Informes Microbiologia I

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22000099

INFORMES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA 2009

2 | P g i n a

2009

Universidad Nacional Federico Villarreal Microbiologa I Ing. Flor Vsquez Nez

INFORMES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA


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Laboratorio 01

UNFV

FIIS

Ing. AGROINDUSTRIAL

MICROBIOLOGIA I

NORMAS DE BIOSEGURIDAD


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NNOORRMMAASS DDEE BBIIOOSSEEGGUURRIIDDAADD I. OBJETIVOS

- El principal objetivo al desarrollar en este laboratorio es que el alumno a prenda cuales son los riesgos a los que puede estar expuesto durante su aprendizaje en el laboratorio de Microbiologa.

- Saber resolver los posibles inconvenientes y accidentes. - Crear en el alumno una actitud mental lgica y de control ante cualquier accidente y sobre

todas las cosas, PREVENIR en lo posible todo los accidentes. - Los riesgos potenciales del laboratorio pueden referirse a materiales

II. INTRODUCCION

Se define Bioseguridad como el conjunto de normas o actitudes que tienen como objetivo prevenir los accidentes en el rea de trabajo, es decir, a disminuir el potencial riesgo ocupacional. Tambin se puede definir como el conjunto de medidas preventivas que deben tomar el personal que trabaja en reas de la salud para evitar el contagio de enfermedades de riesgo profesional.

Definimos Riesgo como la probabilidad que tiene un individuo de sufrir lesin, enfermedad, complicacin de la misma o muerte como consecuencia de la exposicin a un factor de riesgo. Cuando hablamos de Riesgo Ocupacional nos referimos al riesgo al cual est expuesto un trabajador dentro de las instalaciones donde labora y durante el desarrollo de su trabajo.

Se consideran como trabajadores del Laboratorio de Hematologa todas las personas incluidas los estudiantes y el personal de entrenamiento cuyas actividades incluyen el contacto con pacientes, con sangre u otros lquidos biolgicos o con desechos biolgicos, dentro del ambiente del laboratorio. La frecuencia de exposicin accidental de los trabajadores de la salud al Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), al virus de la Hepatitis B y C (VHB y VHC) y a otras enfermedades transmisibles por contacto con sangre u otros lquidos infectantes manejados en el laboratorio, depende de su actividad u oficio bsico, de su actitud frente a la bioseguridad y de las condiciones especificas de su trabajo o factores de riesgo a los que est sometido.

III. ANTECEDENTES

En la historia de la microbiologa se cuentan muchos ejemplos de infecciones contradas en el laboratorio: en 1957 se seala la ocurrencia de casos de fiebre tifoidea, clera brucelosis, ttanos, etc. asociados con el trabajo de laboratorio, adems de algunos agentes patgenos considerados como de muy alto riesgo por presentar una situacin especial, ya que su infectividad se mantiene aun en la sangre los tejidos de vertebrados asintomticos naturalmente infectados, con lo cual la enfermedad puede transmitirse a los manipuladores de estos animales aparentemente sanos y sus productos, como ocurri con la enfermedad de Marburgo aparecida en 1967.


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Se ha elaborado una clasificacin de agentes biolgicos sobre la base del riesgo que representan para el individuo que trabaja con ellos y para la comunidad, se han establecido 4 grupos de riesgo en orden creciente de peligrosidad

GRUPO I: agentes con bajo riesgo para el individuo y la comunidad

GRUPO II: agentes con moderado riesgo individual y riesgo comunitario limitado

GRUPO III: agentes con elevado riesgo individual y bajo riesgo para la comunidad

GRUPO IV: agentes con alto riesgo para el individuo y para la comunidad

NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD

PRECAUCIONES QUE DEBA ADOPTAR EL PERSONAL DE LABORATORIO

No se permitir comer, beber, fumar y/o almacenar comidas as como cualquier otro tem personal (maquillaje, cigarrillos, etc.) dentro del rea de trabajo.

Usar bata de manga larga dentro de laboratorio, la cual se pondr al momento de entrar y deber ser quitada inmediatamente antes de abandonar el laboratorio.

Asegurarse de no presentar cortes, raspones u otras lastimaduras en la piel y en caso de que as sea cubrir la herida de manera conveniente.

Usar guantes de ltex de buena calidad para todo manejo de material biolgico o donde exista, aunque sea de manera potencial, el riesgo de exposicin a sangre o fluidos corporales. Cambiar los guantes toda vez que hayan sido contaminados, lavarse las manos y ponerse guantes limpios.

No tocar los ojos, nariz o piel con las manos enguantadas.

No abandonar el laboratorio o caminar fuera del lugar de trabajo con los guantes puestos.

Bajo ninguna circunstancia se pipeteara sustancia alguna con la boca, para ello se utilizaran peras plsticas o pipeteadores automticos.

Lavar las manos con jabn y agua inmediatamente despus de realizar el trabajo. Descartar los guantes de ltex en un recipiente con solucin desinfectante.

No detener manualmente la centrifuga, no destaparla antes de que cese de girar.

No permitir la entrada de personas ajenas al laboratorio y/o que no tengan sus implementos de bioseguridad adecuados.

Emplear en todo momento las medidas de bioseguridad aqu expuestas

DERRAMES Y ACCIDENTES

Cuando se produzca derrame de material infectado o potencialmente infectado, el operador deber ponerse guantes y luego cubrir el fluido derramado con papel absorbente, derramar alrededor de este solucin descontaminante, y finalmente verter solucin descontaminante sobre el papel y dejar actuar por 10 minutos.

Usando papel absorbente seco y limpio levantar el material y arrojarlo al recipiente de desechos contaminados para su posterior eliminacin. La superficie deber ser enjuagada con solucin descontaminante.


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No se recomienda el uso de alcohol ya que evapora rpidamente y coagula los residuos orgnicos superficiales sin penetrar en ellos.

Durante todo el procedimiento de desinfeccin deber usarse guantes y evitar el contacto con el material derramado y desinfectado.

Los pinchazos, heridas punzantes, lastimaduras y piel contaminada por salpicadura de materiales infectados debern ser lavados con abundante agua y jabn desinfectante. Se deber favorecer el sangrado de la herida.

Si un trabajador sufre exposicin parenteral o de las membranas mucosa a sangre o fluidos corporales, se deber identificar el material y, si es posible determinar la presencia de virus o anticuerpos. El trabajador deber informar cualquier enfermedad febril aguda que ocurra dentro de las doce semanas posteriores a la exposicin.

ELEMENTOS PROTECTORES Y SU USO ADECUADO

Se usaran guantes de ltex en todo procedimiento que implique el manejo de material biolgico o donde exista el riesgo de exposicin a sangre o fluidos corporales, as mismo debern usarse en los procesos de descontaminacin y eliminacin de residuos contaminados.

Los guantes debern ser descartados una vez hayan sido contaminados en los sitios dispuestos para los residuos contaminados, y luego reemplazados por otros.

No tocar los ojos, nariz o piel con las manos enguantadas.

Usar mascarilla en los procedimientos en los que pueda haber riesgo de salpicadura de material biolgico en la mucosa bucal y nasal.

El uso de la bata ser obligatorio en todo momento dentro del laboratorio, la cual deber ser retirada antes de salir del laboratorio. Esta deber ser de manga larga para protegerse de cualquier reactivo o agente qumico, o material biolgico manipulado en el laboratorio.

Debern usarse zapatos cerrados dentro del laboratorio para evitar el contacto de la piel con material contaminado o cualquier producto qumico peligroso, por derramamiento o salpicadura.

Deber usarse gorro de tela para evitar el contacto directo del cabello con material contaminado o sustancias qumicas peligrosas.

MANIPULACION Y EVACUACION DE DESECHOS CONTAMINADOS

Todo el equipo reusable (puntas de micropipetas, cnulas, tubos, etc.) deber ser ubicado en un recipiente metlico o de plstico resistente a punciones y cortaduras, que contenga liquido descontaminante y deber estar localizado en el mismo lugar de trabajo.

Despus es preciso desinfectar el material con sustancias qumicas antes de limpiarlo e introducirlo en la autoclave.

Todo elemento descartable (agujas, jeringas, etc.) deber ser colocado en un recipiente de material resistente a punciones y cortaduras. Estos recipientes deben ser preferiblemente amplios de paredes rgidas y semirrgidas, con tapa asegurada para su posterior descarte y contener en su interior una solucin descontaminante, y estar ubicados lo ms cerca posible del lugar de uso de los instrumentos.


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Para la eliminacin de todo material contaminado, el mtodo de eleccin es la incineracin de los mismos, o el material puede ser autoclavado y luego destruido o enterrado.

Los residuos lquidos que se sospechen estn contaminados deben ser tratados con desinfectantes antes de su eliminacin o colectados en recipientes que sean eliminados en forma segura

SOLUCIONES DESINFECTANTES

Todos los materiales utilizados con las muestras de los pacientes o con los pacientes debern ser descontaminados, la solucin desinfectante utilizada va a depender del tipo de material de que se trate y al grado de contaminacin.

Para la descontaminacin del material descartable (agujas, jeringas, etc.) se utilizara hipoclorito de sodio al 10% (clorox, lmpido). Se preparara la concentracin de hipoclorito indicada en el momento en que ser utilizada.

Las agujas se descartaran junto con la jeringa en el recipiente destinado para esto sin colocar los protectores ni doblarse, junto con otros materiales punzo-cortantes. El material se expondr a la accin del hipoclorito durante 30 minutos.

Pasado el tiempo se toma el material (con pinzas o otro mtodo que impida el contacto con este) dejando que se escurra la solucin descontaminante, y se dejara caer en una caja de cartn, cerrar la caja y colocarla en una bolsa de residuos de color oscuro.

Descartar la solucin de hipoclorito por el desage.

Para la descontaminacin del material reusable se utilizara Glutaraldehido al 2% por ser menos corrosivo.

Se utilizaran dos recipientes, uno con agua destilada donde se sumergir el material para retirar la mayor cantidad posible de las materias orgnicas que contengan. Y otro recipiente con glutaraldehido al 2% donde se sumergir el material durante 30 minutos.

Despus de este tratamiento se retirara el material para lavarlo y esterilizarlo.

La solucin de glutaraldehido tiene una duracin promedio de 28 das, pero se debe controlar su pH diariamente. El agua destilada se descartara cada vez que sea utilizada. Ambas soluciones se descartaran en el desage.

Las superficies de trabajo debern limpiarse diariamente con solucin desinfectante. Esta solucin puede ser hipoclorito de sodio.

VIGILANCIA Y EVALUACION

Resulta necesario que exista una organizacin y medidas apropiadas que garanticen la seguridad del personal de los laboratorios y de los que le rodean. En correspondencia con los grupos de riesgo se han elaborado tambin cuatro niveles de bioseguridad, o sea, combinaciones tcnicas y prcticas de laboratorio, equipos de seguridad y facilidades del laboratorio apropiadas para el riesgo que representan los agentes infecciosos que se manipulan en estos lugares.

Otras funciones relativas a la organizacin de la seguridad en los laboratorios son:

Redactar protocolos de bioseguridad en cada rea y velar por su debido cumplimiento.

Implantar procedimientos de emergencia, particulares y generales, para casos de accidentes laborales de cualquier tipo.


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Garantizar el entrenamiento adecuado del personal que trabaja en el laboratorio.

Velar por que se cumplan las disposiciones relativas a la seguridad del transporte y recepcin o envo de materiales que contengan o con sospechas de contener agentes patgenos.

FACTORES DE RIESGO

Se conoce como factores de riesgo a todos los elementos, sustancias, procedimientos o acciones humanas presentes en el ambiente laboral que de una u otra forma tienen la capacidad de producir lesiones al individuo o daos materiales en el trabajo; encontrndose as en la fuente, el medio o en las personas y tienen como caracterstica fundamental que son fcilmente controlables. Los diferentes factores a que estamos expuestos como trabajadores del rea de la salud, se pueden clasificar en fsicos, qumicos, ergonmicos, elctricos, psicosociales y biolgicos.

FISICOS

Son los factores que actan sobre tejidos y rganos no por composicin qumica sino por efectos energticos. Se dividen en:

Formas Ondulatorias:

Ruidos, Vibraciones

Temperaturas extremas: afectan de forma hormonal y/o humoral al trabajador.

Radiaciones:

No ionizantes (UV, IR, RV, microondas)

Ionizantes (Rayos X, neutrones)

Las radiaciones estn determinadas por dos fuentes:

Emisores deliberados: TV, estaciones radiales, etc.

Emisores accidentales: equipos elctricos, etc.

La luz como fuente de energa y como agente fsico posee tambin sus fuentes:

Natural: sol, luna.

Artificial: lmparas de gas, incandescentes, etc.

QUIMICOS

Los factores qumicos son aquellos que por su composicin qumica son capaces de daar temporal o definitivamente al organismo expuesto. Se pueden clasificar en:

Slidos

Polvos

Humos

Lquidos

Vapores

Neblinas

Rocos


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Gases

Estos agentes qumicos pueden penetrar al organismo por diferentes mecanismos de absorcin, como son: vas respiratorias, piel, vas digestivas y mucosas. Todos los agentes qumicos tienen efectos nocivos ya que pueden afectar localmente al organismo o en forma general lo que muchas veces casa efectos irritantes, asfixiantes, cancergenos, mutagenicos, etc.

ERGONOMICOS

La iluminacin deficiente.

El diseo deficiente del sitio de trabajo y sus mobiliarias.

Hay que tener en cuenta las posturas y posiciones del cuerpo pues llevan a incurrir al padecimiento de lumbagos, inflamaciones, mala circulacin, etc.

Las cargas pesadas, se debe tener mucho cuidado cuando se maneja con ellas, pues hay condiciones y parmetros que indican la relacin del peso de la carga, pues muchas veces ocasiona desgarros, etc.

ELECTRICOS

Entre los factores elctricos que le pueden causar mal al trabajador estn: el no hacer control de calidad a la maquinaria o equipos que funcionan con electricidad, ya que los cables pueden tener peladuras o no se les este dando un buen manejo lo que conlleva a un riesgo para el trabajador.

Tambin el sitio donde est ubicado el equipo, pues este no debe estar en sitios donde se puedan tropezar con l o donde estn en contacto con agua porque puede haber una explosin o una descarga elctrica para los que estn cerca.

PSICOSOCIALES

Consisten en los cambios inesperados que se presentan en un individuo en su rea de trabajo lo cual conlleva a perjuicios en su salud:

o El trabajo repetitivo causa desinters y desmotivacin por el mismo, lo cual con un aumento en su actividad diaria ocasiona el estrs laboral.

o El desequilibrio psicofsico tiene como consecuencia malas relaciones con los compaeros, ya que se vuelve poco tolerante y mal humorado.

o Tambin suceden con frecuencia alteraciones psicosomticas que se detectan con cefalea, trastornos digestivos, asma, etc.

El estrs ocupacional son alteraciones del individuo a nivel fsico y mental, algunas manifestaciones mentales de estrs son:

o Subjetivos: ansiedad. o Comportamiento: aislamiento de la familia. o Trastornos psiquitricos, clnicos o Trastornos adoptivos, afectivos.


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BIOLOGICOS

De todos los factores de riesgo existentes en un laboratorio, los riesgos biolgicos son los ms importantes por la variedad y gran agresividad de microorganismos que se presentan (bacteria, virus y hongos), que causan accidentes o enfermedades profesionales.

Los riesgos de peligrosidad variables a los que est sujeto el personal de laboratorios hematolgicos, los cuales son potencialmente letales, destacan el riesgo de contraer infecciones con los agentes patgenos objeto de trabajo o con otros no sospechosos que se encuentran presentes en las muestras que se reciben en el laboratorio, estos agentes se comportan como riesgo primario para el operador y en ocasiones para la comunidad.

Los riesgos biolgicos inducen infecciones agudas y crnicas, parasitismo y reacciones toxicas y alrgicas a agentes vegetales y animales. Las infecciones pueden ser causadas por bacteria, virus, Ricketsias, Chlamydia, hongos y parsitos. Se considera que entre las causas ms frecuentes de infeccin en el personal de laboratorio, se encuentran:

o Accidentes de trabajo al manipular las muestras o Negligencia e inobservancia de reglamentos al manipular agentes infecciosos o No disponer de medios adecuados de proteccin o Personal inadecuadamente entrenado

Por estas razones hemos elaborado este manual de recomendaciones y educacin sobre algunas medidas generales y especificas que se deben tener en cuenta en laboratorios donde se trabaje con agentes infecciosos para el hombre.


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Laboratorio 02

UUNNFFVV

FFIIIISS

IInngg.. AAGGRROOIINNDDUUSSTTRRIIAALL

MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA II

MATERIALES Y EQUIPOS DEL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA


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MMAATTEERRIIAALLEESS YY EEQQUUIIPPOOSS DDEELL LLAABBOORRAATTOORRIIOO DDEE MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA

I. INTRODUCCION

En un laboratorio de qumica se utiliza una amplia variedad de instrumentos utilizados por los cientficos que trabajan en l. Esto incluye tanto los dispositivos como mechero Bunsen y microscopios como los equipos especializados, tales como espectrofotmetros y calormetros. En su conjunto, se denominan material de laboratorio.

En el desarrollo del laboratorio de microbiologa, se hace necesario el uso de materiales y equipos que faciliten la realizacin de las prcticas. Ciertos materiales usados pueden ser de acero inoxidable y de vidrio. Los hay de vidrio resistente a altas temperaturas por su alto contenido de dixido de silicio, bajo lcali, cido brico, lo que condiciona su escaso coeficiente de dilatacin, teniendo gran aplicacin en la fabricacin de los materiales de vidrio conocido como pyrex. En esta prctica se conocer diversos materiales de vidrio y equipos as como sus aplicaciones en el laboratorio de microbiologa.

II. OBJETIVOS

- Identificar, discriminar y describir los materiales de laboratorio. - Aprender el manejo correcto de los materiales y equipos de laboratorio. - Clasificar e identificar las funciones de los materiales y equipos de laboratorio.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

3.1 MATERIALES

1. Tubo de Pruebas. Son de vidrio, generalmente pyrex. Sirven para ensayos qumicos con pequeas cantidades de reactivos. Hay de diferentes capacidades. Ofrecen resistencia al calentamiento y a los cambios bruscos de temperatura.

2. Vaso de precipitado. Son de vidrio pyrex. Hay de diversas capacidades: 20 ml, 50 ml, 100 ml, 400 ml y 1000 ml. Algunos presentan pico se les conoce como beaker.

3. Pipetas. Es de vidrio. De forma cilndrica, huecas en ambos extremos, la parte inferior ms delgada que la superior. Sirven para medir lquidos. Hay de 1, 5, 10, 15 ml.


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4. Placa petri. Se usa mucho en microbiologa, para sembrar muestras en medios de cultivo que sirven para el desarrollo de microorganismos. Tiene forma de plato plano con bordes elevados que consta de una base y una tapa.

5. Asa de kohle. Est formada por una base que puede estar hecha de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que termina en un aro o punta. Nos ayuda a transportar microorganismos de un medio a otro.

6. Aguja de Kohle. Sirve para realizar la siembra de un cultivo

7. Campana de Durham. Se colocan en los tubos de prueba y sirve para indicar la presencia de gases en el medio de cultivo.

8. Mechero Bunsen. Funciona con gas y aire para proporcionar buena cantidad de calor.

9. Pinza de metal. Para soportar, quitar materiales del horno u otra fuente de calor.

10. Papel Kraft. Se utiliza para envolver los materiales de vidrio y someterlos a esterilizacin.

11. Propipeta. Se utiliza para succionar lquidos a travs de la pipeta.

12. Luna reloj. Es un recipiente para pesar agares.

13. Hervidor. Se utiliza para esterilizar frascos de vidrios.

15. Esptula de metal. Para tomar cantidades de muestra.


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3.2 EQUIPOS

1. Incubadora. Permite mantener caliente el producto en prueba.

2. Estufa Elctrica. Se utiliza para esterilizacin de materiales, para la determinacin de la humedad de muestras de alimentos. Aqu se pueden controlar las temperaturas de secado.

3. Centrifugas. Funcionan a velocidades relativamente altas 4000 rpm. Se usan para separar un compuesto de menor densidad en base a la precipitacin

4. Microondas. Cada vez son ms populares y se utilizan para calentar medios con agar. Las botellas o matraces deben tener el tapn aflojado ya que si est cerrado estallan fcilmente.

5. Bao mara. Es un equipo de acero inoxidable, donde se calienta agua que va hasta los 90o C. y es usado para experimentos que requieren calentamiento a vapor.

6. Microscopio. Equipo que permite la observacin de objetos y detalles de estructuras tan pequeas que no podran ser observadas a simple vista.

7. Cabinas de Seguridad Biolgica. Son recintos ventilados diseados para limitar al mximo el riesgo del personal del laboratorio expuesto a agentes infecciosos. Estos equipos tienen como objetivo principal proporcionar una zona de trabajo que minimice la probabilidad que una partcula transportada por el aire tiende a escapar hacia el exterior de la cabina y contaminar as al operario y a la zona que lo rodea.

8. Autoclaves. Se utiliza para esterilizacin de materiales. Deben poseer manmetro y termostato, as como vlvula de seguridad, sistema de desconexin.

9. Congeladores. Permite almacenar cultivos previamente envasados y sellados. No se deben llenar completamente para evitar que rebosen por el incremento de volumen

Material de madera

Material de plstico o goma

Material de vidrio Material de metal

Material de

porcelana

Instrumentos de medicin

Material volumtrico

Instrumentos trmicos

Gradilla Gradilla Alambique, Ampolla de decantacin

Anillo de hierro Crisol Calormetro Bureta Calormetro, Cmara infrarroja

Mortero (utensilio)

Pipeta (qumica) Baln de destilacin, Bureta

Doble nuez Mortero (utensilio)

Colormetro Matraz aforado Hipsmetro, Termmetro de mximas y mnimas

Pizeta Cristalizador, Cuentagotas, Aparato de Kipp

Esptula Embudo Bchner

Espectrofotmetro de transformada de Fourier

Micropipeta Termmetro de Breguet, Termmetro de alcohol

Probeta (qumica) Embudo de decantacin, Matraz de Erlenmeyer

Gradilla Espectrmetro Probeta (qumica)

Termmetro de bulbo, Pirmetro

Propipeta Kitasato, Matraz aforado

Pie universal PH-metro Pipeta (qumica) Termmetro de bulbo hmedo, Psicrmetro

Pera de succin Placa de Petri, Pipeta (qumica)

Agitador magntico RIFMA Termmetro de mercurio, Termmetro de resistencia

Tapn Probeta (qumica), Retorta, Viscosmetro

Asa bacteriolgica Densmetro Termmetro, Termistor, Termostato

Tubo de microcentrfuga

Serpentn, Extractor Soxhlet

Autoclave de laboratorio

Termmetro de gas, Termoscopio

Tubo de ensayo, Tubo refrigerante (qumica)

Bao Mara

Varilla de vidrio (qumica), Vaso de precipitados

Centrfuga

Vidrio de reloj (qumica), Picnmetro,

Mechero Bunsen, Termociclador

Laboratorio 04

UUNNFFVV

FFIIIISS



PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO


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PPRREEPPAARRAACCIIOONN DDEE MMEEDDIIOOSS DDEE CCUULLTTIIVVOO I. INTRODUCCION

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuada, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

II. OBJETIVOS

- Identificar las clases de medios de cultivo - Preparar medios de cultivo lquidos y slidos - Identificar los requerimientos nutricionales de los microorganismos.

III. GENERALIDADES

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin.


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En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1. Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaba la prdida de los factores nutritivos lbiles.

Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medias sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica.

Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.


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2. Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio.

3. Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

4. Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio.

5. Luz ambiental

La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.

6. pH

La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales.

7. Temperatura

Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios.


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8. Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especmenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)

La evolucin de los medios de cultivo

Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observacin de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilizacin del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexin en su evolucin. La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que consigui aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina.

Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio lquido. Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas.

En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en relacin con los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.

Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Disearon este tipo de medios de tal forma que su especial composicin qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en funcin de sus procesos metablicos, eran los nicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.

En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda observar la produccin de cidos en la fermentacin en ciertos microorganismos.

Tipos bsicos de medios de cultivo

Atendiendo a su estado fsico:

o Lquidos o Semislidos o slidos


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Atendiendo a su utilidad prctica:

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.)

selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina).

enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su identificacin (Lowenstein).

Medios para identificacin:

diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo) especficas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria (Oxidacin-Fermentacin).

IV CUESTIONARIO.

1. Por qu se prepara los medios en agua destilada? La ventaja es que el agua destilada es 100% pura, y es apta para el crecimiento de

las bacterias en ella, a una temperatura adecuada, el agua destilada es la indicada para los medios de cultivo por estas razones. Para limpiar materiales de laboratorio, es la mejor, ya que esta purificada y libre de partculas contaminantes.

El agua destilada es aquella cuya composicin se basa en la unidad de molculas de H2O. Es aquella a la que se le han eliminado las impurezas e iones mediante destilacin. La destilacin es un mtodo, en desuso para la produccin de agua pura a nivel industrial. Esta consiste en separar los componentes lquidos de una mezcla.

2. Realice una descripcin del agar-agar, su composicin qumica, sus funciones,

aplicaciones.

Agar-agar o agar es una substancia gelatinosa derivada de algas marinas. El medio de cultivo es un polisacrido sin ramificaciones obtenido de la pared celular de varias especies de algas rojas de los gneros Gelidium, Euchema y Gracilaria entre otros actuando como pigmento que da un color caracterstico a cada una. La palabra agar viene del malayo agar-agar, que significa jalea.


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Qumicamente el agar es un polmero de subunidades de galactosa; en realidad es una mezcla heterognea de dos clases de polisacridos: agaropectina y agarosa.1 Aunque ambas clases de polisacridos comparten el mismo esqueleto de galactosa, la agaropectina est modificada con grupos cidos, tales como sulfato y piruvato. Los polisacridos de agar sirven como la estructura primaria de la pared celular de las algas. Disuelto en agua caliente y enfriado se vuelve gelatinoso. Su uso principal es como medio de cultivo en microbiologa, otros usos son como laxante, espesante para sopas, gelatinas vegetales, helados y algunos postres y como agente aclarador de la cerveza.

Medios selectivos

Los medios de agar selectivos son utilizados para aplicar una presin selectiva a los organismos que crecen en ellos, por ejemplo para seleccionar solamente bacterias gram-negativas se usa el agar Mac Conkey, que a su vez tiene un colorante que indica si la bacteria es fermentadora de lactosa o no.

Usos en biologa molecular

La carga neutra y el bajo grado de complejidad qumica de la agarosa hacen poco probable que interaccione con biomolculas, como protenas. Los geles hechos de agarosa purificada tienen un tamao de poro relativamente grande, hacindolo til para la separacin basada en el tamao molecular de complejos de protenas o protenas mayores a 200 KDa y fragmentos de ADN mayores a 100 pares de bases. La agarosa se puede utilizar para la separacin electrofortica en la electroforesis de gel de agarosa o para la cromatografa de exclusin molecular. Y como tambin otro contenido.

Uso en la cocina

Esta alga tiene su origen en los mares del sur de frica. Es incoloro, inspido y absorbe agua en cantidades de 200 y 300 veces su peso, formando una gelatina. Tambin hay un producto comercial denominado "agar-agar". Se utiliza entre otras cosas como estabilizador de algunos alimentos y comestibles y para la realizacin de gelatinas.

Su poder gelificante es su gran baza pues, con muy poco polvo de gelatina en una proporcin de agua abundante, da lugar a una gelatina muy dura y compacta; en caliente gelifica, a diferencia de la gelatina de colas de pescado que tiene que estar completamente fra para que cuaje. Tambin cabe destacar que gelifica zumos de frutas exticas (como la pia) y que la gelatina normal no puede gelificar por la acidez de stos zumos. Por otra parte tambin se puede utilizar en la fabricacin de gomitas.

No hace efecto para gelatinizar en contacto con productos grasos, como caldos sin desgrasar o productos aceitosos. Para hace gelatinas rgidas se deben de aadir a caldos hirviendo 16 gramos por litro, y para gelatinas ms blandas para base de platos aadir 6 gramos y 5 hojas de cola de pescado por litro; tiene que cocer bien para que no aparezca el agar-agar en forma de puntos.


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3. Describa la formulacin y preparacin de los siguientes medios: bsicos, selectivos, enriquecidos, de enriquecimiento, diferenciales, especiales.

Medios de cultivo bsicos. Permiten el crecimiento de una gran variedad de microorganismos. Pertenecen a esta categora las infusiones de extractos de carne y peptona, una mezcla de composicin similar a la de los lquidos orgnicos, que se utiliza para muchas bacterias patgenas (causantes de enfermedades).

Medios de cultivo selectivos. Favorecen el crecimiento de un gnero o de una especie concreta de microorganismos. Son muy tiles para aislar ciertos microorganismos a partir de una poblacin mixta. Por ejemplo, si a un cultivo se le aade un inhibidor del crecimiento de bacterias Gram +, como el cristal violeta, nos aseguramos de que en ese cultivo slo van a crecer bacterias Gram -. Pertenecen a esta categora el caldo lactosa bilis verde brillante o el agar Salmonella-Shigella. Segn el procedimiento que se utiliza para favorecer el crecimiento de microorganismos concretos, podemos distinguir entre medios de cultivo diferenciales y medios de enriquecimiento.

Medios de cultivo diferenciales. Utilizan propiedades diferenciales del crecimiento microbiano. El medio de cultivo con agar sangre diferencia las bacterias hemolticas de las no hemolticas, el medio de cultivo de McConkey diferencia a las que son lactosa (+) de los lactosa (-).

Medios de enriquecimiento. Deberan llamarse medios enriquecidos porque lo que se hace es aadir aditivos, que favorecen el crecimiento de un grupo determinado de microorganismos, y neutralizantes que inhiben el crecimiento de otros microorganismos que interferiran con el que estamos buscando. Se puede adicionar sangre, suero o extractos de tejidos animales o de plantas. Por ejemplo el caldo selenito cistina o el caldo agar sangre


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Laboratorio 05

UUNNFFVV

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SIEMBRA DE MICROORGANISMOS


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SSIIEEMMBBRRAA DDEE MMIICCRROOOORRGGAANNIISSMMOOSS I. OBJETIVOS

Aplicar tcnica de siembra en medios lquidos. Observar el crecimiento de bacterias en los diversos medios de cultivo. Identificar caractersticas de desarrollo de microorganismos.

II. INTRODUCCION

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de microbiologa consiste en transferir una muestra microbiolgica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el rea de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que stos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no slo el aspecto nutricional, sino tambin las condiciones ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentracin de sales y durante la incubacin condiciones tales como la temperatura, aireacin la luminosidad.

La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, as como su aislamiento y la obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propsito especfico del estudio.

III. MARCO TEORICO

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando ste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axnico, cuando contiene ms de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.

Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axnico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos estn por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que ste pueda ser axnico. El segundo paso para obtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola clula de un microorganismo en un medio slido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables.


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Un clon est constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido.

Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos bsicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentracin o carga microbiana de la muestra (inculo) a sembrar.

Para impedir la contaminacin de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el are y todas las superficies estn densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra microbiolgica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminacin. Estos incluyen el rea de trabajo, el lavado de las manos, la esterilizacin de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminacin se le llama tcnica asptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:

o La contaminacin y prdida del cultivo en estudio o La salida y dispersin de microorganismos del cultivo, lo que ocasionara la contaminacin

de utensilios, productos y del personal. Este ltimo aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patgenos.

Con relacin a la concentracin del inculo, un error frecuente del principiante consiste en

tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamao de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequesima (casi invisible) que se adhiera al asa, ser ms que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.

IV RESULTADOS Y DISCUSIONES

En los tubos se observar las siguientes caractersticas de desarrollo:

o Si hay enturbamiento del medio o Si hay formacin de una pelcula sobre la superficie o un anillo o Si hay sedimento en el fondo del tubo

De acuerdo a las observaciones hechas se especificarn si son aerobios o anaerobios.


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V CUESTIONARIO

1. Cmo se prepara una muestra antes de aplicar una tcnica de siembra? En microbiologa se entiende por "siembra" la operacin que consiste en depositar un germen aspticamente en un medio de cultivo. Toda siembra debe adaptarse a los siguientes principios generales

1. Practicarla en medios de cultivo favorable y previamente esterilizado. 2. Emplear instrumentos aspticos. 3. No contaminar ni destruir el inculo, 4. Depositarla aspticamente en los medios elegidos. 5. Esterilizar los instrumentos empleados antes y despus de cada operacin.

2. Cules son las pautas necesarias para hacer la inoculacin de la muestra?

Para la inoculacin de muestras es necesario tener en cuenta lo siguiente: El asa: Es un alambre de cromo nquel, tiene un dimetro de 0,3 a 1 mm. de dimetro y est sujeto a un mango de vidrio o de metal. El hilo puede terminar recto (aguja), en anillo (asa) o aplastado (esptula). Los medios de cultivo, como ya se ha dicho, pueden ser slidos o lquidos, y estar contenidos en tubos, placas o frascos. La tcnica general de las siembras variar segn el estado fsico del material a sembrar y del medio de cultivo.

3. Explica sobre las tcnicas de siembra de microorganismos segn el tipo de medio de cultivo.

El mtodo de siembra por estra en placa

Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a continuacin se hacen estras sobre la superficie de un medio slido preparado en una placa Petri (a las placas Petri tambin se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la regin donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la misma tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar clulas individuales. A continuacin, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las clulas aisladas experimenten un nmero suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola clula, no podemos asegurarlo. Quizs, dos clulas quedaron depositadas tan juntas que han originado una nica colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axnico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, sern, casi con toda seguridad, cultivos axnicos.


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Los mtodos de vertido en placa y extensin en placa

En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensin con mil millones de clulas por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensin con un centenar de clulas por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se aade 1 ml de la suspensin bacteriana a 9 ml (le medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se agita vigorosamente para diluir las clulas y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuacin, se puede proceder de dos maneras diferentes.

En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido

y se vierten en placa. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en la superficie. Las colonias superficiales se extendern y sern ms grandes. En el segundo mtodo (extensin en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendindolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estril. La suspensin se absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la superficie. En ambas tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como en el mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensin o en el agar solidificado sembrado por el mtodo del vertido en placas sean cultivos axnicos hasta que se repita el proceso. Las dos tcnicas de siembra por dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor nmero de colonias aisladas que el mtodo de siembra por estra, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.

4. Establecer las diferencias entre aerobios estrictos, anaerobios estrictos, anaerobios facultativos, anaerobios facultativos.

Bacterias aerobias: son aquellas que necesitan oxgeno para su metabolismo. Realizan la oxidacin de la materia orgnica en presencia de oxgeno molecular, es decir, realizan la respiracin celular.

Aerobias estrictos: slo pueden sobrevivir en ambientes oxigenados

Aerobias facultativas: pueden vivir en ambientes con oxgeno o sin l

Bacterias anaerobias: son aquellas que no utilizan oxgeno molecular en su actividad biolgica. La obtencin de energa la realizan mediante catabolismo fermentativo. Se pueden distinguir dos grupos dentro de ellas:

Anaerobias facultativas: pueden vivir en ambientes con oxgeno o sin l.

Bacterias anaerobias estrictas: slo pueden sobrevivir en ambientes carentes de oxgeno.


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5. Cmo se conservan los medios de cultivo? Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco,

mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro tambin puede mantenerse viable durante aos sin hacerlo crecer peridicamente. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de coleccin. Muchos laboratorios poseen una coleccin de cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen un nmero enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbilogos. Existen muchas tcnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecacin (eliminacin del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura.

Los cultivos generalmente se desecan por liofilizacin (congelacin y desecacin). El mtodo consiste en lo siguiente: el cultivo lquido se vierte en un pequeo vial o ampolla de vidrio y se aade leche descremada para proteger las clulas durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vaci para su sublimacin (eliminacin del agua congelada). Durante el proceso de sublimacin las clulas permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras an se mantiene el vaco. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente.

Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrgeno lquido o en un ultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas.

6. Cul es la composicin qumica de la sal, azcar, almidn y colapez? SAL: El sodio (Na) de la sal hace que los componentes alcalinos y cidos del cuerpo se mantengan siempre en un estado estable. Por ejemplo, la cal hace un papel importante en el momento de la digestin, ya que ayuda al cido para hacer la digestin. Tambin tiene un papel importante en la funcin de mantenimiento de los msculos y de los nervios. El sodio forma parte de todas las plantas y vegetales. El Cloro (Cl) de la sal, ayuda en la fabricacin de los jugos gstricos, muchas veces, la falta de este componente produce en el ser humano mareos, flacidez, desgana y nerviosismo. Sobre todo despus de sudar mucho las cualidades de la sal se pierden creando as un desequilibrio mental y corporal. AZUCAR: Qumicamente azcares y carbohidratos son sinnimos, pero normalmente los azcares se refieren a dulces, pequeos, carbohidratos solubles. La palabra azcar generalmente se usa como sinnimo para la sacarosa (sucrosa). En este apartado nos referimos a los azcares como pequeos y dulces carbohidratos solubles.


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Azcar Estructura Dulzor en comparacin con la sacarosa

Sacarosa (glucosa + fructosa)

100%

Glucosa

74%

Fructosa

173%

Maltosa (glucosa + glucosa)

33%

Lactosa (galactosa + glucosa)

16%


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ALMIDON: Desde el punto de vista de su composicin qumica, el almidn es un polisacrido formado por gran cantidad de azcares simples que se entrelazan y forman una cadena. Los azcares que lo constituyen son molculas de glucosa, a su vez compuestos de carbono, hidrgeno y oxgeno. La frmula del almidn es (C6H10O5)n , siendo n el nmero que indica la cantidad de molculas de glucosa. La cadena del almidn puede ser simple (amilosa) o ramificada (isoamilosa). Todas las clases de almidn se tien de azul en contacto con el yodo, y tal coloracin desaparece si se aporta calor. Al calentar y enfriar de inmediato, se forman engrudos. Los diferentes almidones -entre los que cabe mencionar, por ser los ms empleados, el de maz, el de trigo, el de papa y los arrurruces, que tienen su origen en diversas plantas tropicales- se aplican en la industria alimentaria como fuente de azcares, en la fabricacin de explosivos, pegamentos y pasta de papel. COLAPEZ Colapez o cola de pescado son lminas transparentes que se disuelven ponindolas primero en agua fra y despus al fuego con poco agua. Se emplean para hacer gelatina o dar consistencia a algunos preparado (se obtiene de las branquias de ciertos peces de agua dulce, especialmente el esturin Colapez

Comestible: 100 % Energa: 6,00 Kcal.

Carbohidratos: 0,00 g. Grasas: 0,00 g.

Protenas: 1,40 g. Fibra:

Colesterol:

Hierro:

Calcio:

fosforo:

AGSat:

AGSat:

AGPoliInsat:


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Laboratorio 07

UUNNFFVV

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PREPARACION DE MEDIOS DE

CULTIVO SOLIDO


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PPRREEPPAARRAACCIIOONN DDEE MMEEDDIIOOSS DDEE CCUULLTTIIVVOO SSOOLLIIDDOOSS

I. INTRODUCCION

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de microbiologa consiste en transferir una muestra microbiolgica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el rea de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que stos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no slo el aspecto nutricional, sino tambin las condiciones ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentracin de sales y durante la incubacin condiciones tales como la temperatura, aireacin la luminosidad.

La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, as como su aislamiento y la obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propsito especfico del estudio.

II. OBJETIVOS

Aplicar la tcnica adecuada para preparar el rea de trabajo y evitar contaminaciones. Organizar el material para su fcil manejo e identificacin. Manipular adecuadamente los cultivos puros. Seleccionar y aplicar las tcnicas de siembra adecuadas para alcanzar propsitos

especficos. Identificar y describir correctamente las caractersticas culturales y microscpicas de

algunas bacterias. Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscpico y microscpico de

bacterias.

III. MARCO TEORICO

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando ste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axnico, cuando contiene ms de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.


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Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axnico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos estn por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que ste pueda ser axnico. El segundo paso para obtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola clula de un microorganismo en un medio slido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables. Un clon est constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido.

Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos bsicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentracin o carga microbiana de la muestra (inculo) a sembrar.

Para impedir la contaminacin de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el are y todas las superficies estn densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra microbiolgica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminacin. Estos incluyen el rea de trabajo, el lavado de las manos, la esterilizacin de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminacin se le llama tcnica asptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:

o La contaminacin y prdida del cultivo en estudio o La salida y dispersin de microorganismos del cultivo, lo que ocasionara la contaminacin

de utensilios, productos y del personal. Este ltimo aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patgenos.

Con relacin a la concentracin del inculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamao de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequesima (casi invisible) que se adhiera al asa, ser ms que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.

Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso microbiolgico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodn), pipeta pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, esptula y/o gancho.


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En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculacin, hisopos, pipetas o pipetas pasteur que debern esterilizarse previamente. La utilizacin de estos dispositivos, as como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones especficas. Por ejemplo: los medios lquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodn o tapones especiales. Un cultivo lquido puede ser transferido mediante un asa microbiolgica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inculo se deposita dentro del caldo o medio lquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a travs de todo el lquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y es fcil homogeneizarlas, lo que permite estandarizar la concentracin del inculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difcil detectar contaminacin a simple vista.

Los medios semislidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta pasteur; en este ltimo caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado lquido y a una temperatura de aproximadamente 42C se agrega el inculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separacin de microorganismos con diferentes requerimientos de oxgeno.

Los medios slidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, despus de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan caractersticas que varan con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado.

En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que an cuando la mayora de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o cido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecer el crecimiento del microorganismo de inters y la obtencin del cultivo. Con este mismo propsito durante la incubacin se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento ptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayora de las veces estn relacionadas con la de su hbitat natural.

Algunos microorganismos crecen por debajo de 15C, otros requieren temperaturas ms elevadas (30 a 45C) y algunos hasta 80C. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiolgica o un bao de agua a temperatura constante, en tanto que para los microorganismos que presentan su crecimiento ptimo a temperaturas entre 20 y 25C se pueden incubar en la gaveta o cajn del laboratorio, a temperatura ambiente.

En general las incubadoras microbiolgicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con are seco, lo que determina la deshidratacin de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por ms de nueve das. Con relacin a las necesidades gaseosas, no todos los


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microorganismo crecen en presencia de oxgeno atmosfrico; los que slo crecen en presencia de are se llaman aerobios obligados; los que slo crecen en ausencia de oxgeno se denominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categora que comprende bacterias que requieren oxgeno, pero slo lo utilizan cuando ste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaeroflicos. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitacin de los cultivos o mediante la exclusin de oxgeno para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales.

Las bacterias son organismos procariticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parsitos, comensales o mutualistas. Fisiolgicamente este grupo presenta caractersticas muy variables, hay bacterias mviles e inmviles fotosintticas y quimiotrficas, auttrofas y hetertrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas.

En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamao, morfologa celular, forma de agrupacin, reaccin a la tincin de Gram, formacin de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y caractersticas culturales en medios lquidos y slidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamao, elevacin y color de las colonias.

IV. MATERIALES

Frasco con Agar Nutritivo Frasco con Agar EMB Frasco con Agar Mac Conkey Frasco con Agar SS (salmonella shiguella) Luna de Reloj, probeta 200 ml, vaso precipitado Botella estril con tapa (wallon) Franela, pabilo, papel aluminio, bolsa, jara elctrica

V. PROCEDIMIENTO

1. Calibrar la balanza analtica y tarar a cero 2. Pesar la cantidad necesaria del agar seleccionado en una luna reloj, para preparar 100 ml

de agar. Siga la formulacin del fabricante dado en el frasco. 3. Colocar el agar deshidratado en un vaso precipitado limpio y seco, aadir el agua necesaria

medida en probeta y completar hasta 100 ml. 4. Mezclar circularmente. 5. Transferir el agar a una botella estril y cerrarla. Sujetar la botella con pabilo. 6. Introducir la botella en vapor de agua (jarra) y cada 5 min. Retire la botella con una franela,

mover de forma circular y fuerte por 1 min. Luego introducir la botella al agua hirviente nuevamente otros 5 min. Y hacer esta operacin 6 veces hasta que el agar se vea transparente (lustroso)

7. Enfriar, rotular, cubrir con papel aluminio y bolsa 8. Refrigerar a 4o C por 7 das


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VI. CUESTIONARIO

1. Describa la composicin qumica y forma de preparacin del agar segn el fabricante de agar: Agar Mac conkey Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. Fundamento En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona 17.0 Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

Pluripeptona 3.0

Lactosa 10.0

Mezcla de sales biliares 1.5

Cloruro de sodio 5.0

Agar 13.5

Rojo neutro 0.03

Cristal violeta 0.001

pH final: 7.1 0.2

Siembra

- Sembrar en superficie. - Utilizando la tcnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y agregar aproximadamente

15 ml de medio de cultivo fundido y enfriado a 45-50 C.

Incubacin Durante 18-48 horas, a 35-37 C, en atmsfera aerbica


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Resultados

Microorganismos Colonias

Escherichia coli ATCC 25922 Rojas con halo turbio

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Rosadas mucosas

Salmonella typhimurium ATCC 14028

Incoloras, transparentes

Shigella flexneri ATCC 12022 Incoloras, transparentes

Proteus mirabilis ATCC 43071 Incoloras, transparentes

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Diminutas, incoloras, opacas

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo prpura

Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C.

Agar Salmonella shiguella (SS) Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia. Fundamento Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, est dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.


Pluripeptona 5.0 Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullicin durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50C y distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.

Extracto de carne 5.0

Lactosa 10.0

Mezcla de sales biliares 8.5

Citrato de sodio 8.5

Tiosulfato de sodio 8.5

Citrato frrico 1.0

Agar 13.5

Verde brillante 0.00033

Rojo neutro 0.025

pH final: 7.0 0.2


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Siembra Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo. Recomendaciones, se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar E.M.B. (B02-101-05) o de agar Mac Conkey (B02-114-05).

Incubacin Durante24-48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.

Resultados

Microorganismos Colonias

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Transparentes, centro negro

Shigella flexneri Incoloras

Shigella sonnei Incoloras

Proteus mirabilis ATCC 43071 Transparentes, centro negro

Escherichia coli ATCC 25922 Rosadas a rojas

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Rosadas cremosas y mucosas

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Incoloras, de muy escaso crecimiento


Medio preparado: rojo naranja.

Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 C.

Agar Nutritivo Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos. Su uso est descripto en muchos procedimientos para el anlisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria. Fundamento Por las caractersticas de sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La Pluripeptona es la fuente de carbono y nitrgeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.


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Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Extracto de carne 3.0

Cloruro de sodio 8.0

Agar 15.0

pH final: 7.3 0.2

Siembra En superficie o por la tcnica de pour plate, segn el uso a que se destine. Incubacin En aerobiosis, a 35-37 C durante 24 horas.

Resultados

Microorganismos Crecimiento

P. mirabilis ATCC 43071 Bueno-excelente

E. coli ATCC 25922 Bueno-excelente

S. aureus ATCC 25923 Bueno-excelente

B. cereus ATCC 10876 Bueno-excelente

E. faecalis ATCC 29212 Bueno-excelente

P. aeruginosa ATCC 27853 Bueno-excelente


Medio preparado: mbar claro a medio ligeramente opalescente.

Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C.

Agar EMB Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Fundamento Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un caracterstico


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brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Cndida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.


Peptona 10.0 Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Esterilizar en autoclave a no ms de 121C durante 15 minutos. Enfriar a 45C y distribuir agitando suavemente.

Lactosa 5.0

Sacarosa 5.0

Fosfato dipotsico 2.0

Agar 13.5

Eosina 0.4

Azul de metileno 0.065

pH final: 7.2 0.2

Siembra En superficie, por estriado a partir de un inculo poco denso, para obtener colonias aisladas. En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.

Incubacin De 24 a 48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.

Resultados

Microorganismos Tipo de Colonia

Escherichia coli ATCC 25922 Verdosas con brillo metlico y centro negro azulado

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Mucosas, rosa prpura, confluentes

Proteus mirabilis ATCC 43071 Incoloras

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Incoloras, pequeas, puntiformes

Shigella flexneri ATCC 12022 Incoloras

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Incoloras

Caractersticas del medio:

Placas preparadas: color prpura.

La esterilizacin del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color prpura se restaura por agitacin. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.


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Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C.

2. Qu son las peptonas, extracto de levadura, extracto de carne y agar? Por qu se utilizan los medios? PEPTONAS Las peptonas son derivados de la leche animal o carne digeridos por la digestin proteolitica. Adems de contener pequeos pptidos. Tambin contienen grasas, metales, sales, vitaminas y muchos otros compuestos biolgicos. La peptona se usa en Bacteriologa, como medio de cultivo para el desarrollo de bacterias y hongos. La aplicacin principal de las peptonas, extractos y otras materias primas es la produccin de medios de cultivo ya sean deshidratados, lquidos o medios slidos. Estos productos tambin se emplean en la produccin de medios para la fermentacin de tejidos vegetales y como estabilizadores de vacunas. Se utiliza tambin en otras aplicaciones como cosmtica, electroplantingas y productos dietticos. Estos productos derivan de protenas vegetales y animales. Hispanagar ofrece productos animales incluyendo toda la documentacin de su trazabilidad.

- Peptonas de origen vegetal / otras peptonas: Peptona de Soya, Peptona de Soya (no modificada genticamente), Peptona de Soya (no modificada genticamente y libre de derivados animales), Extracto de Levadura.

- Peptonas de origen animal: Peptona Bacteriolgica, Extracto de Carne en polvo, Peptona Biotriptasa, Infusin Cerebro Corazn (bovino), Infusin Cerebro Corazn (porcino), Peptona de Casena tipo I (triptona), Peptona de Casena tipo II, Peptona de Casena AS (Alta solubilidad), Peptona de Gelatina, Infusin de corazn (bovino), Infusin de corazn (porcino), Hidrolizado de Lactoalbmina, Peptona Marina, Extracto de Carne (porcina), Peptona de carne (bovina), Peptona de carne (porcina), Digerido de Corazn de cerdo (PD polvo), Bilis de Buey Bacteriolgica, Leche peptonizada, Polipeptona, Peptona Proteosa, Peptona Proteosa n3, Infusin de Ternera, Peptona de Casena Tipo III, Peptona de Casena TT, Peptona de Casena y Carne, Extracto de Carne (porcina). EXTRACTO DE LEVADURA Es un producto residual de la elaboracin de la cerveza que contiene altas concentraciones de levadura y que se emplea en la industria de la alimentacin frecuentemente como aditivo.

EXTRACTO DE AGAR

Es un alga roja y gelatinosa, muy flexible y resistente a pesar de sus intrincadas ramificaciones. Tambin es conocida por los nombres siguientes: gelosa, gelosia, gelatina vegetal, gelatina china, gelatina japonesa, cola de pescado japonesa... etc. Botanicamente pertenece a la familia Gelidaceae, su nombre cientfico es Gelidium cantilagineum (L.) Gaillon Gelidium capense (5. G. Gmelin) P. C. Silva. En espaol se conoce como gelosa, gelosina, gelatina vegetal, gelatina china, gelatina japonesa, cola de pescado japons o gelatina de kosher.


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Es originaria de los mares del sur de frica. Su extracto denominado tambin agar-agar es incoloro, inspido y absorbe agua en una cantidad que vara entre 200 y 300 veces su peso, formando una gelatina. Existe tambin un producto comercial denominado agar-agar, el alga es la materia prima del mejor agar-agar conocido. Se utiliza entre otras cosas como estabilizador de algunos alimentos y comestibles y para la realizacin de diversas y suculentas gelatinas

3. Qu son los cultivos puros y porque son importantes? Un mtodo fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. CARACTERIZACIN DE CULTIVOS PUROS

- Las colonias deben ser iguales en forma, tamao y color. - Que no existan formas inhibidas. - Al microscopio deben tener un aspecto comn. - Tiene que tener iguales propiedades tintoriales. - Deben ser bioqumicamente y fisiolgicamente iguales. - Una regla importante es no coger nunca de la primera colonia.

MANTENIMIENTO

1. Debemos transferir peridicamente, ya que los tubos de agar se secan, se evapora el agua.

2. Se debe cubrir con parafina, con lo cual la transferencia se puede hacer ms tarde, disminuye el metabolismo y tardan en envejecer.

3. Se disminuye la temperatura, congelamos las clulas. Para proteger las clulas y que no se formen cristales que la

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