INMUNOANALISIS

Servicio Medico Legal SantiagoQ. L. Ethel Guerrero R. Q. F. L. Víctor Vidal P.

DefiniciónDefinición

Técnicas que utilizan la reacción antígeno- anticuerpo para el análisis cualitativo y cuantitativo de diversas sustancias.

En general se utiliza un anticuerpo como reactivo para detectar o cuantificar lo que nos interesa, el antígeno.

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales

Producción de AnticuerposProducción de Anticuerpos

Requiere la inyección de varias dosis del antígeno o hapteno unido a molécula transportadora inmunógena de Peso Molecular elevado, a un animal (conejo, cabra, oveja, caballo) a intervalos regulares, para posteriormente sacrificar el animal y obtener el antisuero.

Anticuerpos PoliclonalesAnticuerpos Policlonales

Separar

el suero

Purificación de

anticuerpos

Anticuerpos MonoclonalesAnticuerpos Monoclonales

Se obtienen de manera similar, pero se extrae el bazo o gangliosganglios linfáticos para obtener linfocitos B sensibilizados.

Se incuban estos con células de mieloma de ratón deficitarias de la enzima HGPRT en presencia de PEG para producir la fusión celular y obtener el hibridoma

Cultivados en medio apropiado, por dos semanas, solo crecen los hibridomas, que producen diferentes tipos de Ac. específicos contra el antígeno.

Por dilución se aislan los diferentes hibridomas, obteniéndose los clones adecuados, los cuales se cultivan, para producir el Ac. Monoclonal más adecuado.

Anticuerpos MonoclonalesAnticuerpos Monoclonales

Linfocitos sensibilizados

Células de Mieloma

Hibridomas

Fusión

Anticuerpos MonoclonalesAnticuerpos Monoclonales

Cultivo de células individuales en pequeño volumen

Producción de Ac - +

Crecimiento continuo - +

- +

+ -

Anticuerpos MonoclonalesAnticuerpos Monoclonales

Cultivo en grandes volúmenes

Recuperar y purificar el AcMo secretado

Anticuerpos MonoclonalesAnticuerpos Monoclonales

Ventajas con respecto Ventajas con respecto a los policlonales:a los policlonales:

– Alta especificidad, Alta especificidad, reconocen un único reconocen un único lugar antigénico.lugar antigénico.

– Se pueden obtener en Se pueden obtener en cantidades ilimitadas cantidades ilimitadas con las mismas con las mismas características.características.

Desventajas:Desventajas:

– Mayor costoMayor costo

EjemplosEjemplos

Cualitativo o de identificación:Cualitativo o de identificación: InmunoblotInmunoblot

Cuantitativo:Cuantitativo: ELISAELISA

Inmunoanálisis con reactivos Inmunoanálisis con reactivos marcadosmarcados

Dentro de estos inmunoanálisis tenemos:Dentro de estos inmunoanálisis tenemos:

– radioinmunoanálisisradioinmunoanálisis– enzimoinmunoanálisisenzimoinmunoanálisis– fluoroinmunoanálisisfluoroinmunoanálisis– luminoinmunoanálisisluminoinmunoanálisis

Inmunoanálisis con reactivos Inmunoanálisis con reactivos marcadosmarcados

– homogéneos y heterogéneoshomogéneos y heterogéneos– diseño competitivo o no competitivodiseño competitivo o no competitivo

Según el diseño del ensayoSegún el diseño del ensayo

competitivos (de reactivo limitado)

no competitivos (de reactivo en exceso)

CompetitivosCompetitivos

Inmunoensayos en que se utiliza el Inmunoensayos en que se utiliza el marcado de antígeno o anticuerpo. marcado de antígeno o anticuerpo.

Una cantidad limitada de anticuerpos Una cantidad limitada de anticuerpos que es insuficiente para unir todo el que es insuficiente para unir todo el antígeno. antígeno.

El antígeno marcado compite con el El antígeno marcado compite con el antígeno sin marcar por los anticuerpos. antígeno sin marcar por los anticuerpos. La cantidad de analito se determina a La cantidad de analito se determina a partir de la regresión correspondiente.partir de la regresión correspondiente.

Competitivo- Captura de anticuerposCompetitivo- Captura de anticuerpos

E

Ag muestra +Ac marcado

E

+

Ag muestra

Ac marcado

E

Sustrato

[Ag]

Señal

Señal

Competitivo- Captura de AntígenoCompetitivo- Captura de Antígeno

Antígeno marcado

Muestra

Lavado

Señal

[Ag]

Señal

Métodos no competitivos o Métodos no competitivos o inmunométricosinmunométricos

El antígeno a cuantificar se une a un exceso de El antígeno a cuantificar se une a un exceso de anticuerpos.anticuerpos.

Por ejemplo, con el anticuerpo fijado a la fase Por ejemplo, con el anticuerpo fijado a la fase sólida, revelando con anticuerpo marcado. sólida, revelando con anticuerpo marcado.

La concentración de antígeno se determina a La concentración de antígeno se determina a partir de la cantidad de anticuerpo marcado que partir de la cantidad de anticuerpo marcado que se une.se une.

Ag

+

Exceso de anticuerpo marcado eliminado por lavado

E

E

Sustra-to

Señal

Señal

[Ag]

Curva standard

bloqueante

No competitivo- “sandwich” de anticuerposNo competitivo- “sandwich” de anticuerpos

Según el diseño del ensayoSegún el diseño del ensayo

homogéneos

heterogéneos

Heterogéneos:Heterogéneos: Los más utilizados.Los más utilizados. Diversos formatos :Diversos formatos :

– micro placas, micro placas, – partículas magnéticas, partículas magnéticas, – Membranas de Membranas de

nitrocelulosa, nitrocelulosa,

Implican un paso de Implican un paso de separación del antígeno separación del antígeno unido del no unido. Por unido del no unido. Por ejemplo ELISA, los ejemplo ELISA, los pasos de lavado son pasos de lavado son etapas de separación.etapas de separación.

HomogéneosHomogéneos Mas utilizados en drogas Mas utilizados en drogas

de abuso y monitoreo de de abuso y monitoreo de fármacosfármacos

Sin pasos de separación, Sin pasos de separación, no se requiere la no se requiere la separación del antígeno separación del antígeno unido del no unido.unido del no unido.

EjemplosEjemplos– EmitEmit– CediaCedia

Ventajas Ventajas – Menos interferencias, más Menos interferencias, más

específicos y sensiblesespecíficos y sensibles– Instrumentación menos Instrumentación menos

costosacostosa– Admiten mayor tamaño Admiten mayor tamaño

de muestra, así disminuye de muestra, así disminuye el límite de detección.el límite de detección.

– Más versátiles en cuanto a Más versátiles en cuanto a tipo de analitotipo de analito

DesventajasDesventajas– Más difíciles de Más difíciles de

automatizarautomatizar– Mayor tiempo de análisisMayor tiempo de análisis

Ventajas Ventajas – Más precisosMás precisos– Al ser en general Al ser en general

automatizados se llevan a automatizados se llevan a cabo sin entrenamiento cabo sin entrenamiento especialespecial

DesventajasDesventajas– Son más costosos en Son más costosos en

reactivos reactivos – En general sólo sirven para En general sólo sirven para

fármacosfármacos

Heterogéneos Homogéneos

HeterogéneosHeterogéneos

Algunos métodos de separación:Algunos métodos de separación:

– Precipitación fraccionada con sulfato de amonio, etanol Precipitación fraccionada con sulfato de amonio, etanol en frío o PEG.en frío o PEG.

– Unión de la forma unida a una fase sólida (EIA, Unión de la forma unida a una fase sólida (EIA, partículas magnéticas)partículas magnéticas)

– CentrifugaciónCentrifugación

Homogéneos Homogéneos CaracterísticasCaracterísticas

La cuantificación de la reacción Ag-Ac en los La cuantificación de la reacción Ag-Ac en los EIA homogéneos se realiza por cambios en la EIA homogéneos se realiza por cambios en la señal proveniente de la marca sin hacer señal proveniente de la marca sin hacer separación física de las formas libre y unidaseparación física de las formas libre y unida..

El cambio de señal depende de la inhibición , El cambio de señal depende de la inhibición , activación o cambios conformacionales en la activación o cambios conformacionales en la enzima.enzima.

Monitoreo terapéutico de fármacos (digoxina) Monitoreo terapéutico de fármacos (digoxina) detección de drogas de abuso.detección de drogas de abuso.

HomogéneosHomogéneos

Ag

Sustrato

Enzima

Ac

Ag

Ag

HomogéneosHomogéneos

Ag

Enzima activa Enzima inactiva

S

Detección y Cuantificación:Detección y Cuantificación:Las medidas se pueden hacer con:Las medidas se pueden hacer con:

- un simple espectrofotómetro o con- un simple espectrofotómetro o con- un analizador automático de química clínica.- un analizador automático de química clínica.

Inmunoanálisis con reactivos Inmunoanálisis con reactivos marcadosmarcados

Con compuestos radiactivos:Con compuestos radiactivos:

– RIA inmunoanálisis heterogéneo y competitivoRIA inmunoanálisis heterogéneo y competitivo

– IRMA inmunoanálisis heterogéneo no competitivoIRMA inmunoanálisis heterogéneo no competitivo

Inmunoanálisis con reactivos Inmunoanálisis con reactivos marcadosmarcados

ENZIMOINMUNOANALISIS:ENZIMOINMUNOANALISIS: Las más utilizadas son:Las más utilizadas son:

– peroxidasa peroxidasa – fosfatasa alcalinafosfatasa alcalina– Glucosa 6-fosfato deshidrogenasaGlucosa 6-fosfato deshidrogenasa– B- galactosidasaB- galactosidasa

VentajasVentajas– disponibles comercialmentedisponibles comercialmente– se pueden conjugar por técnicas simplesse pueden conjugar por técnicas simples– tienen varios sustratos tienen varios sustratos

ENZIMOINMUNOANALISISENZIMOINMUNOANALISIS

Enzimoinmunoanálisis homogéneos:Enzimoinmunoanálisis homogéneos:

- EMITEMIT

- CEDIACEDIA

- Enzimoinmunoanálisis heterogéneos:Enzimoinmunoanálisis heterogéneos:

- ELISAELISA

FLUOROINMUNOANALISISFLUOROINMUNOANALISIS

Fluoroinmunoanálisis homogéneos:Fluoroinmunoanálisis homogéneos:- FPIA (de polarización de fluorescencia)FPIA (de polarización de fluorescencia)- SLFIA (sustrato marcado)SLFIA (sustrato marcado)- FETI (transferencia de la energía de FETI (transferencia de la energía de

fluorescencia)fluorescencia)- Fluoroinmunoanálisis heterogéneos:Fluoroinmunoanálisis heterogéneos:- DELFIA (disociación aumentada por DELFIA (disociación aumentada por

lantánidos)lantánidos)

FluoróforosFluoróforosO O

C

OH

O

R1

R2

HO

Fluoresceína

Inmunoensayos de FluorescenciaInmunoensayos de Fluorescencia

QuimioluminiscenciaQuimioluminiscencia

Es el fenómeno que ocurre en las luciérnagas y consiste Es el fenómeno que ocurre en las luciérnagas y consiste en:en:

– una reacción química con un muy alto rendimiento energético una reacción química con un muy alto rendimiento energético produce una molécula potencialmente fluorescente.produce una molécula potencialmente fluorescente.

– (No hay excitación luminosa como en la fluorescencia)(No hay excitación luminosa como en la fluorescencia)

– Usualmente son reacciones redox catalizadas por enzimas que Usualmente son reacciones redox catalizadas por enzimas que involucran Oinvolucran O2 2 o Ho H22OO2 2 y un sustrato orgánico oxidable. La energía se y un sustrato orgánico oxidable. La energía se libera como luz visible.libera como luz visible.

Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de moléculas, menor límite de detección que en los métodos moléculas, menor límite de detección que en los métodos isotópicos y en otros enzimáticos.isotópicos y en otros enzimáticos.

Técnica analítica QuimioluminiscenteTécnica analítica Quimioluminiscente

Para inmunoensayos se marcan Ag o Ac con Para inmunoensayos se marcan Ag o Ac con sustancias que participan en la reacción sustancias que participan en la reacción quimioluminiscente (luminol, peroxidasa), y la quimioluminiscente (luminol, peroxidasa), y la quimioluminiscencia es el paso final en la quimioluminiscencia es el paso final en la detección. detección.

Se hacen en fase sólida, o en técnicas Se hacen en fase sólida, o en técnicas homogéneashomogéneas