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Inhalt I
Inhalt
Inhalt.................. .............................................................................................................. I
Abbildungsverzeichnis ................................................................................................ IV
Tabellenverzeichnis ..................................................................................................... VI
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................. VIII
Abstract............ ........................................................................................................... XIII
Zusammenfassung ..................................................................................................... XV
1 Einleitung ....................................................................................................... 1
1.1 Epithelien ........................................................................................................ 1
1.2 Mukoviszidose ................................................................................................. 3
1.3 ENaC (Epithelial Sodium Channel) .................................................................. 8
1.3.1 Molekulare Struktur des ENaC ........................................................................ 9
1.3.2 Regulation von ENaC .................................................................................... 11
1.4 Glucocorticoide ............................................................................................. 13
1.5 Therapiemöglichkeiten bei Mukoviszidose..................................................... 15
1.6 Ziel der Arbeit ................................................................................................ 18
2 Material ........................................................................................................ 20
2.1 Chemikalien und Lösungen ........................................................................... 20
2.2 Lösungen für die Zellkultur ............................................................................ 20
2.3 Lösungen für den Mykoplasmentest .............................................................. 21
2.4 Lösungen für die Elektrophysiologie .............................................................. 22
2.5 Lösungen für die Protein Analyse .................................................................. 22
2.5.1 Lösungen für den Bicinchoninsäuretest (BCA-Test) ...................................... 25
2.5.2 Detektion durch Enhanced Chemilumineszenz (ECL) ................................... 25
II Inhalt
3 Methoden ..................................................................................................... 26
3.1 Zellkultur ....................................................................................................... 26
3.1.1 Humane Zelllinien als Mukoviszidosemodelle ............................................... 26
3.1.2 Beschichten der Zellkulturflaschen ................................................................ 27
3.1.3 Kultivierung und Versorgung der Zellen ........................................................ 28
3.1.4 Passagieren der Zellen ................................................................................. 28
3.1.5 Einfrieren der Zellen ...................................................................................... 29
3.1.6 Auftauen der Zellen ....................................................................................... 30
3.1.7 Mykoplasmen-Test ........................................................................................ 31
3.1.8 Kultivierung der Zellen auf Transwell-Membraneinsätzen ............................. 32
3.1.9 Inkubation der Zellen mit Dexamethason ...................................................... 33
3.2 Elektrophysiologie ......................................................................................... 34
3.2.1 Die Ussing-Kammer ...................................................................................... 34
3.2.2 Verlauf einer Messung in der Ussing-Kammer .............................................. 36
3.2.3 Auswertungen der Ussing-Kammer Messungen ........................................... 36
3.3 Protein Analyse ............................................................................................. 37
3.3.1 Proteinisolation von CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen ................................ 37
3.3.2 Bicinchoninsäuretest (BCA-Test) .................................................................. 38
3.3.3 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ....... 38
3.3.4 Proteintransfer auf eine PVDF-Membran ...................................................... 40
3.3.5 Coomassie-Färbung des SDS-Gels .............................................................. 41
3.3.6 Coomassie-Färbung der PVDF-Membran ..................................................... 41
3.3.7 Proteinnachweis durch Antikörper ................................................................. 41
3.3.8 Detektion durch Enhanced Chemilumineszenz (ECL) ................................... 42
3.3.9 Auswertung der Western Blot Analysen ........................................................ 42
4 Ergebnisse .................................................................................................. 43
4.1 Mykoplasmentest .......................................................................................... 43
4.2 Elektrophysiologische Messungen ................................................................ 44
4.2.1 Elektrophysiologische Messungen der CFBE41o- Zellen mit und ohne
Dexamethasonbehandlung ........................................................................................... 45
4.2.2 Elektrophysiologische Messungen der 16HBE14o--Zellen mit und ohne
Dexamethasonbehandlung ........................................................................................... 49
4.2.3 Gegenüberstellung der Ussing-Kammer Messwerte der CFBE41o-- und
16HBE14o--Zelllinien .................................................................................................... 52
Inhalt III
4.3 Proteinbestimmung ....................................................................................... 53
4.3.1 Western Blot Analyse zur Untersuchung der Expression von α- und δ-ENaC
Untereinheiten ............................................................................................................... 53
4.3.1.1 CFBE41o--Zelllinie ......................................................................................... 54
4.3.1.2 16HBE14o--Zelllinie ....................................................................................... 57
4.3.2 Vergleich der Immunoblotanalysen der Zelllinien CFBE41o- und 16HBE14o- 60
5 Diskussion ................................................................................................... 62
5.1 Untersuchungen zur funktionalen ENaC Expression durch
elektrophysiologische Messungen ................................................................................. 63
5.2 Untersuchungen zur quantitativen ENaC Expression durch Western Blot
Analysen.......... ............................................................................................................. 69
6 Ausblick ....................................................................................................... 73
Literatur.......... .............................................................................................................. 75
Anlagen, Abbildungen ................................................................................................... I
Anlagen, Messergebnisse ........................................................................................... III
Anlagen, Chemikalien .................................................................................................. IX
Anlagen, Lösungen für die Zellkultur ......................................................................... XI
Anlagen, Kits ............................................................................................................... XII
Anlagen, Antikörper und Marker ............................................................................... XIII
Anlagen, Geräte .......................................................................................................... XV
Anlagen, Verbrauchsmaterialien ............................................................................ XVIII
Danksagung ............................................................................................................... XIX
Selbstständigkeitserklärung .................................................................................... XXI
IV Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematischer Aufbau einer Epithelzelle mit Transportsystemen ................. 3
Abbildung 2: Vererbung von CF ........................................................................................ 4
Abbildung 3: Die ΔF508 Mutation ...................................................................................... 6
Abbildung 4: Schematische Abbildung des gestörten Ionentransportes bei Mukoviszidose
......................................................................................................................................... 7
Abbildung 5: Schematische Struktur des epithelialen Na+-Kanals ENaC ......................... 11
Abbildung 6: Regulation der ENaC Expression durch Aldosteron und Vasopressin ........ 13
Abbildung 7: Strukturformel von Aldosteron und Dexamethason ..................................... 14
Abbildung 8:Schematische Abbildung eines Gewebekulturfilter ...................................... 32
Abbildung 9: Schematische Abbildung einer Neubauer-Zählkammer .............................. 33
Abbildung 10: Schematischer Aufbau einer Ussing Kammer .......................................... 35
Abbildung 11: Auftrennung von Proteinen in diskontinuierlichen Polyacrylamidgelen ...... 39
Abbildung 12: Darstellung des verwendeten Markers ..................................................... 40
Abbildung 13: Aufbau eines semidry Western Blots ........................................................ 40
Abbildung 14: Mykoplasmentest von CFBE41o--Zellen ................................................... 44
Abbildung 15: Messverlauf von CFBE41o--Zellen ohne Dexamethason-Inkubation
(Kontrollmessungen) ....................................................................................................... 46
Abbildung 16: Gegenüberstellung der unterschiedlich mit Dexamethason behandelten
CFBE41o--Zellen ............................................................................................................. 48
Abbildung 17: Messverlauf von 16HBE14o--Zellen ohne Dexamethason-Inkubation
(Kontrollmessungen) ....................................................................................................... 50
Abbildungsverzeichnis V
Abbildung 18: Gegenüberstellung der unterschiedlich mit Dexamethason behandelten
16HBE14o--Zellen ........................................................................................................... 52
Abbildung 19: Gegenüberstellung beider Zelllinien .......................................................... 53
Abbildung 20: Nachweis von α-ENaC und α-Tubulin in CFBE41o--Zellen durch
Immunoblot-analysen ...................................................................................................... 55
Abbildung 21: Untersuchung der α-ENaC UE der CFBE41o--Zellen durch unterschiedliche
Dexamethasonbehandlung .............................................................................................. 56
Abbildung 22: Darstellung der δ-ENaC UE und α-Tubulin in CFBE41o--Zellen durch
Immunoblotanalysen ....................................................................................................... 57
Abbildung 23: Nachweis von α-ENaC und α-Tubulin in 16HBE14o--Zellen durch
Immunoblotanalysen ....................................................................................................... 58
Abbildung 24: Untersuchung der α-ENaC UE der 16HBE14o--Zellen durch
unterschiedliche Dexamethasonbehandlung ................................................................... 59
Abbildung 25: Darstellung der δ-ENaC UE und α-Tubulin in 16HBE14o--Zellen durch
Immunoblotanalysen ....................................................................................................... 60
Abbildung 26: Gegenüberstellung der unterschiedlichen Expressionsraten von α-ENaC
bei CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen ............................................................................ 61
Abbildung 27: Verlauf der Messungen der CFBE41o--Zelllinie mit 3 h Dexamethason-
Inkubation .......................................................................................................................... I
Abbildung 28: Verlauf der Messungen der 16HBE14o--Zelllinie mit 3 h Dexamethason-
Inkubation .......................................................................................................................... I
Abbildung 29: Verlauf der Messungen der CFBE41o--Zelllinie mit 24 h Dexamethason-
Inkubation ......................................................................................................................... II
Abbildung 30: Verlauf der Messungen der 16HBE14o--Zelllinie mit 24 h Dexamethason-
Inkubation ......................................................................................................................... II
VI Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verwendetes Beschichtungsmedium .............................................................. 20
Tabelle 2: Verwendetes Medium und Waschlösung ........................................................ 20
Tabelle 3: Verwendetes Einfriermedium .......................................................................... 21
Tabelle 4: Verwendete Ringerlösungen und Diuretika ..................................................... 22
Tabelle 5: Verwendete Lösungen für die Proteinisolation ................................................ 22
Tabelle 6: Verwendete Lösungen für die Gelelektrophorese ........................................... 23
Tabelle 7: Verwendete Lösungen und Materialien für die Western Blot Analyse ............. 24
Tabelle 8: Verwendete Lösung zum Strippen einer PVDF-Membran............................... 24
Tabelle 9: Verwendete Färbe- und Entfärbemittel für das SDS-Gel ................................ 24
Tabelle 10: Verwendete Färbe- und Entfärbemittel für die PVDF-Membran .................... 24
Tabelle 11: Verwendete Lösungen für die Antikörperbehandlung ................................... 25
Tabelle 12: Programm für den Thermocycler .................................................................. 31
Tabelle 13: Mittelwerte der Initialwerte mit Standardfehler der CFBE41o--Zellen ............ 47
Tabelle 14: Mittelwerte der Initialwerte mit Standartfehler der 16HBE14o--Zellen............ 51
Tabelle 15: Messdaten der CFBE41o--Zellen (Kontrollmessungen) ................................. III
Tabelle 16: Messdaten der CFBE41o--Zellen mit 3 h Dexamethasonbehandlung ............ IV
Tabelle 17: Messdaten der CFBE41o--Zellen mit 24 h Dexamethasonbehandlung ........... V
Tabelle 18: Messdaten der 16HBE14o--Zellen (Kontrollmessungen) ................................ VI
Tabelle 19: Messdaten der 16HBE14o--Zellen mit 3 h Dexamethasonbehandlung ......... VII
Tabelle 20: Messdaten der 16HBE14o--Zellen mit 24 h Dexamethasonbehandlung ...... VIII
Tabellenverzeichnis VII
Tabelle 21: Verwendete Chemikalien ............................................................................... IX
Tabelle 22: Verwendete Medien und Zusätze................................................................... XI
Tabelle 23: Verwendete Kits für proteinbiochemische und molekularbiologische Methoden
........................................................................................................................................ XII
Tabelle 24: Verwendete Antikörper für biochemische Methoden .................................... XIII
Tabelle 25: Verwendete Größenmarker für biochemische und molekularbiologische
Methoden ...................................................................................................................... XIV
Tabelle 26:Verwendete Geräte ....................................................................................... XV
Tabelle 27: Verwendete Materialien ............................................................................ XVIII
VIII Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
°C Grad Celsius
α Alpha
β Beta
γ Gamma
Δ Delta (groß)
δ Delta (klein)
ε Epsilon
µ Mikro
Ω Ohm
A Ampere
ad Addiere
APS Ammoniumperoxodisulfat
ASL air surface liquid
ATP Adenosintriphosphat
BCA bicinchoninic acid (Bicinchoninsäure)
BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)
bzw. beziehungsweise
ca. Circa
Ca2+ Calcium-Kationen
CaCl2 Calciumchlorid
CF cystic fibrosis (Zystische Fibrose)
CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
Cl- Chlorid-Anionen
Abkürzungsverzeichnis IX
cm Centimeter
CO2 Kohlendioxid
Ct transepithelial capacity (transepitheliale Kapazität)
C-Terminus Carboxy-Terminus
Cu2+ Kupfer-Kationen
Da Dalton
Dex Dexamethason
DMSO Dimethylsulfoxid
DTT Dithiothreitol
ECL enhanced Chemilumineszenz
EDTA ethylene diamine tetra-acetic acid (Ethylendiamintetraessigsäure)
ENaC Epithelial Sodium channel (epithelialer Natriumkanal)
et al. et alii (und andere)
F Farad
FKS fötales Kälberserum
g Gramm
GR Glucocorticoidrezeptor
Gt transepithelial conductance (transepitheliale Leitfähigkeit)
h hour (Stunde)
H2O Wasser
H2O2 Wasserstoffperoxid
HCl Salzsäure
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
hrp horseraddish peroxidase (Meerrettichperoxidase)
IgG Immunglobulin Klasse G
ISC short circuit current (transepithelialer Kurzschlussstrom)
k Kilo
X Abkürzungsverzeichnis
K+ Kalium-Kationen
KCl Kaliumchlorid
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
l Liter
m Meter
m Milli
M Molar (mol/l)
MCC mucociliary clearance
MEM Minimal Essential Medium
MgCl2 Magnesiumchlorid
min Minute
MR Mineralcorticoidrezeptor
n Nano
Na+ Natrium-Kationen
NaCl Natriumchlorid
Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat
Nedd4 neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4
N-Terminus Amino-Terminus
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)
pH pondus Hydrogenii
PKA Proteinkinase A
PVDF Polyvinylidenfluorid
Rt transepithelial resistance (transepithelialer Widerstand)
RT Raumtemperatur
s Sekunde
S Siemens
Abkürzungsverzeichnis XI
SDS sodium dodecyl sulfate (Natriumlaurylsulfat)
sem standard error of the mean, (Standardfehler des Mittelwertes)
SGK1 serum/glucocorticoid regulated kinase 1
SV40 Simian-Virus 40
TBS tris buffered saline (TRIS-gepufferte Salzlösung)
TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin
TMA Tetramethylammoniumchlorid
TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
UE Untereinheit
USP2-45 Ubiquitin-specific protease 2-45
ü.N. über Nacht
V2R vasopressin type 2 receptor
Vt transepithelial voltage (transepitheliale Spannung)
wt Wildtyp
Abstract XIII
Abstract
Various ion channels ensure the homeostasis of intracellular and extracellular water and
salt content in epithelial cells. Dysfunction of these ion channels lead to an altered
homeostasis which often causes diverse diseases. For this maintenance of the balance of
intra-and extracellular epithelial cells basically the chloride ion channel, cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator (CFTR) and the epithelial sodium channel (ENaC)
are responsible. Due to a gene defect of the CFTR the disease cystic fibrosis (CF) is also
characterized by Na+-hyperabsorption of ENaC. Up to now, four ENaC subunits (α, β, γ, δ)
are specified to be active in human cells. In addition, it was demonstrated that α and δ
subunits form the channel pore, while β and γ build the channel complex. In this study, the
CFBE41o—cells, obtained from bronchial epithelial cells of an 1 year old CF patient, and
16HBE14o--cell line, generated from a heart and lung transplant, were used. Up to now,
no stable amiloride-sensitive currents could be detected by Ussing chamber
measurements with these cells. Therefore, the aim of this study was to stimulate the α-
and δ subunits of ENaC expression in these cells with the synthetic glucocorticoid
dexamethasone. Furthermore, Western Blot analyses were performed to examine an
increase on the protein level. In addition to this, Ussing chamber measurements were
performed to analyze a potential use of these cells as an appropriate CF-model system.
However, in this study no significant amiloride-sensitive sodium current of ENaC was
observed. But never the less a tendency of an increased current was seen in both cell
lines treated with dexamethasone for 3 and 24 hours. Contrary to that, the biochemical
investigations by Western Blot analysis of the two cell lines treated with dexamethasone
for 3 and 24 hours showed no significant increase in α-ENaC expression. In conclusion, a
tendency of an increased ENaC expression by dexamethasone could be found.
Therefore, the use CFBE41o-- and 16HBE14o--cells as an appropriate CF-model system
by treating with dexamethasone could be possible.
XIV
Zusammenfassung XV
Zusammenfassung
Die Homöostase des Wasser- und Salzgehaltes von Epithelzellen wird intrazellulär als
auch extrazellulär mit Hilfe verschiedener Ionenkanäle gewährleistet. Funktionsstörungen
dieser Ionenkanäle führen zu einer veränderten Homöostase und damit oft zu den
unterschiedlichsten Krankheiten. Zu diesen Ionenkanälen, die zur inter- und
extrazellulären Gleichgewichtserhaltung in Epithelzellen beitragen, gehören unter
anderem der Chloridionenkanal, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
(CFTR), als auch der epitheliale Natriumkanal, epithelial sodium channel (ENaC). Durch
einen Defekt des Chloridionenkanals CFTR im CFTR-Gen, kommt es zu der Krankheit
Mukoviszidose (englisch cystic fibrosis (CF) genannt). Neben dem Defekt des CFTR tritt
eine Natriumhyperabsorption über den ENaC auf. Es wurden bis heute vier ENaC
Untereinheiten (α, β, γ, δ), die in humanen Zellen aktiv sind, nachgewiesen. Dabei formen
die kanalporenbildenden Untereinheiten α- und δ-ENaC mit den anderen beiden
regulativen Untereinheiten β- und γ-ENaC die Kanalpore. Das Hauptaugenmerk dieser
Arbeit lag auf der Expression der α- und δ-ENaC UE in zwei unterschiedlichen Zelllinien.
In diesen Zelllinien konnte bislang kein stabiler Amilorid-sensitiver Natriumstrom über den
ENaC in der Ussing Kammer gemessen werden. Bei den Zelllinien handelt es sich zum
einen um CFBE41o--Zellen, welche aus bronchialen Epithelzellen eines CF-Patienten
gewonnen wurde, und zum anderen um die Zelllinie 16HBE14o-, die aus einem Herz-
Lungentransplantat generiert wurde und als Wildtyp (wt) dient. Zunächst sollte die
Expression von α- und δ-ENaC mittels des synthetischen Glucocorticoids Dexamethason
in der CFBE41o-- und der 16HBE14o--Zelllinie stimuliert werden. Anschließend wurde
mittels Western Blot Analysen untersucht, ob die Proteinexpression der beiden UE
gesteigert wurde. Zusätzlich wurde überprüft ob eine gesteigerte funktionale Expression
mittels der Ussing-Kammer messbar war und die Zelllinien somit als CF-nahes
Modellsystem dienen können. Bei den elektrophysiologischen Messungen dieser
Zelllinien, mittels der Ussing-Kammer, konnte kein signifikanter Amilorid-sensitiver
Natriumstrom über den ENaC festgestellt werden. Jedoch ist eine Tendenz zu erkennen,
dass dieser in den Zellen beider Zelllinien, welche 3 h und 24 h mit Dexamethason
behandelt wurden, leicht ansteigt. Die biochemischen Untersuchungen durch Western
Blot Analysen der beiden Zelllinien zeigten, dass die Proteinexpression der α-ENaC UE in
den mit Dexamethason, 3 h und 24 h, behandelten CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen
XVI Zusammenfassung
nicht signifikant gesteigert werden konnte. Zudem waren die Standardfehler der
Messergebnisse sehr hoch, so dass keine genaue Aussage über die Expression getroffen
werden konnte. Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass trotz der nicht
signifikanten Ergebnisse, eine tendenziell gesteigerte ENaC Expression durch
Dexamethason beobachtet werden konnte. Daher scheint die Verwendung des
Glucocorticoids Dexamethason durch die Erhöhung der ENaC Expression durchaus als
geeignet, um ein nutzbares CF Zellmodels zu etablieren.
Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Epithelien
Epithelien bilden im gesamten Organismus zunächst eine Schutz- und Barrierefunktion.
Neben diesen beiden Funktionen übernehmen sie einen regulatorischen Stoffaustausch
durch Sekretion, Resorption und den Transport von Nährstoffen und anderen Substanzen
über die Epithelmembran. Die Aufrechterhaltung des inneren Milieus bei z.B. der
Nahrungsaufnahme wird hauptsächlich durch die Regelung von Ausscheidung durch die
Lunge, den Darm, die Niere und die Haut gewährleistet. Dafür sind die besonders
angreifbaren Oberflächen mit Epithelien bedeckt. Alle Epithelien besitzen eine polare
Grundstruktur im Zellaufbau. Die apikale Zellmembran ist zur funktionalen Außenseite
gewandt. Damit die Oberfläche nach außen hin vergrößert wird, ist die apikale Seite meist
mit Mikrovilli besetzt. Entgegengesetzt ist die basolaterale Zellmembran nach innen, der
Blutseite und den seitlich gelegenen lateralen Zellmembranen, zugewandt. Für den
Transport durch das Epithel sind in den apikalen und basolateralen Zellmembranen
verschiedene Transportsysteme eingebaut: Die Symporter, bei dem mehrere Ionen in
eine Richtung transportiert werden. Die Antiporter, bei denen verschiedene Ionen in zwei
Richtungen transportiert werden und die Uniporter, die als einfache Carrier dienen. Zwei
Ionenkanäle, die in der apikalen Epithelmembran liegen, sind z.B. der durch zyklisches
Adenosinmonophosphat (cAMP) angetriebene cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator Kanal (CFTR) (siehe Abbildung 1) und der Amilorid-sensitive
epitheliale Natriumkanal (ENaC) (siehe Abbildung 1). Bei dem CFTR handelt es sich um
einen Cl--Ionenkanal, der Cl--Ionen von innen nach außen transportiert. Der ENaC ist ein
Amilorid-sensitiver Na+-Ionenkanal, der Na+-Ionen vom Zelläußeren ins Zellinnere
transportiert. Auf der basolateralen Seite befindet sich z.B. die Na+/K+-ATPase und der
Na+/K+/2Cl--Cotransporter. Die Na+/K+-ATPase gehört zu den primär aktiven Carriern.
Dieser Carrier wird durch Energieaufwand, indem ATP zu ADP + Phosphat gespalten
wird, angetrieben. Die Na+/K+-ATPase transportiert pro ATP-Molekül 3 Na+-Ionen aus der
Zelle und 2 K+-Ionen in die Zelle. Durch den Symporter Na+/K+/2Cl--Cotransporter
gelangen Cl--Ionen in die Zelle [Schmidt et al., 2010]. Durch die unterschiedlichen
Transportproteine in der Epithelzellmembran wird ein spezifischer und gerichteter
Transport von Nährstoffen und Substanzen gewährleistet [Silverthorn, 2009]. Dadurch
werden sowohl die Homöostase des Salz- und Wassergehaltes innerhalb und außerhalb
der Epithelzellen, als auch die Zusammensetzung extrazellulärer Flüssigkeiten, wie z.B.
2 Einleitung
des airway surface liquid (ASL), welcher aus einem Mukus und dem periciliary liquid layer
(PCL) besteht, gewährleistet. Der Transport von Nährstoffen und Substanzen kann auf
zwei Wege in das Epithel gelangen. Zum einen transzellulär, durch die angesprochenen
Transporter in den Epithelzellmembranen hindurch, zum anderen parazellulär, passiv an
der Epithelzelle vorbei durch spezielle Zell-Zell-Verbindungen, den so genannten tight
junctions. Je nach Gewebe und Epitheltyp, sind die tight junctions unterschiedlich dicht
ausgeprägt und Nährstoffe oder Substanzen können weniger leicht (z.B. Harnblase) oder
leicht über das Epithel (z.B. obere und untere Atemwege) gelangen. Ein spezieller
Epitheltyp ist das respiratorische Epithel, das die oberen und unteren Atemwege
auskleidet. Hierbei eingeschlossen ist das Bronchialsystem, welches vor Keimen und
Bakterien geschützt werden muss. Durch den oben angesprochenen ASL, der aus einem
Mukus und dem PCL besteht, und den apikal besetzten Kinozillien, können Bakterien,
Viren und andere Schmutzpartikel aus der Lunge entfernt werden [Knowles und Boucher,
2002; Tiddens et al., 2010; Schmidt et al., 2010]. Der Mukus liegt über dem PCL (siehe
Abbildung 1) und die durch die Atmung aufgenommenen Fremdpartikel binden an den
viskosen Mukus und werden entlang des Bronchialtraktes abtransportiert. Diesen
beschriebenen Reinigungs- und Schutzmechanismus nennt man mucociliary clearance
(MCC) [Knowles und Boucher, 2002; Thelin und Boucher, 2007]. Ist dieser Mechanismus
durch eine Dysfunktion gestört, kann es zu weitreichenden Erkrankungen wie z.B.
schweren Lungenentzündung und Zerstörung von Lungengewebe kommen [Schmidt et
al., 2010]. Im respiratorischen Epithel spielt der Na+- und Cl--Ionen Transport eine wichtige
Rolle. Die oben genannten Transporter sind alle in der Zellmembran im respiratorischen
Epithel vorhanden und sorgen für die Viskosität des ASL. Treten ein oder mehrere
Defekte in diesen Ionentransportern auf, kann dieses schwerwiegende Krankheiten wie
z.B. Mukoviszidose (engl. cystic fibrosis, CF) hervorrufen. Der schematische Aufbau mit
allen genannten Ionentransportern wird in der Abbildung 1 dargestellt.
Einleitung 3
1.2 Mukoviszidose
Mukoviszidose ist die häufigste angeborene Stoffwechselerkrankung, die in der
kaukasischen Bevölkerung auftritt [Welsh und Fick, 1987]. Von dieser Krankheit ist in
Europa ca. eins von rund 2500 Neugeborenen betroffen [Davies et al., 2007]. Bei der
afroamerikanischen Bevölkerung tritt Mukoviszidose mit ca. 1:17.000, bei der asiatischen
Bevölkerung mit ca. 1:100.000 seltener auf [Koop, 2002; Davies et al., 2007].
Die hohe Inzidenz in der kaukasischen Bevölkerung wird durch verschiedene
Mechanismen wie der hohen Mutationsrate [Goodman und Reed, 1952], dem
Heterozygotenvorteil [Pritchard et al., 1983], einem genetischen Drift [Wright und Morton,
1968], multipler Loci [Sing et al., 1982] und einer reproduktiven Kompensation [Edwards,
1977] erklärt. In Europa liegt so der prozentuale Anteil der heterozygoten Träger bei ca.
4% [Harrison und Dietel, 2006]. Die Anzahl der betroffenen CF-Patienten liegt weltweit bei
ca. 60.000. Davon sind rund 30.000 in den USA, 20.000 in Europa und 10.000 auf den
Abbildung 1: Schematischer Aufbau einer Epithelzelle mit Transportsystemen
In der Abbildung ist schematisch der Grundaufbau einer Epithelzelle mit den im Text erwähnten Ionenkanälen dargestellt. In der apikalen Membran befinden sich der cAMP induzierbare CFTR und der Amilorid-sensitive ENaC. Die durch den Na
+/K
+/2Cl
--Cotransporter eindringenden Cl
--
Ionen, gelangen über den CFTR ins außen liegende ASL. Die Na+-Ionen, die apikal durch den
ENaC in die Zelle gelangen, werden über die Na+/K
+-ATPase basolateral aus der Zelle
transportiert.
ASL
Mukus
PCL
CFTR ENaC
4 Einleitung
restlichen Kontinenten betroffen, jedoch ist eine genaue Bestimmung wegen der
ethnischen Heterogenität und der dauernd anwachsenden Bevölkerung schwierig [Grody
et al., 2001]. Alleine in Deutschland sind 8.000 Menschen, somit 40% der in Europa
betroffenen Personen, an Mukoviszidose erkrankt.
Erstmalig fand 1936 der Züricher Pädiater Fanconi einen Zusammenhang zwischen dem
Darmverschluss, dem Versagen der Bauchspeicheldrüse und der Lunge [Fanconi et al.,
1936]. Zwei Jahre später, 1938, wurde Mukoviszidose von Dorothy Hansine Andersen als
ein eigenes Krankheitsbild beschrieben [Andersen, 1938]. Heute bezeichnet man die
Mukoviszidose als Multiorgankrankheit, bei der Epithelien verschiedener Organe und aller
exokriner Drüsen betroffen sind [Lindemann, 2004].
Mukoviszidose wird autosomal-rezessiv vererbt, wobei heterozygote Merkmalsträger
phänotypisch nicht erkranken. Der genaue Erbgang ist schematisch in Abbildung 2
dargestellt.
Abbildung 2: Vererbung von CF
Mukoviszidose wird autosomal-rezessiv vererbt. Bei dieser Vererbung müssen beide Elternteile mindestens heterozygote Merkmalsträger sein, damit ein Kind homozygot, also auch phänotypisch an CF erkrankt. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein homozygot gesundes oder krankes Kind geboren wird, liegt bei 25%. Zu 50% wird ein Kind als Merkmalsträger mit nur einem betroffenen Allel geboren (verändert nach: http://www.news-medical.net/health/Genetics-of-Cystic-Fibrosis.aspx am 19.03.2013).
Einleitung 5
Hervorgerufen wird die Krankheit von einer Mutation im CFTR-Gen. Dieses Gen kodiert
für den im Abschnitt 1.1 angesprochenen CFTR-Kanal [Riordan et al., 1989a]. Das Gen
besteht aus 27 Exons (250 kb) und ist beim Menschen auf dem langen Arm des
Chromosoms 7q31-32 lokalisiert [Kerem et al., 1989; Rommens et al., 1989; Hirche et al.,
2005; Lindemann, 2004]. Bis heute ist bekannt, dass es mehr als 1940 verschiedene
Mutationen gibt, die verschieden starke Ausprägungen der Krankheit hervorrufen
(http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html am 14.07.2013). Die mit 70-75% am
häufigste auftretende Mutation der Mittel- und Nordeuropäer ist die Mutation ΔF508. In
Abbildung 3 ist schematisch dargestellt, dass durch die Deletion eines Basentripletts
(CTT) die Aminosäure Phenylalanin (F) an der Position 508 nicht vorhanden ist. Tritt dies
auf beiden Allelen auf, wird der Chloridionenkanal fehlgefaltet und durch
Kontrollmechanismen der Zellen abgebaut. Die verschiedenen Mutationen werden in
unterschiedliche Klassen unterteilt. Es gibt fünf Mutationsklassen, die je nach Defekt des
Chloridionenkanals und den Auswirkungen der Mutationen eingeteilt werden. Zu der
ersten Klasse zählen Mutationen, die durch nonsense-Mutationen zu einem früheren
Abbruch bei der Transkription führen [Witt, 2003]. Die bekannteste Mutation ΔF508 gehört
zu der zweiten Gruppe, der missense-Mutationen. Hier führt das Fehlen einer Aminosäure
zu einem fehlgefalteten Protein, welches durch zellautonome Kontrollsysteme wieder
abgebaut wird [Witt, 2003]. Bei der dritten und vierten Klasse wird zwar ein korrekt
gefaltetes Protein exprimiert, kann jedoch nach dem Einbau in die Membran nicht aktiviert
werden. Die fünfte und somit letzte Mutationsklasse hat einen instabilen CFTR-Kanal
durch alternatives Splicen zur Folge [Kulczycki et al., 2003].
6 Einleitung
Die Mutation des CFTR-Gens hat zur Folge, dass die Expression des Cl--Ionenkanals
gestört ist. Vorwiegend wird bei gesunden Menschen dieses Protein im Transportepithel
des respiratorischen Traktes exprimiert. Zu der gestörten Cl--Sekretion bei Mukoviszidose
Patienten herrscht zusätzlich eine Na+-Hyperabsorption. Durch die Na+-Hyperabsorption
entsteht ein erhöhter osmotischer Wassereinstrom in die Zelle und ein erhöhter visköser
Mukus. Am Mausmodell konnte von der Arbeitsgruppe um Mall gezeigt werden, dass die
starke Na+-Hyperabsorption zu den Symptomen der Atemwege eines Mukoviszidose
Patienten führt [Mall et al., 2004]. Der schematische Ablauf dieser beiden Defekte wird in
der folgenden Abbildung dargestellt.
Abbildung 3: Die ΔF508 Mutation
In der Abbildung soll der schematische Ablauf verdeutlicht werden, der bei der ΔF508 Mutation auftritt. Die ΔF508 Mutation liegt auf dem Chromosom 7 Abschnitt q31. Durch die Deletion eines Basentripletts (CTT) fehlt nach der Transkription und Translation die Aminosäure Phenylalanin (F) an Position 508. Ist dies auf beiden Allelen der Fall, wird der Chloridionenkanal falsch gefaltet abgebaut (verändert nach:www.springer.com/biomed/human+genetics/book/978-3-7985-1864-3 am 26.03.2013).
Die Aminosäure Phenylalanin (F)
an Position 508 ist nicht vorhanden
Deletion von CTT auf DNA Ebene
Abschnitt 7q31
CFTR-Gen
CFTR-Protein
Chromosom 7
Bei Deletion von CTT auf
beiden Genkopien ist der Chlorid-Ionenkanal
defekt
Einleitung 7
Der Zusammenhang von ENaC und CFTR wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Zum
einen haben Forschungsgruppen eine Abhängigkeit zwischen der gestörten Cl--Sekretion
und der Na+-Hyperabsorption entdeckt, indem sie in Xenopus laevis Oozyten, nach der
Expression beider Proteine, durch eine Aktivierung des wt-CFTR, eine Inhibierung des
Amilorid-sensitiven Na+-Strom über den ENaC nachweisen konnten [Mall et al., 1998].
Zum anderen wurde von der Arbeitsgruppe um Reddy ein erhöhter Amilorid-sensitiver
Na+-Strom bei der Aktivierung des CFTR gezeigt [Reddy et al., 1999]. Nicht nur in den
beiden aufgeführten Beispielen wird verdeutlicht wie umstritten das Zusammenwirken der
beiden Kanäle ist. So zeigte erstmals die Arbeitsgruppe um Stutts im Jahre 1995 an
MDCK-Zellen und 3T3-Fibroblasten, dass, wenn beide Ionenkanäle exprimiert werden ein
geringerer Amilorid-sensitiver Na+-Strom vorhanden ist, als in Zellen, ohne CFTR
Expression. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde geschlussfolgert, dass eine
inhibierende Wirkung des CFTR auf den ENaC stattfindet [Stutts et al., 1995]. In weiteren
Arbeiten an Xenopus laevis Oozyten wurde der Effekt wiederholt beobachtet [Briel et al.,
1998; Chabot et al., 1999; Hopf et al., 1999; König et al., 2001; Kunzelmann et al., 1997].
Abbildung 4: Schematische Abbildung des gestörten Ionentransportes bei Mukoviszidose
In der linken Zelle wird schematisch der Cl-- und Na
+-Transfer bei gesunden Menschen gezeigt.
Durch den CFTR werden Cl--Ionen vom Zellinneren ins äußere Gewebe transportiert.
Entgegengesetzt gelangen Na+-Ionen durch den ENaC ins Innere der Zelle. Aus osmotischen
Gründen folgt Wasser, sowohl den Cl--Ionen ins umgebene Gewebe, als auch den Na
+-Ionen in
die Zelle. In der rechten Zelle wird der Ionentransfer durch den CFTR und den ENaC bei Mukoviszidose-Erkrankten gezeigt. In diesem Fall ist der Cl
--Ionenkanal durch genetische Mutationen nicht in die
Zellmembran eingebaut. Deswegen können keine Cl--Ionen durch den CFTR in den
extrazellulären Raum gelangen. Zusätzlich kommt es zu einem verstärktem Einstrom von Na+-
Ionen über den ENaC ins Zellinnere, gefolgt von starkem Wassereinstrom in den intrazellulären Raum.
8 Einleitung
Aber auch der Gegenteilige Effekt wurde weiterhin beobachtet. So wurde am
Schweinmodell gezeigt, dass direkt nach der Geburt von CF-Schweinen keine erhöhte
Na+-Absorption beobachtet werden konnte [Chen et al., 2010]. Da in dieser Arbeit das
Hauptaugenmerk auf den ENaC gelegt wird, ist im nächsten Abschnitt dieser genauer
beschrieben.
1.3 ENaC (Epithelial Sodium Channel)
Bereits 1848 wurde von Emil Heinrich du Bois-Reymond beobachtet, dass an isolierter
Haut von Fröschen die innere Seite der Haut positiver geladen war als die äußere [du
Bois-Reymond, 1884]. Dies ließ auf einen Nettostrom von positiv geladenen Ionen über
die Haut von außen nach innen deuten. Dieser Hinweis auf den Nettostrom an der
Froschhaut wurde von dem dänischen Physiologen Hans Ussing in den 1950er und den
1960er Jahren aufgeklärt, indem die physiologische Funktion des ENaC in Epithelien
gezeigt wurde [Koefoed-Johnson und Ussing, 1958].
Erstmalig wurde der ENaC von der Schweizer Arbeitsgruppe um Bernard Rossier kloniert
und charakterisiert, was ein Meilenstein in der Erforschung des ENaC-Kanals und der
damit zusammenhängenden Mukoviszidose darstellt [Canessa et al., 1994b]. Der ENaC
spielt eine wichtige Rolle bei den Funktionen von Organen, wie der Niere, des Darms, der
Lunge oder den Drüsen. Der Kanal ist aber auch an verschiedenen Krankheiten wie z.B.
Bluthochdruck oder Lungenödemen beteiligt. Eine der bekanntesten Krankheiten ist die
erstmals 1963 als das autosomale Liddle-Syndrom, das eine Salz-sensitive
Bluthochdruckerkrankung darstellt, beschrieben. Bei dieser Krankheit liegen of-function-
Mutationen in den β- und γ-ENaC Untereinheiten (UE) vor [Goulet et al., 1998; Liddle et
al., 1963; Chang et al., 1996]. Auch bei Mukoviszidose spielt der ENaC eine wichtige
Rolle. So wurde an Mukoviszidose erkrankten Personen eine erhöhte Na+-Absorption
über den ENaC festgestellt [Chinet et al., 1994]. Dies hat maßgeblich Auswirkungen auf
die Ausbildung der Symptome bei Mukoviszidose durch die Erhöhung der Viskosität des
Mukus im Lungengewebe [Mall et al., 2004; Donaldson und Boucher, 2007].
ENaC ist ein spannungs-unabhängiger Amilorid-sensitiver Kationen-Kanal aus der Klasse
der ENaC-Degenerin-Protein (ENaC-Deg) Familie. Die zugehörigen Kanäle dieser Familie
werden in Invertebraten und Vertebraten exprimiert [Mano und Driscoll, 1999;
Kellenberger und Schild, 2002]. Weitere Proteine dieser Familie sind z.B. die Protonen-
aktiven Acid-sensing Ion Channels (ASICs). Diese Proteine sind in Neuronen des
zentralen und peripheren Nervensystems weit verbreitet. So sind diese unter anderem im
Einleitung 9
Nervensystem von Säuglingen lokalisiert und sind dort für die Detektion und Weiterleitung
sensorischer Information beteiligt [Kellenberger und Schild, 2002].
ENaC wird entlang des respiratorischen Traktes exprimiert, vom Epithel der Nase bis hin
zu den Alveoli [Farman et al., 1997]. Der Kanal wurde ausschließlich in der apikalen
Membran von Epithelzellen lokalisiert [Duc et al., 1994]. Über den ENaC, werden Na+-
Ionen über die apikale Membran in das Zellinnere transportiert, während sie aktiv über die
basolateral liegende Na+/K+-ATPase aus der Zelle heraus transportiert werden, um den
Natriumgradienten über die apikale Zellmembran aufrecht zu erhalten [Kellenberger und
Schild, 2002].
1.3.1 Molekulare Struktur des ENaC
Der ENaC wurde bis vor kurzem noch als ein hetero-multimerer Proteinkomplex
dargestellt, dessen Struktur drei homologe UE (α, β und γ) bilden. Bis zum Jahre 2007
wurde von einer Stöchiometrie α3β3γ3 oder α2βγ ausgegangen [Firsov et al., 1998; Kosari
et al., 1998; Snyder et al., 1998; Anantharam und Palmer, 2007]. Darüber hinaus wurde in
Oozyten des Xenopus leavis demonstriert, dass alleine durch die α-UE Amilorid-sensitiver
Na+-Strom gemessen werden konnte, wohingegen bei Kanälen, die nur aus einer β- oder
γ-UE bestehen kein Na+-Transport nachweisbar ist. Das bedeutet, dass die α-ENaC UE
als kanalporenbildende UE identifiziert wurde und die beiden anderen UE die
regulatorischen Einheiten bilden. Eine maximale Ausbeute des Amilorid-sensitiven Na+-
Stroms wurde mit der Konstellation von allen drei ENaC UE festgestellt [Canessa et al.,
1994b].
Aus der heutigen Literatur ist bekannt, dass in humanen Zellen mindestens vier homologe
Untereinheiten (α, β, γ und δ) des ENaC-Kanals exprimiert werden können. Eine
zusätzliche, nicht-humane ENaC UE, ε, wurde in Xenopus leavis gefunden [Jasti et al.,
2007]. In dieser Arbeit wird nicht genauer auf diese UE eingegangen. Die Expression der
δ-UE wurde bisher im Menschen im nicht-epithelialen und epithelialen Gewebe wie
Pankreas, Dickdarm und Lunge gezeigt [Ji et al., 2006]. Zudem wurde gezeigt, dass diese
UE im respiratorischen Epithel exprimiert wird [Bangel-Ruland et al., 2010]. Diese kann
wie die α-ENaC UE homomere Kanäle bilden, deren Na+-Ionenfluss durch die Bindung mit
den regulativen UE, β und γ, gesteigert werden kann [Waldmann et al., 1995;
Kellenberger und Schild, 2002]. Aus Röntgenstrukturanalysen des verwandten
Ionenkanals ASIC1 geht man bei der molekularen Struktur von ENaC von einem Trimer
aus [Jasti et al., 2007], welcher sich entweder aus α-, β- und γ-UE oder aus δ-, β- und γ-
10 Einleitung
UE bildet [Bhalla und Hallows, 2008]. Die Zusammensetzung der Kanäle ist abhängig
vom Gewebetyp und hat Auswirkungen auf den Amilorid-sensitiven Strom [Kellenberger
und Schild, 2002; Babini et al., 2003]. Die molekularen Strukturen der einzelnen humanen
ENaC UE sind ähnlich. Sie bestehen aus 600-700 Aminosäuren und besitzen zwei
hydrophobe, transmembrane Domänen (M1 und M2), die je einen α-helikalen Anteil und
eine β-Faltblatt-Struktur aufweisen [Garty und Palmer, 1997]. Sie besitzen kurze N- und
C-terminale Enden, welche ins Zellinnere reichen (siehe Abbildung 5). Die ENaC UE
haben zudem extrazelluläre Schleifen von etwa 50 kDa mit Phosphorylierungsstellen
[Alvarez de la Rosa et al., 2000; Bhalla und Hallows, 2008]. An den C-terminalen Enden
befinden sich PY-Motive. Diese Motive vermitteln eine Interaktion mit der in Abschnitt
1.3.2 vorkommenden Ubiquitin-Ligase Nedd4-2 [Goulet et al., 1998]. Die homologen
ENaC UE weisen zudem untereinander eine Sequenzhomologie von 30-40% auf und ihr
Molekulargewicht im glykosylierten Zustand liegt zwischen 80-100 kDa [Canessa et al.,
1994a; Renard et al., 1994; Snyder et al., 1994; Shimkets et al., 1998; Butterworth et al.,
2005; Bhalla und Hallows, 2008].
Der außen liegende Trichter des ENaC-Kanals ist negativ geladen und wird von allen drei
beteiligten ENaC UE gebildet. Durch die negative Ladung werden Kationen selektiv
angezogen [Sheng et al., 2001; Smith und Benos, 1991]. Dadurch, dass sich die Pore in
zytoplasmatischer Richtung verengt, werden nur die kleinsten positiv geladenen Ionen,
wie Na+, Li+ und K+, durch den Kanal gelassen [Palmer, 1999; Shimkets et al., 1997;
Sheng et al., 2001; Smith und Benos, 1991]. Die Pore ist selektiver für Na+- und Li+-Ionen
als für K+- Ionen (Permeabilität/Verhältnis: PLi/PNa > 1 und PNa/PK > 100) [Kellenberger et
al., 1999]. Die Bindung von Amilorid wird in der prä-M2-Domäne vermutet, die mit der M2-
Domäne die Pore bildet [Butterworth et al., 2005]. Durch ein bestimmtes
Membranpotential soll positiv geladenes Amilorid an diese Domäne binden und die
Schließung des Kanals bewirken [Garty und Palmer, 1997].
Die Gene der ENaC UE wurden auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert. Die α-UE
(SCNN1a) befindet sich auf dem Chromosom 12p13. Die ENaC UE β und γ liegen auf
dem Chromosom 16 p12.2-p12.1 und auf Chromosom 16q12. Die beiden UE sind sehr
nah beieinander, ca. 400 kb und sind vermutlich aus Genduplikationen entstanden [Voilley
et al., 1995]. Die δ-UE wurde auf dem Chromosom 1p36.3-p36.2 lokalisiert
(www.ncbi.nlm.nhi.gov). In Abbildung 5 ist ein schematischer Aufbau des ENaC-Kanals,
nach Kristallstrukturanalysen des ASIC1, dargestellt, da ein sehr hoher
Verwandtschaftsgrad der beiden Proteine vorhanden ist.
Einleitung 11
1.3.2 Regulation von ENaC
Die ENaC-Aktivität wird durch Aldosteron und viele andere Faktoren, wie Hormone (z.B.
Vasopressin, Angiotensin II, Insulin) [Rossier et al., 1994; Shimkets et al., 1998] [Corvol et
al., 1999], extrazelluläre Proteasen (z.B. Kallikrein, channel-activating protease -1 (Cap1))
[Vuagniaux et al., 2000], intra- und extrazelluläre Ionenkonzentrationen (z.B. Na+ oder
Ca2+), Osmolarität und die Durchflussgeschwindigkeit, reguliert [Kellenberger und Schild,
2002]. Es wird angenommen, dass ENaC im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert
und mit einer gewissen Grundaktivität in den Golgi-Apparat transportiert wird.
Hauptsächlich durch die Proprotein-Konvertase Furin, welche im Golgi-Apparat lokalisiert
wurde, wird die α- und γ- ENaC UE proteolytisch gespalten und die Aktivität der α-ENaC
UE um ca. 85% und die der γ-ENaC UE um ca. 90% gesteigert. Die Aktivität des ENaC-
Kanals kann auf gleiche Weise durch andere Proteasen wie Trypsin und Cap1 gesteigert
werden [Kleyman et al., 2009].
Abbildung 5: Schematische Struktur des epithelialen Na+-Kanals ENaC
Der ENaC ist aus drei homologen UE (hier α, β, γ), die eine zentrale Pore bilden, aufgebaut. Die hier abgebildeten Transmembran-Domänen M1 und M2 liegen in der Membran. Die C-terminalen Enden mit dem PY-Motiv Anteil und die N-terminalen Enden befinden sich im Zytosol. Die hier abgebildete schematische Darstellung des ENaC-Kanals ist von der kristallographischen Analyse des bekannten Proteins ASIC1 abgeleitet (verändert nach: http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n12/images/nrn2257-i1.jpg am 19.07.2013).
M1 M2
PY
PY
PY
C
C
C N
N
N
12 Einleitung
Da in dieser Arbeit mittels eines Glucocorticoids die Expression verschiedener α- und δ-
ENaC UE gesteigert werden soll, wird das Renin-Angiotensin-Aldosteron System (RAAS),
welches am besten in Nierenepithel untersucht ist, genauer erläutert [Beutler et al., 2003].
Wichtig für die hormonelle Steuerung des ENaC-Kanals in diesem System sind unter
Anderen folgende Rezeptoren: Mineralcorticoidrezeptor (MR) und der Vasopressin-
Rezeptor (V2R). Die Regulation der Expression von ENaC wird durch Aldosteron und
Vasopressin generiert (siehe Abbildung 6). Das Mineralcorticoid Aldosteron stimuliert
ENaC in verschiedenen Geweben, indem es die Expression der unterschiedlichen ENaC
UE induziert. Zudem beeinflusst Aldosteron das Niveau der in der apikalen Membran
verbreiteten ENaC UE [Verrey, 1999]. Durch Angiotensin II wird Aldosteron in der
Nebenniere und Vasopressin im Hypophysenhinterlappen ausgeschüttet. Die Bindung
von Aldosteron an dem MR bildet einen dimeren Ligand-Rezeptor-Komplex, der in den
Zellkern gelangt und dort an empfängliche Elemente der DNA bindet. Dies führt sowohl
zur Induktion einer Reihe von spezifischen Transkripten (aldosterone-induced transcripts,
AIT), wie dem ENaC und der Natrium-Kalium-ATPase oder der SGK1
(serum/glucocorticoid regulated kinase 1), als auch zur Unterdrückung einer Anzahl von
Transkripten (aldosterone-repressed transcripts, ART). Vasopressin bindet an den G-
Protein-gekoppelten Rezeptor vasopressin type 2 receptor (V2R), der zu einer Aktivierung
einer nachgeschalteten Proteinkinase A (PKA) führt. Sowohl SGK1 als auch PKA
inaktivieren die Ubiquitin-Ligase Nedd4-2 durch Phosphorylierung [Snyder et al., 2004].
Dies führt zu einer Erhaltung von aktiven ENaC-Kanälen auf der Membran. Nedd4-2
ubiquitiniert im aktiven Zustand ENaC, indem eine Interaktion der WW-Domäne mit dem
PY-Motiv des zytoplasmatischen C-Terminus der ENaC UE stattfindet. Daraufhin wird
ENaC durch Endocytose ins Zytoplasma überführt und anschließend degradiert [Staub et
al., 1996]. Durch die Ubiquitin-specific protease 2-45 (USP2-45), welche unabhängig von
der Ausschüttung von Aldosteron und Vasopressin exprimiert wird, wird der epitheliale
Natriumkanal deubiquitiniert, durch extrazelluläre Vesikel recycelt und wieder in die
Membran eingebaut [Fakitsas et al., 2007; Zhou und Snyder, 2009; Schild, 2010]. Da bei
Mukoviszidose überwiegend das respiratorische Epithel betroffen ist und dort
hauptsächlich der Glucocorticoidrezeptor vorhanden ist, wird im nächsten Abschnitt
genauer auf Glucocorticoide eingegangen.
Einleitung 13
1.4 Glucocorticoide
Glucocorticoide gehören zu der Gruppe der Steroidhormone. Sie besitzen eine
antiinflammatorische und immunmodulatorische Wirkung, die hauptsächlich genomische
Mechanismen regulieren. Im Menschen modulieren sie diese um rund 10% [Buckingham,
2006]. Für die normale Entwicklung und Wachstum, die Stressreaktion, sowie für die
Regulation des gesamten Immunsystems sind sie unverzichtbar. Sie sind in der heutigen
Medizin zu unverzichtbaren Wirkstoffen geworden. Eines der bekanntesten
Glucocorticoide ist das Cortison, welches 1936 aus der Nebenniere isoliert und von
Hench 1949 zur Behandlung bei rheumatoider Arthritis eingesetzt wurde [Reichstein,
1936; Wintersteiner, 1936; Hench et al., 1949; Hench et al., 1950]. Zunächst galten
Glucocorticoide in der Bevölkerung als ein enormer Gewinn, jedoch wurde nach kürzester
Abbildung 6: Regulation der ENaC Expression durch Aldosteron und Vasopressin
In der Abbildung wird schematisch die Wirkung von Aldosteron und Vasopressin auf die ENaC Expression dargestellt. Durch die Bindung von Aldosteron an den MR wird die Transkription der Zielgene wie z.B. ENaC, Na
+/K
+-ATPase oder SGK1 erhöht. Durch die Erhöhung der Expression von
SGK1 im Zusammenspiel mit PKA, das durch die Bindung von Vasopressin an den V2R freigesetzt wird, wird durch Phosphorylierung Nedd4-2 inhibiert. Somit ist die Endozytose des ENaC-Kanals blockiert und der Na
+-Strom über den ENaC erhöht. Die ENaC-Kanäle, die durch Endozytose in
Vesikeln lagern, können durch USP2-45 deubiquitiniert und in die Membran eingebaut werden (verändert nach: Schild 2010).
14 Einleitung
Zeit festgestellt, dass die Einnahme von Glucocorticoiden eine Reihe von
Nebenwirkungen aufwies. Aus diesem Grund wird ständig weiter nach Alternativen
geforscht.
Glucocorticoide bestehen aus 21 Kohlenstoffatomen und werden in der Nebenniere
synthetisiert [Sapolsky et al., 2000]. Sie können an zwei verschiedene Corticoidrezeptoren
binden. Zum einen an den Mineralcorticoidrezeptor (MR) und zum anderen an den
Glucocorticoidrezeptor (GR). Der Unterschied besteht darin, dass Glucocorticoide, wie
Dexamethason, an beide Rezeptoren binden können und Mineralcorticoide, wie das
Aldosteron, nur an dem MR [Reul et al., 2000; Kellendonk et al., 2002]. Die Affinität der
beiden Corticoidrezeptoren wird durch die Höhe der Konzentration reguliert. Bei dem GR
und dem MR liegen die Ligandenbindungen als ein Multiproteinkomplex vor. Durch die
Bindung eines Glucocorticoids wird der Proteinkomplex abgespalten und das
Glucocorticoid kann im Zellkern die Transkription der Zielgene erhöhen. Die natürliche
Ausschüttung von Steroidhormonen wird durch Stresssituationen hervorgerufen
[Buttgereit, 2000; Gold et al., 2001; Buttgereit und Scheffold, 2002]. In der folgenden
Abbildung werden die Strukturen der Steroidhormone Aldosteron und Dexamethason
gezeigt.
Abbildung 7: Strukturformel von Aldosteron und Dexamethason
Auf der linken Seite A ist das Mineralcorticoid Aldosteron und auf der rechten Seite B das Glucocorticoid Dexamethason abgebildet. Beide Corticoide sind aus 21 C-Atomen aufgebaut und gehören zu der Gruppe der Steroidhormone. Sie ähneln sich in ihren Strukturformeln. Die Ähnlichkeit lässt auf einen analogen physiologischen Effekt schließen (verändert nach: www.freebase.com am 07.14.2013).
In Bezug auf die Mukoviszidoseforschung wurde das Mineralcorticoid Aldosteron getestet.
Forschungen zeigten, dass die Zugabe von Aldosteron in Nierenzellen der Ratte zu einer
erhöhten α-ENaC UE Expression jedoch nicht zu erhöhten β- und γ-ENaC UE Expression
führte [Masilamani et al., 1999]. Die Arbeitsgruppe um Oberleithner fand zudem eine
A) B)
Einleitung 15
erhöhte Expression des ENaC-Kanals durch Anschwellen der mit Aldosteron behandelten
Zellen heraus. Dies resultierte aus einem veränderten Salz- und Wasserhaushalt
[Oberleithner et al., 2003]. In Versuchen an Ratten und Mäusen wurde gezeigt, dass das
Mineralcorticoid am meisten in der Niere exprimiert wird [Masilamani et al., 1999; Schulz-
Baldes et al., 2001]. Da bei Mukoviszidose das Hauptaugenmerk auf der Lunge liegt,
wurde untersucht, inwieweit Aldosteron eine Wirkung auf die Expression von ENaC im
respiratorischen Epithel besitzt. 1994 wurde gezeigt, dass in der Lunge hauptsächlich
Glucocorticoide den ENaC regulieren. Um eine ähnliche Reaktion wie in der Niere zu
erhalten, muss Aldosteron in höheren Konzentrationen eingesetzt werden [Champigny et
al., 1994]. Aus diesem Grund wurde in der Mukoviszidoseforschung das Glucocorticoid
Dexamethason zur Untersuchung des ENaC-Kanals verwendet. Dexamethason ist ein
synthetisch hergestelltes Glucocorticoid, welches eine 30fach höhere Wirkung als das
körpereigene Kortison besitzt. Es wirkt im Zusammenspiel mit einem
Glucocorticoidrezeptor, welcher mit dem Heat-Shock-Protein (HSP90) verbunden ist.
Bindet das Dexamethason an den GR, spaltet sich das HSP90 ab und der Rezeptor-
Ligand-Komplex wandert in den Zellkern. Im Zellkern bindet der Komplex an die
Glucocorticoid-responsive Elemente der DNA und erhöht die Transkription der Zielgene
[Beato et al., 1995; Karin, 1998; Hayashi et al., 2004]. Die Auswirkungen von
Dexamethason in H441 Lungenzellen und in alveolaren Rattenepithelzellen zeigten, dass
die Expression von α-ENaC mRNA bis auf das Fünffache anstieg [Sayegh et al., 1999;
Dagenais et al., 2001]. Zudem konnte die Arbeitsgruppe um Degenais die Stimulation von
den β- und γ-ENaC UE durch Dexamethason nachweisen [Dagenais et al., 2001]. In
Studien von der Arbeitsgruppe um Rubenstein im Jahre 2010 konnte in den humanen
Bronchialepithelzellen, CFBE41o-, gezeigt werden, dass eine 24-stündige Inkubation mit
1 µM Dexamethason eine Auswirkung auf die funktionale Expression des ENaC-Kanals
besitzt, indem der Na+-Strom über diesen erhöht war [Rubenstein et al., 2010]. Da das
Resultat der Untersuchungen an verschiedenen Modellsystemen der Etablierung neuer
Therapiemöglichkeiten in der Mukoviszidoseforschung dient, wird im nächsten Abschnitt
näher auf diese Therapieansätze für die Behandlung von Mukoviszidose eingegangen.
1.5 Therapiemöglichkeiten bei Mukoviszidose
Seit der Entdeckung des CFTR-Gens wird mittels verschiedener Methoden versucht, ein
Medikament, das gegen die Ursache dieser Krankheit wirkt, zu finden. Bisherige
Forschungen führten jedoch lediglich zu symptomlindernden Maßnahmen wie z.B. der
Inhalation schleimlösender Medikamente oder der Einnahme von Antibiotika [Touw et al.,
1905]. Die dauerhafte Einnahme von Antibiotika, als auch zum Teil von
16 Einleitung
Entzündungshemmern, wirkt dem Bakterienbefall und Entzündungen der Atemwege
entgegen. Weitere Maßnahmen sind die Verabreichung von Pankreasenzymen,
Drainagen und als letzten Schritt eine Lungentransplantation [Pletz et al., 2010]. Versuche
zahlreicher gentherapeutischer Ansätze hatten bis heute, zum Beispiel aufgrund von
Immunreaktionen, keinen Erfolg [Yang et al., 1995]. In der Arbeitsgruppe um Weber
versucht man, eine sogenannte „Transkript-Therapie“ mit CFTR-mRNA statt einer
Gentherapie zu entwickeln [Bangel-Ruland et al., 2013]. Ein großer Vorteil der
Transfektion mit mRNA ist das Umgehen der Zellkernhülle, die bei der Verwendung von
DNA eine große Barriere darstellt. Zudem werden durch Verzicht auf Fremd-DNA und
Viruspartikel die negativen Immunreaktionen umgangen. Weiterhin arbeitete die
Arbeitsgruppe um Weber im Jahre 2012 an einer Studie, in der die ΔF508 Mutation des
CFTR mittels Sildenafil (Phosphodiesterase-5 Inhibitor) korrigiert wird. Es wurde bestätigt,
dass Sildenafil nicht nur als Korrektor des Transportdefektes dient, sondern auch als
Potentiator der CFTR-Aktivität agiert. Da Sildenafil durch diese beiden Wirkungen effizient
zur Linderung von Mukoviszidosesymptomen beitragen kann, wäre diese Substanz eine
sehr interessante Therapiemöglichkeit gewesen. Da aber eine zu große Menge des
Stoffes für Therapiezwecke eingesetzt werden müsste und die Substanz ebenfalls
blutdrucksenkend wirkt, ist diese Therapiemöglichkeit für diese Krankheit nicht
durchführbar [Leier et al., 2012].
In den ersten Jahren, nachdem das CFTR-Gen entdeckt wurde, ist das Hauptaugenmerk
auf den defekten Chloridionenkanal gelegt worden. Mittlerweile weiß man, dass auch die
Na+-Hyperabsorption über den ENaC für die CF-Symptomatik verantwortlich ist [Mall et
al., 2004; Bangel et al., 2008]. Aus diesem Grund wird nicht nur an der Wiederherstellung
des CFTR sondern auch an der Reduktion der Na+-Hyperabsorption geforscht. Eine der
bekanntesten Therapien um die Na+-Hyperabsorption über den ENaC zu verringern, ist
der Einsatz des Diuretikums Amilorid, welches den ENaC an der außen liegenden Pore
blockiert [Hofmann et al., 1998]. In zahlreichen Studien konnte ein Kurzzeiteffekt durch
Inhalation des Diuretikums Amilord festgestellt werden. In diesen Studien wurde unter
anderem eine reduzierte transepitheliale Potentialdifferenz am respiratorischen Epithel
und zum Teil auch eine verbesserte Lungenfunktion festgestellt [Reinhardt et al., 2001].
Eine weitere Therapiemöglichkeit wurde im Jahre 2009 von der Arbeitsgruppe um Weber
veröffentlicht, bei der durch die Applikation von Antisense-Oligonukleotiden (AON) die
Expression des ENaC-Kanals durch Abbruch der Translation verhindert wird [Sobczak et
al., 2009]. Die AON bestehen aus 16 Basenpaaren. Diese sind synthetische und
einzelsträngige DNA-Moleküle. AON sind komplementär zu den ENaC-kodierenden
mRNA-Motiven. Durch die Bindung der komplementären AON an die ENaC-mRNA wird
Einleitung 17
die Expression des ENaC-Kanals unterdrückt. In Versuchen an Nasenepithelzellen konnte
von Sobczak et al. eine 75%ige Inhibition der Expression des ENaC-Kanals erreicht
werden [Sobczak et al., 2009]. Einer der Vorteile dieser Therapiemöglichkeit liegt darin,
dass die maximale Wirkungsdauer 72 Stunden beträgt [Sobczak et al., 2010]. Eine
ähnliche Möglichkeit Mukoviszidose zu behandeln untersuchte die Firma (GSK) in
Kooperation mit anderen Arbeitsgruppen im Jahre 2013. Hierzu wurde die Expression von
α-ENaC mittels siRNA (small-interfering RNA) inhibiert. Durch das Einbringen der siRNA
in humane Nasenepithelzellen wurde die Expression der α-ENaC UE für über 72 Stunden
reduziert. Dies hatte eine Verringerung des Amilorid-sensitiven Na+-Stroms um 69% zur
Folge. Dementsprechend wirkt die eingebrachte siRNA als potentieller Inhibitor auf die
funktionale Expression des ENaC-Kanals ein [Clark et al., 2013]. Für die hier
angesprochenen Therapiemöglichkeiten sind verschiedene Modellsysteme unverzichtbar.
So sollen in dieser Arbeit zwei in der CF-Forschung etablierte Zelllinien, CFBE41o- und
16HBE14o-, einem CF-nahem Systemmodell noch näher gebracht werden.
18 Einleitung
1.6 Ziel der Arbeit
Obwohl das Verständnis für die Krankheit Mukoviszidose seit der Identifizierung des
CFTR-Gens 1989 weit vorangeschritten ist, konnte die Krankheit noch nicht geheilt
werden. Für die Grundlagenforschung ist es zwingend erforderlich möglichst
physiologisch und pathologisch nahe Versuchsmodelle zu etablieren. Neben Tiermodellen
sind immortalisierte Zelllinien, sowie primäre Zellen das Mittel der Wahl zur
grundlegenden Erforschung der defekten Ionentransportvorgänge bei Mukoviszidose.
In der vorliegenden Arbeit werden zu diesem Zweck die humanen bronchialen
Epithelzelllinien CFBE41o- und 16HBE14o- verwendet. Die CFBE41o--Zellen sind
immortalisierte Zellen, die von Bronchialepithelzellen eines einjährigen Mukoviszidose-
Patienten kultiviert wurden und sich besonders gut für die Mukoviszidoseforschung
eignen, da die Zellen polarisierte Monolayer bilden. Die Zellen weisen den genetischen
Defekt ΔF508 homozygot auf [Gruenert et al., 2004; Ehrhardt et al., 2006]. Die
16HBE14o--Zelllinie wurden von einem Herz-Lungen-Transplantat kultiviert und spiegelt
die Wildtyp (wt)-Situation wieder [Cozens et al., 1994]. Bisher konnte in funktionellen
Studien jedoch keine stabile Amilorid-sensitive Na+-Absorption in diesen Zelllinien
nachgewiesen werden, obwohl bereits gezeigt wurde, dass die ENaC-UE auf mRNA und
Proteinebene exprimiert werden [Rubenstein et al., 2010; Lemke, 2012].
Aus der Literatur ist bekannt, dass in Epithelzellen hauptsächlich die α-ENaC UE
exprimiert wird, welche meistens funktionale Kanäle mit der β- und γ-UE ausbildet
[Canessa et al., 1994b; Li et al., 1995]. Durch Untersuchungen der Arbeitsgruppe um
Weber wurde festgestellt, dass auch die δ-UE des ENaC-Kanals in Nasenepithelzellen
eine wichtige Rolle bei der Bildung dieses Kanalproteins spielt. Durch unterschiedliche
Methoden konnte in humanen Nasenepithelzellen dargestellt werden, dass die δ-ENaC
UE hier ca. 50% des Amilorid-sensitiven Na+-Transportes übernimmt [Bangel-Ruland et
al., 2010]. Zudem konnte bereits gezeigt werden, dass das synthetische Glucocorticoid
Dexamethason (1 µM) die funktionale Expression, nach einer 24 h Inkubation mit
Dexamethason, um ca. 50% steigern konnte. Außerdem konnte in der Arbeit die
Proteinexpression proportional zu der Inkubationszeit gesteigert werden [Lemke, 2012].
Auch in anderen Arbeitsgruppen konnte eine Erhöhung der funktionalen Expression durch
Dexamethason (1 µM) ermittelt werden. So zeigte die Arbeitsgruppe um Rubenstein eine
Erhöhung der funktionalen Expression der inkubierten CFBE41o--Zellen, aber keine
Auswirkungen auf die Proteinexpression [Rubenstein et al., 2010]. Ein Nachweis für die
Ergebnisse ist bisher noch nicht erfolgt, so dass in dieser Arbeit sowohl die funktionale
Expression als auch die Proteinexpression überprüft und erhöht werden soll. Zudem soll
Einleitung 19
durch Kanalblocker die unterschiedliche Wirkung des Dexamethasons auf die
verschiedenen ENaC UE, α und δ, untersucht werden. Für diesen Nachweis werden die
Zellen über unterschiedlichen Inkubationszeiten mit Dexamethason inkubiert und
anschließend elektrophysiologisch in einer modifizierten Ussing-Kammer untersucht.
Auch Proteinbiochemisch, soll die Auswirkung des Dexamethasons auf die Expression
der einzelnen ENaC UE, α und δ, untersucht werden. Die mit Dexamethason stimulierte
Proteinexpression soll mittels Western Blot Analyse mit spezifisch gegen α-ENaC UE und
δ-ENaC UE gerichteten Antikörpern untersucht werden.
Ziel der Masterarbeit ist es nun, mit Hilfe des Dexamethasons humane Epithelzellen der
CFBE41o--und der 16HBE14o--Zelllinien so zu stimulieren, dass die α- und δ-ENaC
Expression gesteigert wird, um festzustellen, ob die beiden Zelllinien anschließend als
CF-nahes Systemmodell dienen können.
20 Material
2 Material
2.1 Chemikalien und Lösungen
Die verwendeten Chemikalien, die für das Ansetzen der Lösungen verwendet wurden,
werden in den Anlagen aufgeführt. Soweit nicht anders vermerkt wurden alle Lösungen
mit Millipore-H2O angesetzt und bei RT gelagert. Die pH-Werte wurden mit verdünnter
HCL bzw. verdünnter NaOH oder Tris eingestellt.
2.2 Lösungen für die Zellkultur
Tabelle 1: Verwendetes Beschichtungsmedium
Beschichtungsmedium
44 ml LHC Basalmedium
65 µl Rinderserumalbumin (BSA, 7,5%ig)
1500 µl Rinderkollagen Typ I (1 mg/ ml)
500 µl Humanes Fibronektin (1 mg/ ml)
3935 µl Millipore-H2O (autoklaviert)
Tabelle 2: Verwendetes Medium und Waschlösung
Kulturmedium
10% (v/v) Fötales Kälberserum
1% (v/v) 100x L-Glutamin (Endkonzentration)
1% (v/v) Penicillin (10.000 v/ ml)/ Streptomycin (10.000 µg/ ml)
ad 250 ml Minimum Essential Medium (MEM)
1 x PBS
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10,2 mM Na2HPO4 * H2O
1,8 mM KH2PO4
ad 1000 ml Millipore-H2O
autoklavieren
Material 21
Tabelle 3: Verwendetes Einfriermedium
Einfriermedium
50% (v/v) Fötales Kälberserum
10% (v/v) Demethylsulfoxid (DMSO)
ad Endvolumen mit Minimum Essential Medium (MEM)+ Zusätze (Kulturmedium)
2.3 Lösungen für den Mykoplasmentest
Die Lösungen für den BCA-Test sind dem verwendeten KIT, AG-aliquoted Mycoplasma
Detection Kit for conventional PCR von Venor® GeM Advance, zu entnehmen.
10 x TBE Puffer (pH 8,3)
0,9 M Tris
0,9 M Borsäure
20 mM EDTA
1,5%iges Agarosegel
750 mg Agarose
50 ml 0,5 x TBE-Puffer
1,25 µl Ethidiumbromid
22 Material
2.4 Lösungen für die Elektrophysiologie
Tabelle 4: Verwendete Ringerlösungen und Diuretika
1 x Zellkulturringer pH 7,3
130 mM NaCl
5 mM KCl
1 mM CaCl2
2 mM MgCl2
5 mM Glukose
10 mM HEPES
sterilfiltrieren
1 x Na+-freier Zellkulturringer pH 7,3
130 mM TMA
5 mM KCl
1 mM CaCl2
2 mM MgCl2
5 mM Glukose
10 mM HEPES
sterilfiltrieren
Amilorid 10 mM Amilorid (Stocklösung)
100 µM in 1 x Zellkulturringer
2.5 Lösungen für die Protein Analyse
Tabelle 5: Verwendete Lösungen für die Proteinisolation
2%iger Tritonlysispuffer + PIC
Tris 1 mM
NaCl 15 mM
EDTA 0,2 mM
Triton X-100 2%
1% PIC (wird vor gebrauch hinzugegeben)
Material 23
Tabelle 6: Verwendete Lösungen für die Gelelektrophorese
4 x Proben Puffer
0,32 M Tris HCl
40% Glycerin
8% SDS
10% DTT (1M) frisch vor Gebrauch hinzugegeben
0,04% Bromphenolblau
4 mM EDTA
Lagerung bei RT
Sammelgel
1,3 ml 30% Acrylamid
2,5 ml Sammelgelpuffer
6,2 ml Millipore-H2O
-10 min entgasen-
100 μl 10% APS
10 μl TEMED
Sammelgelpuffer 0,5 M Tris
0,4% SDS
Trenngel 7,5% (für den Ansatz von drei Gelen)
3,75 ml 30% Acrylamid
3,75 ml Trenngelpuffer
7,4 ml Millipore-H2O
-10 min entgasen-
100 μl 10% APS
5 μl TEMED
Trenngelpuffer 1,5 M Tris
0,4%SDS
SDS-Laufpuffer
23 mM Tris
190 mM Glycerin
0,2% SDS
24 Material
Tabelle 7: Verwendete Lösungen und Materialien für die Western Blot Analyse
PVDF Membran Roti®-PVDF (Roth AG, Arlesheim, Schweiz)
Transferpuffer pH 8,3
48 mM Tris-HCl
39 mM Glycerin
10 % Methanol
Filterpapier A. Hartenstein, Würzburg, Deutschland
Tabelle 8: Verwendete Lösung zum Strippen einer PVDF-Membran
Natronlauge 0,2 M NaOH
Tabelle 9: Verwendete Färbe- und Entfärbemittel für das SDS-Gel
CoomassieBrillantBlueTM-Färbelösung
0,2 % (w/v) Coomassie-Brilliant-Blue R-250
10 % (v/v) Essigsäure
10% (v/v) Methanol
Lösung lichtgeschützt lagern
Coomassie-Entfärbelösung 10 % (v/v) Essigsäure
30 % (v/v) Methanol
Tabelle 10: Verwendete Färbe- und Entfärbemittel für die PVDF-Membran
Coomassie Brillant BlueTM-Färbelösung
0,075 % (w/v) Coomassie-Brilliant-Blau R-250
100 ml Methanol
Lösung lichtgeschützt lagern
ad 250 ml Minimum Essential Medium (MEM)
Coomassie-Entfärbelösung
40 % Ethanol
10 % Essigsäure
50 % Millipore-H2O
Material 25
Tabelle 11: Verwendete Lösungen für die Antikörperbehandlung
10 x TBS Waschpuffer Kulturmedium
10 mM TRIS
1,5 mM NaCl
ad 1000 ml Millipore-H2O
TBST Waschpuffer
100 ml 10 x TBS
500 µl Tween 20 (0,05 %)
ad 1000 ml Millipore-H2O
5% Blockpuffer in 1 x TBST 5% Magermilchpulver in 1 x TBST
1% Blockpuffer in 1 x TBST 1% Magermilchpulver in 1 x TBST
2.5.1 Lösungen für den Bicinchoninsäuretest (BCA-Test)
Die Lösungen für den BCA-Test sind dem verwendeten KIT, Pierce® BCA Protein Assay
Kit von Thermo Scientific Inc. (Rockford, Illinois, USA), zu entnehmen.
2.5.2 Detektion durch Enhanced Chemilumineszenz (ECL)
Die Lösungen für die Detektion sind dem KIT, Super Signal® West Pico Chemiluminescent
Substrat, zu entnehmen.
26 Methoden
3 Methoden
In der vorliegenden Arbeit soll, nach Inkubation mit Dexamethason der CFBE41o-- und
16HBE14o--Zellen, die funktionale Expression als auch die Proteinexpression der α- und
δ-ENaC UE untersucht werden. Die funktionale Expression wurde mittels einer
modifizierten Ussing-Kammer gemessen. Die Proteinexpression wurde mit der Western
Blot Analyse ermittelt. Im folgenden Teil der Arbeit werden die angewandten Methoden für
die Kultivierung, die elektrophysiologischen Messungen an der Ussing-Kammer und die
biochemischen Untersuchungen der verwendeten Zelllinien beschrieben. Wurden die
Versuche nach externen Versuchsprotokollen durchgeführt, wird auf diese verwiesen. Alle
verwendeten Materialen, Geräte, Kits und Antikörper sind den Anlagen zu entnehmen.
3.1 Zellkultur
Die verwendeten bronchialen Epithelzellen wurden in einem Inkubator bei 37°C in, 5%
CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit gelagert. Die Methoden in der Zellkultur wurden unter
sterilen Bedingungen durchgeführt, um eine Kontamination mit Bakterien zu vermeiden.
Hierzu diente eine Sterilbank, in der die bronchialen Epithelzellen behandelt wurden. Um
eine Kontamination mit anderen Zelllinien auszuschließen, wurde die Arbeitsfläche in der
Sterilbank vor und nach Gebrauch mit Bacillol sterilisiert. Die Zusammensetzungen der
verwendeten Lösungen sind dem Materialteil zu entnehmen.
3.1.1 Humane Zelllinien als Mukoviszidosemodelle
Humane Zelllinien werden häufig in der Mukovizidoseforschung benutzt, um
Regulationsmechanismen in unterschiedlichen Geweben zu untersuchen. Hierbei können
verschiedene Aktivatoren, wie z.B. Dexamethason, oder Inhibitoren, wie z.B. Amilorid,
getestet werden. Einige Zelllinien besitzen die Fähigkeit polarisierte Monolayer
auszubilden. Diese können mit elektrophysiologischen Methoden mittels Ussing-Kammer
untersucht werden. Die Aktivierung oder Inhibierung kann auch mittels
proteinbiochemischen Methoden, wie der Western Blot Analyse, nachgewiesen werden.
Der Vorteil humaner Zelllinien gegenüber Tiermodellen ist zunächst die einfache und
kostengünstigere Versorgung der Zellen. Zusätzlich stammen die Zelllinien aus
unterschiedlichen Organen des Menschen und sind als Modellsystem der Symptomatik
Methoden 27
der Krankheit näher als Tierorganismen. Primärzelllinien sind in der
Mukoviszidoseforschung noch besser geeignet als humane Zelllinien. Jedoch sind diese
nur begrenzt verfügbar, weshalb viele Zelllinien von erkrankten Patienten, z.B. die
CFBE41o--Zelllinie, oder von gesunden Patienten, wie z.B. die 16HBE14o--Zelllinie,
generiert wurden.
Die CFBE41o--Zelllinie wurde von der Arbeitsgruppe um Gruenert generiert und 2004
beschrieben [Gruenert et al., 2004]. Die Zellen wurden aus Bronchialepithelzellen eines
einjährigen CF-Patienten gewonnen. Über ein replikationskompetentes pSVori-Plasmid
mit Simian-Virus (SV-40 Virus) Antigen wurden die Zellen transformiert und immortalisiert
[Gruenert et al., 2004; Ehrhardt et al., 2006]. Die Zellen weisen die bei CF am häufigsten
auftretende ΔF508 Mutation homozygot auf und sind eine in der CF-Forschung etablierte
Zelllinie [Ehrhardt et al., 2006]. Durch die morphologischen und physiologischen
Eigenschaften, wie die Bildung von polarisierten Monolayer und tight junctions wird ein
transepithelialer Widerstand von 100-500 Ω bei Messungen in der Ussing-Kammer
erreicht [Gruenert et al., 2004].
Die Zelllinie 16HBE14o- wurde wie die CFBE41o--Zellen von der Arbeitsgruppe um
Gruenert generiert [Cozens et al., 1994]. Die Zellen wurden von bronchialen Epithelzellen
eines Herz-Lungen-Transplantats gewonnen. Wie die CFBE41o--Zellen sind diese über
ein replikationskompetentes pSVori-Plasmid mit einem SV-40 Virus Antigen transformiert
und immortalisiert worden. Die 16HBE14o--Zellen sind in der CF-Forschung eine
etablierte Zelllinie, die als Kontrollzelllinie zu der CFBE41o--Zelllinie dient, da diese Zellen
gesunden Bronchialepithelzellen entsprechen und keinen defekten CFTR-Kanal
aufweisen [Cozens et al., 1994]. Auch diese Zellen bilden polarisierten Monolayer und
tight juncions aus, wodurch ein transepithelialer Widerstand von 200-1000 Ω bei den
Ussing-Kammer Messungen entsteht [Gruenert et al., 2004].
3.1.2 Beschichten der Zellkulturflaschen
Um eine bessere Adhäsion der Zellen zu erlangen, wurden sowohl 75 cm2 (T-75) und 25
cm2 (T-25) Zellkulturflaschen, als auch 0,33 cm2 Filter mit einem Beschichtungsmedium
(siehe Materialteil), das 1% Fibronektin und 3% Kollagen beinhaltet, beschichtet.
Fibronektin ist ein hochmolekulares Glykoprotein der extrazellulären Matrix, welches an
Kollagen bindet und zur Förderung der Zellmigration und -adhäsion dient [Ruoslahti et al.,
1979]. Kollagen ist ein Strukturprotein, das hauptsächlich im Bindegewebe vorkommt.
Zusätzlich zu dem verbesserten Wachstum und der Adhäsion der Zellen wird das
28 Methoden
einschichtige Wachstum der Zellen gefördert. Bei dem Beschichten der Flaschen wurden
ca. 1-2 ml (T-25) und ca. 2-3 ml (T-75) Beschichtungsmedium verwendet. Der Boden
musste vollständig benetzt sein. Danach wurde das überflüssige Medium wieder
abgenommen. Die frisch beschichtete Zellkulturflasche wurde für 2 h bei 37°C oder über
Nacht (ü.N.) bei RT unter der Sterilbank inkubiert. Die Filter wurden mit ca. 300 µl
Beschichtungsmedium auf die gleiche Weise beschichtet.
3.1.3 Kultivierung und Versorgung der Zellen
Um bei den Bronchialepithelzellen ein optimales Wachstum sicherzustellen, wurden die
Zellen auf die zuvor beschichteten T-25 und T-75 Zellkulturflaschen kultiviert. Den Zellen
wurde ein spezielles Kulturmedium hinzugefügt, welches sowohl das Wachstum fördert
als auch Bakterienbefall vorbeugt. Das verwendete Kulturmedium setzt sich aus dem
Grundmedium Minimal Essential Medium (MEM), MEM with Earle´s Salts with L-
Glutamine, Wachstumsfaktoren wie fötalem Kälberserum (FKS) und zusätzlichen Anteil
von 1% L-Glutamin sowie Antibiotika, 1%ges Penicillin/Streptomycin-Gemisch,
zusammen. Das Grundmedium MEM wurde 1959 von Harry Eagle entwickelt [Eagle,
1959; Morton, 1970]. Das FKS dient zur Förderung des Zellwachstums. Je mehr FKS dem
Medium hinzugegeben wird, desto schneller wachsen die Zellen. In dem verwendeten
Kulturmedium wurden 10% verwendet. Das eingesetzte L-Glutamin wirkt sich zusätzlich
positiv auf die Wachstumsrate der Zellen aus und das Antibiotikagemisch schützt vor
Bakterienbefall der Zellen und des Mediums selbst. Die Zellen wurden alle zwei bis drei
Tage mit frischem Medium versorgt, indem diesem zunächst das alte Kulturmedium mit
Hilfe einer Pasteurpipette und einer Vakuumpumpe entnommen wurde. Die Zellen wurden
mit 3 ml (T-25 Zellkulturflasche) oder 6 ml (T-75 Zellkulturflasche) sterilem 37°C warmen
PBS gewaschen, um die toten und nicht angewachsenen Zellen zu entfernen und
anschließend wurden 5 ml (T-25 Zellkulturflasche) oder 10 ml (T-75 Zellkulturflasche)
37°C warmes Kulturmedium hinzugegeben.
3.1.4 Passagieren der Zellen
Damit die Zellen nicht absterben, oder ihre morphologischen Eigenschaften verändern,
sollte eine Konfluenz zwischen 80 und 90% nicht überschritten werden. Ist der
Flaschenboden vollständig mit Zellen bewachsen, somit zu 100% konfluent, können durch
Kontakte die Zellen absterben, oder die morphologischen Eigenschaften verändert
werden. Die Konfluenz kann mittels eines Lichtmikroskops beobachtet werden. Sobald
diese zwischen 80 und 90% lag wurden die Zellen auf eine neue Flasche passagiert. Für
Methoden 29
diesen Vorgang wurde zunächst das Medium abgesaugt. Danach wurden die Zellen mit 1
x PBS, das zuvor mit allen anderen verwendeten Lösungen in einem 37°C warmen
Wasserbad vorgewärmt wurde, gewaschen. Bei der T-25 Zellkulturflasche verwendete
man 1 ml und bei der T-75 Zellkulturflasche 2 ml Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA)-Enzymgemisch um die Zellen vom Flaschenboden zu lösen. Dieser Effekt wird
durch den Abbau von extrazellulären Proteinen durch Trypsin gewährleistet. Trypsin
stammt aus der Familie der Serinproteasen [Whitcomb und Lowe, 2007]. Durch den
Zusatz des EDTA werden die Zell-Zell-Verbindungen, durch die Bildung von
Chelatkomplexen mit zweiwertigen Kationen wie Ca2+, unterbrochen [Schmitz, 2011].
Durch das Aufbrechen der Zell-Zell-Verbindungen liegen die Zellen vereinzelt in der
Flasche vor und ermöglichen ein vereinfachtes Passagieren der Zellen in eine neue
Flasche. Nach der Zugabe des Enzymgemisches wurden die Zellen für 7 min in einem
37°C Brutschrank inkubiert da Trypsin sein Temperaturoptimum bei 37°C hat. Nachdem
die Zellkulturflasche aus dem Brutschrank entnommen wurde, wurde leicht gegen die
Zellkulturflaschenwand geklopft, um die Zellen restlos vom Flaschenboden zu lösen.
Konnten nicht alle Zellen vom Flaschenboden entfernt werden, wurde die Flasche erneut
für eine Minute in den Brutschrank gestellt. Nach dieser Minute wurde die Flasche aus
dem Brutschrank genommen und es wurde erneut an die Zellkulturflaschenwand geklopft.
Zu beachten war, dass die Zellen dem Trypsin nicht zu lange ausgesetzt waren, da dies
Stress und den Zelltod bei den Zellen hervorruft. Nach dem trypsinisieren der Zellen
wurde bei den T-25 Zellkulturflaschen 4 ml und bei den T-75 Zellkulturflaschen 8 ml
Kulturmedium hinzugegeben und resuspendiert. Danach wurden die Zellsuspensionen in
15 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und für 5 min bei 500 x g bei RT zentrifugiert.
Danach wurde der Überstand verworfen und das Pellet in einem definierten Kulturmedium
aufgenommen und resuspendiert. Es wurde eine 1:15 Verdünnung in den neuen
Zellkulturflaschen hergestellt. Die Zellen wurden nicht nur zur Zelllinienerhaltung
passagiert, wo die Passagennummer das Alter der Zellen anzeigt, sondern auch für
weiterführende Versuche wie der Proteinisolation (siehe Abschnitt 3.3.1). Hierfür mussten
die Zellen für verschiedene Inkubationszeiten mit Dexamethason in mehreren Flaschen
ausgesät werden. Dieser Vorgang wird splitten genannt. Des Weiteren werden
Messungen an der Ussing-Kammer vorgenommen, wofür die Zellen auf bestimmte Filter
ausgesät werden mussten (siehe Abschnitt 3.1.9).
3.1.5 Einfrieren der Zellen
Um einen Vorrat an Zellen zu besitzen oder eine bestimmte Passage für spätere
Versuche zu erhalten, können die Zellen bei -80°C für einen längeren Zeitraum
30 Methoden
eingefroren und gelagert werden. Für das Einfrieren von Zellen muss ein bestimmtes
Einfriermedium verwendet werden. Diesen Vorgang nennt man Kryokonservierung und
beinhaltet das zeitlich befristete Einfrieren von Zellen unter Verwendung eines
Gefrierschutzmittels. Das Gefrierschutzmittel verhindert das Gefrieren des Wassers in den
Zellen und somit den Zelltod [Schmitz, 2011]. Dem Einfriermedium ist das
Gefrierschutzmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugefügt. Die genaue Zusammensetzung
des Einfriermediums ist dem Materialteil zu entnehmen. Das Einfriermedium wurde auf
Eis gehalten bis es zu den Zellen hinzugegeben wurde. Jeder weitere Arbeitsschritt wurde
auf Eis weitergeführt, da DMSO bei RT zelltoxisch wirkt. Zunächst wurde wie in Abschnitt
3.1.5 bis zur Zentrifugation bei 500 x g für 5 min bei RT verfahren. Dem Zellpellet wurden
vorsichtig 5,4 ml des Einfriermediums hinzugegeben und das Pellet resuspendiert. Damit
die Zellen keinem Stress ausgesetzt wurden, wurde das Einfriermedium tröpfchenweise
auf diese gegeben. Nach der Resuspension wurden je 1,8 ml der Zellsuspension in
bestimmte Kryoröhrchen überführt, in denen die Zellen bei -80°C gelagert werden.
Zunächst wurden die Kryoröhrchen mit der Zellsuspension für 15 min auf Eis gehalten
und für mind. 2 h oder ü.N. in einer Styroporbox bei -20°C gelagert. Diese Schritte dienen
der langsamen Aufnahme des DMSO in die Zellen. Als letzten Schritt wurden die Zellen in
den Kryoröhrchen in einen -80°C Gefrierschrank überführt und anschließend gelagert.
3.1.6 Auftauen der Zellen
Im Gegensatz zum langsamen Einfrieren der Zellen, damit das DMSO langsam in die
Zellen eindringen kann, muss beim Auftauen darauf geachtet werden, dass dieser Schritt
schnell vollzogen wird, da das DMSO auch nach dem Einfrieren bei RT Zelltoxisch wirkt.
Nach der Entnahme der Zellen aus einem -80°C Gefrierschrank, wurden diese zügig in
einem 37°C Wasserbad aufgetaut. Nachdem die Zellen aufgetaut waren, wurde die
Zellsuspension schnellstmöglich in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen, das zuvor mit 5-7 ml
warmen Kulturmedium gefüllt wurde, überführt und resuspendiert. Danach wurde die
Zellsuspension für 5 min bei 500 x g bei RT zentrifugiert. Der entstandene Überstand mit
DMSO wurde verworfen und dem Zellpellet 5 ml frisches 37°C warmes Kulturmedium
hinzugefügt und resuspendiert. Nach der Aussaat der Zellen auf eine T-25
Zellkulturflasche wurden diese unter Standardbedingungen bei 37°C, 5 % CO2-Gehalt und
95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Des Weiteren wurde wie in Abschnitt 3.1.4 „Kultivierung
und Versorgung der Zellen“ verfahren.
Methoden 31
3.1.7 Mykoplasmen-Test
Um eine Mykoplasmenkontamination ausschließen zu können, sollte in bestimmten
Abständen, sowie direkt nach dem Auftauen und Erhalten von neuen Zellen, ein
Mykoplasmen-Test durchgeführt werden. Bestmöglich ist der Test mit Zellkulturen
durchzuführen, wenn diese eine Konfluenz von 90-100% erreicht haben. Für den Test
verwendet man 100 µl vom Zellkulturüberstand. Die 100 µl Zellkulturüberstand wurden in
ein DNA freies Reaktionsgefäß gegeben und dicht verschlossen. Im nächsten Schritt
wurden die Proben für 10 min bei 95°C inkubiert. Zur Entfernung der Zellfragmente
wurden die Proben bei 1000 x g für 5 sec zentrifugiert. Der Überstand wurde für die PCR
verwendet. Für die PCR wurde das AG-aliquoted Mycoplasma Detecion Kit for
conventional PCR von Venor® GeM Advance verwendet. Die Verwendeten Lösungen für
die PCR wie die Volumina sind dem Kit zu entnehmen. Zusätzlich für den PCR-Ansatz
wurde die TopTaq DNA-Polymerase (5 U/µl) verwendet.
Zur Analyse der PCR-Produkte wurde eine DNA-Gelelektrophorese durchgeführt. Die
PCR-Produkte lassen sich hierdurch in einer entsprechenden Matrix in einem elektrischen
Feld auftrennen. Die Auftrennung erfolgt dabei umgekehrt proportional zum Logarithmus
ihres Molekulargewichts. Die Größe der jeweiligen Banden kann unter Zuhilfenahme
eines Molekulargewichtsmarkers ermittelt werden, der sich nach den gleichen
Bedingungen im elektrischen Feld wie die Proben verhält und auftrennt. In dieser Arbeit
wurde die Analyse der PCR-Produkte mit einem 1,5%igen Agarose-Gel in 1 x TBE-Puffer
durchgeführt. Danach wurde dem Gel 125 µl Ethidiumbromid (EtBr) zugegeben und in
eine Gelkammer gegossen. EtBr ist eine interkalierende Substanz und bindet an die DNA-
Doppelhelix. Durch das EtBr sind die Banden unter UV-Licht auswertbar. Auf das 1,5%ige
Agarose-Gel wurden 1 µl 6 x Ladepuffer und 5 µl des PCR-Ansatzes aufgetragen, zudem
wurden 5 µl des Fast + RulerTM Low Range DNA Ladder als Marker aufgetragen. Die
Auftrennung der DNA erfolgte bei einer Spannung von 128 V.
Tabelle 12: Programm für den Thermocycler
1 Zyklen 94°C für 2 min
39 Zyklen 94°C für 30 sec 55°C für 30 sec 72°C für 30 sec
Auf 4 °C abkühlen Pause
32 Methoden
3.1.8 Kultivierung der Zellen auf Transwell-Membraneinsätzen
Für die elektrophysiologischen Messungen an der Ussing-Kammer, müssen die Zellen auf
speziellen Membraneinsätzen ausgesät werden. Für die Messungen müssen die Zellen
einschichtig und zu 100 % konfluent wachsen. Für diese Messung wurde eine bestimmte
Zellzahl auf Gewebekulturfiltern, die aus Polysterol bestehen und eine Membran aus
Polyster mit einer Fläche von 0,33 cm2 und eine Porengröße von 0,4 µm beinhalten,
ausgesät.
Die verwendeten Filter wurden vor dem Beginn des Versuchs in eine sterile 24 x
Transwellplatte überführt. Anschließend wurden die Filter wie die Zellkulturflaschen in
Abschnitt 3.1.3 mit Beschichtungsmedium beschichtet. Danach wurden die Zellen
genauso behandelt wie in Abschnitt 3.1.5 „Passagieren der Zellen“ beschrieben wurde.
Nachdem Zentrifugationsschritt wurde dem Zellpellet 6 ml 37°C warmes Kulturmedium
hinzugegeben und das Pellet resuspendiert. Danach wurden die Zellen mit Hilfe einer
Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Die Neubauer-Zählkammer besteht aus einem
bestimmten Objektträger. Dieser besitzt zwei eingravierte Zählnetze, eins auf jeder Seite,
getrennt durch einen Spalt. Ein Deckglas wird auf den Objektträger gelegt. Hierbei
entsteht ein winziger Spalt. 10 µl der Zellsuspension wurden auf jede Seite der Neubauer-
Zählkammer pipettiert. Danach wurde unter dem Mikroskop je ein großes Quadrat mit 4 x
4 kleinen Quadraten, von jeder Seite, mäanderförmig ausgezählt. Von den ausgezählten
Quadraten wurde ein Mittelwert gebildet und mit 104 multipliziert, damit wurde die genaue
Zellzahl pro Milliliter bestimmt. Der Wert 104 ergibt sich aus der Kammertiefe mit 0,1 mm
woraus ein Volumen der großen Quadrate von 0,1 mm3 oder 10-4 ml resultiert. Auf die
Abbildung 8:Schematische Abbildung eines Gewebekulturfilter
In der Abbildung ist ein Gewebekulturfilter schematisch dargestellt, der für die Versuche an der Ussing-Kammer verwendet wurde. Abgebildet ist die apikale und basolaterale Seite des Filters. Der Filter besitzt eine Membran mit einem Durchmesser von 6,5 mm.
apikal
basolateral
6,5 mm
Methoden 33
Filter wurden 1,1 x 105 Zellen ausgesät, maximal jedoch 300 µl der Zellsuspension, da
das Fassungsvolumen apikal ca. 300 µl und basolateral ca. 700 µl beträgt. Nachdem das
Volumen der Zellsuspension bekannt war, wurde die fehlende Menge bis zu 300 µl apikal
und 700 µl basolateral in die Filter und Wellplatte vorgelegt.
Abbildung 9: Schematische Abbildung einer Neubauer-Zählkammer
Bei der verwendeten Zählkammer sind zwei von dem hier abgebildeten Quadrat vorhanden. Es wurden je ein blau markiertes Quadrat mäanderförmig ausgezählt, der Mittelwert gebildet und mit 10
4 Multipliziert, um die
genaue Zellzahl pro Milliliter zu erhalten (verändert nach: www.zaehlkammer.de am 31.07.2013).
Nach der Aussaat erfolgte bei den Filtern der erste Mediumwechsel nach zwei Tagen.
Das Medium wurde vollständig apikal und basolateral abgesaugt und danach wurde auf
beiden Seiten mit 37°C warmen 1 x PBS gewaschen. Anschließend wurde apikal 300 µl
und basolateral 700 µl Kulturmedium zu den Zellen gegeben. Beim Medienwechsel und
dem Waschschritt ist darauf zu achten nicht die Membran zu beschädigen. Die weitere
Behandlung der Filter ist in Abschnitt 3.1.3 „Kultivierung und Versorgung der Zellen“
beschrieben.
3.1.9 Inkubation der Zellen mit Dexamethason
Für die Inkubation von Dexamethason wurde das Medium in den Zellkulturflaschen
(Proteinisolation) und den Filtern (elektrophysiologische Messungen) vollständig
abgesaugt. Die Zellkulturflaschen wurden wie in Abschnitt 3.1.4 beschrieben mit 1 x PBS
gewaschen. Dann wurde den Zellen 1 µM Dexamethason (mit Kulturmedium angesetzt)
hinzugegeben. Die Filter wurden ebenfalls mit 1 x PBS gewaschen. Anschließend wurde
den Zellen apikal 1 µM Dexamethason (mit Kulturmedium angesetzt) und basolateral 700
µl 37°C warmes Kulturmedium hinzugegeben. Zum Schluss wurde zu den Zellen apikal
5,88 µl Dexamethason hinzugegeben. Die behandelten Zellen wurden 3 h, 24 h oder als
34 Methoden
Kontrolle ohne Dexamethason vor der elektrophysiologischen Messung an der Ussing-
Kammer und vor der Proteinisolation inkubiert.
3.2 Elektrophysiologie
Mit Hilfe der elektrophysiologischen Messungen an der Ussing-Kammer wurde in dieser
Arbeit der transepitheliale Amilorid-sensitive Na+-Strom gemessen und somit kann eine
funktionale Aussage über die Aktivität des ENaC im Zusammenhang mit Dexamethason
getroffen werden. Alle verwendeten Lösungen wurden vor den Messungen auf 37°C
erwärmt. Die Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen sind dem Materialteil zu
entnehmen. Nähere Erläuterungen zum Aufbau der Ussing-Kammer sind im folgenden
Abschnitt 3.2.1 beschrieben.
3.2.1 Die Ussing-Kammer
Mittels der 1951 entwickelten Apparatur des dänischen Zoologen Hans Ussing, kann der
transepitheliale Strom und Widerstand von Epithelien ermittelt werden [Ussing und
Zerahn, 1951]. Der transepitheliale Widerstand (Rt) beschreibt die Dichte des Epithels in
Ω*cm2. Der Transport über das Epithel wird als transepithelialer Stromfluss dargestellt.
Um den transepithelialen Widerstand und Stromfluss messen zu können, ist die Kammer
in zwei Hälften geteilt. Die zwei Kammerhälften können z.B. von einem Filter, voneinander
getrennt werden. Der apikalen als auch der basolateralen Seite der Zellen auf der
Membran können verschiedenen Lösungen hinzugefügt werden. Durch die Ausbildung
von tight junctions zwischen den Zellen wird ermöglicht, dass überwiegend nur der
Transport von Ionen durch die Zellen gemessen wird (transzellulär). Zwei gewebsnahe
Spannungselektroden messen die transepitheliale Spannung (Vt). Diese wird durch
Strom, der durch zwei gewebsferne Stromelektroden appliziert wird, auf null gehalten. Bei
dem applizierten Strom spricht man von einem sogenannten Kurzschlussstrom (ISC, short
circum current). Dieser gibt den Ionentransport über das Epithel wieder. Der benötigte,
ausgleichende Kurzschlussstrom wird über eine Voltage Clamp errechnet und der
ermittelte Wert an ein bestimmtes Computerprogramm, ImpDsp 1.4 (Prof. Dr. W. van
Driessche, Leuven, Belgien) über eine dazugehörige Hardware übermittelt und
dargestellt.
Methoden 35
In dieser Arbeit wurde mit einer modifizierten Ussing-Kammer gemessen, die neben der
Messung des Kurzschlussstroms (ISC) in µA/cm2, sowohl die der Kapazität (Ct) in µF/cm2
als auch die der Leitfähigkeit (Gt) in mS/cm2 aufzeichnet. Die Kapazität gibt bei der
Messung ein Maß über die Membranoberfläche wieder. Ein Faktor für den Einfluss auf die
Membranoberfläche ist die Exo- und Endozytose der Zellen. Durch das Hinzugeben
spezieller Substanzen kann die Exo- und Endozytose der Zellen so verändert werden,
dass dies durch die Kapazität wiedergegeben werden kann. Der im oberen Abschnitt
erwähnte Widerstand (Rt) kann mittels des reziproken Wertes der Leitfähigkeit errechnet
werden. Der Aufbau einer Ussing-Kammer ist in der Abbildung 10 schematisch
dargestellt.
Abbildung 10: Schematischer Aufbau einer Ussing Kammer
Das verwendete Epithel, welches auf der Membran sitzt, trennt die apikale Kammerhälfte von der basolateralen Seite. Über die dargestellten Zuläufe werden verschiedene Lösungen hinzugegeben und über die Abläufe wieder abgepumpt. Die Spannungselektroden sind gewebsnah und messen die transepitheliale Spannung. Die Stromelektroden sind gewebsfern und applizieren den Kurzschlussstrom (verändert nach http://users.telenet.be/ep-devices/EPD Ussing chamber - Costar filters.pdf am 14.07.2013)
36 Methoden
3.2.2 Verlauf einer Messung in der Ussing-Kammer
Nach 8-9 Tagen wurden die Filter, auf denen zuvor die Zellen ausgesät wurden, in der
Ussing-Kammer gemessen. Das Wachstum der Zellen wurde täglich unter einem
Lichtmikroskop beobachtet. Werden die Zellen zu früh gemessen, haben sich meist noch
keine Monolayer ausgebildet und man kann oft Lücken zwischen den Zellen auf der
Membran beobachten. Eine zu späte Messung, würde ein mehrschichtiges Wachstum der
Zellen fördern.
Nach Einsetzen des Filters wurden die Zellen sofort apikal und basolateral mit einer
physiologischen Ringerlösung (Zellkulturringer) perfundiert, um ein Austrocknen der
Membran zu vermeiden. Basolateral wurden die Zellen die ganze Messung über mit
Zellkulturringer perfundiert. Nach Stabilisierung der Kapazität, der Leitfähigkeit und des
Kurzschlussstroms, wurden apikal verschiedenen Lösungen hinzugegeben. Es war darauf
zu achten, dass sich immer stabile Werte der Messparameter einstellten, bevor eine neue
Lösung den Zellen hinzugefügt wurde. Als erstes wurde den Zellen Amilorid (100 µM in
Zellkulturringer) hinzugegeben, um den Amilorid-sensitiven Na+-Strom durch den ENaC
zu messen. Damit der Amilorid-sensitive Na+-Strom nach der Messung ausgewertet
werden konnte, wurde als nächster Schritt den Zellen Na+-freie Ringerlösung
hinzugegeben und somit der Na+-Strom über das Epithel gehemmt. Als nächsten Schritt
wurden die Zellen wieder mit Zellkulturringer perfundiert. Um nur den Amilorid-sensitiven
Na+-Strom, der durch die δ-ENaC UE erfolgt, zu messen, wurde den Zellen im nächsten
Schritt der Azofarbstoff Evans-Blue (300 µM in Zellkulturringer) hinzugegeben. Evans-
Blue blockiert die δ-ENaC UE. Um den δ-ENaC UE Anteil am gesamten Amilorid-
sensitiven Strom ermitteln zu können, wurde den Zellen als nächstes Evans Blue mit
Amilorid, in den gleichen Konzentrationen wie zuvor, hinzugegeben. Es wurde erneut Na+-
freier Zellkulturringer hinzugefügt. Im letzten Schritt wurden die Zellen wieder mit
Zellkulturringer perfundiert, um die Ausgangswerte zu erhalten und auch die Reversibilität
der Parameter zu zeigen. Die nicht mit Dexamethason inkubierten Zellen dienten als
Kontrollzellen für die 3 h und 24 h inkubierten Zellen und wurden ebenso behandelt.
3.2.3 Auswertungen der Ussing-Kammer Messungen
Die Auswertungen und Abbildungen der Messungen an der Ussing-Kammer wurden mit
dem Programm OriginPro 6.1 durchgeführt. Für die Abbildungen der Messreihen mussten
die Messdaten in kompatible Daten für das Programm umgeschrieben werden. Für die
weitere Auswertungen der unterschiedlich behandelten Zellen, wurden zunächst absolute
Werte, für den Amilorid-sensitiven Na+-Strom, der über den ENaC erfolgt und für den
Methoden 37
gesamt Na+-Strom, berechnet. Die absoluten Werte für den Amilorid-sensitiven Na+-Strom
über den ENaC wurden durch die Differenz zwischen dem ISC des Zellkulturingers und
des ISC des Amilorids in Relation zum ISC des Na+-Stroms berechnet. Ähnlich wurde der
gesamt Na+-Strom berechnet, durch die Differenz des ISC des Zellkulturringers und des ISC
des Na+-freien Zellkulturringers. Mittels der absoluten Werte, konnte der prozentuale
ENaC-Stromanteil (% ENaC Anteil) bezogen auf den Gesamt Na+-Strom, berechnet
werden. Zusätzlich wurden die Mittelwerte der Leitfähigkeit mit Standardfehler wie
Kapazität mit Standardfehler ermittelt und beschrieben. Die Anzahl gemessener Filter sind
in den Abbildungen mit n gekennzeichnet.
3.3 Protein Analyse
Durch die proteinbiochemischen Analysen können quantitative Aussagen bezüglich des
ENaC getroffen werden. Dafür wurde zunächst eine Proteinisolation der Zellen mit
verschiedenen Inkubationszeiten mit Dexamethason durchgeführt. Anschließend wurden
die Proteine über eine diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-
PAGE) aufgetrennt und mittels einer Western Blot Analyse mit folgender Antikörper
Inkubation behandelt. Durch die Detektion kann eine Aussage über die Expression von
ENaC im Zusammenhang mit Dexamethason getroffen werden. Die Zusammensetzungen
der verwendeten Lösungen sind dem Materialteil zu entnehmen.
3.3.1 Proteinisolation von CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen
Nachdem die Zellen eine Konfluenz von 80-90 % in einer T-75 Flasche erreicht hatten,
wurde eine Proteinisolation von drei unterschiedlich behandelten Zellansätzen
durchgeführt. Zum einen Zellen ohne Inkubation mit Dexamethason als Kontrolle, zum
anderen Zellen, die 3 h und 24 h mit 1 µM Dexamethason inkubiert wurden. Als die
gewünschte Konfluenz erreicht wurde, wurden die Zellen auf Eis gestellt und das
Kulturmedium abgesaugt. Die folgenden Schritte wurden auf Eis durchgeführt, falls nicht
anders beschrieben. Die Zellen wurden danach mit 10 ml eiskalten 1 x PBS gewaschen.
Abschließend wurde den Zellen 700 µl 2%iger Tritonlysispuffer, zu dem zuvor 1%
Proteaseinhibitor hinzugegeben wurde, um eine Degradation der Proteine zu vermeiden,
hinzugegeben. Danach wurden die Zellen mit einem Zellschaber abgekratzt, eventuelle
Luftblasenbildung sollte vermieden werden. Die entstandene Zellsuspension wurde in ein
2 ml-Reaktionsgefäße überführt. Die Zellsuspension wurde in ein 2 ml-Reaktionsgefäße
3 x für 2 Sekunden sonifiziert. Danach wurden die aufgeschlossenen Zellen 10 min auf
Eis inkubiert und anschließend für 30 min bei 4000 x g bei 4°C zentrifugiert. Anschließend
38 Methoden
wurde der Überstand in neue 2 ml-Reaktionsgefäße überführt und die Proteinlysate in
flüssigen Stickstoff schockgefroren. Die Stocklösungen werden bei -80°C aufbewahrt.
3.3.2 Bicinchoninsäuretest (BCA-Test)
Diese Methode dient zur Messung von Proteinkonzentrationen. In dieser Arbeit wurden
unterschiedlich mit Dexamethason behandelten CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen mittels
dieser Methode untersucht.
Bei dem BCA-Test handelt es sich um eine Methode, bei der zweiwertige Cu2+-Ionen in
Anwesenheit von Proteinen in einer alkalischen Lösung zu einwertigen Cu+-Ionen
reduziert werden. Diese bilden in Zusammenhang mit Bicinchoninsäure einen violetten
Farbkomplex [Smith et al., 1985]. Mittels eines Photometers können die Proteinmengen
anhand der Farbreaktion bei 562 nm gemessen werden. Die gemessene Absorption ist
proportional der Proteinkonzentration. Um die genaue Proteinkonzentration bestimmen zu
können, wurde eine Messung mit definierten Proteinkonzentrationen von
Kälberserumalbumin durchgeführt. Anhand der so entstandenen Eichgerade konnten nun
die genauen Proteinkonzentrationen der drei unterschiedlich behandelten Proteinlysaten
berechnet werden. Die genaue Durchführung des BCA-Tests ist dem Handbuch des
verwendeten Kits, Pierce® BCA Protein Assay Kit von Thermo Scientific Inc. (Rockford,
Illinois, USA), zu entnehmen. Die Proteinlysate wurden in einer 1:10 und 1:20
Verdünnungen gemessen.
3.3.3 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Durch die diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese wird ermöglicht, dass Proteine
unabhängig von ihrer Eigenladung nur nach ihrem Molekulargewicht in einem elektrischen
Feld aufgetrennt werden [Laemmli, 1970]. Damit die Eigenladung vernachlässigt werden
kann, wurden bei dieser Methode die Proteinlysate mit SDS (engl. Sodium dodecyl sulfate
= Natriumdodecylsulfat) behandelt. SDS ist ein Detergenz, welches sich an die
hydrophoben Aminosäuren des Proteins anlagert und eine große anionische Kopfgruppe
bildet. Dadurch erlangt das ganze Protein eine negative Gesamtladung. Durch den Zusatz
an Dithiothreitol (DTT) werden inter- und intramolekulare Disulfidbrücken denaturiert.
Das SDS-Gel besteht aus zwei unterschiedlichen Gelen, Sammel- und Trenngel, die sich
in ihrem pH-Wert und ihrer Porengröße unterscheiden. In Abbildung 11 wird das SDS-Gel
genauer beschrieben.
Methoden 39
Durch das 3,9%ige Sammelgel wird die Fokussierung der Proteine in scharfe Banden
erreicht und die Proteine können im 7,5%igen Trenngel nach ihrem Molekulargewicht
aufgetrennt werden. Nach der Auftrennung der SDS-Proteinkomplexe können diese
anschließend im Gel mit verschiedenen Färbemethoden, z.B. durch eine Coomassie-
Färbung sichtbar gemacht werden.
Von den gemessenen Proben wurden 40 µg aufgetragen. Die berechneten Mengen
wurden mit 4 x Probenpuffer mit DTT 10% versetzt und mit Lysispuffer auf das
entsprechende Endvolumen aufgefüllt. Die vorbereiteten Proben wurden anschließend bei
95°C für 5 min im Wasserbad denaturiert. Anschließend wurden die Proben auf das SDS-
Gel, welches zuvor in eine SDS-Gel-Elektrophoresekammer eingespannt und diese mit
Elektrophorese-Laufpuffer gefüllt wurde, aufgetragen. Zusätzlich wurden 8 µl von dem
Abbildung 11: Auftrennung von Proteinen in diskontinuierlichen Polyacrylamidgelen
Im großporigen Sammelgel mit einem pH-Wert von 6,8 ordnen sich die SDS-Proteinkomplexe zwischen den voraus-laufenden Chloridionen (Leitionen) und den Glycinionen (Folgeionen) an. Die Glycinionen liegen bei diesem pH als Zwitterionen mit einer Nettoladung von Null vor. Das Glycin erhält in dem kleinporigen Trenngel mit einem pH-Wert von 8,8 eine negative Gesamtladung und überholt die SDS-Proteinkomplexe, wodurch der Sammeleffekt aufgehoben wird. Somit trennen sich die SDS-Protein-Komplexe nach ihrer molekularen Masse auf (verändert nach: http://www.immunbiologie.uni-bonn.de/juergen/MinMap/Uni-Bonn/PAGE-Dateien/image002.jpg am 14.07.2013).
40 Methoden
Marker PageRulerTM Prestained Protein Ladder, um die spätere Größe der detektierten
Banden bestimmen zu können, aufgetragen (siehe Abbildung 12). Die SDS-Gel-
Elektrophoresekammer wurde auf 30 mA und maximaler Spannung eingestellt.
3.3.4 Proteintransfer auf eine PVDF-Membran
Es wurde mit dem SDS-Gel aus Abschnitt 3.3.3 weiter verfahren. Nach Beenden der
Gelelektrophorese, wurden die Proteine vom Gel auf eine PVDF-Membran in einer
semidry Transferkammer für 25 min bei 5 mA/cm2 und maximaler Spannung transferiert.
In der nächsten Abbildung ist schematisch dargestellt, wie der Western Blot aufgebaut
wurde.
Abbildung 12: Darstellung des verwendeten Markers
Der PageRulerTM
Prestained Protein Ladder ist für 4-20%ige Tris-Glycin SDS-Gele geeignet. Der Marker hat Referenzbanden von ca. 10-170 kDa. Mit einer Größe von ca. 70 kDa hebt sich eine rot gefärbte Bande deutlich von den anderen ab und ermöglicht eine erleichterte Auswertung (verändert nach: http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=717EAB22-C50E-319F-D227-C1EB41C4343C).
Abbildung 13: Aufbau eines semidry Western Blots
Wie in der Abbildung gezeigt wurden die Filterpapiere, das SDS-Gel und die Membran in einer Transferkammer für einen semidry Transfer aufgebaut. Der Blot wurde aufgebaut, indem 5 Filterpapiere, die Membran, das Gel und danach noch einmal 5 Filterpapiere von unten nach oben aufeinander gelegt wurden. Zuvor wurden die Filterpapiere und das SDS-Gel in Transferpuffer eingetaucht und angefeuchtet. Bevor die Membran auf die Filterpapiere gelegt wurde, wurde diese als erstes in Methanol inkubiert und dann ebenfalls in Transferpuffer eingetaucht (verändert nach: http://www.rndsystems.com/DAM_public/5598.gif).
5x Filterpapier
5x Filterpapier
SDS-Gel PVDF-Membran
ANODE (+)
KATHODE (-)
Methoden 41
3.3.5 Coomassie-Färbung des SDS-Gels
Das Gel wurde nach dem Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran in Coomassie-
Brilliant-Blue für 1 h geschüttelt. Danach wurde das Gel ü.N. in Entfärbelösung auf einem
Schüttler entfärbt. Nachdem Entfärben des Gels wird dieses für 15 min in Fixierlösung
inkubiert. Das Gel wird nach dem Fixieren in Millipore-H2O aufgehoben und mittels eines
Scanners digitalisiert. Anhand dieses Gels kann kontrolliert werden, ob bei dem Transfer
die Proteine vollständig auf die PVDF-Membran transferiert worden sind.
3.3.6 Coomassie-Färbung der PVDF-Membran
Die PVDF-Membran wurde in Coomassie-Brilliant-Blue für 1 min geschüttelt. Hierbei
konnte Coomassie-Brilliant-Blue reversibel die membrangebundenen Proteine anfärben.
Danach wurde die Membran in einer Entfärbelösung für ca. 5-10 min auf einem Schüttler
entfärbt. Durch das Anfärben der PVDF-Membran mit Coomassie-Brilliant-Blue, konnte
nach dem Entfärben der PVDF-Membran geprüft werden, ob die Proteine bei dem
Transfer auf die PVDF-Membran überführt wurden.
3.3.7 Proteinnachweis durch Antikörper
Nach dem Transfer der Proteine auf die PVDF-Membran, können diese mittels indirekter
Immundetektion nachgewiesen werden. Dazu wurde die Membran in 5%iger
Milchpulverlösung in TBS-Puffer mit Tween (TBST) für 2-3 h bei RT blockiert. Bei diesem
Schritt werden die freien Bindungsstellen auf der Membran blockiert und somit die
Möglichkeit verringert, dass der Antikörper unspezifisch bindet. Danach wurde die PVDF-
Membran ü.N. bei 4°C auf einem Rollinkubator mit dem Primärantikörper (siehe Anlagen)
inkubiert. Der Primärantikörper wurde wie in den Anlagen beschrieben mit einer 5%igen
Milchpulverlösung in TBST verdünnt (α-ENaC 1:1250, δ-ENaC 1:200 und α-Tubulin
1:200). Nach der Inkubation mit dem Primärantikörper wurde die Membran 3 x für 10 min
mit TBST gewaschen. Danach erfolgte eine Inkubation mit dem Sekundärantikörper
(siehe Anlagen). Diese Inkubation für die Untersuchung des α-Tubulin Proteins dauerte 2
h, wohingegen die Inkubation bei der Untersuchung von α- und δ-ENaC 1 h betrug. Der
Sekundärantikörper wurde 1:10000 in 5%igen Milchpulverlösung in TBST verdünnt (siehe
Anlagen). Anschließend wurde die Membran erneut 3 x für 10 min mit TBST gewaschen.
Bei dem letzten Schritt vor der Detektion wurde die Membran 5 min mit TBS gewaschen.
Um zu zeigen, dass die Antikörper spezifisch binden, wurde für den spezifisch gegen δ-
ENaC gerichteten Antikörper als Positivkontrolle die Zelllinie MIA PaCa-2 (50 µg
42 Methoden
Gesamtprotein) aufgetragen. MIA PaCa-2 wird vom Hersteller des Antikörpers (Santa
Cruz) als Positivkontrolle Empfohlen. Diese Zellen sind humane Pankreaskarzinomzellen,
in denen die Expression der δ-ENaC UE nachgewiesen ist. Der spezifisch gegen α-ENaC
gerichtete Antikörper wurde mit einem neutralisierenden Peptid (PEP-088; Dianova)
inkubiert und diente als Negativkontrolle. Hierfür wurde das Peptid mit dem Antikörper
(3:1) für 15 h bei 4°C in 3 ml 5%iger Milchpulverlösung inkubiert und die Membran wurde
anschließend wie oben beschrieben ü.N. mit dieser Lösung behandelt. Der weitere
Verlauf ist wie im oberen Abschnitt beschrieben.
3.3.8 Detektion durch Enhanced Chemilumineszenz (ECL)
Nach der Antikörperbehandlung, die in Abschnitt 3.3.7 beschrieben wird, wurde die
PVDF-Membran in eine große Petrischale (Ø = mm) gelegt und 3 ml der ECL Lösung A
und 3 ml von der ECL Lösung B aus dem Kit, Super Sigal® West Pico Chemiluminescent
Substrat, hinzugegeben. Dieses Gemisch enthält Luminol und die Membran wurde 3 min
in diesem inkubiert. Durch die Oxidation des Luminols, durch die an den Antikörper
gekoppelte Peroxidase, konnte eine Detektion von den Proteinen mittels dem Imager
Fusion-SL Advance von PeQlab, nach unterschiedlichen Expositionszeiten, durchgeführt
und ausgewertet werden.
3.3.9 Auswertung der Western Blot Analysen
Die mittels des Imager, Fusion-SL Advance von Peqlab, ermittelten Ergebnisse wurden
densiometrisch mit dem Computerprogramm Image J 1.45s (National Institutes of Health,
USA) hinsichtlich der Farbdichte der einzelnen Banden analysiert. Dabei wurden die
analysierten Messwerte, die von den Kontrollen gemessen wurden, auf 100 % gesetzt.
Die analysierten Messwerte der 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen
konnten anschließend mittels dem Computerprogramm OriginPro 6.1 (Origin Lab
Cooperation, Northamton, Massachusetts, USA) in Relation zu den Kontrollen normalisiert
und ausgewertet werden. Dieses gab Aufschluss über die genaue prozentuale Steigung
oder Abfall der Expression der mit Dexamethason inkubierten Zellen. Die ausgewerteten
Daten werden jeweils mit dem Mittelwert ± standard error of the mean (SEM) dargestellt.
Die Anzahl der durchgeführten Proteinisolationen ist in N und die der durchgeführten
Western-Blot Analysen in n in den Abbildungen dargestellt.
Ergebnisse 43
4 Ergebnisse
Im Rahmen dieser Masterarbeit wurde die Dexamethasonwirkung auf die humanen
Bronchialepithelzellen CFBE41o-- und 16HBE14o- mittels proteinbiochemischer und
elektrophysiologischer Methoden untersucht. Zunächst wurde ein Mykoplasmentest der
Zellen durchgeführt, um eine Kontamination mit Mykoplasmen auszuschließen. Die
humanen Bronchialepithelzellen eignen sich sowohl für die proteinbiochemischen, als
auch die elektrophysiologischen Methoden, da diese einfach zu kultivieren sind und
polare Monolayer ausbilden.
4.1 Mykoplasmentest
Der Mykoplasmentest dient zur Untersuchung der Zellen auf eine Kontamination durch
Mykoplasmen. Durch die geringe Größe der Mykoplasmen von ca. 0,3-2 µM, können
diese weitgehend ungehindert in die Zellen eindringen. Da noch nicht genau bekannt ist,
inwieweit Mykoplasmen in die Regulationsmechanismen der Zellen einwirken, jedoch,
dass das Wachstum verlangsamt wird, ist eine Mykoplasmenkontamination unbedingt zu
vermeiden. Sollte eine Zelllinie dennoch mit Mykoplasmen kontaminiert sein, sollte diese
verworfen und durch nicht kontaminierte Zellen neu aufgebaut werden.
Der Abbildung 14 ist zu entnehmen, dass die CFBE41o-- und 16HBE14o--Zelllinien nicht
mit Mykoplasmen kontaminiert waren. Auf die Gele wurden Zelllysate der CFBE41o-- und
16HBE14o--Zellen sowie H2O als Negativkontrolle, als auch eine Positivkontrolle
aufgetragen. Diese enthielt DNA-Fragmenten des Mykoplasma oral-Genoms und war
dem Kit beigefügt. Die CFBE41o-- und die 16HBE14o--Zellen, sowie die Negativkontrolle,
weisen eine Größe von 191 bp auf. Bei der Positivkontrolle ist eine doppelte Bande von
191 und 270 bp zu beobachten. Die Bande bei 191 bp zeigt einen negativen Nachweis für
Mykoplasmen. Die 270 bp große Bande zeigt einen positiven Nachweis für mit
Mykoplasmen kontaminierte Zellen. Die weitere Kultivierung, als auch die
elektrophysiologischen und biochemischen Methoden konnten nach erfolgreichem
Mykoplasmentest weitergeführt werden.
44 Ergebnisse
4.2 Elektrophysiologische Messungen
Für die elektrophysiologischen Messungen in der Ussing-Kammer wurden die Zellen
(1,1 * 105) auf speziellen Filtern ausgesät. Auf diesen wuchsen die Zellen innerhalb von 7-
8 Tagen zu konfluenten Monolayern. Durch die Beobachtung der Filter mit Hilfe eines
Lichtmikroskops, konnte festgestellt werden, dass das optimale Wachstum nach 8 Tagen
erreicht worden war und die Filter einen sehr guten Widerstand für die Messung an der
Ussing-Kammer besaßen. Die Zellen wurden 3 h und 24 h vor den Messungen mit
Dexamethason inkubiert. Danach wurde eine Messung wie in Abschnitt 3.2.2 beschrieben
durchgeführt. In den folgenden Abbildungen werden je zwei Zeitverläufe zur Erfassung
des Kurzschlussstroms der Kontrollmessungen dargestellt. Die weiteren Abbildungen der
3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen sind den Anlagen beigefügt. Bei jeder
Messung wurde eine Doppelbestimmung der Filter durchgeführt und die Ergebnisse für
die weitere Auswertung gemittelt. Die gemittelten Messdaten der absoluten Werte für die
Kurzschlussstrom-Messungen, für Amilorid und Na+-freien Ringer, sind den Anlagen zu
A) B)
Abbildung 14: Mykoplasmentest von CFBE41o--Zellen
In Abbildung A wurde ein Zelllysat der CFBE41o--Zellen, eine Positivkontrolle und als
Negativkontrolle H2O, auf ein 1,5%iges Agarosegel aufgetragen. In Abbildung B wurde anstatt des Zelllysats der CFBE41o
--Zellen ein Zelllysat der 16HBE14o
--Zellen auf ein 1,5%iges Agarosegel
aufgetragen. Zudem wurde die gleiche Negativ- und Positivkontrolle wie in Abbildung A verwendet. Um die Größe der Banden zu identifizieren, wurde auf beide Agarosegele der Fast + Ruler
TM Low
Range DNA Ladder aufgetragen. In den Abbildungen A und B sieht man sowohl bei den CFBE41o
-- und 16HBE14o
--Zellen, als auch der Negativkontrolle eine Bande bei 191 bp. Die
Positivkontrolle weist eine Bande bei 191 bp und bei 270 bp auf.
Ergebnisse 45
entnehmen. Den Abbildungen 16 und 18 ist die Dexamethasonwirkung auf die
unterschiedlich behandelten Zellen zu entnehmen.
4.2.1 Elektrophysiologische Messungen der CFBE41o- Zellen mit und ohne Dexamethasonbehandlung
Zur Untersuchung an der Ussing Kammer dienten unbehandelte CFBE41o--Zellen als
Kontrollen, diese wurden 7-8 Tage nach der Aussaat gemessen. Da bei den Zellen in
früheren Arbeiten kein stabiler Na+-Strom durch den ENaC festgestellt worden war
[Lemke, 2012], wurde kein exaktes Ergebnis für die Kontrollzellen erwartet. Bei den
Kontrollmessungen der CFBE41o--Zellen war ein Absinken des Kurzschlussstroms nach
Hinzugeben von Amilorid zu sehen. Jedoch reagierten die Zellen sehr unterschiedlich auf
Amilorid (siehe Abbildung 15). Auch das weitere, erwartete Absinken des
Kurzschlussstroms, nach Hinzugeben von Na+-freiem Ringer, war zu beobachten. Die
Reversibilität von Amilorid wurde durch das Hinzugeben von Zellkulturringer, nach der
Messung mit Na+-freiem Ringer, dargestellt. Die Abbildung 15 zeigt zwei Zeitverläufe der
CFBE41o--Zellen. In dem Zeitverlauf A ist eine stärkere prozentuale Amiloridantwort, von
39,33%, als bei dem Zeitverlauf B, mit 11,11%, zu sehen. Diese Ergebnisse weisen auf
den nicht-stabilen Na+-Strom hin, der vor den Messungen in früheren Arbeiten ermittelt
worden war [Lemke, 2012]. Der gemittelte prozentuale ENaC-Strom der gemessenen
Filter der CFBE41o--Zellen beträgt 21,67 ± 2,56%. Der Widerstand der gemittelten
Initialwerte liegt bei 213,15 ± 11,99 Ω*cm2 und die der Kapazität bei 1,22 ± 0,02 µF.
46 Ergebnisse
Abbildung 15: Messverlauf von CFBE41o--Zellen ohne Dexamethason-Inkubation
(Kontrollmessungen)
In der Abbildung ist der zeitliche Verlauf von zwei Ussing-Kammer Messungen von CFBE41o--
Zellen ohne Dexamethasonbehandlung dargestellt. Auf der y-Achse ist der gemessene Kurzschlussstrom (ISC) in µA/cm
2 gegen die Zeit in min auf der x-Achse aufgetragen. In den
Abbildungen werden die verschiedenen Lösungen dargestellt, die den Zellen während der Ussing-Kammer Messungen, apikal hinzugegeben wurden. Zeitverlauf A zeigt eine stärkere Amiloridantwort mit 39,33% als Zeitverlauf B mit 11,11%.
B)
A)
Ergebnisse 47
Die Vorbereitung der 3 h lang mit Dexamethason behandelten Zellen, sowie die
anschließenden Messungen erfolgten wie bei den unbehandelten Zellen. Der Unterschied
lag hier in der 3-stündigen Vorbehandlung der Filter mit Dexamethason. Bei diesen
Messungen erwartete man einen größeren prozentualen ENaC-Strom durch den
stimulierenden Effekt des Glucocorticoids Dexamethason. Wie in den Zeitverläufen der
unbehandelten Zellen ist bei den CFBE41o--Zellen, die 3 h mit Dexamethason behandelt
wurden, eine deutliche Antwort auf Amilorid und eine stärkere Antwort auf Na+-freien
Ringer festzustellen. Im Vergleich zu den Kontrollmessungen ist die Amiloridantwort der
mit 3 h Dexamethason behandelten Zellen nicht viel stärker. Der gemittelte prozentuale
ENaC-Strom der CFBE41o--Zellen beträgt 25,17 ± 3,07%. Die gemittelten Initialwerte für
den Widerstand und die Kapazität betragen 264,73 ±18,1 Ω*cm und 1,21 ± 0,02 µF. Auch
nach einer 24 h Inkubation mit Dexamethason der CFBE41o--Zellen ist eine deutliche
Antwort auf Amilorid und eine sehr starke Antwort auf Na+-freien Ringer festzustellen.
Diese Zellen weisen im Vergleich zu den Kontrollmessungen eine leicht stärkere
Amiloridantwort gegenüber den Kontrollmessungen auf. Der gemittelte prozentuale
ENaC-Strom liegt bei 25,21 ± 2,29%. Die gemittelten Initialwerte für den Widerstand und
der Kapazität betragen 256,95 ±21,1 Ω*cm und 1,14 ± 0,05 µF.
In der folgenden Tabelle sind die gemittelten Initialwerte des Kurzschlussstroms (ISC), der
Leitfähigkeit (Gm), der Kapazität (Cm) und des Widerstands (Rt) aufgetragen. In allen
Messdaten sind nur geringe Schwankungen zu erkennen. Jedoch fällt auf, dass die
Kapazitätswerte umso geringer wurden, je länger die Zellen mit Dexamethason inkubiert
waren. Die Werte der Kapazität liefern Aufschluss über mögliche endo- und exozytotische
Proßesse, die über die Zellmembran abgelaufen sind. Zudem gibt der transepithelial
gemessene Widerstand Information über die Dichte des Epithels und inwieweit
parazellulärer Ionenfluss über das Epithel stattfinden konnte.
Tabelle 13: Mittelwerte der Initialwerte mit Standardfehler der CFBE41o--Zellen
Zellen Anzahl der
Filter ISC [µA/cm2]
Gm
[mS/cm2] Cm [µF] Rt [Ω*cm]
CFBE41o-
Kontrolle 24 4,42 ± 1,74 5,16 ± 0,35 1,22 ± 0,02
213,15 ± 11,99
CFBE41o-
3 h Dex 22 2,72 ± 0,99 4,3 ± 0,36 1,21 ± 0,02
264,73 ±18,1
CFBE41o-
24 h Dex 25 3,98 ± 0,32 4,46 ± 0,32 1,136 ± 0,05
256,95 ± 21,1
48 Ergebnisse
Um den prozentualen ENaC-Strom der behandelten CFBE41o--Zellen zu den
Kontrollmessungen zu vergleichen, wurden die Zellen mit dem Statistikprogramm
OriginPro analysiert und die Ergebnisse gegenübergestellt. In den Ergebnissen der mit
Dexamethason behandelten Zellen verglichen zu den Kontrollmessungen ist kein
signifikanter Unterschied vorhanden. Jedoch ist bei den Zellen, die 3 h und 24 h mit
Dexamethason behandelt wurden, eine Tendenz mit einer leichten Steigerung in dem
gemessenen ENaC-Strom zu erkennen. Die unbehandelten Zellen weisen einen
prozentualen ENaC-Strom von 21,67 ± 2,56% auf. Bei den 3 h und 24 h mit
Dexamethason behandelten Zellen liegt der prozentuale ENaC-Strom bei 25,17 ± 3,07%
und 25,21 ± 2,29%.
Abbildung 16: Gegenüberstellung der unterschiedlich mit Dexamethason behandelten CFBE41o
--Zellen
In der Abbildung ist der gemittelte prozentuale ENaC-Stromanteil von den Kontrollmessungen und den 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten Zellen dargestellt. Die Kontrollmessungen weisen, nach 24 gemessenen Filtern, den geringsten prozentualen ENaC-Stromanteil mit 21,67 ± 2,56% auf. Der prozentuale ENaC-Strom der 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen ist, nach 22 und 25 gemessenen Filtern, fast gleich und liegt bei 25,17 ± 3,07% und 25,21 ± 2,29%. Es konnte bei der Analyse kein signifikanter Unterschied des prozentualen ENaC-Stromanteils im Vergleich zwischen den unterschiedlich behandelten Zellen ermittelt werden.
Ergebnisse 49
4.2.2 Elektrophysiologische Messungen der 16HBE14o--Zellen mit und ohne Dexamethasonbehandlung
Die 16HBE14o--Zellen wurden genauso behandelt und gemessen wie die CFBE41o--
Zellen. Auch die Kontrollmessungen der 16HBE14o--Zellen zeigten ein Absinken des
Kurzschlussstroms nach Hinzugeben von Amilorid. Zu beobachten war, dass die Antwort
auf Amilorid bei jedem Filter unterschiedlich ausfiel (siehe Abbildung 17). Nach dem
Hinzugeben des Na+-freien Ringers war ein weiteres Absinken des Kurzschlussstroms zu
sehen. Durch das Hinzugeben von Zellkulturringer wurde die Reversibilität von Amilorid,
nach der Zugabe von Na+-freiem Ringer, gezeigt. In Abbildung 17 sind zwei Zeitverläufe
als Beispiel dargestellt, die die unterschiedliche funktionale Expression des ENaC-Kanals
zeigen. Im Zeitverlauf A ist eine 23,90%ige Amiloridantwort und in Zeitverlauf B eine
12,75%ige Amiloridantwort beobachtet worden. Auch diese beiden Beispielmessungen
weisen wie die Beispielmessungen der Kontrollmessungen der CFBE41o--Zellen auf den
nicht stabilen ENaC-Strom hin. Die gemessenen Filter der 16HBE14o--Zellen besitzen
einen gemittelten prozentualen ENaC-Strom von 23,42 ± 2,48% und die gemittelten
Initialwerte für den Widerstand und der Kapazität liegen bei 785,3 ± 5,91 Ω*cm und
1,25 ± 0,02 µF.
B) A)
50 Ergebnisse
Abbildung 17: Messverlauf von 16HBE14o--Zellen ohne Dexamethason-Inkubation
(Kontrollmessungen)
Die Abbildung zeigt die zeitlichen Verläufe zweier Ussing-Kammer Messungen der 16HBE14o--
Zellen ohne Dexamethasonbehandlung. Auf der y-Achse ist der gemessene Kurzschlussstrom (ISC) in µA/cm
2 gegen die Zeit in min auf der x-Achse aufgetragen. Der Abbildung kann entnommen
werden welche verschiedenen Lösungen den Zellen während der Ussing-Kammer Messungen apikal hinzugegeben wurden. Zeitverlauf A zeigt mit 23,09% eine stärkere Amiloridantwort als Zeitverlauf B mit 12,75%.
Die Messungen der 16HBE14o--Zellen nach einer 3h und 24 h Inkubation mit
Dexamethason erfolgten wie die der CFBE41o--Zellen. Auch bei den 16HBE14o--Zellen
wurde eine stärkere Amiloridantwort durch die Stimulation des Glucocorticoids
Dexamethason erwartet. Bei den 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten Zellen war
eine starke Antwort auf Amilorid und eine noch stärkere Antwort auf Na+-freien Ringer zu
beobachten. Verglichen mit den Kontrollmessungen, zeigten die behandelten Zellen, 3 h
und 24 h mit Dexamethason, eine kaum stärkere Amiloridantwort. Die 3 h mit
Dexamethason inkubierten Zellen besitzen einen gemittelten prozentualen ENaC-Strom
von 25,79 ± 2,99% und die, der 24 h mit Dexamethason inkubierten Zellen, einen von
25,88 ± 2,40%. Die gemittelten Initialwerte der 3 h mit Dexamethason behandelten Zellen
des Widerstands und der Kapazität liegen bei 786,83 ± 71,34 Ω*cm und 1,26 ± 0,02 µF.
Die gemittelten Initialwerte des Widerstands und der Kapazität bei den 24 h mit
Dexamethason behandelten Zellen betragen 256,95 ±21,1 Ω*cm und 1,14 ± 0,05 µF.
Die gemittelten Initialwerte des Kurzschlussstroms (ISC), der Leitfähigkeit (Gm), der
Kapazität (Cm) und des Widerstands (Rt) sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Anhand
A) B)
Ergebnisse 51
der Tabelle ist zu beobachten, dass je länger die Zellen mit Dexamethason behandelt
wurden die Leitfähigkeit gesunken und somit der Widerstand erhöht war.
Tabelle 14: Mittelwerte der Initialwerte mit Standartfehler der 16HBE14o--Zellen
Zellen Anzahl der
Filter ISC [µA/cm2]
Gm
[mS/cm2] Cm [µF] Rt [Ω*cm]
16HBE14o-
Kontrolle 20 1,99 ± 0,4 1,51 ± 0,16 1,25 ± 0,02
785,3 ± 5,91
16HBE14o- 3 h Dex
24 2,82 ± 0,42 1,52 ± 0,13 1,26 ± 0,02 786,83 ± 71,34
16HBE14o-
24 h Dex 23 2,34 ± 0,47 1,29 ± 0,13 1,27 ± 0,02
979,81 ± 90,17
Die Gegenüberstellung der Messergebisse der unterschiedlich mit Dexamethason
behandelten 16HBE14o--Zellen zeigten wie die CFBE41o--Zellen, nach der Analyse mit
dem Statistikprogramm OriginPro 6.1, keinen signifikanten Unterschied. Die 3 h und 24 h
mit Dexamethason behandelten Zellen weisen eine Tendenz zu einer Erhöhung zu den
Kontrollmessungen auf. So zeigten die Kontrollmessungen einen gemittelten prozentualen
ENaC-Strom von 23,42 ± 2,48% und die 3 h und 24 h mit Dexamethason von
25,79 ± 2,99% und 25,88% ± 2,40%.
52 Ergebnisse
Abbildung 18: Gegenüberstellung der unterschiedlich mit Dexamethason behandelten 16HBE14o
--Zellen
Die Abbildung zeigt den gemittelten prozentualen ENaC-Stromanteil der Kontrollmessungen und der 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen. Die Kontrollmessungen zeigen nach 21 gemessenen Filtern den geringsten prozentualen ENaC-Stromanteil mit 23,42 ± 2,48%. Die 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten Zellen besitzen, nach 24 und 23 gemessenen Filtern, einen leicht erhöhten prozentualen ENaC-Stromanteil mit 25,79 ± 2,99 und 25,88 ± 2,40%. Bei der Analyse konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Kontrollmessungen und den mit Dexamethason behandelten Zellen nachgewiesen werden.
4.2.3 Gegenüberstellung der Ussing-Kammer Messwerte der CFBE41o-- und 16HBE14o--Zelllinien
In dem folgenden Abschnitt werden die gemittelten prozentualen ENaC-Stromanteile der
Zelllinien CFBE41o- und 16HBE14o- gegenübergestellt. Dies lässt einen genaueren
Vergleich zwischen den beiden Ziellinien zu und ermöglicht eine Aussage über eine
eventuell unterschiedliche Stimulation des Dexamethasons bei den jeweiligen Zelllinien.
Der prozentuale ENaC-Stromanteil der CFBE41o--Zellen ist insgesamt geringer als bei
den 16HBE14o--Zellen. Es war zu beobachten, dass beide Zelllinien ähnlich stark mittels
des Glucocorticoids Dexamethason stimuliert werden konnten. So wurde der gemittelte
prozentuale ENaC-Strom bei den CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen nach einer 3-
stündigen Inkubation mit Dexamethason um ca. 3,5% und ca. 2,37% erhöht. Nach einer
24-stündigen Inkubation mit Dexamethason der CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen wurde
ein erhöhter gemittelter prozentualer ENaC-Strom von ca. 3,54% und ca. 2,46%
Ergebnisse 53
beobachtet. In der folgenden Abbildung sind die Messdaten der Abbildungen 16 und 18
zum Vergleich des prozentualen ENaC-Stromanteils der beiden Zelllinien CFBE41o- und
16HBE14o- dargestellt.
Abbildung 19: Gegenüberstellung beider Zelllinien
In der Abbildung ist der gemittelte prozentuale ENaC-Stromanteil der Kontrollmessungen und der 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten CFBE41o
-- und 16HBE14o
--Zellen, dargestellt. Die
CFBE41o--Zellen (cyan) besitzen in den Kontrollmessungen und den 3 h und 24 h mit
Dexamethason behandelten Zellen, einen leicht geringeren prozentualen ENaC-Stromanteil als die der 16HBE14o
--Zellen (blau). Der Unterschied bei den Kontrollmessungen liegt bei 1,75%, bei den
3 h mit Dexamethason inkubierten Zellen bei 0,62% und bei den 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen bei 0,67%.
4.3 Proteinbestimmung
4.3.1 Western Blot Analyse zur Untersuchung der Expression von α- und δ-ENaC Untereinheiten
Die α- und δ-ENaC Proteinexpression der CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen sollten
mittels 1 µM Dexamethason erhöht und mittels Western Blot Analyse untersucht werden.
Hierfür wurden die Zellen beider Zelllinien auf Zellkulturfalschen kultiviert, auf denen diese
konfluente Monolayer bilden konnten (Abschnitt 3.3.1). Die Inkubation erfolgte 3 h und
54 Ergebnisse
24 h vor der Proteinisolation (Abschnitt 3.1.10). Zum Vergleich dienten unbehandelte
Zellen als Kontrollen. Anschließend wurde eine Gelelektrophorese nach Laemmli
durchgeführt (Abschnitt 3.3.3). Die Expression von α- und δ-ENaC UE sowie α-Tubulin
wurde mittels Western Blot Analyse mit spezifischen Antikörpern untersucht (Abbildungen
20, 22, 23 und 25). Dadurch, dass die untersuchten Proteine unterschiedliche
Molekulargewichte besitzen, konnte die Membran nach der Detektion in zwei Teile
geschnitten und gleichzeitig mit den verschiedenen Antikörpern behandelt werden. α-
Tubulin ist ein zytosolisches, nicht-regulierendes Protein, welches in allen Zellen ubiquitär
exprimiert wird. Das Molekulargewicht von α-Tubulin liegt bei ca. 60 kDa. In diesem
Versuch diente α-Tubulin als Ladekontrolle der Proteine und als Qualitätskontrolle der
Zellen. Durch die Detektion des α-Tubulin ist es möglich eine Aussage über die
unterschiedlichen Expressionsraten der α- und δ-ENaC UE in den CFBE41o-- und
16HBE14o--Zellen zu treffen.
4.3.1.1 CFBE41o--Zelllinie
α-ENaC wurde in den Proteinlysaten der CFBE41o--Zellen nach der Gelelektrophorese
mit einem molekularen Gewicht von ca. 120 kDa detektiert. Zudem wurde eine zweite
Bande von α-ENaC bei ca. 125 kDa detektiert (siehe Abbildung 20). Die hier detektierten
Banden könnten eine ubiquitinierte Form des ENaC-Kanals darstellen [Ruffieux-Daidié et
al., 2008]. α-Tubulin wurde in den untersuchten Proben gleich stark exprimiert. Das deutet
darauf hin, dass die Proteinlysate zum einen mit der gleichen Proteinkonzentration
aufgetragen wurden und zum anderen, dass die Proteinlysate, von der Qualität, in einem
guten Zustand waren.
Ergebnisse 55
Abbildung 20: Nachweis von α-ENaC und α-Tubulin in CFBE41o--Zellen durch Immunoblot-
analysen
Die oberen Banden zeigen den Nachweis von α-ENaC durch die Verwendung eines α-ENaC spezifischen Antikörpers bei einer Größe von ca. 120 und 125 kDa. Zur Größenidentifikation wurden 5µl des PageRuler
® Prestained Protein Ladder verwendet. Zum Abgleich der
aufgetragenen Proteinmengen und zum Nachweis der Qualität der Zellen, wurde eine Western Blot Analyse mit einen spezifisch gegen α-Tubulin gerichteten Antikörper (untere Banden, ca. 60 kDa) durchgeführt.
Um die detektierten Banden densiometrisch auszuwerten, wurden diese mittels des
Computerprogramms Image J 1.45s von Wayne Rasband (National Institutes of Health,
USA) hinsichtlich der Farbdichte analysiert. Es wurden beide detektierten Banden (ca.
120 und 125 kDa) ausgewertet und in Relation zu den α-Tubulin Ergebnissen normalisiert.
Anschließend wurden die Werte der unbehandelten Zellen auf 100% gesetzt, um die 3 h
und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen, in Relation zu den Kontrollen zu
normalisieren. Die errechneten Messdaten wurden mittels des Computerprogramms
OriginPro 6.1 analysiert (siehe Abbildung 21). In der folgenden Abbildung ist eine
Tendenz der unterschiedlich starken Expression der α-ENaC UE in den mit
Dexamethason verschieden behandelten Proben zu erkennen. Die Zellen, die 24 h mit
Dexamethason behandelt wurden, exprimieren die α-ENaC UE am stärksten. Es ist eine
Steigerung der α-ENaC Proteinexpression von 10,94 ± 22,35%, bezogen auf die
Kontrollen, zu erkennen. Bei den detektierten Banden der unbehandelten und der 3 h mit
Dexamethason behandelten Zellen ist ein Abfall von ca. 12,08 ± 16,82% der
Proteinexpression der α-ENaC UE, bezogen auf die Kontrollen, zu erkennen.
56 Ergebnisse
Abbildung 21: Untersuchung der α-ENaC UE der CFBE41o--Zellen durch unterschiedliche
Dexamethasonbehandlung
In der Abbildung ist die prozentuale ENaC Proteinexpression der mit Dexamethason unterschiedlich behandelten Zellen dargestellt. Für die Auswertung wurde das Computerprogram OriginPro 6.1 verwendet. Für die Auswertung wurden von allen drei Proben drei Proteinisolationen mit je einer Western Blot Analyse durchgeführt. Die unbehandelten Zellen (Kontrollen) wurden auf 100% gesetzt und in Relation zu den 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen normalisiert. In Bezug auf die Kontrollen weisen die 3 h mit Dexamethason behandelten Zellen eine geringere und die 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen eine höhere Expression der α-ENaC UE auf. Die 3 h mit Dexamethason behandelten Zellen besitzen im Vergleich zu den Kontrollen eine 12,08 ± 16,82% geringere und die 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen eine 10,94 ± 22,35% höhere α-ENaC UE Proteinexpression.
Die Western Blot Analyse der δ-ENaC UE wurde mit zwei unterschiedlich spezifisch
gegen δ-ENaC gerichteten Antikörpern untersucht. δ-ENaC kann nach Angaben des
Antikörperherstellers (Santa Cruz) mit einem Molekulargewicht von ca. 110 kDa
nachgewiesen werden. Bei den Untersuchungen der δ-ENaC Proteinexpression wurden
in der ersten durchgeführten Methode (1. AK Santa Cruz (H-230) mehrere Banden
detektiert. Es wurden auch Banden mit einem Molekulargewicht von 110 kDa detektiert,
jedoch sind zu viele weitere Banden vorhanden, dass keine genaue Aussage getroffen
werden kann, welche Bande die δ-ENaC UE darstellt (Abbildung 22 A). Bei den
Untersuchungen mit der zweiten Methode (1.AK Santa Cruz (N-20) wurden spezifische
Banden auf einer Höhe von ca. 110 kDa detektiert. Durch den starken Hintergrund, der
höchstwahrscheinlich durch die Bindung des zweiten Antikörpers an die Membran
entstanden ist, konnten die Banden nicht ausgewertet werden (Abbildung 22 B). Bei
beiden Western Blot Analysen wurde eine Untersuchung mit einem spezifisch gegen α-
Tubulin gerichteten Antikörper durchgeführt. Anhand der erfolgreichen Expression von α-
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Inkubation mit Dexamethason
Ergebnisse 57
Tubulin kann gesagt werden, dass die Zelllysate vergleichbar waren. Zusammenfassend
kann aus diesen Ergebnissen die Aussage getroffen werden, dass zu der Expressionsrate
der δ-ENaC UE in den CFBE41o--Zellen keine Auswertung erfolgen kann.
Abbildung 22: Darstellung der δ-ENaC UE und α-Tubulin in CFBE41o--Zellen durch
Immunoblotanalysen
Bei der Western Blot Analyse A wurde mit dem spezifisch gegen δ-ENaC gerichteten Antikörper H-230 gearbeitet. Durch die vielen detektierten Banden ist keine Aussage über die Expression von δ-ENaC zu treffen, obwohl eine Bande bei 110 kDa detektiert wurde, die nach Angaben des Herstellers die δ-ENaC UE nachweist. Auf dem Blot B ist eine spezifische Bande bei ca.110 kDa zu sehen, die höchstwahrscheinlich die δ-ENaC UE darstellt. Durch den starken Hintergrund bei dieser Analyse kann keine Auswertung der Expression von δ-ENaC erfolgen. Zum Abgleich der aufgetragenen Proteinmengen und Nachweis der Qualität der Zellen, wurde eine Immunoblotanalyse mit einen spezifisch gegen α-Tubulin gerichteten Antikörper (untere Banden in Beiden Immunoblotanalysen, ca. 60 kDa) durchgeführt. In beiden Versuchen wurde eine Positivkontrolle, MIA PaCa-2 mitgeführt.
4.3.1.2 16HBE14o--Zelllinie
Bei der Western Blot Analyse der 16HBE14o--Zellen zur Untersuchung der α-ENaC
Proteinexpression wurden wie bei den CFEBE41o--Zellen zwei Banden detektiert. Die
detektierten Banden wiesen eine Größe von ca. 120 kDa und 125 kDa auf. Auch hier
wurden möglicherweise ubiquitinierte Formen des ENaC-Kanals beobachtet. Wie bei den
Immunoblotanalysen zuvor, wurde α-Tubulin in den untersuchten Proben gleich stark
exprimiert. Das deutet auf gleiche Proteinkonzentrationen und gute Qualität der
Proteinlysate hin (Abbildung 23).
A) B)
58 Ergebnisse
Abbildung 23: Nachweis von α-ENaC und α-Tubulin in 16HBE14o--Zellen durch
Immunoblotanalysen
In der Abbildung sind zwei Banden mit den Größen von ca. 120 kDa und 125 kDa, die mittels des spezifisch gegen α-ENaC gerichteten Antikörpers detektiert wurden, dargestellt. Zusätzlich ist eine weitere Bande, die mit einem spezifisch gegen α-Tubulin gerichteten Antikörper detektiert wurde, von ca. 60 kDa zu sehen. α-Tubulin dient zum Abgleich der aufgetragenen Proteinmengen und zum Nachweis der Qualität der Zellen.
Nach erfolgreicher Detektion der α-ENaC UE durch einen spezifischen Antikörper,
konnten diese mit dem Programm Image J 1.45s von Wayne Rasband (National Institutes
of Health, USA) auf ihre Farbdichte hin analysiert werden. Zunächst wurden die
Messdaten der α-ENaC UE in Relation zu den Messdaten des α-Tubulin normalisiert.
Anschließend wurden die analysierten Ergebnisse der Kontrollen auf 100% gesetzt, um
im weiteren Verfahren die Messdaten der 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten
Zellen in Relation zu den Kontrollen zu normalisieren und mit dem Computerprogram
OriginPro 6.1 auszuwerten. Nach der Western Blot Analyse und der Auswertung war eine
Tendenz mit einer leichten Steigerung der α-ENaC Proteinexpression bei den 3 h und
24 h mit Dexamethason behandelten Zellen zu erkennen (siehe Abbildungen 23 und 24).
Die errechnete Steigerung der α-ENaC Proteinexpression bei den 3 h und 24 h mit
Dexamethason behandelten Zellen im Vergleich zu den Kontrollen liegt bei 15,52 ± 13,1%
und 0,51 ± 15,62%. Dies zeigt, dass die α-ENaC Proteinexpression bei den 16HBE14o--
Zellen am stärksten nach 3 h Dexamethasonbehandlung ist.
Ergebnisse 59
Abbildung 24: Untersuchung der α-ENaC UE der 16HBE14o--Zellen durch unterschiedliche
Dexamethasonbehandlung
Die Abbildung zeigt die gemittelte prozentuale Proteinexpression der unterschiedlich mit Dexamethason behandelten Zellen, die mit dem Statistikprogramm OriginPro 6.1 ausgewertet wurden. Je drei Proteinisolationen mit je einer Western Blot Analyse diente für die Auswertung. Für die Auswertung wurden die Kontrollen auf 100% gesetzt und in Relation zu den 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen normalisiert. Die 3 h mit Dexamethason behandelten Zellen weisen eine 15,52 ± 13,1% höhere α-ENaC Proteinexpression auf als die Kontrollen. Die α-ENaC Proteinkonzentrationen bei den 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen ist leicht stärker, mit 0,51 ± 15,62%, als bei den Kontrollen.
Die Detektion der δ-ENaC UE wurde wie bei den CFBE41o--Zellen mit zwei
unterschiedlich spezifisch gegen δ-ENaC gerichteten Antikörpern durchgeführt. Bei der
ersten Methode mit dem Antikörper Santa Cruz (H-230) wurden wie bei den CFBE41o--
Zellen sehr viele Banden detektiert. Nach Angaben des Herstellers, sollte δ-ENaC mit
einem Molekulargewicht von 110 kDa nachgewiesen werden. Die entsprechende Bande
ist nach der Western Blot Analyse detektiert worden, jedoch konnte durch das Auftreten
der anderen Banden keine genaue Aussage getroffen werden, ob die Bande bei 110 kDa
die δ-ENaC UE darstellt (siehe Abbildung 25 A). Nach einer Western Blot Analyse mit
dem Antikörper Santa Cruz (N-20), konnte eine spezifische Bande bei 110 kDa detektiert
werden. Jedoch war wie bei den CFBE41o--Zellen der Hintergrund sehr stark, so dass die
detektierten Banden nicht auswertbar waren. Auch bei den hier untersuchten Zellen
könnte der starke Hintergrund durch die Bindung des 2. Antikörpers an die Membran
entstanden sein (siehe Abbildung 25 B). Dass die Zelllysate in einem guten Zustand
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Inkubation mit Dexamethason
60 Ergebnisse
waren, konnte durch die Untersuchung mittels eines spezifisch gegen α-Tubulin
gerichteten Antikörpers, gezeigt werden. Zusammenfassend kann aus diesen
Ergebnissen keine Aussage über die Proteinexpression der δ-ENaC UE getroffen werden.
Abbildung 25: Darstellung der δ-ENaC UE und α-Tubulin in 16HBE14o--Zellen durch
Immunoblotanalysen
In der Abbildung A wird die Western Blot Analyse mit dem spezifisch gegen δ-ENaC gerichteten Antikörper H-230 gezeigt. δ-ENaC besitzt laut dem Hersteller (Santa Cruz) ein Molekulargewicht von ca. 110 kDa. Diese Bande ist in der Abbildung A dargestellt, jedoch sind noch weitere Banden auf dem Blot zu sehen. In der Abbildung B sind spezifische Banden für die δ-ENaC UE detektiert, jedoch ist ein sehr starker Hintergrund auf diesem Blot zu erkennen. Die Detektion von α-Tubulin (ca. 60 kDa) diente zum Abgleich der Proben und zum Nachweis der Qualität der Zellen.
4.3.2 Vergleich der Immunoblotanalysen der Zelllinien CFBE41o- und 16HBE14o-
Im folgenden Abschnitt sind die α-ENaC UE Proteinkonzentrationen der verschieden mit
Dexamethason behandelten Zellen beider Zelllinien dargestellt. Dies lässt eine Aussage
über eine eventuell unterschiedliche Stimulation des Dexamethasons, der beiden
Zelllinien, treffen. Die unbehandelten Zellen wurden für diesen Vergleich wieder auf 100%
gesetzt, um die 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten Zellen in Relation zu den
Kontrollen zu normalisieren. Innerhalb der Zelllinien hat man einen gegenteiligen Effekt
des Dexamethasons auf die 3 h und 24 h inkubierten Zellen gesehen. So ist bei den 3 h
mit Dexamethason behandelten CFBE41o--Zellen ein Absinken der Proteinkonzentration
A) B)
Ergebnisse 61
von 12,08 ± 16,82 zu erkennen. Im Gegensatz dazu zeigt sich bei den 16HBE14o--Zellen
ein Anstieg der Proteinkonzentration von 15,52 ± 13,1%. Bei den 24 h mit Dexamethason
behandelten Zellen steigt die Proteinexpression der CFBE41o--Zellen um 10,94 ± 22,35%
und bei den 16HBE14o--Zellen um nur 0,51 ± 15,62%. In der folgenden Abbildung sind
die prozentualen ENaC Proteinkonzentrationen der beiden Zelllinien aus den beiden
Abbildungen 21 und 24 dargestellt.
Abbildung 26: Gegenüberstellung der unterschiedlichen Expressionsraten von α-ENaC bei CFBE41o
-- und 16HBE14o
--Zellen
In der Abbildung ist die gemittelte prozentuale α-ENaC Proteinexpression der Kontrollen und der 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten, CFBE41o
-- und 16HBE14o
--Zellen, dargestellt. Die
Kontrollen wurden für beide Zelllinien auf 100% normalisiert. Der Unterschied bei den 3 h mit Dexamethason inkubierten Zellen liegt bei 27,6% und bei den 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen bei 10,43%. Dabei ist zu beachten, dass bei den 3 h mit Dexamethason behandelten Zellen, die 16HBE14o
--Zellen in der α-ENaC Proteinexpression steigen und die CFBE41o
--Zellen in dieser
sinken. Bei den 24 h mit Dexamethason behandelten CFBE41o-- Zellen steigt die α-ENaC-
Proteinexpression mehr als bei den 16HBE14o--Zellen.
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Inkubation mit Dexamethason
62 Diskussion
5 Diskussion
Seit der Entdeckung des CFTR-Gens 1989 ist die Forschung für die Krankheit
Mukoviszidose weit voran geschritten [Riordan et al., 1989b]. Zu Anfang wurde das
Hauptaugenmerk auf den gestörten Cl--Ionenkanal CFTR gelegt. Heute weiß man, dass
die Symptome vermehrt auch durch die Na+-Hyperabsorption durch den ENaC auftreten
[Mall et al., 2004; Bangel et al., 2008]. Durch die Dysfunktionen des epithelialen
Transportes wird dem Mukus Wasser entzogen und der Abtransport des ASL ist nicht
gewährleistet. Der Schutzmechanismus MCC kann nicht weiter erfolgen und es kommt zu
schwerwiegenden Folgeerkrankungen wie schwere Lungenentzündungen und
Lungenödeme [Hirche et al., 2005; Thelin und Boucher, 2007]. Zurzeit wird an
vielzähligen Therapieansätzen geforscht. Die Gentherapie ist nur ein Ansatz in der
Forschung, diese setzt bei der grundlegenden Ursache dieser Krankheit an. Es gibt viele
Forschungsansätze, die die auftretenden Begleiterkrankungen und Symptome lindern
sollen. Zum einen durch Einnahme von Amilorid, zum anderen durch das Einbringen von
Antisense Oligonukleotidsequenzen oder siRNA Sequenzen, die zum Abbruch oder
Inhibieren des ENaC-Kanals führen sollen [Hofmann et al., 1998; Sobczak et al., 2009;
Clark et al., 2013]. Somit wäre auch die Na+-Hyperabsorption reduziert und der
Schutzmechanismus MCC könnte wieder funktionieren. Um solche Forschung zu
betreiben, werden oftmals humane Zelllinien verwendet, da diese dem Organismus der
menschlichen Zelle am nächsten und zudem leicht kultivierbar sind. Aus diesem Grund
wurde in dieser Arbeit versucht, zwei humane Bronchialepithelzellen, CFBE41o- und
16HBE14o-, für diese Forschungen zu optimieren. Die CFBE41o-- und 16HBE14o--
Zelllinien sind humane Bronchialepithelzelllinien, wobei die CFBE41o--Zellen aus einem
Mukoviszidosepatienten und die 16HBE14o--Zellen aus einem gesunden Patienten
stammen. Die CFBE41o--Zellen weisen die am häufigsten auftretende Mutation ΔF508
auf [Gruenert et al., 2004; Ehrhardt et al., 2006]. Beide Zelllinien sind etablierte
Modellsysteme für die Mukoviszidoseforschung. Sie sind in der Lage polarisierte
Monolayer und tight junctions auszubilden, was eine elektrophysiologische Messung an
der Ussing-Kammer zulässt. Jedoch besitzen die Zellen keinen stabilen ENaC-Strom, der
über die Ussing-Kammer gemessen werden kann [Rubenstein et al., 2010; Lemke, 2012].
Damit die Zellen als Modellsystem für Mukoviszidose besser geeignet sind, indem sie
auch die Ionentransporteigenschaften im Hinblick auf ENaC erfüllen, wird in der
Diskussion 63
vorliegenden Masterarbeit untersucht, welchen Einfluss verschiedene Inkubationszeiten
des Glucocortikoids Dexamethason auf die funktionale Expression und die
Proteinexpression des ENaC ausübt.
Im ersten Teil der Diskussion wird genauer auf die funktionale ENaC-Expression, die
durch die verschiedenen Inkubationszeiten mit Dexamethason stimuliert werden sollte,
eingegangen. Der zweite Teil der Diskussion behandelt die Einwirkung der verschiedenen
Inkubationszeiten des Dexamethasons zur Stimulierung der α- und δ- ENaC UE
Proteinexpression.
5.1 Untersuchungen zur funktionalen ENaC Expression durch elektrophysiologische Messungen
Mittels Ussing-Kammer Messungen wurde die Wirkung des Dexamethasons (1 µM), nach
verschiedenen Inkubationszeiten, auf die funktionale ENaC Expression der CFBE41o- und
16HBE14o--Zellen untersucht. Zudem sollte der ENaC-Strom, welcher von der δ-ENaC
UE generiert wird, ermittelt werden. Da in diesen beiden Zelllinien der Amilorid-sensitive
Na+-Strom über den ENaC nicht zuverlässig konstant ist, wurde in dieser Arbeit versucht
die funktionale Expression mittels des Dexamethasons zu erhöhen. Für diese Versuche
wurden beide Zelllinien zunächst auf spezielle Zellkulturfilter ausgesät. Nach 8 Tagen
waren die Zellen zu einem konfluenten Monolayer auf den Filtern herangewachsen und
konnten gemessen werden. 3 h und 24 h vor der Messung wurden die Zellen mit
Dexamethason inkubiert.
Die unbehandelten Zellen (Kontrollmessungen) wiesen einen prozentualen ENaC-
Stromanteil gemessen am Gesamt-Na+-Strom von etwa 21,67 ± 2,56% auf. Da die Zellen
keinen stabilen ENaC-Strom besitzen, ist dieses verglichen zu früheren Arbeiten mit
gesunden humanen Nasenepithelzellen, wo der Amilord-sensitive Na+-Strom 39,1 ± 2,3%
betrug, noch sehr hoch [Bangel-Ruland et al., 2010]. Die Arbeitsgruppe um Rubenstein
untersuchte inwieweit das Glucocorticoid Dexamethason die funktionale Expression
erhöht. Für die Versuche verwendeten sie unter anderem die CFBE41o--Zellen. Diese
wurden wie in dieser Arbeit auf Zellkulturfilter ausgesät, damit die Zellen eine polarisierte
Monolayer bilden konnten. 24 h vor der Messung wurden Zellen mit 1 µM Dexamethason
inkubiert. Auch die Arbeitsgruppe um Rubenstein untersuchte den ENaC-Strom mittels
der Ussing-Kammer. Dabei war in den Kontrollmessungen kaum Amilord-sensitiver Na+-
Strom durch den ENaC gemessen worden [Rubenstein et al., 2010]. Dies zeigt noch
deutlicher, wie hoch der hier gemittelte Amilorid-sensitive Na+-Strom ist. Betrachtet man
64 Diskussion
die einzelnen prozentualen Werte des Amilorid-sensitiven Na+-Stroms, kann
geschlussfolgert werden, dass dieser in den Zellen nicht zuverlässig konstant ist (siehe
Tabelle 27 in den Anlagen). Die 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen
besitzen einen prozentualen ENaC-Strom von 25,17 ± 3,02% und 25,21 ± 2,29%. Durch
die Stimulation des Glucocorticoids Dexamethason wurde ein höherer Anstieg des ENaC-
Stroms erwartet. Da das Glucocorticoid Dexamethason nicht nur an den
Mineralcorticoidrezeptor (MR), wie das Aldosteron, sondern auch an den
Glucocorticoidrezeptor (GR) bindet, sollte eine Steigerung der funktionalen Expression
des ENaC-Kanals in der Ussing-Kammer messbar sein. Dadurch, dass das
Dexamethason am GR bindet, gelangt dieses in den Zellkern und kann dort an
Glucocorticoid-responsive Elemente auf der DNA binden und so die Transkription der
Zielgene bewirken [Chow et al., 1999; Buttgereit, 2000; Reul et al., 2000; Gold et al.,
2001; Buttgereit und Scheffold, 2002; Kellendonk et al., 2002]. Eines dieser Proteine ist
die SGK1, die mit PKA Nedd4 durch Phosphorylierung inhibiert und die Endozytose mit
folgender Degradation des ENaC-Kanals verhindert. Aus diesem Grund sollten die ENaC-
Kanäle nicht aus der Zellmembran entfernt werden und in einem aktiven Zustand
vorliegen. Durch diesen Effekt sollte eine sichtliche Steigerung des Amilord-sensitiven
Na+-Stroms über den ENaC vorhanden sein. Die Steigerung bei den Zellen, die 3 h mit
Dexamethason behandelt wurden betrug in dieser Arbeit ca. 3,5%. Dies könnte an dem
sehr hohen Amilorid-sensitiven Na+-Strom liegen, der schon ohne die Behandlung des
Dexamethasons vorhanden war (siehe Kontrollmessungen). So könnten die vorhandenen
ENaC-Kanäle überwiegend aktiv in der Zellmembran eingebaut gewesen sein, sodass
durch das Zugeben des Dexamethasons, Nedd4 zwar inhibiert wurde, jedoch nur ein
kleiner Anteil der ENaC-Kanäle vorher in einen inaktiven Zustand überführt wurde. Die
geringe Steigerung des Amilorid-sensitiven Stroms könnte aber auch Aufgrund der kurzen
Inkubationszeit entstanden sein. Das Hinzugeben des Dexamethasons 3 h vor der
Messung könnte für die Regulation in der Zelle ein zu kurzer Zeitraum gewesen sein. Die
untersuchten Zellen, die 24 h mit Dexamethason behandelt wurden, weisen eine
3,54%ige Erhöhung des Amilorid-sensitiven Na+-Stroms auf. Auch bei dieser
Inkubationszeit erwartete man einen stärkeren Anstieg des untersuchten Amilorid-
sensitiven Na+-Stroms. Auch hier könnte die Möglichkeit bestehen, dass die vorhandenen
ENaC-Kanäle schon aktiv in der Zellmembran eingebaut waren. Jedoch kann bei dieser
Inkubationszeit nicht darauf geschlossen werden, dass die Zeit für die ablaufenden
Mechanismen in der Zelle zu kurz waren, da in früheren Arbeiten eine optimale
Inkubationszeit von 24 h ermittelt worden war [Dagenais et al., 2001]. In dieser Studie von
der Arbeitsgruppe um Dagenais wurde an alveolaren Rattenepithelzellen untersucht,
Diskussion 65
welche Auswirkungen das Dexamethason nach verschiedenen Inkubationszeiten auf die
funktionale ENaC Expression besitzt. Sie untersuchten die funktionale ENaC Expression
an 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, und 48 h mit Dexamethason behandelten Zellen in der Ussing-
Kammer. Die optimalsten Ergebnisse stellten die 24 h mit Dexamethason inkubierten
Zellen dar [Dagenais et al., 2001]. Zudem wird vermutet, dass das Glucocorticoid
Dexamethason im Mechanismus ähnlich wie das Mineralcorticoid Aldosteron auf die
funktionale ENaC Expression einwirkt. Bei Aldosteron existieren zum einen der langsame
genomische und zum anderen der schnelle nicht genomische Weg, um die funktionale
ENaC Expression zu erhöhen. Bei dem langsamen genomischen Weg kann wie einleitend
erklärt, Aldosteron durch Bindung an ein Mineralcorticoidrezeptor an empfängliche
Elemente der DNA binden und durch Transkription und Translation die Expression der
Zielproteine erhöhen oder vermindern. Bei diesem Vorgang werden sowohl die Na+/K+-
ATPase als auch der ENaC und die SGK1 vermehrt exprimiert [Chen et al., 1999]. Durch
SGK1 wird die Ubiquitin-Ligase Nedd4-2 phosphoryliert und somit inhibiert [Snyder et al.,
2004]. Nedd4-2 ubiqitiniert im aktiven Zustand ENaC und dieser gelangt über Endozytose
ins Zytoplasma, wo ENaC kurz vor der Degradation steht [Staub et al., 1997]. Bei dem
kurzen nicht genomischen Weg wird vermutet, dass die funktionale ENaC Expression
durch posttranslationale Modifikationen, z.B. Phosphorylierungen, wieder hergestellt wird
[Eaton et al., 2001]. Bei dem genomischen Weg wurde gezeigte, dass die funktionale
ENaC Expression in zwei Phasen stattfindet. So wurde der ENaC-Strom um das 4 bis 6
fache in den ersten 2-6 h und in der späten Phase zwischen 12-48 h zusätzlich nochmal
um das 3 bis 4 fache erhöht [Eaton et al., 2001]. Im Gegensatz zu dem genomischen
Weg, zeigte der nicht genomische Weg eine Erhöhung des ENaC-Stroms nach weniger
als 2 min [Zhou und Bubien, 2001]. Aus diesen Studien wird die Vermutung für die
Ergebnisse in dieser Arbeit unterstützt, dass eine Inkubationszeit von 24 h besser
geeignet ist, als eine von 3 h. Zudem ist die Überlegung, ob die in dieser Arbeit
verwendete Konzentration von 1 µM des Dexamethasons, für die Inkubationszeiten von 3
h und 24 h, zu gering war. Da mit Zellen gearbeitet wurden, deren Amilorid-sensitive
Strom nicht zuverlässig mittels der Ussing Kammer gemessen werden konnte, könnte die
Konzentration von 1 µM, welches Verglichen zu anderen Zellen, z.B. H441 Zellen, eine
hohe Konzentration darstellt, zu gering sein. So wurden in anderen Studien mit anderen
Konzentrationen gearbeitet um den Amilorid-sensitiven Na+-Strom zu erhöhen. So zeigte
die Arbeitsgruppe um Richard in H441 Zellen, wie sich unterschiedliche Konzentrationen
des Dexamethasons auf den Amilorid-sensitiven Na+-Strom auswirken. So fanden sie
heraus, dass die unterschiedlichen Konzentrationen des Dexamethasons von 10 nM, 30
nM und 100 nM, einen jeweils gesteigerten Amilorid-sensitiven Na+-Strom der Zellen in
66 Diskussion
Ussing-Kammer Messungen aufwiesen. Der gemessene Strom lag bei den Zellen mit 10
nM bei 2,7 ± 0,7 µA/cm2, bei denen mit 30 nM bei 6,8 ± 1,6 µA/cm2 und denen mit 100 nM
bei 12,9 ± 2,0 µA/cm2 [Richard et al., 2004]. Aus diesen Arbeiten kann geschlussfolgert
werden, dass der Amilorid-sensitive Na+-Strom umso stärker ist, je höher die
Konzentration an Dexamethason ist. In der vorliegenden Arbeit kann durch die
gemessene Anzahl der Filter und der geringen Standardfehler bei den unterschiedlich
behandelten Zellen von einem aussagekräftigen Ergebnis ausgegangen werden. Auch die
gemittelten Widerstände bei den Zellen, 213,15 ± 11,99 Ω*cm2 (Kontrollen), 264,73 ± 18,1
Ω*cm2 (3 h) und 256,95 ± 21,1 Ω*cm2 (24 h), sind denen der Literaturangaben
entsprechend und besitzen keinen niedrigeren als 100 Ω*cm2 [Gruenert et al., 2004]. Dies
gibt Aufschluss darüber, dass der Amilorid-sensitive Na+-Strom überwiegend durch die
Zellen, transzellulär, erfolgt ist. Jedoch ist den gemittelten Initialwerten des
Kurzschlussstroms (ISC) unter Ringerlösung zu entnehmen, dass dieser, umso höher
wurde, je niedriger der Widerstand war. Das könnte geringe Auswirkungen auf die hier
ermittelten Werte haben, da der Widerstand bei den Kontrollmessungen am geringsten
war und somit der Ionenfluss zwar überwiegend transzellulär stattfand, jedoch eventuell
mehr parazelluläre Ströme auftraten, als bei den inkubierten Zellen. Die gemittelten
Initialwerte der Kapazität (Ct) zeigten keine großen Veränderungen. Eine
Schlussfolgerung der gemittelten Ergebnisse der Kapazität ist schwierig, da sich die
Kapazität während einer Messung verändert und Aufschluss über die endo- und
exozytotischen Prozesse in der Zellmembran gibt. Somit kann keine Aussage, aus den
gemittelten Werten der Kapazität, getroffen werden, ob durch die Stimulation des
Dexamethasons ENaC-Kanäle in die Zellmembran eingebaut wurden.
Die Messungen der 16HBE14o--Zellen sahen ähnlich aus wie die der CFBE41o--Zellen.
Der gemittelte Amilorid-sensitive Na+-Strom der Kontrollzellen lag bei 23,85 ± 2,48%. Da
diese Zellen wie die CFBE41o--Zellen keinen stabilen Amilorid-sensitiven Strom
aufweisen ist der gemittelte ENaC-Strom sehr hoch im Vergleich zu gesunden humanen
Nasenepithelzellen, wo dieser bei 39,1 ± 2,3% lag [Bangel-Ruland et al., 2010]. Betrachtet
man den Amilorid-sensitiven Strom der 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten
Zellen, der bei 25,79 ± 2,99% und 25,88 ± 2,40% liegt, ist dieses wie bei den CFBE41o--
Zellen, nicht den Erwartungen entsprechend. So ist bei diesen Zellen nach 3 h
Dexamethasonbehandlung nur eine 1,94%ige und bei den mit 24 h
Dexamethasonbehandlung eine 2,03%ige Erhöhung des Amilorid-sensitiven Stroms zu
erkennen. Da bei beiden Zelllinien ein ähnliches Ergebnis auftritt, kann für die 16HBE14o--
Zellen die gleichen Vermutungen getroffen werden wie bei den CFBE41o--Zellen. So
Diskussion 67
könnte auch hier die Konzentration des Dexamethasons (1 µM) zu gering für diese
Zelllinie gewesen sein.
Auch die Widerstände der unterschiedlich behandelten 16HBE14o--Zellen betrugen bei
den Kontrollmessungen 785 ± 5,91 Ω*cm2, bei den 3 h und 24 h mit Dexamethason
behandelten Zellen 786,83 ± 71,34 Ω*cm2 und 979,81 ± 90,17 Ω*cm2 und unterschritten
einen Literaturwert von 200 Ω*cm2 nicht [Gruenert et al., 2004]. Dieses lässt wieder darauf
schließen, dass überwiegend transzellulärer Ionenfluss stattfand. Auch die gemittelten
Initialwerte der Kapazität weisen kaum Veränderungen auf.
Vergleicht man nun die Ergebnisse der beiden Zelllinien untereinander, sieht man, dass
der gesamte Amilorid-sensitive Na+-Strom der 16HBE14o--Zellen höher ist als bei den
CFBE41o--Zellen. So ist bei den Kontrollzellen ein Unterschied von 1,75% und bei denen
mit 3 h und 24 h mit Dexamethason behandelten Zellen von 0,59% und 0,67% zu sehen.
Jedoch ist der durch Dexamethason hervorgerufene Effekt bei den CFBE41o--Zellen
geringfügig höher als bei den 16HBE14o--Zellen. Dies kann an dem hohen vorhandenen
Amilorid-sensitiven Na+-Strom vor der Dexamethasonbehandlung liegen, der bei den
16HBE14o--Zellen um 1,75% höher war als bei den CFBE41o--Zellen. Die minimale
Erhöhung des gemessenen Amilorid-sensitiven Na+-Stroms bei den 16HBE14o--Zellen
kann daran begründet sein, dass die Zellen nicht desselben Ursprungs wie die CFBE41o--
Zellen sind. So bestehen beide Zelllinie aus humanen Bronchialepithelzellen, aber die
16HBE14o--Zellen stammen aus einem gesunden Herz-Lungentransplantat [Cozens et
al., 1994] und die CFBE41o--Zellen wurden aus Bronchialepithelzellen eines 1jährigen
Mukoviszidosepatienten generiert [Gruenert et al., 2004; Ehrhardt et al., 2006].
In früheren Arbeiten mit humanen Nasenepithelzellen, konnte ein 50%iger Amilorid-
sensitiver Na+-Strom, der durch die δ-ENaC UE generiert wurde, festgestellt
werden[Bangel-Ruland et al., 2010]. Diese Studie ließ darauf schließen, dass ein sehr
hoher Anteil des Amilorid-sensitiven ENaC-Stroms durch die δ-ENaC UE generiert wird.
Dieses veranlasste, dass die in dieser Arbeit untersuchten CFBE41o-- und 16HBE14o--
Zellen, auch auf ihre funktionale Expression der δ-ENaC UE erforscht wurden. In dieser
Arbeit wurde hierfür der Azofarbstoff Evans Blue, der als Antagonist zu der δ-ENaC UE
wirkt, verwendet. Die Arbeitsgruppe um Yamamura untersuchte die Auswirkungen des
Evans Blue an hENaCαβγ- und hENaCδβγ-injizierten Xenopus leavis Oozyten. Hierfür
verwendeten sie verschiedene Konzentrationen des Evans Blue. Sie stellten fest, dass
Evans Blue mit einer Konzentration von 100 µM und höher, als Antagonist zur δ-ENaC UE
wirkt. Hierbei wird nur der Amilorid-sensitive ENaC-Strom, der durch die δ-ENaC UE
generiert wird blockiert und der Amilorid-sensitive Strom über die α-ENaC UE kann weiter
68 Diskussion
erfolgen [Yamamura et al., 2005]. Bei der Untersuchung der Filter in der vorliegenden
Arbeit wurde beobachtet, dass nach Hinzugeben des Evans Blue sowohl die Leitfähigkeit
als auch der Strom der Zellen extrem Anstieg, so dass die Filter nicht messbar waren. Es
lag während der Untersuchungen die Vermutung nahe, dass der Wirkstoff Evans Blue
sich auf den Elektroden ablagert. Evans Blue ist ein organisches Salz und besitzt ein
Molekulargewicht von 960,8 g/mol [Freedman und Johnson, 1969]. Wegen dieser
Vermutungen wurde eine weitere Messmethode (2.) mit anderen Filtern und einem
anderen Aufbau der Ussing-Kammer ausprobiert. So wurden in der vorherigen Methode
(1.) Filter verwendet, die eine Membran mit einer Fläche von 0,33 cm2 besaßen und mit
Fibronektin und Kollagen beschichtet wurden. Die 2. Filter hatten einen Durchmesser von
1,54 cm2 und bestanden aus einer Kollagenmatrix. Bei der 1. Methode war die Ussing-
Kammer senkrecht gestellt, sodass die Lösungen oben (apikal) und unten (basolateral)
hinzugegeben wurden. Bei der 2. Methode war die Ussing-Kammer waagerecht und die
Lösungen wurden links (apikal) und rechts (basolateral) hinzugegeben. Die Elektroden
wurden bei der 1. Methode in die Lösungen der apikalen und basolateralen Seite
hineingesteckt, sodass ein direkter Kontakt der Lösungen mit den Elektroden auftrat. Bei
der 2. Methode wurden die Elektroden in einen Agar gesteckt, der mit einer 1 M KCL-
Lösung hergestellt worden war und sollten daher nicht so anfällig für den Azofarbstoff
Evans Blue sein.
Nach dem Verändern der Methode wurden ein paar Testmessungen durchgeführt um zu
untersuchen, ob auch bei dieser Methode die Leitfähigkeit und der Kurschlussstrom an-
stieg. Es war zu beobachten, dass zwar sowohl die Leitfähigkeit als auch der
Kurzschlussstrom anstieg, nach einer geringen Zeit die Leitfähigkeit auf die vorherigen
Werte wieder sank und der Kurzschlussstrom noch weiter sank als er zuvor mit
Zellkulturringer gemessen wurde. Dies wiederlegt zum größten Teil die Vermutung, dass
der Farbstoff sich auf den Elektroden ablegt, da auch bei diesen Messungen die
Leitfähigkeit und der Kurzschlussstrom leicht anstiegen und der Farbstoff nicht in
Berührung mit den Elektroden kam. Doch könnte der Farbstoff die Elektroden indirekt
über den Agar berührt haben, da dieses aber nur in kleinen Mengen geschehen könnte,
könnten sich die Leitfähigkeit nach kurzer Zeit wieder auf den vorherigen Wert stabilisiert
haben und der Kurzschlussstrom noch weiter gesunken ist. Näher liegt die Vermutung,
dass der Farbstoff sich bei der 1. Methode, bei der die Ussing-Kammer senkrecht steht,
auf die Zellen legt und die Zellen einen Schock erleiden. Bei der neuen Methode
reagieren die Zellen auch mit einem kleinen Schock, da aber die Ussing-Kammer
waagerecht steht, legt der Farbstoff sich nicht auf die Zellen und kann im System
Diskussion 69
zirkulieren. Da diese Methode erst in einer späteren Phase dieser Arbeit verändert wurde,
sind nicht genügend Messungen vorhanden, um ein klares Ergebnis darzustellen.
Zusammenfassend zu der funktionalen Expression, die mit Dexamethason stimuliert
werden sollte, ist zu sagen, dass der Amilorid-sensitive Na+-Strom in beiden Zelllinien
eine steigernde Tendenz bei beiden Inkubationszeiten gezeigt hat. Es konnte in dieser
Arbeit jedoch keine Aussage des zu messenden Amilorid-sensitive ENaC-Stroms, der von
der δ-ENaC UE generiert wird, getroffen werden.
5.2 Untersuchungen zur quantitativen ENaC Expression durch Western Blot Analysen
Mittels Western Blot Analysen mit anschließender Immunodetektion wurde die Wirkung
des Dexamethason (1 µM), nach verschiedenen Inkubationszeiten auf die Expression von
α- und δ- ENaC UE in den CFBE41o-- und den 16HBE14o--Zellen getestet. Zunächst
wurden die Zellen für 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubiert. Anschließend wurden
Proteinlysate von den unbehandelten (Kontrollen), den 3 h mit Dexamethason und den
24 h mit Dexamethason behandelten Zellen gewonnen. Danach wurden die Proteine
mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Die
Untersuchten α- und δ- ENaC Proteine konnten mit spezifisch gegen α- und δ- ENaC
gerichteten Antikörpern nachgewiesen werden.
Sowie bei den CFBE41o--Zellen, als auch bei den 16HBE14o--Zellen konnten zwei
spezifische Banden für α-ENaC bei ca. 120 und 125 kDa detektiert werden. Dass hier
zwei spezifische Banden detektiert wurden, kann an posttranslationalen Modifikationen,
z.B. Phosphorylierungen, liegen. Die Phosphorylierungen werden durch die Proteinkinase
A (PKA) induziert [Garty und Palmer, 1997]. Durch frühere Arbeiten konnte die α-ENaC
UE in verschiedenen Größen nachgewiesen werden. Von den Arbeitsgruppen um Hughey
und Rubenstein wurde α-ENaC mit einem Molekulargewicht von 95 als auch von 65 kDa
nachgewiesen [Hughey et al., 2004; Rubenstein et al., 2010]. Eine weitere Arbeitsgruppe
detektierte die α-ENaC UE mit einem Molekulargewicht von 125 kDa. Bei dieser
Untersuchung wurde ein spezifisch gegen Ubiquitin gerichteter Antikörper verwendet, was
Aufschluss über den in dieser ermittelten α-ENaC UE gibt [Ruffieux-Daidié et al., 2008].
Ubiquitin ist ein kleines, hochkonserviertes, Protein, bestehend aus 76 Aminosäuren. Das
Protein ist in jeder Zelle ubiquitär vorhanden und an verschiedenen Prozessen in der Zelle
beteiligt [Hershko und Ciechanover, 1998]. So bewirkt es, z.B. bei dem Renin-
Angiotensin-Aldosteron System, durch Bindung an den ENaC, das dieser über
70 Diskussion
Endozytose in Vesikeln im Zytoplasma vorliegt und kurz vor der Degradation steht. Die in
dieser Arbeit detektierten Banden können eine ubiquitinierte, somit inaktive Form der α-
ENaC UE darstellen. Da bei den Immunoblotanalysen ein Gesamtproteinlysat der Zellen
verwendet wurde, kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob die Proteine in der
Zellmembran eingebaut waren oder durch Endozytose in Vesikeln im Zytosol vorlagen. Es
könnte also eine inaktive Form der α-ENaC UE sein, die in der Zellmembran liegt und
noch durch die Proprotein-Konvertase Furin in seine aktive Form gebracht werden muss.
In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass die α- und γ- ENaC UE proteolytisch durch Furin
gespalten werden können und dadurch die α-ENaC UE um ca. 85% und der γ-ENaC UE
um ca. 90% gesteigert werden konnte. Das Furin wurde im trans-Golgi Netzwerk
lokalisiert und schneidet α-ENaC UE während des Reifeprozesses in der extrazellulären
Domäne [Hughey et al., 2004]. Es könnten in dieser Arbeit aber auch α-ENaC UE
detektiert worden sein, die in Vesikeln im Zytosol vorliegen. Diese wurden zuvor durch
Nedd4-2 ubiquitiniert. Durch die Bindung des Ubiquitins an die α-ENaC UE könnten diese
kurz vor der Degradation stehen [Staub et al., 1997; Malik et al., 2005].
Die detektierten Banden wurden densiometrisch mittels des Programms ImageJ 1.45s auf
ihre Farbdichte hin analysiert. In den CFBE41o--Zellen wurde nach einer 3-stündigen
Inkubation mit dem Glucocorticoid Dexamethason (1 µM) eine Inhibierung, also
Verringerung der Proteinkonzentration im Vergleich zu den Kontrollen, der α-ENaC UE
Proteinexpression von ca. 12,09 ± 16,82% festgestellt. Nach einer Inkubation von 24 h
wurde die α-ENaC UE Proteinexpression um ca. 10,94 ± 22,35% erhöht. Durch die
Inkubation mit Dexamethason bei den 16HBE14o--Zellen konnte die Proteinexpression
der α-ENaC UE nach 3 h um ca. 15,52 ± 13,1% und nach 24 h um ca. 0,51 ± 15,62%
gesteigert werden. Da für diese Versuche nur drei Proteinisolationen mit je einer
Immunoblotanalyse, durchgeführt wurden und der Standardfehler sehr hoch ist, sind die
Ergebnisse nicht aussagekräftig. Analysiert man diese Ergebnisse unter der Betrachtung
des hohen Standardfehlers, kann geschlussfolgert werden, dass durch die Inkubation des
Dexamethasons keine gesteigerte Proteinexpression der α-ENaC UE stattfand. Dieses
Ergebnis würde mit den Ergebnissen der Arbeitsgruppe um Rubenstein übereinstimmen,
die zwar durch die Inkubation des Dexamethasons eine Erhöhung der funktionalen
Expression des ENaC-Kanals in der Ussing-Kammer messen konnten, jedoch keine
erhöhte Proteinexpression ermittelten [Rubenstein et al., 2010]. In weiteren Arbeiten
dieser Arbeitsgruppe wurde gezeigt, dass der Glucocorticoidrezeptor in beiden Zelllinien
exprimiert wird und eine Tendenz einer erhöhten α-ENaC mRNA Expression vorhanden
ist. So wurde bei den CFBE41o-- und 16HBE14o--Zellen nach einer 24-stündigen
Inkubation mit Dexamethason im Vergleich mit den Kontrollen eine 2,5 ± 0,11 und
Diskussion 71
2,11 ± 0,84 fache Erhöhung der α-ENaC mRNA Expression ermittelt. Die CFBE41o--
Zellen, die 3 h mit Dexamethason inkubiert waren, zeigten verglichen mit den Kontrollen
eine 0,12 ± 1,5 fache Inhibierung. Bei den 16HBE14o--Zellen wurde wieder eine kleine
Tendenz von einer 1,29 ± 0,62 fachen Erhöhung zu den Kontrollen ermittelt. Die Werte
wurden von jeweils 3 mRNA Isolierungen mit je einer PCR ermittelt. Die Standardfehler
sind, wie bei der Ermittlung der Proteinexpression der α-ENaC UE, sehr hoch [Höben,
2013]. Eine Tendenz in der mRNA Expression der α-ENaC UE ist zu erkennen, jedoch
sind die Ergebnisse, wie bei der Proteinexpression der α-ENaC UE dieser Arbeit durch die
hohen Standardfehler nicht aussagekräftig. Die Arbeitsgruppe um McTavish hat in
Atemwegsepithelzellen herausgefunden, dass der Promotor für die α-ENaC UE
unabhängig zu der SGK1 aktiviert werden kann, da in der α-ENaC-Sequenz ein
Glucocorticoid-Response-Element vorhanden ist [McTavish et al., 2009]. Das
Glucocorticoid-Response-Element ist eine kurze Nukleotidsequenz, die im Bereich des
Promotors des Zielgens liegt. An dieses Element kann das Glucocorticoid Dexamethason
binden und die Expression von z.B. α-ENaC erhöhen. Unter dieser Betrachtung sollte eine
Steigerung der Proteinexpression der α-ENaC UE stattfinden. Jedoch könnte eine
Konzentration des Dexamethasons von 1 µM für die proteinbiochemischen
Untersuchungen zu gering sein. Zudem zeigte die Arbeitsgruppe um McTavish, dass die
Einwirkung auf die Bindung an das Glucocorticoid-Response-Element innerhalb der α-
ENaC-Sequenz konzentrationsabhängig ist und verwendeten daher in ihren Versuchen
4 µM Dexamethason [McTavish et al., 2009]. Eine weitere Studie aus dem Jahre 2000
zeigte an adulten Alveolarepithelzellen, dass durch die Zugabe von Dexamethason (1 µM)
die Expression der β- und γ-ENaC UE mRNA um das 1,6 und 17 fache gesteigert werden
konnte. Die Expression der α-ENaC UE mRNA konnte jedoch nur um das 0,5 fache
gesteigert werden [Lazrak et al., 2000]. Dies bestätigt die Annahme, dass Dexamethason
in einer höheren Konzentration bessere Ergebnisse erzielen könnte.
In dieser Arbeit wurde zu der stimulierten Proteinexpression durch Dexamethason der α-
ENaC UE auch die der δ-ENaC UE untersucht. Jedoch waren die Ergebnisse der
Immunoblotanalysen nicht auswertbar. In dieser Arbeit wurden zwei verschieden
spezifisch gegen δ-ENaC UE gerichtete Antikörper verwendet. Beide stammen von der
Firma Santa Cruz. Der δ-ENaC (H-320) Antikörper wurde aus einem Kaninchen
gewonnen und der δ-ENaC (N-20) aus einer Ziege. Beide Antikörper binden an eine
Epitopkartierung in der Nähe des N-Terminus von humanen δ-ENaC. Der erste Antikörper
ist der δ-ENaC (H-230) Antikörper. Nach der Immunodetektion mit diesem Antikörper
waren auf der Membran wiederholt 4 - 5 Banden detektiert. Dies lässt auf eine
Unspezifität des Antikörpers schließen. Nachdem wiederholten Auftreten der vielen
72 Diskussion
Banden, wurde ein weiterer 1. Antikörper (N-20) verwendet. Nach der Immunoblotanalyse
wurde zwar nur eine Bande detektiert (ca.110 kDa), doch war der Hintergrund auf der
Membran so stark, dass die leicht sichtbaren Banden nicht densiometrisch auszuwerten
waren. Der starke Hintergrund liegt höchstwahrscheinlich an dem 2. Antikörper (donkey
anti-goat IgG-HRP), der an die Membran bindet. Aus diesem Grund wurden verschiedene
Methoden untersucht, um den Hintergrund zu reduzieren. Als erstes wurde die
Blockierungslösung von 5% auf 1% Magermilch in TBST reduziert. Die Antikörper (1. AK,
1:200; 2. AK, 1:10000 verdünnt) wurden in dieser Blockierungslösung angesetzt. Nach
der Umstellung der Methode hatte sich der Hintergrund nicht verändert. Im nächsten
Schritt wurden die Verdünnungen der Antikörper verändert, vom 1. AK auf 1:100 und der
2. AK 1:5000 und der 2. AK nur in TBST angesetzt. Dies brachte ebenfalls keine
Besserung. Auch verschiedene Inkubationszeiten, Blockierung über Nacht bei 4 °C oder
2 h bei RT und 1. Antikörper über Nacht bei 4°C oder 2 h bei RT, ergaben keinen
sichtbaren Unterschied des Hintergrundes. Jedoch waren die Banden am stärksten bei
einer 2-stündigen Blockierung bei RT und der Inkubation des 1. Antikörpers in 1%
Blockierungslösung über Nacht bei 4°C. Im nächsten Schritt wurden die
Proteinkonzentrationen von 40 µg auf 60 µg erhöht, dieser Ansatz zeigte ebenfalls keine
positiven Auswirkungen. Nach diesen Veränderungen der Methoden wurde vom
Hersteller ein neuer 2. Antikörper (rabbit anti-goat IgG-HRP) (1:5000 verdünnt) zur
Verfügung gestellt, der wie der andere 2. Antikörper, einen starken Hintergrund auf der
Membran darstellte. Bei allen Versuchen die Methode zu etablieren wurde eine
Positivkontrolle, MIA PaCa II, mit untersucht, um auszuschließen, dass das Problem an
den beiden untersuchten Zelllinien, CFBE41o- und 16HBE14o-, lag.
Ausblick 73
6 Ausblick
Die hier untersuchte funktionale Expression des ENaC-Kanals ergab eine tendenzielle
Steigerung für die 3 h und 24 h mit Dexamethason inkubierten Zellen. Um den Amilorid-
sensitiven Na+-Strom, der über den ENaC mittels Ussing-Kammer gemessen wird, stärker
zu erhöhen, sollten die Inkubationszeiten der Zellen beibehalten werden und eine
Konzentrationsänderung des Dexamethasons vorgenommen werden. So wurde in
anderen Studien gezeigt, dass eine Erhöhung des Dexamethasons auch zu einer
Erhöhung des Amilorid-sensitiven Na+-Stroms führt. Sie verwendeten hierfür eine
Konzentration des Dexamethasons von 10 nM, 30 nM und 100 nM [Richard et al., 2004].
In den folgenden Versuchen sollte Beispielsweise auch eine Steigerung der Konzentration
um das 3 fache und 10 fache erfolgen. So sollten die Zellen zum Vergleich mit 1 µM, 3 µM
und 10 µM Dexamethason inkubiert werden. Zudem sollten Wiederholungen der Ussing-
Kammer Messungen mit der gleichen Methodik durchgeführt werden, da in früheren
Arbeiten ein größerer Anstieg des Amilorid-sensitiven Na+-Stroms der inkubierten Zellen
zu beobachten war als bei den Messungen in dieser Arbeit. Dies könnte aber auch an
dem vorhandenen hohen Amilorid-sensitiven Na+-Stroms liegen, der bereits ohne eine
Behandlung mit Dexamethason vorhanden war. In den früheren Arbeiten war nicht so ein
hoher Amilorid-sensitiver Na+-Strom in den Kontrollmessungen zu beobachten
[Rubenstein et al., 2010; Lemke, 2012]. Zudem konnte in dieser Arbeit keine Aussage
über die funktionale Expression der δ-ENaC UE getroffen werden, da die Methode
zunächst optimiert werden musste. Da die Zellen auf anderen Filtern und nach einer
anderen Methodik mit dem Farbstoff Evans Blue messbar waren, sollten diese Versuche,
wie in der Diskussion beschrieben, durchgeführt werden.
Die durchgeführten quantitativen Messungen mittels Western Blot Analysen der beiden
Zelllinien, CFBE41o- und 16HBE14o-, für die α-ENaC UE waren nicht sehr aussagekräftig,
da eine zu geringe Anzahl der Versuche durchgeführt wurde und der Standardfehler sehr
hoch war. Aus diesem Grund sollten die Versuche zunächst genauso weiter durchgeführt
werden wie in dieser Arbeit beschrieben. Lässt man die geringe Anzahl der
durchgeführten Versuche außer Acht und betrachtet das Ergebnis mit einbezogenen
Standardfehler, könnten auch hier, wie bei den funktionalen Messungen, die
Konzentration des Dexamethasons erhöht werden, um eine gesteigerte Proteinexpression
der α-ENaC UE zu erlangen. So wurde in anderen Studien eine 4 µM Konzentration des
74 Ausblick
Dexamethasons eingesetzt, um die Expression der α-mRNA UE zu erhöhen [McTavish et
al., 2009]. Zu der Untersuchung der α-ENaC Proteinexpression, sollte auch die δ-ENaC
Proteinkonzentration mittels des Dexamethasons erhöht werden. Da bei den
Untersuchungen keine auswertbaren Immunoblots entstanden, kann keine Aussage über
die quantitative Expression dieser UE getroffen werden. Da bei dem zweiten 1. Antikörper
spezifische Banden für die δ-ENaC UE detektiert wurden, sollte an dieser Methode weiter
gearbeitet werden, bis der Hintergrund minimiert ist. So könnte z.B. für den 2. Antiköper
eine Lösung aus der Spezies, aus der dieser gewonnen wurde, zur Verdünnung des
Antikörpers verwendet werden. Die Versuche sollten mit 3 h und 24 h, 1 µM
Dexamethason wiederholt werden. Da aber bei den anderen Versuchen jeweils von einer
Konzentrationsänderung gesprochen wird, sollte auch hier gleichzeitig eine weitere
Konzentration, z.B. 4 µM untersucht werden.
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Anlagen, Abbildungen A-I
Anlagen, Abbildungen
Abbildung 27: Verlauf der Messungen der CFBE41o--Zelllinie mit 3 h Dexamethason-Inkubation
In der Abbildung ist der zeitliche Verlauf von einer Ussing-Kammer Messungen von CFBE41o--Zellen
mit einer 3 h Dexamethasonbehandlung dargestellt. Auf der y-Achse ist der gemessen Kurzschlussstrom (ISC) in µA/cm
2 gegen die Zeit in min auf der x-Achse aufgetragen. In der Abbildung
werden die verschiedenen Lösungen dargestellt, die den Zellen während der Ussing-Kammer Messungen apikal hinzugegeben wurden. Der prozentuale Amiloridstrom in Bezug auf den gesamt Na
+-
Strom ist in diesen Zellen im Vergleich zu den Kontrollen leicht erhöht. Im Vergleich zu den Zellen, die 24 h mit Dexamethason behandelt wurden, ist kein Unterschied im gemessenen Kurzschlussstrom zu entdecken.
Abbildung 28: Verlauf der Messungen der 16HBE14o--Zelllinie mit 3 h Dexamethason-Inkubation
Die Abbildung zeigt den zeitlichen Verlauf einer Ussing-Kammer Messung der 16HBE14o--Zellen
nach 3 h Dexamethasonbehandlung. Auf der y-Achse ist der gemessene Kurzschlussstrom (ISC) in µA/cm
2 gegen die Zeit in min auf der x-Achse aufgetragen. Der Abbildung kann entnommen
werden welche verschiedenen Lösungen den Zellen während der Ussing-Kammer Messungen apikal hinzugegeben wurden. Der prozentuale Amiloridstrom in Bezug auf den gesamt Na
+-Strom ist in
diesen Zellen im Vergleich zu den Kontrollen leicht erhöht. Im Vergleich zu den Zellen, die 24 h mit Dexamethason behandelt wurden, ist kein Unterschied im gemessenen Kurzschlussstrom zu entdecken.
A-II Anlagen, Abbildungen
Abbildung 29: Verlauf der Messungen der CFBE41o
--Zelllinie mit 24 h Dexamethason-Inkubation
In der Abbildung ist der zeitliche Verlauf von einer Ussing-Kammer Messungen von CFBE41o--Zellen
mit einer 24 h Dexamethasonbehandlung dargestellt. Auf der y-Achse ist der gemessen Kurz-schlussstrom (ISC) in µA/cm
2 gegen die Zeit in min auf der x-Achse aufgetragen. In der Abbildung
werden die verschiedenen Lösungen dargestellt, die den Zellen während der Ussing-Kammer Messungen, apikal hinzugegeben wurden. Der prozentuale Amiloridstrom in Bezug auf den gesamt Na
+-
Strom ist in diesen Zellen, im Vergleich zu den Kontrollen, leicht erhöht. Im Vergleich zu den Zellen, die 3 h mit Dexamethason behandelt wurden, ist kein Unterschied im gemessenen Kurzschlussstrom zu erkennen.
Abbildung 30: Verlauf der Messungen der 16HBE14o--Zelllinie mit 24 h Dexamethason-Inkubation
Die Abbildung zeigt den zeitlichen Verlauf einer Ussing-Kammer Messung der 16HBE14o--Zellen
nach 24 h Dexamethasonbehandlung. Auf der y-Achse ist der gemessene Kurzschlussstrom (ISC) in µA/cm
2 gegen die Zeit in min auf der x-Achse aufgetragen. Der Abbildung kann entnommen
werden welche verschiedenen Lösungen den Zellen während der Ussing-Kammer Messungen apikal hinzugegeben wurden. Der prozentuale Amiloridstrom in Bezug auf den gesamt Na
+-Strom ist in
diesen Zellen im Vergleich zu den Kontrollen leicht erhöht. Im Vergleich zu den Zellen, die 3 h mit Dexamethason behandelt wurden, ist kein Unterschied im gemessenen Kurzschlussstrom zu entdecken.
Anlagen, Messergebnisse A-III
Anlagen, Messergebnisse
Tabelle 15: Messdaten der CFBE41o--Zellen (Kontrollmessungen)
Anzahl gemessener Filter
ΔISC Amilorid ΔISC Na+-frei ΔISC ENaC [%]
1 3,47 11,15 31,12
2 4,60 19,72 23,33
3 0,96 16,14 5,95
4 1,83 9,66 18,96
5 1,25 6,34 19,79
6 3,92 10,63 36,91
7 2,88 12,91 22,28
8 1,81 7,41 24,39
9 1,35 7,97 16,98
10 2,39 10,20 23,44
11 1,77 15,91 11,11
12 0,82 14,85 5,54
13 1,12 9,37 11,95
14 2,88 23,86 12,05
15 1,86 6,17 30,23
16 1,58 7,39 21,30
17 1,63 16,57 9,84
18 1,73 6,93 24,99
19 1,44 3,65 39,33
20 0,85 18,98 4,46
21 3,13 28,55 10,96
22 5,57 10,40 53,49
23 4,64 10,72 43,32
24 2,01 10,99 18,25
Mittelwert ± SEM 2,47 ± 0,27 11,07 ± 1,22 21,67 ± 2,56
A-IV Anlagen, Messergebnisse
Tabelle 16: Messdaten der CFBE41o--Zellen mit 3 h Dexamethasonbehandlung
Anzahl gemessener Filter
ΔISC Amilorid ΔISC Na+-frei ΔISC ENaC [%]
1 2,53 9,66 26,18
2 0,73 7,33 9,97
3 8,25 15,47 53,31
4 1,68 8,11 20,70
5 3,05 11,27 27,08
6 1,09 6,26 17,43
7 1,14 9,94 11,45
8 0,50 9,38 5,33
9 3,06 14,63 20,89
10 2,56 8,31 30,85
11 0,63 5,55 11,33
12 1,14 1,86 61,10
13 0,95 6,52 14,58
14 2,17 9,76 22,28
15 1,73 5,82 29,73
16 2,96 11,95 24,79
17 0,59 2,26 26,22
18 5,95 20,49 29,02
19 4,15 18,00 23,05
20 3,47 6,68 51,92
21 2,79 9,66 28,82
22 0,59 7,59 7,77
Mittelwert ± SEM 2,35 ± 0,40 9,39 ± 0,96 25,17 ± 3,07
Anlagen, Messergebnisse A-V
Tabelle 17: Messdaten der CFBE41o--Zellen mit 24 h Dexamethasonbehandlung
Anzahl gemessener Filter
ΔISC Amilorid ΔISC Na+-frei ΔISC ENaC [%]
1 2,94 13,57 21,67
2 2,07 5,27 39,21
3 2,35 8,87 26,56
4 2,07 12,46 16,59
5 3,84 12,00 32,03
6 2,22 4,49 49,40
7 1,33 6,30 21,10
8 0,30 9,42 3,20
9 0,95 6,72 14,12
10 4,09 16,13 25,39
11 2,94 9,96 29,50
12 3,00 9,37 32,06
13 1,67 12,03 13,91
14 1,31 9,16 14,32
15 0,85 6,28 13,49
16 4,11 10,60 38,82
17 1,33 4,45 29,90
18 0,73 2,55 28,78
19 0,54 3,51 15,33
20 1,23 6,59 18,69
21 9,22 32,38 28,49
22 3,47 15,51 22,36
23 4,07 9,42 43,23
24 4,52 10,48 43,15
25 0,81 8,96 9,04
Mittelwert ± SEM 2,48 ± 0,37 9,86 ± 1,15 25,21 ± 2,29
A-VI Anlagen, Messergebnisse
Tabelle 18: Messdaten der 16HBE14o--Zellen (Kontrollmessungen)
Anzahl gemessener Filter
ΔISC Amilorid ΔISC Na+-frei ΔISC ENaC [%]
1 1,53 3,69 41,46
2 0,24 1,31 18,42
3 0,33 0,99 33,80
4 0,89 2,74 32,54
5 1,11 2,98 37,43
6 0,24 0,60 39,71
7 0,03 0,71 3,67
8 0,84 4,49 18,61
9 0,33 5,93 5,52
10 0,17 0,89 18,62
11 1,04 3,54 29,48
12 0,32 1,33 23,90
13 0,13 1,39 9,21
14 1,05 4,50 23,36
15 0,95 2,75 34,43
16 0,26 0,75 34,82
17 1,19 4,98 23,91
18 0,77 6,00 12,75
19 0,96 3,23 29,84
20 0,10 1,85 5,63
Mittelwert ± SEM 0,62 ± 0,09 2,73 ± 0,37 23,85 ± 2,48
Anlagen, Messergebnisse A-VII
Tabelle 19: Messdaten der 16HBE14o--Zellen mit 3 h Dexamethasonbehandlung
Anzahl gemessener Filter
ΔISC Amilorid ΔISC Na+-frei ΔISC ENaC [%]
1 0,56 1,34 41,32
2 0,19 0,83 23,27
3 1,99 3,88 51,23
4 1,19 3,66 32,52
5 0,76 2,82 26,81
6 0,85 1,76 48,43
7 1,25 3,12 39,97
8 0,82 1,64 49,98
9 3,62 7,81 46,33
10 0,11 2,15 5,24
11 0,53 4,12 12,80
12 0,27 2,35 11,47
13 0,55 1,88 29,42
14 0,35 1,97 17,51
15 1,31 5,74 22,80
16 0,13 1,13 11,92
17 0,19 1,25 15,33
18 0,32 1,41 23,03
19 0,96 5,91 16,19
20 1,49 3,29 45,41
21 0,16 2,11 7,62
22 0,31 1,70 18,46
23 0,26 2,02 12,76
24 0,27 3,00 9,15
Mittelwert ± SEM 0,77 ± 0,16 2,79 ± 0,34 25,79 ± 2,99
A-VIII Anlagen, Messergebnisse
Tabelle 20: Messdaten der 16HBE14o--Zellen mit 24 h Dexamethasonbehandlung
Anzahl gemessener Filter
ΔISC Amilorid ΔISC Na+-frei ΔISC ENaC [%]
1 0,86 5,23 16,52
2 1,31 3,27 40,14
3 0,61 3,56 17,23
4 0,58 2,01 29,00
5 0,27 1,46 18,52
6 0,70 1,73 40,42
7 0,17 1,66 9,99
8 0,19 0,96 19,68
9 0,78 3,82 20,42
10 0,62 2,81 21,90
11 0,21 1,43 14,36
12 1,03 2,75 37,37
13 0,23 1,18 19,65
14 0,14 1,03 13,79
15 0,23 1,02 22,65
16 0,34 0,85 39,67
17 4,92 12,04 40,88
18 0,07 1,41 4,61
19 0,99 2,02 48,94
20 0,75 2,42 30,99
21 0,45 1,29 35,06
22 0,37 1,84 19,96
23 1,19 3,55 33,41
Mittelwert ± SEM 0,74 ± 0,2 2,58 ± 0,48 25,88 ± 2,40
Anlagen, Chemikalien A-IX
Anlagen, Chemikalien
Tabelle 21: Verwendete Chemikalien
Reagenz Hersteller
3-Aminophtalhydrazid (Luminol) Sigma-Aldrich, Taufkirchen,
Deutschland
Acrylamid/Bisacrylamid (Rotiphorese Gel 30
(37:5:1))
Roth, Karlsruhe, Deutschland
Ammoniumperoxidisulfat (APS) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Calciumchlorid (CaCl2) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Coomassie-Brilliant-Blau R-250 Roth, Karlsruhe, Deutschland
Dexamethason Sigma-Aldrich, Taufkirchen,
Deutschland
Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Dithiothreitol (DTT) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Essigsäure ≥ 96 %, p.a. Roth, Karlsruhe, Deutschland
Ethanol ≥ 99,5 %, p.a. Roth, Karlsruhe, Deutschland
D (+) Glucose wasserfrei p.a. Roth, Karlsruhe, Deutschland
Glycin Roth, Karlsruhe, Deutschland
Glycerin Merck, Darmstadt, Deutschland
A-X Anlagen, Chemikalien
Kaliumchlorid p.a. (KCl) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Magnesiumchlorid (MgCl2) Merck, Darmstadt, Deutschland
Methanol Roth, Karlsruhe, Deutschland
Milchpulver Roth, Karlsruhe, Deutschland
Natriumchlorid p.a. (NaCl) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Natriumlaurylsulfat (SDS) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Salzsäure 1 M (HCl) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Tetramethylethylendiamin (TEMED) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Tween 20 Roth, Karlsruhe, Deutschland
Anlagen, Lösungen für die Zellkultur A-XI
Anlagen, Lösungen für die Zellkultur
Tabelle 22: Verwendete Medien und Zusätze
Reagenz Hersteller
BSA Fraction V solution 7,5% Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland
Fetale Bovine Serum Gold (Fötales
Kälberserum,FKS)
PAA Laboratories GmbH, Pasching, AT
Humanes Fibronektin Biochrom AG, Berlin, Deutschland
L-Glutamin (200 mM) PAA Laboratories GmbH, Pasching AT
LHC Basalmedium Invirtogen, Karlsruhe, Deutschland
MEM with Earle´s Salt (with L-Glutamine) PAA Laboratories GmbH, Pasching, AT/
Biochrom AG, Deutschland
Penicillin/ Streptomycin (100x) PAA Laboratories GmbH, Pasching, AT
Rinderkollagen Typ I (Collagen A) Biochrom AG, Berlin, Deutschland
Trypsin/ EDTA solution Biochrom AG, Berlin, Deutschland
A-XII Anlagen, Kits
Anlagen, Kits
Tabelle 23: Verwendete Kits für proteinbiochemische und molekularbiologische Methoden
Kit Hersteller
AG-aliquoted Mycoplasma Detecion Kit
for conventional PCR von Venor® GeM
Advance
Minerva Biolabs, Berlin, Deutschland
Pierce® BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, Rockford, USA
Super Signal® West Pico
Chemiluminescent Substrat
Thermo Scientific, Rockford, USA
Anlagen, Antikörper und Marker A-XIII
Anlagen, Antikörper und Marker
Tabelle 24: Verwendete Antikörper für biochemische Methoden
Bezeichnung Firma Verdünnung für Immuno-
blotanalyse
Anti-Alpha-ENaC aus
Kaninchen (Klon: pk)
Dianova, Hamburg,
Deutschland
1:1250
Anti-Tubulin, alpha Ab-2
aus Kaninchen (Klon:)
Dianova, Hamburg,
Deutschland
1:200
δENaC (H-230) Antikörper
rabbit polyclonal IgG
Santa Cruz Biotechnology,
Inc., CA, USA
1:200
δENaC (N-20) Antikörper
goat polyclonal IgG
Santa Cruz Biotechnology,
Inc., CA, USA
1:100
Peroxidase AffiniPure Goat
Anti-Rabbit IgG
Jackson
ImmunoResearch, Suffolk
1:10000
Rabbit anti-goat IgG-HRP:
sc-2768
Santa Cruz Biotechnology,
Inc., CA, USA
1:5000
Donkey anti-goat IgG-
HRP: sc 2020
Santa Cruz Biotechnology,
Inc., CA, USA
1:5000
A-XIV Anlagen, Antikörper und Marker
Tabelle 25: Verwendete Größenmarker für biochemische und molekularbiologische Methoden
Bezeichnung Firma Größenangabe
Fast + RulerTM Low Range
DNA Ladder
Fermentas, St. Leon-Rot,
Deutschland
~50 bp bis ~1500 bp
PageRulerTM Prestained
Protein Ladder
Fermentas, St. Leon-Rot,
Deutschland
~10 kDa bis ~170 kDa
Anlagen, Geräte A-XV
Anlagen, Geräte
Tabelle 26:Verwendete Geräte
Gerät Hersteller
Autoklav 3850 EL Systec, Wettenberg, Deutschland
Blockthermostat BT200 Kleinfeld Labortechnik, Gehrden,
Deutschland
Blotapparatur Fastblot semi-dry B43 Biometra, Gottingen, Deutschland
Eppendorf Centrifuge 5415C Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Eppendorf Centrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Eppendorf Centrifuge 5702 Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Feinwaage CP124S Sartorius AG, Gottingenn,
Deutschland
Gefrierschrank Heraeus Herafreeze Kendro, Hanau, Deutschland
Gelkammer Biometra, Gottingen, Deutschland
Heizmagnetrührer RCT basic IKA® Werke GmbH & Co. KG,
Staufen,
Deutschland
Inkubator Heraeus BBD 6220 Kendro, Hanau, Deutschland
A-XVI Anlagen, Geräte
Kamera PowerShot G2 Canon Deutschland GmbH, Krefeld,
Deutschland
Milli-Q-Water Biocel Millipore, Bedford, USA
Neubauer Zahlkammer Paul Marienfeld GmbH & Co. KG,
Lauda-
Königshofen, Deutschland
pH-Meter inoLab pH Level 2 WTW GmbH & Co. KG, Weilheim,
Deutschland
Photometer WPA Biowave S2100 Biochrom AG, Berlin, Deutschland
Pipetten Typ Eppendorf-Research Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Pipettierhilfe Pipetus Akku Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt,
Deutschland
Rollinkubator RM5 Karl Hecht KG, Sondheim,
Deutschland
Schüttler Typ 3005 GFL®, Burgwedel, Deutschland
SDS-Page Apparatur Minigel-Twin G42 Biometra, Gottingen, Deutschland
Sicherheitsgasbrenner Schuett Flammy S schuett-biotec GmbH, Göttingen,
Deutschland
Spannungsgeber Standard Power Pack P25 Biometra, Gottingen, Deutschland
Ussing-Kammer Prof. Willy van Driessche, KU
Leuven, Belgien
Vakuumpumpe Mini-Laborpumpe N86 K.N. 18 KNF Neuberger GmbH, Freiburg,
Anlagen, Geräte A-XVII
Deutschland
Vortexer MS1 Mini Shaker IKA® Werke GmbH & Co. KG,
Staufen,
Deutschland
Waage CP4202S Sartorius AG, Gottingenn,
Deutschland
Wärmeschrank WTC Binder WTC, Tuttlingen, Deutschland
Wasserbad Thermo Haake DC10/P5 Thermo Electron, Karlsruhe,
Deutschland
Wasserbad ISOTEMP210 Fisher Scientific, Schwerte,
Deutschland
Zellkultur-Werkbank Heraeus HERASafe HS15 Kendro, Hanau, Deutschland
A-XVIII Anlagen, Verbrauchsmaterialien
Anlagen, Verbrauchsmaterialien
Tabelle 27: Verwendete Materialien
Verbrauchsmaterial Hersteller
Costar® Well Cell Culture Cluster (3524) Corning Inc., Corning, USA
Costar® Transwell® Permeable Supports Ø
6,5 mm Polyester Membrane (0,33 cm2)
Corning Inc., Corning, USA
CryoPure Tube 1,8 ml Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland
Parafilm® M Roth, Karlsruhe, Deutschland
Reaktionsgefäße 1,5 ml / 2 ml Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland
Roti®-PVDF Membran Roth, Karlsruhe, Deutschland
Filterpapiere A. Hartenstein, Würzburg,
Deutschland
Zellkulturflasche T-25 Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland
Zellkulturflasche T-75 Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland
SPL Life Sciences, Pocheon-City,
Südkorea
Zentrifugenröhrchen 15 ml Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland
Zentrifugenröhrchen 50 ml Sarstedt, Nürmbrecht, Deutschland
Danksagung A-XIX
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Wolf-Michael Weber danke ich für die Überlassung des interessanten
Themas, die freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppe sowie die Betreuung und
Begutachtung dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. Dirk Labudde danke ich für die Übernahme des Korreferats und der damit
verbundenen externen Betreuung.
Besonders möchte ich mich bei Frau Dr. Nadine Bangel-Ruland und Frau Dr. Katja
Tomczak für die engagierte, kompetente Betreuung, die hilfreiche Unterstützung und das
Korrekturlesen meiner Materarbeit bedanken.
Allen Mittarbeitern der AG Weber danke ich für ihre ständige Hilfsbereitschaft, die vielen
guten Ratschläge und das freundschaftliche Arbeitsklima. Insbesondere bedanke ich mich
bei Conny Rohe und Elena Fernández Fernández für ihre tatkräftige Unterstützung und,
dass sie immer ein offenes Ohr hatten, wenn man es brauchte. Auch Knut danke ich,
dass er mir morgens um 8.30 Uhr ein Lächeln aufs Gesicht zaubern konnte. Den Bachelor
gilt ein besonderer Dank für die sehr lustigen Momente, die wir in unserer Zeit zusammen
in der Arbeitsgruppe Weber erleben durften. Besonders hervorheben möchte ich Inga
Höben, die mich zu immer neuen Denkanstößen motiviert hat und bedanke mich herzlich
für die gute Zusammenarbeit.
Ein weiterer, besonderer Dank gilt Anika Nicolaudius, die ohne zu zögern meine Arbeit
Korrektur gelesen hat.
Mein herzlicher Dank gilt meiner Familie, besonders meinen Eltern, meiner Schwester
und meiner Oma, die mir durch ihre ausnahmslose und liebevolle Unterstützung
ermöglicht haben, weiterhin meinen eigenen Weg zu gehen und mich bei meinem
bisherigen Lebensweg, trotz vieler Komplikationen, tatkräftig unterstützt haben. Danke,
dass ihr immer für mich da seid.
Zum Schluss gilt ein besonderer Dank meinem Freund Sven, der gerade in den letzten
Zügen meiner Masterarbeit immer hinter mir stand und der Ruhepol an meiner Seite ist.
Ich danke ihm dafür, dass er mich durch seine Liebe und Geduld immer wieder auffangen
konnte und mich so tatkräftig bei allem unterstützt.
Selbstständigkeitserklärung XXI
Selbstständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter
Verwendung der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt habe.
Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus Quellen entnommen wurden, sind als solche
kenntlich gemacht.
Diese Arbeit wurde in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde
vorgelegt.
Münster, den 14.08.2013
Ann-Katrin Woiki