Hämolymphe

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Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................... 11. Theoretische Einleitung...................................................................................................... 2

1.1 Blut und Hämolymphe............................................................................................. 21.1.1 Blut ..................................................................................................................... 21.1.2 Hämolymphe .................................................................................................... 2

1.2 Informationsübertragende Moleküle ..................................................................... 21.2.1 Hormone ................................................................................................................. 31.2.2 Neurotransmitter .................................................................................................... 31.2.3 Pheromone ............................................................................................................. 4

1.3 Die Entwicklung der Insekten...................................................................................... 41.3.1 Die Metamorphose ................................................................................................ 41.3.2 Die Hormonelle Steuerung der Metamorphose und Häutung ........................ 4

1.4 Die Photometrie............................................................................................................. 61.5 Chromatographie .......................................................................................................... 7

2. Praktische Durchführung ................................................................................................. 102.1 Aufgabenstellung des Versuchs ............................................................................... 102.1 Material und Methoden .............................................................................................. 10

3. Ergebnisse ......................................................................................................................... 123.1 Erstellung eines photometrischen Spektrums von desulfo-Hämolymphe undVergleich mit desulfo-Sinalbin ......................................................................................... 123.2 Trennung der Hämolymphe von Athalia rosae mit HPLC und anschließenderphotometrischer Nachweis von Sinalbin ............................................................... 12

3.3 Biotest: Nachweis der Grenzkonzentration für die Fraßhemmung vonCarcinus maenas........................................................................................................... 13

4. Diskussion ...................................................................................................................... 144.1 Erstellung eines photometrischen Spektrums von desulfo-Hämolymphe undVergleich mit desulfo-Sinalbin ......................................................................................... 144.2 Trennung der Hämolymphe von Athalia rosae mit HPLC und anschließenderphotometrischer Nachweis von Sinalbin........................................................................ 14

4.3 Biotest: Nachweis der Grenzkonzentration für die Fraßhemmung vonCarcinus maenas........................................................................................................... 15

5. Zusammenfassung ........................................................................................................... 15

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1. Theoretische Einleitung

1.1 Blut und Hämolymphe

Im Körper von Tieren und Menschen ist das Kreislaufsystem das wichtigste Transportmittel.Über dieses System können Nährstoffe, Atemgase, Abwehrstoffe und Botenstoffe an den Ortim Körper gebracht werden, am dem sie benötigt werden. Stoffwechselprodukte werdendurch das Kreislaufsystem zu den Exkretionsorganen befördert.

1.1.1 Blut

Das Blut ist die transportierende Flüssigkeit im Körper von Tieren mit einem geschlossenenKreislaufsystem. Es fließt in den Blutgefäßen und ist von der Interzellular-Flüssigkeitgetrennt. Der Stoffaustausch zwischen Blut und Gewebe (bzw. Interzellular-Flüssigkeit)erfolgt durch Diffusion oder aktiven Transport an den Membranen.Das Vertebraten-Blut besteht aus besonderen Zellen und dem flüssigen Blutplasma.Die Blutzellen kann man in drei Gruppen unterteilen: die Erythrocyten, deren Hauptaufgabeder O2-Transport ist, die Leukocyten, die für die spezifische Immunabwehr zuständig sind,und die Thrombocyten, die bei der Blutgerinnung mitwirken. In den Erythrocyten befindensich die respiratorischen Proteine (z.B. das Hämoglobin beim Menschen), die O2 binden undtransportieren können.Das Blutplasma setzt sich aus Wasser (ca.90%), darin gelösten Elektrolyten (pH-Pufferung)und Plasmaproteinen, wie z.B. Albumin (Erhaltung des osmotischen Gleichgewichts),Immunglobulinen (Immunabwehr) und Fibrinogen (Blutgerinnung) zusammen. Außerdemsind im Blutplasma auch Glucose (Nährstoff) und Harnstoff (Exkretion) enthalten.

1.1.2 Hämolymphe

Bei Tieren mit einem offenen Kreislaufsystem nennt man die transportierende FlüssigkeitHämolymphe. Diese fließt, kaum von Gefäßen umschlossen, durch den Körper; Interzellular-Flüssigkeit und Hämolymphe sind nicht getrennt, man spricht hier von einerhämocoelfüllenden Hämolymphe.Hämolymphe ist dem Blut der Wirbeltiere sehr ähnlich, mit der Ausnahme, dass sich in derHämolymphe keine Erythrocyten zum O2-Transport befinden. Der Sauerstoff wird hier überdas Tracheensystem direkt zu den Organen und Geweben befördert. Da der Sauerstoff inder Gasphase transportiert wird, geht der Transport sehr viel schneller als bei denVertebraten: ein Insekt kann eine Zelle mit 100mal mehr O2 pro Zeiteinheit versorgen als einWirbeltier.Respiratorische Pigmente werden meist nicht benötigt und schwimmen, wenn vorhanden,frei in der Hämolymphe.

1.2 Informationsübertragende Moleküle

In einem komplexen vielzelligen Organismus, in dem verschiedene Gewebe und Organespezielle Aufgaben übernehmen, muss gewährleistet sein, dass die verschiedenenTätigkeiten genau aufeinander abgestimmt sind. Hierfür ist ein gut funktionierendesKommunikationssystem innerhalb des Körpers unerlässlich.

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Bei den Metazoen haben sich zwei Kommunikationsysteme entwickelt, das Nervensystemund das Endokrinsystem. Im Nervensystem wird Information in Form von Aktionspotentialenund mit Hilfe von Neurotransmittern über die Nervenbahnen weitergeleitet, im endokrinenSystem dienen Hormone als Informationsträger. Für die Kommunikation zwischen einzelnenIndividuen derselben Art gibt es weitere chemische Botenstoffe, die Pheromone.

1.2.1 Hormone

Das endokrine System nutzt als Botenstoffe ausschließlich chemische Botenstoffe, dieHormone. In der Regel werden die Hormone in bestimmten Zellen oder endokrinen Organen(z.B. Schilddrüse) gebildet, in den Blutkreislauf ausgeschüttet und gelangen über das Blut anihren Zielort. Hier binden sie an spezifische Rezeptoren und entfalten ihre Wirkung. Natürlichgibt es auch Ausnahmen, wie z.B. die Prohormone, die erst an ihrem Bestimmungsort in daseigentliche Hormon umgewandelt werden, oder Hormone, die nur auf die eigene Zelle (oderbenachbarte) wirken, ihren Entstehungsort also nie verlassen. Manche Hormone bewegensich auch nur durch Diffusion im Gewebe oder werden sowohl von endokrinen, als auch vonNervenzellen gebildet.Die Hormone spielen eine Rolle bei der Stoffwechsel- und Fortpflanzungsregulierung, siefördern das Wachstum und die Entwicklung, die Anpassung eines Organismus an seineUmwelt und steuern Verhaltensprozesse. Hormone verhalten sich wirkungsspezifisch undnicht streng artspezifisch (Sexualhormone wirken zum Beispiel auch bei Amphibien),außerdem kann ein Hormon auch mehrere Funktionen haben.Die Hormone können in vier Gruppen unterteilt werden, die sich in ihrem chemischen Aufbauunterscheiden: die Protein- und Peptidhormone (mit komplexer Molekülform, die einerAminosäuresequenz zu Grunde liegt, z.B. Insulin), die Aminosäurederivate (z.B. Adrenalin),die Steroidhormone (cyclische Kohlenwasserstoffderivate, z.B. Östrogene und Testosteron)und die Prostaglandine (cyclische, ungesättigte Fettsäuren).Hormone können ihre Wirkungsweise auf zwei verschiedene Arten entfalten:

• Direkte Wirkungsweise: Auf Grund ihres meist lipophilen Charakters wirken dieSteroidhormone direkt, da sie die Zellmembran ungehindert passieren können. ImInnern der Zelle binden die Hormone an einen spezifischen Rezeptor (Hormon-Rezeptor-Komplex), der sich entweder im Cytoplasma oder im Zellkern befindet.Der Hormon-Rezeptor-Komplex dockt an die Promotorregion bestimmterabzulesender Gene (gene responsive elements) an und beeinflusst somit dieTranskription entweder in hemmender oder in fördernder Art und Weise.

• Indirekte Wirkungsweise: Die anderen drei Hormonklassen wirken indirekt, da ihrlipophiler Anteil meist nicht ausreicht, um die Zellmembran passieren zu können. DieHormone binden als first messenger an einen Rezeptor in der Zellmembran. DurchKonformationsänderungen wird ein second messenger (z.B. cGMP) im Zellinnernaktiviert. Durch Aktivierung dieses second messengers kommt es zur Auslösungeiner Verstärkugskaskade, die die Zelle wiederum in hemmender oder fördernder Artund Weise beeinflusst.

1.2.2 Neurotransmitter

Im Nervensystem findet die Informationsweiterleitung hauptsächlich auf elektrischem Wegstatt. Die Information wird mit Hilfe von Aktionspotentialen (APs), die auf Grund derPotentialdifferenz an der Axonmembran entstehen können, über die Nervenzellenweitergeleitet. Für die interzelluläre Signalweitergabe an den Synapsen verwendet auchdieses System chemische Botenstoffe. Diese Neurotransmitter (z.B. Adrenalin, Acetylcholin)werden bei einem ankommenden AP von der Synapse in den postsynaptischen Spalt

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entleert. Die Neurotransmitter binden an Rezeptoren, die sich auf der postsynaptischenMembran der „Empfängerzelle“ befinden und lösen dort eine Erregung aus. Die Weiterleitungzwischen Neuron und Neuron oder Neuron und Effektor findet also auch auf chemischemWeg statt und kann mit der hormonellen Wirkungsweise verglichen werden. Jedoch ist dieWirkung der Neurotransmitter auf sehr kleine Distanzen beschränkt.

1.2.3 Pheromone

Unter den Pheromonen versteht man eine Gruppe von chemischen Botenstoffen, die derchemischen Kommunikation zwischen Individuen derselben Art dienen. Sie werden vonexokrinen Drüsen produziert und nach außen abgegeben. Dort werden sie dann mittelsSinneszellen (meist Riechzellen) aufgenommen und führen zu einer Reaktion. Ein bekanntesBeispiel für Pheromone sind die Sexuallockstoffe.Eine Form der Pheromone sind die sog. Kairomone, die der Kommunikation zwischenverschiedenen Arten bzw. auch zwischen Tier und Pflanze dienen.

1.3 Die Entwicklung der Insekten

1.3.1 Die Metamorphose

Unter Metamorphose versteht man bei Tieren Entwicklungsvorgänge, die unterGestaltswechsel vom Larven- zum Adultstadium führen; sie ist bei den Insekten durchHäutungen gekennzeichnet.Man unterscheidet bei den Insekten zwischen einer vollständigen und einer unvollständigenMetamorphose.

• Hemimetabolie (unvollständige Verwandlung): Bei dieser Entwicklung schlüpft dieLarve aus einem Ei. Über mehrere, untereinander ähnliche Häutungsstadienentwickelt sie sich direkt zur Imago. Zwischen den Larvenstadien und der Imagoliegen meist nur geringe morphologische Unterschiede (die Larve ist kleiner als dieImago und bei pterygoten Insekten flügellos). Durch diese Entwicklung sind zumBeispiel Wanzen und Heuschrecken gekennzeichnet.

• Holometabolie (vollständige Entwicklung): Hier liegt zwischen dem Larven- unddem Adultstadium ein unbewegliches Ruhestadium, das Puppenstadium. Währendder Verpuppung werden große Teile des Larvenkörpers enzymatisch aufgelöst undnur noch wenige Imaginalscheiben (undifferenzierte Stammzellen) bleiben übrig. Ausdiesen werden dann neue Körperteile aufgebaut, sodass die Imago der Larvemorphologisch völlig unähnlich ist. Diese Art der Entwicklung weisen zum BeispielSchmetterlinge, Fliegen und Käfer auf.

1.3.2 Die Hormonelle Steuerung der Metamorphose und Häutung

Die Metamorphose wird sowohl bei Insekten als auch bei Amphibien hormonell gesteuert.Im Gehirn der Tiere wird durch neurosekretorische Zellen das prothorakotrophe Hormon(PTTH) gebildet. Über die Axone dieser Zellen wandert dieses Hormon zu paarigenGehirnanhangsorganen (Corpora cardiaca) und wird dort gespeichert. Von hier aus gelangt

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das PTTH in die Hämolymphe, wo es die Prothorakaldrüse stimuliert, woraufhin diese dasProhormon Ecdyson, ein Steroidhormon, ausschüttet (siehe Abb.2).Dieses wird dann in den Epidermiszellen (Zielorgane) in aktives Ecdysteron (20-OH-Ecdyson), das Häutungshormon, umgewandelt. Diese Ecdysonausschüttung findet amAnfang jeder Häutung statt.Ob es sich aber um eine Larval- oder eine Imaginal-Häutung handelt, bestimmt dieKonzentration der in der Corpora allata gebildeten Juvenilhormone (JH). Befinden sichgrößere Mengen JH in der Hämolymphe, so kommt es zu einer Larval-Larval-Häutung; sinktdie JH-Konzentration jedoch unter einen bestimmten Pegel, kommt es bei denholometabolen Insekten zu einer Larval-Puppal-Häutung, bei den hemimetabolen Insektenzu einer Larval-Imaginal-Häutung.Das Ausschlüpfen der Imago aus der Exuvie (alte Exocuticula) wird vom eclosion hormone(Schlüpfhormon) induziert, indem es das motorische Verhaltensprogramm einer Häutungauslöst. Ecdysteron hingegen fördert den Abbau der alten Endocuticula und die Syntheseeiner neuen Cuticula aus Epidermiszellen.Nachdem das Tier geschlüpft ist, wird Bursicon ausgeschüttet, das die Sklerotisierung undFärbung der neuen, noch weichen Exocuticula stimuliert.

Abb. 1: Hormonale Regulation der Entwicklung eines holometabolen Insekts (Wehner/Gehring,Zoologie; 1995, 23.Aufl.,Thieme Verlag)

Ca: Corpora allata; Cc: Corpora cardiaca; Im: Imago; La: Larve; Pu: Puppe; Nsz: neurosekretorischeZellen; Pt: Prothorakaldrüse

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1.4 Die Photometrie

Trifft Licht auf Materie, kommt es zu Wechselwirkungen, bei denen die innere Energie derMoleküle erhöht wird. Dabei laufen verschiedene Teilvorgänge gleichzeitig ab:

• Absorption von Strahlung• Elastische und unelastische Streuung von Strahlung• Reflexion von Strahlung

Da es verschiedene Reaktionen zwischen Materie und Licht gibt, kann man auchverschiedene Messverfahren anwenden.Bei der Photometrie verwendet man den von der Probe absorbierten Teil der gesamtenEingangsstrahlung für die Messung.Damit der absorbierte Teil gemessen werden kann, verwendet man bei der Photometrie nurmonochromatisches Licht.Diese Messung kann nur instrumentell vorgenommen werden. Ein Photometer hat, einfachbeschrieben, folgenden Aufbau:

Kontinuumstrahler Æ Monochromator (Prisma) Æ Probe Æ Empfänger Æ Anzeige

Von einer Lichtquelle (Kontinuumstrahler) wird ein Strahl weißes (monochromatisches) Lichtauf ein Prisma oder Gitter gelenkt. Hier wird er gebrochen und so in verschiedeneSpektralfarben zerlegt. Der Photometrie liegt das Prinzip zu Grunde, dass verschiedeneWellenlängen auch unterschiedlich stark gebrochen werden.Ein Gitter setzt sich aus einer großen Anzahl von schmalen, parallelen Spalten zusammen,die sich in derselben Ebene befinden und die in der Praxis oft durch Furchen oder Spaltenersetzt sind. Sobald nun ein Lichtstrahl auf das Gitter fällt, entstehen sog. Beugungsbilder.Der Brechungsindex (Vorzugsrichtung des Lichts) ist abhängig von der Wellenlänge.Die Probe absorbiert einen Teil des Lichtes, der nichtabsorbierte Teil wird von einemHalbleiter-Photoelement aufgefangen.

Abb. 2: Photometer (alte Protokolle)

Man verwendet einen Detektor (Halbleiter-Photoelemente), um die Lichtintensität nachDurchlaufen der Probenküvette zu bestimmen. Als Halbleiter benutzt man z.B. Substanzenwie PbS oder CdS.Ein Halbleiter-Photoelement setzt sich aus drei Schichten zusammen: eine semitransparentePhotokathode, eine ringförmige Elektrode und eine leitende Trägerplatte.Durch auf die Photokathode auftreffende Lichtstrahlen werden gebundene Elektronen frei(freie Ladungsträger). Dadurch wird zum einen die Sperrschicht leitfähig, zum anderen

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ändert sich an bestimmten Stellen durch das Wandern der Elektronen deren Dichte und esentstehen „Löcher“, die ebenfalls zu einem Anstieg der Leitfähigkeit führen.So kommt es zu einer direkten Umwandlung der Strahlungsenergie in elektrische Energieund das Ausmaß der Absorption kann gemessen werden.

Die Auswertung der Ergebnisse erfolgt durch das Lambert-Beersche-Gesetz: Man rechnetdie Konzentration eines gelösten Stoffes in einer Probe aus, indem man das Verhältnis deraustretenden mit der einstrahlenden Lichtintensität vergleicht:

†

E = log I0

I= e ⋅ c ⋅ d

E: Extinktion (Maß der Absorption)I0: Intensität des in eine Messlösung eintretenden LichtsI: Intensität des aus der Messlösung austretenden Lichtse: Stoffkonstante (Extinktionskoeffizient in [dm_])c: Konzentration des gelösten Farbstoffesd: Schichtdicke

Man unterscheidet zwei verschiedene Typen von Photometern, das Einstrahl- und dasZweistrahl-Photometer.

• Einstrahl-PhotometerZuerst wird das Gerät mit einer Leerwertprobe abgeglichen. Nach diesem Abgleichkönnen die Absorptionsspektren der einzelnen Küvetten mit den eigentlichen Probendiskontinuierlich gemessen werden.

• Zweistrahl-PhotometerBei diesem Gerät wird der monochromatische Messstrahl getrennt; dieVergleichsmessung und die Messung der Absorptionsspektren der einzelnen Probenfinden gleichzeitig statt.

1.5 Chromatographie

Trennmethoden, mit denen man Substanzgemische durch Verteilung auf zwei Phasen in ihreKomponenten zerlegen kann, bezeichnet man als Chromatographie.Zur Trennung der Substanzgemische nutzt man Gleichgewichte aus, die zwischen beidenPhasen entstehen können. Je nach Methode können die verschiedenen Phasen fest, flüssigoder gasförmig sein. Die beiden Phasen dürfen auf keinen Fall miteinander mischbar sein;man unterscheidet die stationäre Phase, die immer unbeweglich ist und die mobile Phase,die an der stationären Phase vorbeiströmt. Die Substanzgemische, die aufgetrennt werdensollen, befinden sich in der mobilen Phase, entweder sind sie in einem Fließmittel gelöstoder sie befinden sich als Gase in einem Trägergas.Aufgrund unterschiedlicher Wechselwirkungen werden die einzelnen Komponenten dermobilen Phase an der stationären Phase mehr oder weniger stark zurückgehalten, dieTrennung der Substanzen erfolgt also auf Grund des verschiedenen Retentionsgrades derunterschiedlichen Stoffe.

Man unterscheidet verschiedene Effekte, auf denen diese Trennung beruht: es kommt zurEinstellung eines Gleichgewichtes durch Adsorption, Austausch und Verteilung.

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Man kann verschiedene Arten der Chromatographie unterscheiden:

• Gelfiltration:Die Gelfiltration wird v.a. zur Trennung polymerer Gemische und zur Bestimmung vonMolekülmassen (vor allem bei Naturstoffen wie z.B. Proteinen) verwendet, sie eignetsich also besonders zur Auftrennung verschieden großer Moleküle.Als stationäre Phase wird hier eine Matrix mit Hohlräumen, die eine bestimmtePorengröße aufweisen, verwendet, die die Moleküle unterschiedlich schnell bzw. tiefpassieren. Die kleineren Moleküle dringen unterschiedlich stark in die Gelmatrix ein,während die größeren Moleküle die Poren nicht passieren und somit nicht in dasInnere gelangen können. Im Eluat erscheinen zuerst die größeren Moleküle, d.h. dieeinzelnen Komponenten werden in der Reihenfolge abnehmender Molekülgrößenacheinander eluiert.

• Ionenaustauschchromatographie:Man verwendet die Ionenaustauschchromatographie v.a. zur Auftrennung vonProteinen und nützt dabei deren amphoteren Charakter aus.Das Grundgerüst von Ionenaustauschern trägt Festionen (fest gebundene Ionen) vonanionischem oder kationischem Charakter (z.B. COO-, SO3+). Diese bewirken zumeinen die Unlöslichkeit des Lösungsmittels, zum anderen einen positiven odernegativen Ladungsüberschuss. Dieser Ladungsüberschuss wird durch Gegenionen,die eine konträre Ladung zu den Festionen besitzen, kompensiert. Diese Gegenionensind frei beweglich und somit der austauschbare Bestandteil des Grundgerüsts. Jenach Ladung der Gegenionen spricht man von Kationen- bzw. Anionenaustauschern.Auf Grund dieser Anordnung kann es nun zu einem Austausch der frei beweglichenIonen Gegenionen mit gleichsinnig geladen Ionen der mobilen Phase kommen.Je nach Ladung und Molekülgröße werden die Ionen in unterschiedlichem Ausmaßausgetauscht. Ungeladene bzw. gegensinnig geladene Moleküle werden vomIonenaustauscher nicht zurückgehalten.Dieses für den Ionenaustauscher charakteristische Prinzip der reversiblen Adsorptionermöglicht auch eine Trennung verschieden stark geladener Moleküle (z.B. Proteineund Nukleinsäuren).Durch Anlegen eines Salzgradienten im Laufmittel können die ausgetauschtenMoleküle später wieder verdrängt werden, da die Bindungen reversibel sind. DieMoleküle werden je nach Affinität zu den Festionen nacheinander verdrängt.Außerdem können die Moleküle auch durch pH-Wert-Veränderungen wieder abgelöstwerden, da diese die Bindungseigenschaften beeinflussen.

• Affinitätschromatographie:Bei diesem Verfahren nutzt man spezifische Wechselwirkungen zwischen affinenReaktionspartnern, die miteinander Komplexe bilden können. Gebildet werden solcheKomplexe z.B. zwischen Enzymen und deren spezifischen Inhibitoren oder zwischenAntikörpern und Antigenen.Wird ein Reaktionspartner (Effektor) an einen Träger gebunden, entsteht ein sog.Affinitätsharz, das zur stationären Phase wird. Es kommt zur Komplexbildung, wenndie mobile Phase mit dem affinen Reaktionspartner des Effektors an der stationärenPhase vorbeifließt. Das heißt, die in der mobilen Phase enthaltene Komponentelagert sich an, die Begleitsubstanzen der mobilen Phase können ohneWechselwirkungen mit dem Affinitätsharz ungehindert an diesem vorbeifließen.Der affine Reaktionspartner kann im Anschluss durch Zerstörung des Komplexeseluiert und isoliert werden.

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• Reversed-Phase-Chromatography:Unter der Reversed-Phase-Chromatography versteht man einen Spezialfall derAdsorptionschromatographie.Bei diesem Verfahren können Substanzen getrennt werden, die in lipophilenSystemen gut löslich sind, z.B. Peptide.Stark polare Trägermaterialien (z.B. Kieselgel, Papier, Cellulose) werden durchVeretherung ihrer funktionellen Gruppen weitgehend unpolar gemacht, da die polarenGruppen den Ablauf der Chromatographie stören und die Bindung von lipophilenStoffen verhindern würden. Durch Veretherung der funktionellen Gruppen werdenlipophile Wechselwirkungen möglich. Auf diese Weise wird –nach dem Nernst´schenVerteilungsgesetz- das mobile Substanzengemisch zwischen den beiden Phasen(gegenüber dem polaren Trägermaterial) in umgekehrter Folge getrennt.Durch hydrophobe Wechselwirkungen werden so lipophile Substanzen gebunden,während hydrophile Substanzen ungehindert an der stationären Phase vorbeifließenkönnen.Die lipophilen Stoffe können später mit Hilfe eines unpolaren Lösungsmittels wiederentfernt werden.Nernst´sches Verteilungsgesetz:

)(

)(

Unterphasec

OberphasecK

A

A=

K= VerteilungskoeffizientcA= Konzentration des Stoffes A (in mol/l oder g/l)

• Hochleisungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC):Unter der HPLC versteht man ein Verfahren mit sehr hoher Trennschärfe; es stellteine Verbesserung der Gelfiltration dar und wird zur schnellen Trennung von leichtflüchtigen Substanzen verwendet.Als mobile Phase wird hier eine Flüssigkeit verwendet, in der das Gemisch, dasgetrennt werden soll, gelöst ist. Man benutzt ein besonders feinkörnigesTrägermaterial, um eine möglichst große Adsorption zu erreichen. Durch dieFeinkörnigkeit des Trägermaterials kommt es zu einem erhöhtenStrömungswiderstand, der aber durch die Erhöhung der Fließgeschwindigkeit(erhöhter Eingangsdruck) kompensiert wird.

Abb. 3: Aufbau des HPLC (alte Protokolle)

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2. Praktische Durchführung

2.1 Aufgabenstellung des Versuchs

Der von uns durchgeführte Versuch ist ein Teil des Forschungsprojektes „Mechanismus derSekretion, lokale Veränderungen des Cuticulastoffwechsels und dessen hormonelleSteuerung“, der die Schwerpunkte Proteinstoffwechsel, Chitinstoffwechsel undSklerotisierung aufweist.Thema unseres Versuchs ist die fraßhemmende Wirkung von Insektenhämolymphe, in diezur Abwehr von Fraßfeinden toxische Stoffe eingelagert werden können. Ein Beispiel fürdiese Taktik der Einlagerung von toxischen Stoffen ist die Larve der Blattwespe Athaliarosae.Der Fraßschutz der Larve kann zwei verschiedene Ursachen haben: zum einen kann sie dasHormon 20-OH-Ecdyson selbst synthetisieren, zum anderen kann sie aus sekundärenPflanzenstoffen, die sie mit ihrer Futterpflanze Senf (Sinapis sp.) aufnimmt, das GlucosinolatSinalbin synthetisieren. Beide Stoffe sind in der Hämolymphe nachweisbar.Im Carcinus Maenas Assey (Carcinus Maenas Biotest) werden abwechselnd Senfextrakteund Hämolymphe von Athalia rosae Larven getestet. Von diesen werden mit Hilfe der HPLCdie Sinalbingehalte ermittelt. Das Sinalbin muss mit dem Enzym Sulfatase behandeltwerden, da es sich mit dem vorhandenen HPLC-System nicht direkt nachweisen lässt. DieSulfatgruppe wird durch die Sulfatase vom Sinalbinmolekül abgespalten, es wird zumdesulfo-Sinalbin, das aufgrund veränderter Laufeigenschaft auf der HPLC nun nachgewiesenwerden kann.

Abb. 4: Strukturformel von Sinalbin (alte Protokolle)

2.1 Material und Methoden

Der Versuch umfasst 5 verschiedene Schritte:

• Herstellung von Extrakten aus den Futterpflanzen Sinapis alba (Senf) undBrassica pekinensis (Chinakohl), die bereits durch den Assistenten vorbereitet sind;Das Assistent zerreibt eine definierte Masse Blätter der Futtermasse mit feinemSeesand in einer Reibschale und gibt dies anschließend in 70%iges Methanol. DasExtrakt wird filtriert und das Filtrat wird weiterverarbeitet: 1min Vortex, 1minUltraschall, 10min Zentrifugieren (so entstehen die Futterpellets).

• Herstellung von Extrakten aus der Hämolymphe von Athalia rosae, die ebenfallsv o m A s s i s t e n t e n v o r b e r e i t e t s i n d ;Die Cuticula der Larven wird mit einer feinen Nadel durchstochen. Auf diese Weisewird den Larven die Hämolymphe entnommen. Das Volumen der autretendenHämolymphe wird in eine Eppendorftube mit 200ml 70%igem Methanol überführt undweiterverarbeitet: 1min Vortex, 1min Ultraschall, 10min Zentrifugieren (so entstehendie Futterpellets).

• Trennung der Extrakte mit HPLC:Die Probenschleife (loop) der HPLC fasst 200m l. Man trägt ca. 250m l auf, derÜberschuß wird in ein Überlaufgefäß geleitet. Nach dem Lauf wird das

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Sinalbinpeakpaar integriert (Peakfläche). Man bezieht sich auf die aufgetragenen200ml um die Fläche zu berechnen.Nach Sulfatasebehnadlung beträgt das Gesamtvolumen des Hämolymphextraktesca. 2000ml (die Hämolymphprobe wurde aus 50m l = 50mg FG hergestellt). 10Flächeneinheiten entsprechen ca. 30nmol Sinalbinäquivalenten.Aus diesen Angaben soll errechnet werden, wie hoch der Sinalbingehalt in derHämolymphe in Bezug auf 1g Frischgewicht (FG) ist (Angabe in mmol/g FG).Die HPLC-Trennung findet unter folgenden Laufbedingungen statt:

o Stationäre Phase: RP-18 Absorptionssäuleo Mobile Phase: H2O-Methanol

0-45 min: 100% H2O46-50 min: 40% H2O, 60%Methanol51-60 min. 100% Methanol61-70 min: 100% H2O

Während der ersten 45min erfolgt die Auftrennung, in der Zeit von 46-60min dieReinigung der Säule, damit sie danach wieder auf die Ausgangsbedingungenk a l i b r i e r t w e r d e n k a n n .

• Nachweis der Substanz mit Hilfe eines UV-Spektrums:Das Spektrum des Hämolymphextraktes wird mit Hilfe eines Spektralphotometers ineinem Bereich von 200-400nm erstellt. Die Hämolymhprobe liegt als wässrige Probevor, und wurde zuvor mit Sulfatase behandelt. Der Nullabgleich des Photometerserfolgt mit H2O als Leerwertprobe.Das Spektrum des Hämolymphextraktes soll mit Spektren von 20-Hydroxyecdysonund desulfo-Sinalbin verglichen werden.

• Biologischer Test:Fraßhemmung bei der Strandkrabbe Carcinus maenas

Abb. 5: Cacinus Maenas (alte Protokolle)

Bei diesem Test soll die minimale Hemmkonzentration ausgetestet werden undsoweit möglich quantifiziert werden (mmol/ml Futterpelletvolumen).Zur Herstellung der Futterpellets werden die eingetrockneten Proben in jeweils 10mldestilliertem H2O gelöst, daraufhin kurz anzentrifugiert und mit 20m l MUPU(Muschelpulver)-Gelatine versetzt: Aus jedem Ansatz stellt man nun ein großesFutterpellet her, das nach dem Festwerden in vier Teile zerschnitten, und an Carcinusmaenas getestet wird. Futterpellets, die nur aus MUPU-Gelatine bestehen, dienen alsNegativkontrolle. Als Positivkontrolle verwendet man 20-Hydroxy-Ecdyson (20E-OH)in unterschiedlichen Verdünnungen. Diese sind bereits vorbereitet und liegen alsgetrocknete Proben vor.Die Stoffmengen in den jeweiligen Verdünnungen betragen gerundet:20E CO = 21.600nmol20E C1 = 10.800nmol

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20E C2 = 5.400 nmol20E C3 = 2.700 nmol20E C4 = 1.350 nmol

Abb. 6: Futterpellets (alte Protokolle)

3. Ergebnisse

3.1 Erstellung eines photometrischen Spektrums von desulfo-Hämolympheund Vergleich mit desulfo-Sinalbin

Beim Spektrum von Wasser (H2O bidest) fällt auf (siehe Abb.1 im Anhang), dass imWellenlängenbereich von ca. 215-250 nm große Messfehler auftreten, die vom Gerätverursacht werden. Diese dürfen im Folgenden nicht weiter berücksichtigt werden.

Das Spektrum der Athalia-Hämolymphe (desulfo) weist ein Absorptionsmaximum ineinem Wellenlängenbereich von ca. 260-297nm auf (siehe Abb.2 im Anhang), wobeidie Kurve dann langsam abnimmt, in diesen Wellenlängenbereichen (297-400nm)wird also auch noch Licht absorbiert.

Das Spektrum vom desulfo-Sinalbin hat einen Peak bei ca. 265 nm und bereits abca.280 nm wird nur noch wenig absorbiert (siehe Abb.3 im Anhang).

3.2 Trennung der Hämolymphe von Athalia rosae mit HPLC und anschließenderphotometrischer Nachweis von Sinalbin

Die Abb.4 im Anhang zeigt die von uns erstellte photometrische Kurve des Sinalbinsnach Trennung des Hämolymphextrakts durch HPLC. Leider zeigt diese keinencharakteristischen Peak im Bereich von ca. 14-16 Minuten und ist daher für eineAuswertung ungeeignet.Aus diesem Grund verwenden wir die Kurve des Kurses vom 29.06.99 (sieheAnhang Abb.5). Hierbei handelt es sich allerdings um den photometrischen Nachweisvon Sinalbin in Senfextrakt und nicht in Hämolymphe. Diese Kurve weißt nach einerungefähren Laufzeit von 14-17 Minuten einen Peak mit einem Maximum von ca. 0,48mV auf. Der Peak sinkt bei 15,5 Minuten um ca.0,3 mV und steigt dann bei 16Minuten wieder um ca. 0,05 mV an.

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Vor und nach dem Peak beträgt die Spannung ungefähr 0 mV.

Mit Hilfe der Peakfläche lässt sich der Sinalbingehalt in 1g Frischgewicht Senfbestimmen:

o 1. 10 Peakflächeneinheiten entsprechen 30 nmol Sinalbin unser Peak hat 36,28971 FE, dies entspricht 108,86913 nmol Sinalbin.

o 2. Eine Probenschleife (Loop) der HPLC fasst exakt 200m l Senfextraktwelches in unserem Fall 108,86913 nmol Sinalbin enthält.Das Gesamtextrakt beträgt 5300 ml und enthält 2650 nmol Sinalbin.

o 3. Umrechnung des Sinalbingehalts in die Einheit mmol/g: 100 mg Senf enthalten 2650 nmol Sinalbin, das heißt in 1mg Senf sind 26,5 nmol Sinalbin enthalten.

g

mol

g

mol

mg

nmol

mg

nmol mm50,26

10

1050,26

1

50,26

100

26503

3

=⋅

==-

-

Ergebnis: in 1g Senf (FG) sind 26,50 mmol Sinalbin enthalten.

3.3 Biotest: Nachweis der Grenzkonzentration für die Fraßhemmung vonCarcinus maenas

Zu Beginn des Biotests wurde die Strandkrabbe mit MUPU-Gelatine-Pellets gefüttert,um zu überprüfen, ob sie überhaupt frisst. Dies wurde auch zwischen den anderenFütterungen immer wieder überprüft. Die Krabbe hat alle unbehandelten MUPU-Pellets gefressen und somit war die Richtigkeit des Versuchs gewährleistet.

Tab. 1: Fraßhemmung bei 20-OH-Ecdyson

Verdünnungsgrad [nmol] C0 (21,60) C1 (10,80) C2 (5,40) C3 (2,70) C4 (1,350)Stoffmengenkonzentration [mmol/ml] 0,00072 0,00036 0,00018 0,00009 0,000045

Reaktion der Krabbe + + -

+ : positive Reaktion (Futterpellet wurde nicht gefressen)- : negative Reaktion (Futterpellet wurde gefressen)

Die Krabbe zeigte bei der C4-Probe keine Fraßhemmung. Doch bereits ab der C3-Probe wurden die Futterpellets nach einer kurzen Geschmacksprobe wiederausgespuckt. Das heißt, die Grenzkonzentration für die Fraßhemmung liegt bei einerEcdysonkonzentration von 0,00009 mmol/ml.

Hämolymphe

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Tab. 2: Fraßhemmung bei Senfrohextrakt

Verdünnungsgrad [mg] C0 (100) C1 (50) C2 (10) C3 (5)Stoffmengenkonzentration [mmol/ml] 0,088 0,044 0,0088 0,0044

Reaktion der Krabbe + - -

+ : positive Reaktion (Futterpellet wurde nicht gefressen)- : negative Reaktion (Futterpellet wurde gefressen)

Hier erfolgte die Fraßhemmung ab Futterpellet C1, die Proben C3 und C2 wurdengefressen. Die Grenzkonzentration für die Fraßhemmung beim Senfrohextrakt liegtbei einer Sinalbinkonzentration von 0,044 mmol/ml.

4. Diskussion

4.1 Erstellung eines photometrischen Spektrums von desulfo-Hämolympheund Vergleich mit desulfo-Sinalbin

Der Kurvenverlauf von Hämolymphe desulfo und desulfo-Sinalbin ist nicht identisch;das Sinalbin weißt einen Peak bei ca. 265 nm auf, während das Absorptiosmaximumbei Hämolymphe-desulfo bei ca. 278 liegt. Man kann anhand der photometrischenKurven also keinen sicheren Rückschluß darauf ziehen, dass in der HämolympheSinalbin enthalten ist.Der Unterschied in den Kurven ergibt sich dadurch, dass das Sinalbin in derHämolymphe in einer anderen Form vorliegt, da es mit anderen in der Hämolympheenthaltenen Stoffen reagiert hat. Verschidene Sinalbinvarianten lkann man zumBeispiel durch die Substitution der OH-Gruppen unterscheiden. Auch gibt es vomSinalbin mehrere Arten, die alle in unterschiedlicher Konzentration in verschiedenenSenfpflanzen vorkommen können. Außerdem ist die Art und die Menge des Sinalbinsje nach Senfpflanze, deren Standort und der Jahreszeit der Ernte unterschiedlich.Auch entspricht die Pflanze die die Larve fraß nicht der, aus der das Sinalbinextraktgewonnen wurde.

4.2 Trennung der Hämolymphe von Athalia rosae mit HPLC und anschließenderphotometrischer Nachweis von Sinalbin

Der steile Anstieg der Kurve sowohl in unserem Chromatogramm (Anhang Abb.4),als auch im Chromatogramm der anderen Gruppe (Anhang Abb.5), das wir zurKonzentrationsberechnung verwendet haben, lässt sich durch Ionen erklären, die ihrAbsorptionsmaximum in einem Bereich von 400-200 nm haben. Für unseren Versuchist dies vernachlässigbar, da das Sinalbin aufgrund seiner Molekülgröße erst nachca. 14 Minuten einen Peak aufweist.

Hämolymphe

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Unser Chromatogram ist zur Konzentrationsberechnung unbrauchbar, da es keinenPeak bei 14 Minuten aufweist. Ein Grund dafür sind mit großer Wahrscheinlichkeitdie Druckschwankungen in der HPLC-Säule, die durch Luftblasen im Systementstanden sind.Unser Ergebnis kann demnach also nicht zur Berechnung der Sinalbinkonzentrationverwendet werden. Aufgrund dessen verwendeten wir die fast ideale Kurve eineranderen Gruppe, bei der man den charakteristischen „zweigipfeligen“ Peak nach 14Minuten gut erkennen kann.

4.3 Biotest: Nachweis der Grenzkonzentration für die Fraßhemmung vonCarcinus maenas

Bei diesem Versuch hängen die Ergebnisse vom Fressverhalten und der Tagesformdes Versuchstiers ab. Außerdem werden meistens andere Krabben für den Biotestverwendet. Das heißt, dass die Ergebnisse an den verschiedenen Kurstagen starkvoneinander abweichen können.Um repräsentative Ergebnisse ermitteln zu können, müsste man das Fressverhaltenüber längere Zeit beobachten. Eine Möglichkeit dafür wäre zum Beispiel die Bildungdes Mittelwerts aller während des Semesters erhaltenen Grenzkonzentrationen.

Die Fraßhemmung tritt bei Ecdyson bereits bei einer Konzentration von 0,00009mmol/ml auf, bei Senfrohextrakt liegt die Grenzkonzentation bei 0,044 mmol/ml. DieKrabbe reagiert also auf 20-OH-Ecdyson wesentlich empfindlicher, als auf Sinalbin.Für einen genauen Beweis sind jedoch genauere Daten nötig, auch hier müsste mandie gesamten Werte aller Kurstage heranziehen.

5. Zusammenfassung

In unseren Versuchen haben wir versucht, durch eine HPLC den Hämolymphextrakteiner Athalia rosae-Larve in seine Bestandteile aufzutrennen. Anschließend solltedurch photometrische Methoden das Absorptionsspektrum des Hämolymphextraktesbestimmt werden.Außerdem haben wir das Absorptionsspektrum von Hämolymphe-desulfo mit demvon desulfo-Sinalbin verglichen.Im darauffolgendem Biotest wurden die Grenzkonzentrationen von Senfrohextraktund 20-OH-Ecdyson ermittelt, ab denen bei Carcinus maenas eine Fraßhemmungeinsetzt.

Hämolymphe

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Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Hormonale Regulation der Entwicklung eines holometabolen Insekts ............. 5Abb. 2: Photometer ................................................................................................................. 6Abb. 3: Aufbau des HPLC ...................................................................................................... 9Abb. 4: Strukturformel von Sinalbin .................................................................................... 10Abb. 5: Cacinus Maenas ...................................................................................................... 11Abb. 6: Futterpellets .............................................................................................................. 12

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Fraßhemmung bei 20-OH-Ecdyson ...................................................................... 13Tab. 2: Fraßhemmung bei Senfrohextrakt......................................................................... 14

Literatuverzeichnis

- Wehner/Gehring, Zoologie; 23.Auflage 1995, Thieme Verlag- Campbell, Biologie; 2.korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum Akademischer

Verlag- Schmidt/Thews, Physiologie des Menschen; 26.Auflage 1993, Springer Verlag- Klinke/Silbernagl, Lehrbuch der Physiologie; 2.Auflage 2000, Thieme Verlag- Scherf, Wörterbuch Biologie; 1997, dtv- Vogel/Angermann, Taschenatlas der Biologie, Band 2; 1990, Thieme Verlag