INIŢIEREA UNEI CULTURI IN VITRO

6.1.1 Aspecte generale privind condiţiile aseptice de cultură

Prima condiţie în realizarea cu succes a unei culturi de celule sau ţesuturi in vitro este asepsia. Mediile de cultură sunt foarte favorabile dezvoltării bacteriilor şi ciupercilor, creşterea cărora este mult mai rapidă decât cea a celulelor vegetale şi duce la inhibarea proceselor fiziologice ale ţesuturilor cultivate. De aceea un laborator de culturi de ţesuturi este organizat şi păstrat într-o asepsie strictă asemeni unei săli de operaţie.

Principalele cauze ale apariţiei infecţiilor în culturile in vitro sunt:1) Aerul care conţine o cantitate mare de organisme patogene de tipul bacteriilor sau

fungilor.2) Ţesuturile vegetale sunt acoperite la suprafaţă cu fungi şi/sau bacterii. Cele mai

infectate organe sunt cele ce se dezvoltă în pământ (rădăcini, bulbi, tuberculi). Bacteriile şi ciupercile se dezvoltă şi în interiorul ţesuturilor, în vasele conducătoare libero-lemnoase sau în spaţiile intercelulare, caz în care este imposibilă sterilizarea ţesuturilor, iar folosirea antibioticelor nu este recomandată.

3) Corpul uman, care poartă numeroase microorganisme pe piele sau în respiraţie. Metodele de eliminare ale acestor surse de infecţie sunt:a) Produsele chimice , care distrug microorganismele:-hipoclorit de sodiu;-hipoclorit de calciu;-mercurobutol;-cloridă mercurică;-produse bactericide şi fungicide;-etanol 70-80%.b)Becuri de gaz pentru sterilizarea instrumentarului prin flambare. c) Aerul cald: la 120oC timp de 20 minute (autoclav), căldură umedă pentru

sterilizarea mediilor de cultură şi a apei sau 180 oC timp de 2-3 ore, căldură uscată (etuvă) pentru sterilizarea sticlăriei.

d) Razele ultraviolete, care distrug doar o parte din spori.e) Sisteme de filtrare a aerului: se folosesc filtre speciale ce nu permit trecerea

particulelor mai mari de 0,22µm. Filtrarea este realizată de un ventilator-extractor ce asigură o ventilaţie constantă cu o viteză optimă şi are avantajul de a menţine steril aerul din incinta hotei cu flux laminar. În momentul de faţă toate laboratoarele de culturi aseptice sunt prevăzute cu hote cu flux laminar de aer steril.

6.1.2 Prepararea mediului de cultură

Datorită faptului că în prepararea unui mediu de cultură intervin mai mulţi factori este necesară alcătuirea unei liste de materiale înainte de a se trece la prepararea lui. Pe parcursul preparării se vor bifa, pe rând, toate elementele măsurate şi introduse, ţinându-se seama cu stricteţe de volumul final al mediului.

Se vor nota cu atenţie toate detaliile legate de provenienţa substanţelor chimice sau a soluţiilor stoc, erorile, corecţiile, provenienţa agarului, calitatea apei. În aparenţa sunt factori ce nu prezintă o mare importanţă, dar în realitate succesul unei culturi depinde într-o foarte mare măsură de calitatea mediului şi implicit de factorii menţionaţi mai sus.

Etapele preparării unui mediu de cultură sunt:1)Diluţia sărurilor minerale: macro- şi microelemente, apoi ajustarea la volumul final.2)Măsurarea pH-ului, corectarea cu KOH 10N; în general pH-ul este de 5,5-5,8.

3)Adiţia zaharurilor (sucrozei) urmată de adiţia agarului, care se adaugă în ploaie în timp ce mediul este amestecat tot timpul.

4)Sterilizarea mediului de cultură la 120oC între 20-30 minute, în funcţie de cantitatea de mediu din recipient.

5)Adăugarea vitaminelor şi hormonilor (sterilizaţi prin filtrare) în mediu se face atunci când temperatura mediului ajunge la 40-50 oC.

6)Repartizarea mediului în vasele de cultură sterile se face imediat după adiţia vitaminelor şi fitohormonilor.

Observaţii Mediile de cultură pot fi preparate în vase Erlenmeyer, dacă se prepară cantităţi mici

(mai puţin de un litru), iar agarul este sterilizat odată cu mediul prin autoclavare în kuktă. Pentru cantităţi mai mari de un litru se folosesc vase speciale, borcane cu capac termorezistent.

Dacă mediul conţine substanţe labile termic, substanţele vor fi dizolvate separat, apoi sterilizate prin filtrare şi incorporate în mediul autoclavat în prealabil. Acest procedeu se execută în hota cu flux laminar de aer steril.

Dacă se folosesc vase de cultură din plastic achiziţionate din comerţ sterilizate, adiţia mediului de cultură sterilizat se va face de asemenea în condiţii sterile, la gura becului de gaz unde temperatura este de aproximativ 40oC, după ce gura vasului Erlenmeyer în care se află mediul s-a trecut prin flacără pentru flambare.

Ajustarea pH-ului se face de preferat cu pH metrul înainte de sterilizarea mediului. A se evita hârtia de pH deoarece aceasta nu dă rezultate precise şi importanţa stabilirii unui pH corect se reflectă în succesul culturii in vitro. Agarul şi zaharoza nu schimbă pH-ul mediului, de aceea ajustarea acestuia se face înainte de adiţia celor două componente.

Pentru a se evita infectarea soluţiilor stoc este recomandabilă folosirea unor recipiente auxiliare, în care se va goli o cantitate aproximativ egală cu cea necesară preparării mediului de cultură, din care se va lua cu ajutorul pipetei cantitatea optimă.

6.1.3 Izolarea şi inocularea explantelor

Din punct de vedere teoretic, toate părţile unei plante pot constitui explante pentru iniţierea unei culturi de ţesuturi, datorită totipotenţei celulare, proprietate a celulei vegetale de a regenera în mod normal un individ întreg, identic cu planta donor.

Din punct de vedere al asepsiei, pot fi distinse două tehnici obligatorii:-stabilirea unei culturi aseptice din ţesuturi prelevate de la o plantă întreagă cultivată în

condiţii nesterile (prima etapă a micropropagării vegetale);-menţinerea asepsiei unei culturi deja iniţiate prin transplantarea inoculilor în condiţii

aseptice pe alte medii de cultură (etapele a doua şi a treia în tehnica de micropropagare vegetativă).

Prima categorie prezintă cele mai mari dificultăţi deoarece implică efectuarea unei sterilizări corect a ţesuturilor ce urmează a fi introduse în condiţii aseptice de cultură.

A.Sterilizarea ţesuturilorSterilizarea materialului vegetal înainte de iniţierea unei culturi in vitro este dificilă

deoarece gradul de infectare al ţesuturilor este variabil şi pentru fiecare tip de manipulare trebuie utilizate diferite substanţe chimice, în diferite concentraţii cu durate diferite de timp pentru imersarea ţesuturilor. În general, părţile aeriene ale unei plante sunt mult mai puţin infectate cu bacterii şi fungi decât cele subterane. Dificultatea sterilizării constă în necesitatea absolută de a distruge toate microorganismele patogene folosind produse chimice, astfel încât

să nu se distrugă şi celulele vegetale (care sunt cel puţin la fel de sensibile precum bacteriile sau fungii). De aceea, este absolut necesară stabilirea unui timp optim de imersare a ţesuturilor în soluţiile sterilizante.

Drept exemplu, pentru micropropagarea Saintpauliei tehnicile de sterilizare optime sunt:

-fasonarea peţiolului în fragmente de aproximativ 1cm lungime;-imersia fragmentelor de peţiol în etanol 70% timp de 20 secunde;-imersia în hipoclorit de calciu 4% timp de 12 minute, cu agitarea continuă a vasului

în care se realizează imersia;-efectuarea a trei clătiri succesive cu apă distilată sterilă pentru îndepărtarea agentului

de sterilizare.Cel mai utilizat produs de sterilizare este hipocloritul de calciu Ca(OCl)2 deoarece nu

penetrează ţesutul vegetal. Este totuşi un produs puţin stabil în soluţie apoasă şi trebuie preparat imediat înainte de utilizare cantitatea dorită de hipoclorit este dizolvată în apă prin agitare continuă timp de aproximativ 10 minute, după care, soluţia formată se filtrează, iar filtratul se utilizează imediat. Concentraţiile standard folosite sunt de 4% şi 8%, iar timpul de imersie variază între 5 şi 30 de minute.

Alţi produşi chimici ce pot fi folosiţi pentru sterilizarea materialului vegetal sunt:Hipocloritul de sodiu, NaOCl - acest produs este comercializat în pungi de plastic cu

titrul colorimetric de 48o. Se folosesc concentraţii între 5% şi 20% v/v. Timpul necesar pentru realizarea unei sterilizări optime la o diluţie de 5% este de la 5 minute la 30 de minute. Acest produs penetrează ţesuturile putând cauza leziuni la nivel celular ducând la scăderea capacităţii regenerative a ţesuturilor cultivate in vitro.

Biclorura mercurică (otravă puternică), HgCl2 – este un sterilizant foarte eficient, folosit în doze mici de ordinul 0,01% până la 0,05%. Este dificil de înlăturat deoarece are aderenţă crescută la ţesuturi, necesitând clătiri repetate, fiind recomandate cinci-şase clătiri comparativ cu trei în alte cazuri.

Mercurobutol – este de asemenea un sterilizant foarte bun şi se poate găsi în farmacii. Conţine un detergent ce-i măreşte puterea de penetrarea şi eficienţa, dar este foarte dificil de înlăturat necesitând efectuarea a două, trei clătiri cu alcool etilic de 70%.

Trebuie subliniat faptul că sterilizarea materialului biologic vegetal se realizează numai la suprafaţă şi dacă accidental ţesuturile sunt infectate în interior nu este posibilă sterilizarea lor.

În unele cazuri sterilizarea explantelor nu este necesară, cum ar cazul meristemelor bine protejate de numeroase frunzuliţe rudimentare sau a anterelor protejate în spic.

B.Pregătirea echipamentului necesar sterilizării şi lucrului la hota cu flux laminar steril

Înainte de realizarea sterilizării materialului vegetal şi începerea operaţiilor de fasonare şi inoculare pe mediu de cultură artificial a materialului vegetal, activităţi ce se realizează în condiţii sterile, este necesară pregătirea hotei cu flux laminar de aer steril, locul unde se vor realiza etapele precizate.

Sterilizarea hotei necesită parcurgerea mai multor etape:- se şterg, cu o bucată de vată înmuiată în alcool etilic de 70%, toate suprafeţele orizontale şi verticale din interiorul hotei insistându-se pe suprafaţa de lucru;- se pulverizează puţin alcool pe filtrele de aer ale hotei;- se pulverizează alcool în toate colţurile şi colţişoarele interiorului hotei;- se porneşte lampa UV, iar după cinci minute se porneşte şi ventilaţia.

În cazul hotelor cu flux de aer laminar (alcătuit din lamele dispuse în straturi paralele) steril este suficient, ca înainte de utilizare, să se şteargă cu alcool etilic 70% toate suprafeţele interioare, în special suprafaţa de lucru. La acest tip de hotă, filtrul de aer nu trebuie pulverizat cu alcool sau alte lichide deoarece este foarte fragil.

Pregătirea instrumentarului se face înainte de începerea lucrului:- se flambează instrumentele de metal la flacăra becului de gaz, după înmuierea în alcool 90%; este recomandabilă folosirea concomitentă a câte trei bucăţi din fiecare instrument;- instrumentele se imersează în alcool etilic 70% în vase de sticlă dacă nu se foloseşte flambarea şi în alcool de 90-96% dacă se doreşte flambarea acestora;- hârtia de filtru sau aluminiu folosită ca suport pentru fasonarea materialului biologic se sterilizează prin autoclavare;- vasele Petri sterilizate în prealabil în etuvă la 180oC timp de 2-3ore se scot, din pachetele de hârtie sau din cutiile de metal speciale în care au fost sterilizate, doar în hota sterilizată;- mediul de cultură sterilizat se va turna în vase de sticlă sau plastic sterilizate în prealabil doar la hotă, când aceasta este pornită;- se pregătesc vasele de cultură cu sau fără mediu;- se pregătesc două borcane cu apă distilată sterilă, pentru clătirea materialului vegetal, sau a instrumentarului în cazul când acesta este introdus doar în alcool, fără flambare.

C.Operaţiunile ce se execută la hota cu flux de aer sterilMenţinerea condiţiilor aseptice se face urmând câteva reguli stricte şi necesare:

- înainte de a începe lucrul la hotă, operatorul trebuie să-şi spele mâinile cu săpun (preferabil cu mercurobutol sau altă substanţă sterilizantă), să-şi suflece mânecile halatului până mai sus de coate, să-şi frece palmele, încheieturile mâinilor şi antebraţele cu alcool 70% sau cu mercurobutol şi să se clătească cu apă distilată sterilă;- mâinile operatorului vor fi sterilizate cu alcool de 70%, de fiecare dată când vin în contact cu materiale nesterile (păr, haine, etc);- instrumentarul se schimbă des, după două până la maximum cinci explante, şi se sterilizează prin flambare sau imersie în alcool şi clătire cu apă distilată sterilă;- explantele se fasonează cu ajutorul unui bisturiu chirurgical cu lama foarte fină, mai ales când se doreşte obţinerea unor explante de dimensiuni mici, cum e cazul meristemelor, sau extrase cu ajutorul pensetelor cu vârf subţire, în cazul anterelor, ovulelor, etc;- explantele sunt inoculate pe mediu imediat pentru a se evita deshidratarea lor şi intrarea în contact cu germenii, viteza de lucru fiind un factor important în succesul culturilor in vitro;- orice explant ce a căzut pe masa de lucru sau a fost atins de altceva în afară de hârtia de lucru sterilă, va fi eliminat;- dopurile de vată nu vor fi lăsate niciodată pe masa de lucru, iar capacele pot fi plasate cu gura în jos;- gâturile borcanelor, vaselor Erlenmeyer şi sticlelor sunt sterilizate prin trecerea prin flacăra becului de gaz;- odată cu terminarea lucrului, alcoolul rămas va fi păstrat în containere închise, pentru siguranţă.

6.1.4 Menţinerea culturilor

În general, culturile sunt plasate pe rafturi iluminate cu tuburi neon fluorescent alb cu o intensitate de 12W/m2 (aproximativ 2500 lucşi) la o temperatură de 20-25o şi un fotoperiodism de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric.

Odată cu instalarea culturilor se va urmări apariţia infecţiilor, care se văd în general după câteva zile.

6.1.5 Infecţiile şi cauzele apariţiei acestora

Apariţia infecţiilor în culturile in vitro are mai multe cauze. După simptomele manifestate putem să ne dăm seama dacă infecţia este cauzată de o ciupercă sau de o bacterie.

Dacă este generată de o ciupercă, se va observa dezvoltarea unui miceliu cu o textură mată sau pufoasă, de cele mai multe ori de culoare albă sau gri. Penicillium generează un miceliu de culoare gri mat, pe când Rhizopus nigricans, care se şi multiplică foarte repede şi care trebuie distrus prin autoclavarea culturilor înainte de deschidere şi spălare, sau aruncare, formează miceliu de culoare închisă cu aspectul unor fructificaţii de culoare neagră.

Dacă infecţiile se datorează unei bacterii se va manifesta de forma unei paste lăptoase în interiorul mediului şi pe suprafaţa acestuia. Această pastă este uneori colorată roz sau galben.

Se va observa dacă infecţia a pornit de la zona de contact dintre ţesut şi mediul de cultură, şi dacă e aşa se poate concluziona că sursa de infecţie este însuşi explantul. Dacă infecţia porneşte din alt punct al mediului de cultură, sursa poate fi aerul, sterilizarea ineficientă a mediului sau din apa condensată pe capacul recipientului de cultură. În unele cazuri, din fericire rare, sporii unor bacterii pot rezista autoclavării, de aceea este necesară clătirea sticlăriei în clorură lichidă. Atunci când se observă dezvoltarea unui miceliu de Penicillinium se constată o capacitate de lucru slabă a operatorului. Manipularea necorespunzătoare a materialului vegetal şi aplicarea ineficientă a tehnicilor de cultură in vitro, generând infecţii ale culturilor se poate datora: vorbitului în timpul lucrului la hota cu flux de aer laminar steril, sterilizarea necorespunzătoare şi insuficientă a instrumentarului, transportul microorganismelor de la explantele infectate la cele neinfectate.

Se poate ca, în cursul culturii, să nu se observe apariţia unei infecţii cu bacterii, caz în care mediul de cultură folosit nu permite dezvoltarea acestora. Totuşi, culturile pot fi infectate şi cea mai sigură cale este subcultivarea lor pe mediu adiţionat cu 2g/l peptonă (un component obligatoriu în mediile de creştere ale bacteriilor). Prin această metodă se testează culturile şi de elimină vasele de cultură infectate, obţinând culturi de ţesuturi libere de bacterii.

6.1.6 Probleme tehnice minore ce pot cauza pierderi în culturile in vitroSe poate întâmpla ca unele culturi să meargă foarte bine în anumite condiţii, iar

alteori, în aceleaşi condiţii să meargă prost sau deloc. Problema poate fi dată de condiţiile de cultură, care sunt rareori identice, condiţiile climaterice din camera de creştere se pot schimba, s-a schimbat tipul vasului de cultură sau calitatea sticlei acestuia. Un singur detaliu minor în aparenţă, poate schimba întreaga evoluţie a culturii, de aceea atenţia şi meticulozitatea sunt calităţi absolut necesare unui operator in vitro.

În continuare se prezintă câteva exemple concludente:- creşterea volumului vasului de cultură poate încetini schimbul de gaze cu exteriorul ceea ce duce la încetinirea creşterii inoculilor;- utilizarea parafilmului încetineşte considerabil schimbul de gaze şi poate modifica funcţionarea ţesuturilor;- unele capace căptuşite conţin cleiuri toxice ce pot, prin evaporare sau prin dizolvare în apa condensată, să otrăvească ţesuturile; de aceea, este recomandată îndepărtarea acestor căptuşeli înainte de folosirea capacelor;- condensul apei în vasele de cultură apare atunci când temperatura din exteriorul vasului este cu câteva grade mai mică decât cea din interior, cauza putând fi expunerea directă a culturilor la aerul rece suflat de aparatele de climatizare.