Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Meilleure compréhension de la machine biologique de photoproduction d’H2
- Fonctionnement
- Rôle dans le métabolisme global
- Régulation (lumière, SO4, NO3, CO2)
Photoproduction d’H2
Identification de verrous biologiques &
Elaboration de stratégies de
reprogrammation métabolique pour une
production d’H2 forte et durable
Ingénierie de la cyanobactérie modèle Synechocystis, pour une meilleure
photoproduction d'hydrogène (EngineeringH2Cyano) ANR BioE09-13
Partenaires: EngineeringH2Cyano et nouvelle collaboration
CEA/DSV/iBiTec-S
& CNRS/URA2096
Coordinateur & responsable partenaire 1:
F. CHAUVAT
Collaborateurs
C. CASSIER-CHAUVAT
H. BOTTIN
T. JITTAWUTTIPOKA (Postdoc ANR)
C. LEPLAT (Postdoc ANR)
J. DUTHEIL (Thèse CEA)
M. ORTEGA-RAMOS (Thèse ANR)
S. FARCI
CNRS/UPR9036/BIP
Responsable scientifique partenaire 2:
M. ROUSSET
Collaborateurs
M. BRUGNA
A. KPEBE
S. LE LAZ (Postdoc ANR)
Nouvelle collaboration: CEA/DSV/iBEB
Responsable : Laurent COURNAC
Collaborateurs
P. RICHAUD
G. GUEDENEY
Les cyanobactéries (“algues” bleues):
anciennes, robustes, fort impact sur la biosphère
- Organismes photosynthétiques les plus abondants de la planète Colonisent la plupart des écosystèmes aquatiques et terrestres
(mers, océans, rivières, lacs, eaux saumâtres, sols même désertiques….)
- A l'origine de l’atmosphère oxygénique de la planète qu’elles continuent à renouveler 30 à 40% de la production d'O2 par les océans
Fixation annuelle de 25 giga tonnes de CO2 (puit de carbone)
- Composante majeure du phytoplancton : base de la chaîne alimentaire
-Organismes pionniers
Potentiel biotechnologique des cyanobactéries
Fermes à cyanobactéries
Alimentation animale & humaine
Cosmétiques
Source de produits thérapeutiques
- Anticancer, Antiviraux (anti HIV)
- Vitamines & antioxidants*
Bioremédiation
Biofuels (our projects*)
H2*, Ethanol*, Ethylène*, Butanol & bio-diesels
Bio-plastiques (PHA, PHB)
Robustes & Compétitives
Pas besoins de
- terres cultivables
- d’engrais
- de pesticides, d’herbicides
- d’eau douce
Notre approche: Biologie intégrative
Génomique fonctionnelle, Mesures dégagement H2, Dosage enzymatiques,
Transcriptome, Métabolome, Bioinformatique, etc..
WT M
cadmium et h2o2
...
...
...
Selected Gene Tree: cd et h2o2 sur gn modulÈsSelected Experiment Tree: cadmium et h2o2
Colored by: N/AGene List: modulÈ 1/4 h2o2 and modulÈ 1/9 cadmium (455)
RT: 0.00 - 29.99 SM: 7G
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rela
tive
Abu
ndan
ce
5.34
4.23
3.01
12.04
12.1711.89 12.30
17.6714.7914.05
11.45 15.27
19.95 27.2918.03 26.41 28.9220.19 24.9524.2522.22
10.83
2.789.75
5.880.32 6.47 9.650.76
6.94 9.41
NL: 9.06E3
Base Peak m/z= 87.00790-87.00964 F: FTMS - p ESI Full ms [50.00-1000.00] MS 080911_HSF5_09
Synechocystis PCC6803: la cyanobactérie modèle utilisée dans notre projet
Unicellulaire, euryhaline (pousse bien en eau de mer)
Photosynthèse oxygénique
Productions naturelles: anti-oxydants, alkanes, PHB, EPS, etc…
Propriétés électrogéniques
Hydrogénase bidirectionnelle (réversiblement inactivée par O2)
Petit génome séquencé facilement manipulable grâce à nos outils
(50 publications voir http://www.researcherid.com/rid/E-7394-2010 )
1.1.1 SEM : 3¸me
essai
Figure 1 Figure 2 Images SEM de Synechocystis, fixˇe avec 2.27% de glutaraldˇhyde et 0.15% de bleu
alcian, et sˇchˇe par sˇchage supercritique CO2.
HoxH
HoxY
HoxF
HoxE HoxU
H2 NADPH
NADP+ 2H+
+ 2 e-
HoxH
HoxY HoxF
HoxE HoxU
Active hydrogenase
Maturation & assembly
Les verrous biologiques I:
La machine de production d’H2 est complexe, peu-abondante et fragile
O2
?
Inactive
forme
Ketoglutarate
+ glutamine
Fed
1e-
GltS
Sir FTR
Trx ox
2e-
Trx red
2e-
SO32- S2-
6e-
NarB
NH4+-
NirA
NO3-
NO2-
6e-
2e-
2 glutamates
NADP+ NADPH
Bidirectional hydrogenase
H2 NADPH
NADP+ 2H+ + 2 e-
PQ
2H2O O2 + 4e- + 4H+
2e-
Cytb6/f PSII PSI
SDH
NDH-2
CO2 assimilation
NDH-1 NADP+
NADH NAD+
h
Flv
Carbohydrates
FNR
Verrous biologiques II: la machine de production d’H2 est
complexe, peu-abondante, fragile & mal alimentée en électrons
?
Analyses transcriptomiques
cadmium et h2o2
...
...
...
Selected Gene Tree: cd et h2o2 sur gn modulÈsSelected Experiment Tree: cadmium et h2o2
Colored by: N/AGene List: modulÈ 1/4 h2o2 and modulÈ 1/9 cadmium (455)
WT OM
Construction et analyse de mutants surproduisants les protéines Hox (et Hyp),
cultivés dans diverses conditions (lumière, température, minéraux, etc)
Mesures de production d’H2 Analyses
métabolomiques
Amélioration des mutants pour
optimiser la photoproduction d’hydrogène par voie biologique
Intégration des données
Identification de verrous biologiques
Stratégie du projet EngineeringH2Cyano
lexA abrB1 abrB2
hox transcription regulators
sll1222 ssl2420 sll1225
hoxE hoxF hoxU hoxY hoxH
Genes encoding the hydrogenase enzyme complex
hypF hypA1 hypB1 hypC hypD hypE
Genes encoding Hox assembly proteins
Cloning in our expression vectors
Replacement of the weak natural hox promoter
by a strong, constitutive or regulated promoter
Sequential cloning in
our replicative expression vectors
Subtask 1
Tache 1: Construction de mutants “surproducteurs” de la machine de production d’H2
Objectif: Augmentation de l’abondance de la machine de production d’H2
Subtask 3b Subtask 2
Genomic organization of the genes to be over-expressed
Subtask 3a
Résultats récents I: Identification et/ou manipulation de régulateurs
de l’opéron hox pour augmenter la production d’H2 hox
E
Travaux en cours: caractérisation du réseau
de régulation de hox
2) L’augmentation de production d’H2 dans le mutant dépourvu de R2 (x 2-3)
est renforcée ( x 2-3) par la surproduction de l’activateur A1
1) Caractérisation d'un nouveau régulateur (le répresseur “R2”) de la production d’H2
(Dutheil et al.
soumission ds 15 j)
Résultats récents II: construction d’un mutant surproduisant l’hydrogénase en
fonction de la température de croissance : remplacement du faible promoteur naturel
de l’opéron hox par notre promoteur fort et thermo-régulé
Notre système de thermo-contrôle permet:
- forte expression à 39°C
- expression modérée à 33°C-34°C
- pas d’expression à T°≤ 30°C
Synechocystis chromosome hox operon
KmR
TT cI857 pR (+RBS)
Thermoregulation
cassette
Confirmation de la thermo-régulation des gènes hox de notre mutant
hox E
hox U
hox Y
hox F
sll1222
ss2420
sll1225
hox H
Quantitative PCR of the hox genes in WT and mutant at 30°C and 39°C
Semi -quantitative PCR of the hox genes in WT and mutant at 39°C
WT TM WT TM WT TM WT TM WT TM WT TM WT TM WT TM
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
HoxE HoxF sll1222 HoxU HoxY ssl2420 sll1225 HoxH
Rel
ativ
e R
NA
(fo
ld
chan
ge)
WT 30°
WT 39°
TM 30°
TM 39°
ARNm (hoxEFUYH) : x60
Confirmation de la thermo-régulation de la production d’H2 de notre mutant
30°C 39°C
WT Mutant T° régulé Déletion hox
Expression gènes hox x 60
Activité Hox x 4
x ≥ 100
x 12
Pro
du
ctio
n H
2 e
n U
nit
és a
rbit
rair
e
L’augmentation de production d’H2 est moins importante que celle de l’expression des gènes
En plus de l’expression des gènes hox, il y a d’autres verrous biologiques à lever
Transcriptome analyses
and integrative representation of the omics data
Tache 2: Analyses des réponses globales à une meilleure production d’H2
Objectifs: Caracterisation de l’adaptation à une meilleure production d’H2
Conception de stratégies performantes pour la surproduction d’H2
cadmium et h2o2
...
...
...
Selected Gene Tree: cd et h2o2 sur gn modulÈsSelected Experiment Tree: cadmium et h2o2
Colored by: N/AGene List: modulÈ 1/4 h2o2 and modulÈ 1/9 cadmium (455)
WT OM
WT and hydrogenase overproducing mutants
(constructed in task1) growing in various conditions
In silico analysis of data
Phenotypic analysis including
H2 production assay
Résultats récents III: Développement de nouveaux outils de transcriptomique
permettant l’analyse et visualisation des réponses de la totalité des gènes
sll1222 ssl2420 sll1225
hoxE hoxF hoxU hoxY hoxH
hox encoding genes
Cloning into the BACTH system
Tache 3: Recherche d’interaction Hox/Ferrédoxine
Objectif: Identification de nouveaux acteurs de la production d’H2
Résultats récents IV: les Fed 4 & 5 intéragissent avec HoxH & HoxY
fed1 fed2 fed3 fed4 fed5 fed6 fed7 fed8 fed9
ferredoxin encoding genes
lexA abrB1 abrB2
hox transcriptional activators
sll1222 ssl2420 sll1225
hoxE hoxF hoxU hoxY hoxH Genes encoding the Hox hydrogenase complex
hypF hypA1 hypB1 hypC hypD hypE
Genes encoding Hox maturation proteins
Cloning in our expression vectors
Replacement of the weak natural hox promoter
by a strong, constitutive or regulated promoter
Sequential cloning in our
expression vectors
Subtask 1
Tache 4
Recherche de mutations permettant d’augmenter la tolérance à l’O2 de l’hydrogénase
Objectifs: Augmenter la tolerance à l’O2 et surproduire ces hydrogénases
Subtask 3b Subtask 2
Genomic organization of the genes to be over-expressed
Improvement of the Hox enzyme tolerance to oxygen
Subtask 3a
Task 4
Shewanella oneidensis
AS-52 : DhydADhyaB
Construction et sélection à haut débit de mutations augmentant la tolérance à
l’O2 de l’H2ase modèle de Shewanella oneidensis MR-1
Evolution dirigée
hydrogénases
tolérantes à l’oxygène
Transposition à
Synechocystis PCC6803
Criblage
http
://foru
m.n
atio
nsta
tes.n
et
[Ni-Fe] H2ase
Souches poussant sur H2
en présence d’O2
Purification et
caractérisation
Identification
des mutations
Les mutants de Shewanella seront
sélectionnés sur leur capacité à croitre sur
H2 et décolorer l’amaranthe, en présence
de O2 qui normalement inhibe H2ase
Am
ara
nte
En présence d’O2
H2
lm
ax 5
20
nm
Accepteur d’électrons
Amines aromatiques incolores
(H
on
g e
t al.
,20
07
)
Chaîne de transport d’électrons
2H++2e-
Donneur d’électrons
e- e-
Azoréduction H2-dépendante de l’amarante par S.oneidensis MR-1
HYDROGENASES
Bilan à mi-parcour, et échéancier prévisible
PUBLICATIONS
1) Développement d’un protocole de métabolomique (Narainsamy et al. 2011 Metabolomics) pour
analyser la reprogrammation métabolique nécessaire à l’augmentation de la photoproduction
d’H2
2) Caractérisation d'un nouveau régulateur de la production d’H2 (Dutheil et al. soumission mi-
février 2012)
3) Développement de nouveaux outils de transcriptomique pour analyser la reprogrammation
génétique nécessaire à l’augmentation de la photoproduction d’H2 (prévue en 2012)
4) Construction et analyses globales d’un mutant de surproduction thermorégulée de
l’hydrogénase (Hox) (Ortega-Ramos et al. 2012)
5) Identification et analyse de nouveaux partenaires redox de l’hydrogénase (fin 2012)
6) Construction et analyses globales d’un mutant mutant de surproduction thermorégulée de
l’hydrogénase “complète” (Hox+Hyp) (Ortega-Ramos et al. 2013)
7) Identification de mutations augmentant la tolérance de l’hydrogénase à l’O2 (2012-13)
8) Caractérisation du réseau des régulateurs transcriptionnels controlant la production d’H2 (2013)
MASTER 2 M. Ortega-Ramos (PARIS XI, juillet 2010) Construction d’un mutant de
surproduction thermorégulée de l’hydrogénase (Hox)
THÈSES
1) J. Dutheil (CEA, soutenance décembre 2012)
2) M. Ortega-Ramos (ANR-BioE09, démarrée en Nov 2010, soutenance décembre 2013)