGAGGATTGAAAG TCCACCACAGAGCCCGTAATTGTATACCACCGCGAATACCT GAATCTCAAAGAGAGGATTGAAAG ATCTGTATATGCGCCAACCTGTCAATAAGCGGGTCTGCGTTTT GAATCTCGAAGAGAGGATTGAAAG TGCACCGGAATGCACCGGAAAACCTACACTGTGCCCCTGA

GAATCTTAAGTTGAGGATTGAAAG

Thermoproteus neutrophilus

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

34

Organisation du CRISPR (2)

Taille constante ou variable Signature particulière sur le génome d’origine (proto-

spacer) (Deveau 2008) Identification de virus à partir des spacers (Andersson,

science 2008) Le même spacer sur deux CRISPRs différents du

même génome ou chez des souches voisines Duplication ou acquisition indépendante d’un spacer

sur le même CRISPR (Horvath 2008) 417 spacers présents en deux copies parmi 21497 (< 2%) 89 souches parmi 712 (~13%)

DR

Les spacers :

Methanothermobacter thermautotrophicusus

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

35

Problématique

Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son

parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur

de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure

minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences

adjacentes sur le même génome

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

36

Démonstration du rôle du CRISPR

Implication dans l’acquisition d’une résistance contre les phages (Barrangou et col., Science 2007), (Horvath 2008), (Devau 2008)

Discussion

Modèle interférence ARN chez les procaryotes (Makarova 2006)

-Autre rôle? - Régulation de certains gènes?

Introduction Résultats Discussion Perspectives

37

Problématique

Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son

parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur

de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure

minimale transposée Transposition des CRISPRs et des séquences

adjacentes sur le même génome

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

38

Confirmation de l’acquisition polarisée

Le CRISPR NC_007503_3 de Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901.Le DR jaune + le leader chez NC_007503_3 et NC_007503_4

Acquisition polarisée : (lillestol 2006), (Barrangou 2007), (Horvath 2008),(Tyson& Banfield 2008), (Andersson 2008)

Discussion

Leader

Introduction Résultats Discussion Perspectives

39

Acquisition de nouveaux motifs

sp4Leader

Leader DR’DR2 sp2 DR1sp3DR3 sp1

sp4DR3copie

Leader

Leader DR’DR2 sp2 DR1sp3 sp1

DR’DR2 sp2 DR1sp3 sp1DR3

DR3

sp4DR3copie

DR’DR2 sp2 DR1sp3 sp1DR3DR3

Comment le dernier motif est-il ajouté?ADN invasif

DR3copie

Le DR adjacent au leader est le dernier DR acquis ou le premier DR acquis?

sp4

Leader DR’DR2 sp2 DR1sp3 sp1

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

40

Problématique

Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son

parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur

de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure

minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences

adjacentes sur le même génome

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

41

Le CRISPR comme marqueur phylogénétique

Avantages: Facilité technique (PCR ou spoligotypage) Rapidité Importation et échangeabilité inter-laboratoires

Limites: 60% des bactéries n’ont pas de CRISPR Acquisition indépendante du même spacer CRISPR non polymorphes ou absents (Lactobacillus casei ) CRISPR très polymorphe (Y. pseudotuberculosis, M. canettii)

Bon outil de différenciation de souches + outil complémentaire pour étudier la micro-évolution

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

42

Problématique

Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son

parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de

microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure

minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences

adjacentes sur le même génome

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

43

Même leader et même DR

Transport à travers les plasmides (Godde 2007)

Legionella pneumophila Lens

Le même DR chez des espèces éloignées

Discussion Transfert horizontal du CRISPR

%GC différent du reste du génome (Horvath 2008)

Introduction Résultats Discussion Perspectives

44

Problématique

Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son

parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de

microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure

minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences

adjacentes sur le même génome

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

45

Création d’un nouveau CRISPR

Les essaimages de CRISPRsUn seul groupe de gènes associésLe même DR (quelques déviations parfois)Spacers différentsHypothèse : structure minimale transposée

formée d’un leader et un DR

DR

DR

Discussion

Introduction Résultats Discussion Perspectives

46

PLAN

Introduction : Les CRISPRs avant 2006Etat des lieux jusqu’à fin 2005But de la thèse

RésultatsInvestigation des CRISPRsLe CRISPR pour la phylogénie

DiscussionInvestigations du CRISPRUtilisation du CRISPR pour la phylogénie

PerspectivesAméliorations des outils Les métagénomes

Perspectives

Introduction Résultats Discussion Perspectives

47

Perspectives (1)

Investigations des petits CRISPRs Confirmation des CRISPRs putatifs (blast DR, …) Vérifications manuelles? Recherche des gènes cas Recherche de proto spacer

Epidémiologie, phylogénie (Projets en cours)

Exploitation des données de métagénomes Explorer des génomes de l’environnement (communautés

multi-espèces) Nature des CRISPRs, statistiques, transfert horizontal… Exploration des phages pour chercher les proto-spacer et

identifier leurs sites de reconnaissance Stockage des DR et des spacers avec possibilité de BLAST

Perspectives

Introduction Résultats Discussion Perspectives

48

Perspectives (2)

Diversité des DR : 24-43 pb Nombre de motifs : jusqu’à plus de 250 motifs

Perspectives

Institut de Génétique et Microbiologie

LES CRISPRS, INSTRUMENTS D'ETUDE DE L'EVOLUTION INTER ET INTRA-SPÉCIFIQUE

CHEZ LES MICROORGANISMES

Soutenance de thèse, le 24 Juin 2008, IGM

Ibtissem GRISSA