INFORME TÉCNICO FINAL

PROYECTO SIP 2007 0759

SUSCEPTIBILIDAD ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS DE ARROZ. BIOACTIVOS

PROTEÍNICOS.

DIRECTORA: MC MA. ISABEL CORTÉS VÁZQUEZ.

INVESTIGADORES PARTICIPANTES: MC ROBERTO BRIONES MARTÍNEZ,

ESTUDIANTES PARTICIPANTES: OSCAR JAVIER RAMOS.

Resumen

Se realizó un estudio de la susceptibilidad a la proteólisis de proteínas

obtenidas de arroz Morelos A98 (PA), de sus fracciones proteínicas: albúminas,

globulinas y glutelinas y, comparativamente, de proteínas aisladas de suero

lácteo (PSL). Se analizó el efecto de dos proteasas de diferente especificidad y

origen: tripsina y hemisfericina, ensayando diferentes tiempos de hidrólisis.

Asimismo, con el propósito de conocer las propiedades funcionales de los

productos de reacción generados en la proteólisis se determinaron las

propiedades emulsionante y antioxidante. Los resultados obtenidos mostraron

que las fracciones de proteínas aisladas de arroz presentan diferencias

significativas en su susceptibilidad a la hidrólisis tríptica. Los valores de grado

de hidrólisis para las albúminas, globulinas, glutelinas y del concentrado total de

proteínas del arroz, después de 120 minutos de reacción, fueron 1.9, 11.5, 2.6 y

4.8%, respectivamente. Las globulinas presentaron la más alta susceptibilidad a

la hidrólisis tríptica. Las preparaciones totales PA y PSL, en cambio, resultaron

con bajos de grado de hidrólisis con ambas enzimas (1-2.6%). El análisis de

funcionalidad de los hidrolizados de PSL con hemisfericina mostró la presencia

de péptidos cuya actividad emulsionante (IAE) fue significativamente más alta

que la de los hidrolizados de PA o la de sus fracciones aisladas. Las fracciones

de proteínas del arroz, por otra parte, mostraron muy buenas características de

estabilidad emulsionante. Los niveles de actividad antioxidante (AOX) sobre el

radical 2,2-difenil-1-picril hidracilo (DPPH) generados por los péptidos

contenidos en los hidrolizados con hemisfericina de las PA y de PSL, en

tiempos de reacción cortos (30 min), produjeron un 40% de reducción de la

oxidación; valor que se incrementó hasta 55% para 180 min de proteólisis. Por

otra parte, los productos de los hidrolizados trípticos de las PSL mostraron una

AOX muy baja, 15% aproximadamente. La tripsinólisis de las fracciones

albúminas, globulinas y glutelinas del arroz generó productos de reacción con

buenas características de actividad antioxidante, reduciendo hasta en un 75%

la oxidación del radical DPPH. Mientras que los productos de reacción de los

hidrolizados de proteínas de suero lácteo con la proteasa cisteínica

hemisfericina fueron los que mostraron los mejores niveles de actividad

emulsionante.

Antecedentes.

El arroz que se produce en el Estado de Morelos es ampliamente reconocido

por su alta calidad. Específicamente, su contenido proteínico es de interés

como fuente de péptidos con funcionalidad mejorada: tecnofuncionales y/o

bioactivos, obtenidos por modificación enzimática (proteólisis limitada). La

aplicación de la tecnología enzimática en la hidrólisis de proteínas alimentarias

o de proteínas sub-utilizadas se vuelve una alternativa dentro de la búsqueda

de péptidos funcional cuyas propiedades biológicas, fisicoquímicas, funcionales

y sensoriales puedan ser mejoradas respecto a las de la proteína nativa. Los

estudios de susceptibilidad proteolítica permiten obtener el patrón específico de

los productos de hidrólisis, que constituye una huella de las propiedades

conformacionales de una proteína. Adicionalmente, se plantea la hipótesis de

que, por razones estructurales, resultarán diferentes tanto la susceptibilidad a la

proteólisis como la funcionalidad del contenido proteínico total del arroz y de las

fracciones proteínicas separadas en función de su solubilidad con diferentes

disolventes (globulinas, albúminas, glutelina). Con base en lo anterior, en la

presente propuesta, se realizó un estudio comparativo de la hidrólisis con dos

proteasas de diferente especificidad y origen (tripsina y hemisfericina) a

distintos grados de hidrólisis sobre proteínas obtenidas de arroz. El objetivo de

la presente investigación fue caracterizar la susceptibilidad tríptica y

hemisfericínica, así como la funcionalidad y actividad antioxidante resultante de

la modificación enzimática en las fracciones proteicas aisladas de arroz

variedad Mor-A-98: albúmina, globulina, glutelina.

Metas: a) Identificación de péptidos con propiedades funcionales realzadas,

aislados de fracciones proteínicas sometidas a hidrólisis tríptica y

hemisfericínica. b) Determinar los perfiles de grado de hidrólisis para cada

sistema estudiado de enzima-sustrato. c) Caracterizar mediante electroforesis

los productos de reacción obtenidos a diferentes grados de hidrólisis. d)

Evaluar y comparar las propiedades emulsionante y antioxidante de los

péptidos resultantes durante la hidrólisis enzimática

Materiales y métodos

La muestra de arroz Morelos A-98 de la marca “La Perseverancia de Jojutla” fue

procesada en un molino Tekmar A-10 (Alemania) y tamizada a un tamaño de

partícula de 40 US. La harina ya tamizada fue desengrasada utilizando el

método de Wang et al (1999) con unas modificaciones, en la que se hace uso

de iso-butanol en una relación 1:3 manteniéndolo en agitación durante 30

minutos. Pasado este tiempo se decanta el disolvente y al sedimento se le

añade hexano lo suficiente para cubrirlo y se agita por unos 5 minutos mas, se

vuelve a decantar y el sedimento se deja airear toda la noche. La harina

desengrasada se almacenó a una temperatura de 5ºC.

Extracción de las fracciones peptídicas de arroz. Para la extracción de las

fracciones de proteínas más abundantes (albúmina, globulina y glutelina) se

utilizo el método descrito por Ju et al (2001). Extracción de albúmina (Extracción

acuosa): a la harina ya desengrasada se le adicionó agua destilada a 20ºC en

una proporción de 1:4, y se mantuvo en agitación por 4 horas, fue centrifugadá

a 3000 g x min. (1500 rpm), el sobrenadante obtenido se separó y filtró ya que

ahí se contenía la mayor parte de las fracciones solubles en agua,

principalmente albúmina. Extracción de globulina (Extracción salina): al

sedimento se le añadió una solución de NaCl al 5% (1:4) a 20ºC con agitación

de 4 horas y posteriormente se centrifugó en las mismas condiciones, los

sobrenadantes obtenidos se filtraron. Extracción de glutelina (Extracción

alcalina: de nueva forma al sedimento resultante de la fracción anterior se le

añadió NaOH al 0.02M, 13, (pH 11.0), a 20ºC y solo se agitó por 30 minutos; se

centrifugó y se filtraron su sobrenadantes.

Separación de las proteínas de los extractos Todas las fracciones fueron

precipitadas de los sobrenadantes por el ajuste de pH a valores que

corresponden a sus puntos isoeléctricos (PI). Los valores de pH en que se

obtuvo la precipitación, PIs, fueron determinados tomando muestras de cada

sobrenadante ajustándolas a distintos intervalos de pH (3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5,

6.0, 6.5 y 7.0) los cuales fueron sometidos a centrifugación y se midió la

absorbancia de los sobrenadantes obtenidos a 320 nm. El pH que obtuvo la

menor absorbancia correspondió al PI. El resto del sobrenadante se precipitó al

pH de su punto isoeléctrico y se centrifugó a 10, 000 rpm x minuto y los

sedimentos obtenidos se lavaron con agua destilada dos veces y ajustados a

pH 7.0 y sometidos a congelación. Estos sedimentos se liofilizaron para su

almacenamiento y posterior uso.

Aislamiento de la proteína total de arroz. Para realizar la extracción de las

proteínas de arroz totales se utilizó el método descrito por Sudarat et al (2005),

en el cual se hizo una dilución de harina desengrasada y agua destilada (1:4),

se ajustó el pH a 10.0 agitando constantemente durante 30 minutos a

temperatura ambiente. La mezcla fue centrifugada (HERMLE z 383 k,

Alemania) a 3000 rpm por 30 minutos, se obtuvo el sobrenadante que se

sometió a una precipitación isoeléctrica pH a 5.0 (precipitación isoeléctrica) y se

volvió a centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos. El precipitado fue lavado con

agua (pH 4.5) y se neutralizó para su liofilización.

Suero lácteo. El suero fue proporcionado por el laboratorio de lácteos del

CBTA #8 de Xoxocotla, Mor., este fue procesado en el Laboratorio de Enzimas

Vegetales (Reyes-Nava y Briones-Martínez) para concentrar la proteína por

medio de precipitación térmica a 85ºC y posterior liofilización para su

conservación y uso posterior. Extracción de proteínas de suero lácteo: para

extraer la proteína se utilizó el método desarrollado por Kika et al (2007) con

unas modificaciones, se hicieron dispersiones al 2% del liofilizado y se

desengrasó por agitación a 4ºC. El contenido de proteína soluble fue

determinado con el método de Bradford (1976). La concentración de hizo por

extracción con carboximetil celulosa (CMC) al 2% (p/v); y eluida con regulador

de fosfatos pH 9.0. Se centrifugó a 5000 rpm por 20 minutos y el precipitado fue

lavado dos veces con agua destilada, y se procedió a filtrar con papel filtro

Whatman de poro medio.

Enzimas. Tripsina (Sigma Chemical Co., EUA). Se preparó una solución al

0.4% (p/v) en regulador de fosfatos (0.05M, pH 7.6) para el concentrado de

proteína de arroz y suero lácteo mientras que se utilizó 0.5% para las fracciones

peptídicas. Hemisfericina. Se empleó una preparación de hemisfericina refinada

obtenida en el Laboratorio de Enzimas Vegetales del CeProBi (Briones-

Martínez, et al). Se preparó una solución al 5% (p/v) en regulador de fosfatos

activada con cisteína (1.6M), para las fracciones no se hace comparación con la

enzima hemisfericina y tripsina.

Hidrolizados. Los hidrolizados se prepararon en experimentos por lote, en un

vaso de reacción de 100 ml con doble pared para el control de la temperatura,

acoplado a un titulador automático pH-stat con registro de consumo de NaOH

(0.1N). Las proteínas fueron hidrolizadas a un pH y temperatura constantes de

7.6 y 45ºC con un volumen de reacción de 50 ml. La concentración de enzima

fue de 1% (v/v) con respecto al volumen del sustrato y 10% (v/v) de solución de

tripsina para las fracciones. Los tiempos de hidrólisis fueron de 15, 60, 180 y

360 minutos para cada sistema E/S y 0, 10, 30, 60 y 120 minutos para las

fracciones, de cada tiempo de hidrólisis se tomo una alícuota de 8µl para su

caracterización electroforética.

Método de Bradford. Este método determina el contenido de proteína soluble

en una solución y consiste en la formación de un compuesto de adsorción de

coloración azul entre los residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el

colorante Azul Coomassie. Absorbe luz a 595 nm, los límites para la

determinación de proteína están entre 1 y 10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4

mg/ml (ensayo estándar) y la intensidad de absorción depende del contenido de

aminoácidos básicos y aromáticos. El reactivo de Bradford es preparado de la

siguiente manera. Primero, se obtiene una solución concentrada que incluye

100 mg de azul de Coomasie G-250 (SIGMA Chemical Co., EUA) con 50 ml de

etanol al 95% y 100 ml de ácido fosfórico al 65% pureza de 85%, se

homogeniza y se afora posteriormente a 1 L con agua desionizada.

El procedimiento consiste en hacer reaccionar 100 µl del sobrenadante de las

dispersiones de las proteínas con 2 ml del reactivo de Bradford, agitar

brevemente en un vortex, dejar reposar durante 5 min y leer a 595 nm, en un

espectrofotómetro (SHIMADZU UV-160) utilizando como blanco 2ml de reactivo

de Bradford mas 100 µl de agua. Los análisis se realizaron por triplicado. Las

absorbancias obtenidas se comparan con una curva tipo para calcular el

contenido de proteína soluble, ésta se preparó utilizando como referencia

albúmina de suero bovino (BSA) en una concentración de 2.5 mg/10 ml de agua

destilada desionizada.

Electroforesis en gel de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes

(SDS). La electroforesis en poliacrilamida es un método sensible, rápido y

económico para evaluar el patrón de proteínas contenido en una muestra, el

número de especies proteínicas, sus pesos moleculares y la concentración. Se

requieren cantidades pequeñas de muestra del orden de microgramos de

proteína. Se colocan alícuotas de 8 microlitros de muestra en 8 microlitros de

regulador (1M tampón Tris-HCl pH 0.6, glicerol al 50% (v/v), SDS 10% (p/v),

azul de bromofenol y agua destilada). Previamente las soluciones de proteínas,

se someten a temperaturas de ebullición durante dos minutos, y las muestras

así tratadas se aplican a geles verticales de poliacrilamida (13 al 15%

dependiendo de los tamaños moleculares ensayados), siguiendo el método

descrito por Laemmli (1970). La electroforesis se llevo a cabo en una cámara

Mini PROTEAN 3 Cell (BIO-RAD Lab. Inc., EUA). Se utilizo como referencia de

pesos moleculares, el marcador BenchMark Prestained (Invitrogen, EUA). Los

geles se tiñeron durante 15 minutos a temperatura ambiente en solución

fijadora constituida por ácido acético al 10% (v/v), azul de Coomassie R-250

(SIGMA Chemical Co., EUA), metanol al 40% (v/v) y agua destilada. El exceso

de colorante se retiró con una solución desteñidora a base de agua, ácido

acético al 10% (v/v) y metanol al 40% (v/v); haciendo varios cambios de esta

solución hasta que pueden definirse las bandas de los geles.

La distancia recorrida por las bandas proteínicas del marcador de pesos

moleculares conocidos se utiliza como referencia para la elaboración de la

curva de pesos moleculares con la que se determina (por medio de regresión

lineal) el peso correspondiente a las especies que se separan

electroforéticamente.

Propidades funcionales

Indice de Actividad Emulsionante (IAE). Las propiedades emulsionantes de

los hidrolizados se determinaron mediante el método de Pearce y Kinsella

(1978), con ciertas modificaciones. Las muestras se prepararon con aceite de

maíz puro (La Gloria, CORFUERTE; México) en una relación 1:3

(aceite/muestra). La mezcla fue dispersada en una batidora de uso casero

(Princess 2052, China) a velocidad 1 durante 1 minuto. Inmediatamente

después de la homogeneización se tomaron cuidadosamente del fondo del

recipiente, alícuotas de 0.25 ml y se diluyeron con 5 ml de una solución de

dodecil sulfato de sodio (SDS) al 2% en regulador de fosfatos pH 7.6 0.05 M.

Finalmente se midió la absorbancia de las emulsiones diluidas contra un blanco

de regulador a 500 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu 250). Las

lecturas de absorbancia fueron utilizadas para calcular el índice de Actividad

Emulsionante utilizando la fórmula definida por Pearce y Kinsella. Los análisis

fueron realizados por triplicado. El índice de Actividad Emulsionante (IAE) se

determina por la siguiente formula:

Donde:

A500= es la absorbancia a 500 nm; Φ= volumen de la fracción de la fase

oleosa.; l= paso de luz.; C= peso de la proteína por unidad de volumen de la

fase acuosa antes de la emulsión.

Estabilidad emulsionante (EE).

La estabilidad relativa de las emulsiones preparadas en este estudio se siguió

en emulsiones preparadas mediante el método de Pearce y Kinsella, de las

cuales se tomaron alícuotas de 0.25 ml a tiempos de 0, 1, 3, 5 y 10 minutos

después de la homogeneización, se diluyeron en 5 ml de dodecil sulfato de

sodio (SDS) 2% y se leyeron las absorbancias a 500 nm. Los análisis fueron

realizados por triplicado.

Actividad antioxidante. La propiedad con implicaciones e actividad biológica o

bioctividad que se midió fue la de actividad antioxidante (AOX) del radical

DPPH. Se utilizó el método descrito por Von Gadow et al (1997) con algunas

modificaciones. Se preparó una solución metanólca de DPPH (2,2- difenil- 6-

picrilhidrazilo). Este es un método colorimétrico que se basa en que el DPPH

tiene apariencia en su forma oxidativa que es de color púrpura, pero al ser

reducido en presencia de un antioxidante cambia a un color amarillo (Figura 4 y

5). Para este método se preparo una solución 0.1 mM de DPPH (SIGMA

Chemical Co., EUA) en metanol al 100%. La reacción se efectuó agregando la

solución de DPPH a las muestras de los hidrolizados en una relación 1:1, la

mezcla fue agitada vigorosamente en un vortex (Genie 2, EUA) y

posteriormente se mantuvo en reposo durante 30 minutos en la oscuridad, al

finalizar este tiempo se leyó el sobrenadante a 517 nm. Se utilizo metanol como

blanco y la solución de DPPH al tiempo cero como testigo. Los análisis se

realizaron por triplicado.

Resultados y discusión

Aislamiento de la proteína total de arroz Mor A-98.- Efecto del pH.

(Sudarat,2005). Previa extracción de lípidos, las preparaciones proteínicas

obtenidas se sometieron a varios lavados en medio alcalino, a pH 10.0, en el

cual se obtuvo una primera preparación, en una segunda etapa se precipitó

por su punto isoeléctrico a las fracciones de interés con base en el mejor

rendimiento, el cual se obtuvo a pH de 5.0 como se observa en la figura 1.

Figura 1. Patrón electroforético de los precipitados isoeléctricos de proteína obtenidos del arroz Variedad Morelos A-98. M, marcador (M), valores de pH .

Caracterización electroforética de las proteínas de arroz en diferente etapas

de su aislamiento. En la figura 2, se muestra el patrón electroforético de las

proteínas totales de la variedad de arroz A-98, con y sin tratamiento (columnas

5 y 6), entre las que se encuentra una mayor proporción de especies de peso

molecular menor a 15 kD, en segundo lugar aparecen proteínas de peso

molecular de 20 y 60 kD. Se puede observar en las columnas 2 y 4 que los

sobrenadantes que resultan de la precipitación isoeléctrica presentan una

buena cantidad de proteína de 15 kD.

Figura 2. Caracterización electroforética de las proteínas de arroz. M marcador, 1 extracción alcalina, 2 precipitación isoeléctrica, 3 segunda extracción alcalina, 4 segunda precipitación isoeléctrica, 5 y 6 primero y segundo concentrado de proteínas respectivamente.

Grado de hidrólisis (GH) tríptica. La acción catalítica de la tripsina se observó

en mayor medida sobre la fracción de globulinas, lo que indica una mayor

susceptibilidad de su estructura al efecto de esta enzima de origen animal. Se

observaron grados de hidrólisis (GH) de 1.95, 11.47, 2.63 y 4.81 para albúmina,

globulina, glutelina y concentrado de proteína de arroz, respectivamente

(Figura. 3)

Figura 3. Hidrólisis tríptica de las proteínas de la variedad de arroz Morelos A-98: concentrado (CPA) y fracciones albúmina, globulina y glutelina. Comparativo de los perfiles de grado de hidrólisis (GH).

Identificación por electroforesis de los péptidos resultantes de las proteínas de arroz sometidas a hidrólisis tríptica y hemisfericínica. En los patrones electroforéticos (Figura 4) se observa la ausencia de los

péptidos de 25 kD (testigos, 1,3,5,7 y 9 ) con la aparición de bandas de péptidos

de bajo peso molecular en los carriles 8 y 6, correspondientes a los tiempos de

hidrólisis más largos, 180 y 360 minutos respectivamente. La desaparición de

las fracciones es un primer indicador de la susceptibilidad enzimática de las

proteínas de arroz a la acción de la hemisfericina, a diferencia de las fracciones

obtenidas en los sistemas hemisfericina/lactosuero, tripsina/lactosuero y

tripsina/arroz que se muestran como comparativo.

Figura 4. Electroforesis en gel de poliacrilamida (14%) de los hidrolizados de proteínas de arroz y de suero lácteo. A: proteínas de suero lácteo- tripsina, B: proteínas de suero lácteo- hemisfericína, C: proteínas de arroz- tripsina y D: proteínas de arroz- hemisfericína. M representa la línea de marcadores moleculares; 1: la muestra sin hidrolizar; 2: 15 min de hidrólisis; 3: testigo 15 min; 4: 60 min de hidrólisis; 5: testigo 60 min; 6: a 180 min de hidrólisis; 7: testigo de 80 min; 8: 360 min de hidrólisis; y 9: testigo de 360 min.

Indice de actividad emulsionante y estabilidad de la emulsión.

Se determinó la capacidad emulsionante de los hidrolizados hemisfericínicos

obtenidos con las proteínas totales de arroz y con sus diferentes fracciones,

albúmina, glutelina y globulina, medida como el Indice de actividad

emulsionante IAE (Figura 5-A). La estabilidad de las emulsiones ensayadas

(EE) se analizó de forma comparativa para los hidrolizados de arroz /

hemisfericina y las fracciones de proteínas del arroz, los valores de IAE más

altos correspondieron al hidrolizado de globulina; los hidrolizados de albúmina,

no obstante presentar valores de IAE menores, tuvieron una buena estabilidad

en el mismo tiempo probado (Figura 5B).

Figura 5-A. Índice de actividad emulsionante de los hidrolizados enzimáticos. A: arroz, S: suero, T: tripsina, H: hemisfericina; 15, 30, 60, 120, 180 y 360: tiempo de hidrólisis (min).

Figura 5B. Estabilidad emulsionante de los hidrolizados con hemisfericina de proteína total de arroz y de sus fracciones proteínicas albúmina, globulina y glutelina. A: arroz; H: hemisfericina; 15, 60, 180 y 360: tiempo de hidrólisis (min).

Los hidrolizados trípticos de proteínas de arroz presentaron un comportamiento

similar. En la figura 6 se resumen los valores de capacidad y estabilidad

emulsificante,como resultado de la acción de la hemisfericina y de tripsina sobre

los diferentes aislados de arroz; se observó que la hemisfericina modificó en

mayor medida esta propiedad funcional, que la tripsina.

Figura 6. Estabilidad emulsionante de los hidrolizados enzimáticos de arroz con tripsina y hemisfericina. A: arroz; T: tripsina; H: hemisfericina; 15, 60, 180 y 360: tiempo de hidrólisis (min)

Actividad antioxidante (AOX). Se utilizó el aditivo antioxidante comercial ácido

ascórbico como referencia (100%), se observó que los hidrolizados de albúmina

de arroz presentaron un mayor porcentaje de efecto antioxidante sobre DPPH.

Con un 80% de AOX, los hidrolizados hemisfericínicos de las albúminas de

arroz mostraron el mejor efecto antioxidante a un tiempo de reacción de 120

minutos. Los hidrolizados de las proteínas totales de arroz mostraron una AOX

menor al 50%, con un porcentaje mayor para los obtenidos con hemisfericina a

un tiempo de hidrólisis de 180 minutos que para los hidrolizados trípticos ( 30

%) al mismo tiempo de reacción. (Figura 8)

Figura 8. Actividad antioxidante de los hidrolizados de proteínas de suero lácteo y de las fracciones albúmina, globulina y glutelina de arroz. Ac. Asc.: ácido ascórbico.

Los datos informados confirman el cumplimiento de las metas propuestas con la

separación de tres fracciones de arroz variedad A-98, albúminas, glutelinas y

globulinas. Se comprobó que el modo de acción de la tripsina y la hemisfericina

es diferente dependiendo del sustrato utilizado: la susceptibilidad enzimática de

cada tipo de fracción proteica está relacionado con la modificación estructural

que se refleja en las propiedades funcionales analizadas. Los hidrolizados con

hemisfericina tuvieron una buena estabilidad emulsionante en comparación con

los hidrolizados trípticos. La actividad antioxidante de los hidrolizados

generados por hemisfericina fue mejor para los hidrolizados de albúmina con un

80% de AOX.

El impacto de los resultados es en el avance acerca del conocimiento de la

susceptibilidad a la proteólisis de las diferentes fracciones de proteínas que

contiene el arroz, como preparación total y como especies independientes, y en

cuanto a que dichos conocimientos son la base tecnológica de una estrategia

para producir péptidos a partir de proteínas de arroz con propiedades

funcionales de interés práctico.

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