Informe del Proyecto de Investigación: INMUNOTOXICIDAD DE HIDROCARBUROS POLIAROMÁTICOS Y DE LA MICROBIOTA EN LA CARPA COMÚN Cyprinus carpio AMBIENTALMENTE EXPUESTA. Clave SIP 20072167 Participantes:

Dr. Armando Vega López (Director del proyecto) Dra. Ethel A. Garcia Latorre Dra. Maria Lilia Domínguez López M en C Graciela M. González Lugo Introducción

La Laguna de Zumpango es una de las tres localidades tipo remanentes de la

ex zona lacustre del Valle de México. El cuerpo de agua es alimentado por

aguas residuales tratadas al nivel secundario de origen doméstico provenientes

del Poniente de la zona metropolitana de la Ciudad de México, y además

recibe los desechos industriales generados también en la región. Las matrices

complejas, como son las aguas residuales, contienen múltiples xenobióticos y

contaminantes y esto sucede sobre todo cuando el tratamiento es incompleto;

tal es el caso de las aguas que alimentan esta laguna. De los xenobióticos más

abundantes en la mayoría de los sistemas acuáticos, destacan los

hidrocarburos poliaromáticos (HPA). Estos compuestos han demostrado ser

inmunotóxicos, genotóxicos, carcinogénicos, y mutagénicos ya que activan

múltiples mecanismos de respuesta celular. Estos daños pueden estar

mediados por los receptores aril hidrocarburo, que activan genes de respuesta

localizados en la región promotora dentro de la cromatina de los hepatocitos.

Este fenómeno esta mediado por la función mixta oxidasa (FMO), donde el

citocromo P450 (cit P450), que es una super familia de enzimas, participa de

manera importante. A consecuencia de las interacciones entre los xenobióticos

y sus receptores, se generan especies reactivas del oxígeno (ROS) en los

procesos redox del cit P450. Las ROS son responsables del estrés oxidativo en

los hepatocitos de algunos peces. Este daño se ha documentado para varias

especies centinelas y en otros países; sin embargo, se desconoce el efecto del

agua de la Laguna de Zumpango sobre el hígado la carpa común y de la

misma forma, tampoco hay reportes sobre los detrimentos producidos en las

células del sistema inmune. También prevalece una carencia de información

sobre los mecanismos de regulación genética de esta respuesta al estrés

oxidativo. Se ha reportado que las enzimas de la FMO biotransforman los HPA

en metabolitos altamente reactivos, capaces de unirse al ADN. Como resultado

de estas interacciones toxicológicas, la apoptosis que es la muerte celular

programada, se incrementa. Por esta razón, también puede considerarse como

una muerte celular inducida por la exposición a xenobióticos del tipo dioxina,

como los HPA. A pesar de la importancia de este fenómeno, existen pocos

estudios que hayan encontrado relaciones entre la apoptosis y los HPA, así

como los mecanismos celulares que codifican esta respuesta. Dado el carácter

electrofílico de los HPA, se pueden formar haptenos, que se conjugan a las

proteínas séricas y pueden inducir respuestas de anticuerpos. Los haptenos

conjugados pueden llegar a ser biomarcadores de exposición y daño en

diversas especies de peces ambientalmente expuestos; no obstante, el uso de

estos marcadores biológicos todavía se encuentra en proceso de

experimentación a nivel mundial. Considerando que la carpa común es una

especie de interés comercial y que los HPA pueden dañar al hombre a través

de la ingesta, la evaluación tanto de estos biomarcadores, como el factor de

bioconcentración constituyen una herramienta fundamental para la evaluación

del riesgo por consumo de alimentos contaminados.

De la misma forma, en las aguas residuales se pueden encontrar diversas

especies de microorganismos, que pueden ser parte de la flora bacteriana

normal o pueden ser cepas patógenas tanto para los peces como para el

hombre. En la respuesta inmune innata, la generación de ROS producida en

los macrófagos es uno de los mecanismos defensa característicos de estas

células. Sin embargo y pesar de la importancia de esta estrategia de defensa

celular, las ROS producidas también pueden dañar otros órganos del sistema

inmune, especialmente aquellos donde ocurren las interacciones celulares y

también en los órganos linfoides y mieloides. Se ha demostrado en modelos de

roedores que la co-exposición a xenobióticos y a diversos patógenos puede

desacoplar la respuesta inmune en su totalidad. La consecuencia de estos

daños puede traspasar el nivel de individuos expuestos y alcanzar el nivel

poblacional. De la misma forma tiene repercusiones en el desarrollo fetal, ya

que los productos de progenitores co-expuestos nacen con inmunodeficiencias.

No obstante, prevalece una carencia de información sobre estas posibles

repercusiones en peces expuestos a HPA y organismos patógenos. También la

respuesta inmune adquirida se altera notablemente por esta co-exposición. Se

ha documentado que los niveles de inmunoglobulinas se abaten notablemente.

La consecuencia de este daño es una mayor susceptibilidad al ataque de

patógenos y una menor respuesta de los mecanismos de detoxificación. Esto

cobra importancia en especies de interés comercial expuestas a elevados

niveles de contaminación, como es el caso de la carpa común habitante de la

Laguna de Zumpango. A pesar de estas importantes relaciones entre los

tóxicos, los patógenos y las células del sistema inmune, en México no existen

estudios inmunotoxicológicos que hayan demostrado el daño producido por la

co-exposición de los xenobióticos y los agentes patógenos.

Objetivos Determinar los parámetros biológicos y ambientales críticos que modifican la

respuesta de las células del sistema inmune de la carpa común Cyprinus carpio

crónicamente expuesta a mezclas de hidrocarburos poliaromáticos (HPA) y

patógenos presentes en el agua de la Laguna de Zumpango.

Objetivos específicos: En peces de ambos sexos y por clases de edad habitantes de la Laguna de

Zumpango y con respecto a sus propios controles, cumplir con los objetivos

siguientes:

1) Evaluar la apoptosis en leucocitos totales y en tejidos encapsulados del

sistema inmune de la carpa común y relacionarla con metabolitos biliares de

HPA.

2) Estudiar la regulación genética de las señales celulares pro-apoptóticas y

anti-apoptóticas en órganos del sistema inmune.

3) Estimar la respuesta pro-oxidante y antioxidante en órganos del sistema

inmune de la carpa común y relacionarlas con la misma respuesta en el hígado.

4) Relacionar los FBC de HPA con la respuesta pro-oxidante y antioxidante de

los órganos del sistema inmune y de la biotransformación, como un mecanismo

de generación de especies reactivas del oxigeno.

5) Valorar la regulación genética de los elementos celulares de respuesta pro-

oxidante y antioxidante en células del sistema inmune y hepáticas.

6) Caracterizar la microbiota de los intestinos grueso y delgado y del agua de la

Laguna de Zumpango relacionándola con la respuesta inmune adquirida para

las cepas patógenas detectadas.

Metas Las metas planeadas servirán de base para el desarrollo de una nueva línea de

investigación en la ENCB, la evaluación inmunotoxicológica, que es una parte

fundamental en los estudios de monitoreo del riesgo ambiental cuyo objetivo

final será tanto la protección de las especies, como del hombre.

II MÉTODOS Y MATERIALES 2.1 Colecta y mantenimiento de organismos. La carpa común Cyprinus carpio fue capturada por medio de redes agalleras

en la Laguna de Zumpango, Edo. de México ya que este cuerpo de agua es

remanente de la zona lacustre del Valle de México y recibe aporte de

contaminación al ser mantenido con aguas negras tratadas a nivel secundario.

Los peces control provienen de la piscifactoría Tezontepec dependiente de la

SAGARPA, del municipio de Tezontepec de Aldama, estado de Hidalgo. En el

laboratorio se obtuvo sangre por vía intracardiaca para la evaluación de

apoptosis en leucocitos totales y los peces fueron sacrificados para la

obtención del timo, el bazo, la cabeza del riñón y el hígado como órganos de

referencia. Los organismos fueron clasificados de acuerdo a la talla obteniendo

4 clases descritas a continuación:

CLASE Talla

I menor 20

II 20,5-25

III 25,5-30

IV 30,5-35

2.2 Evaluación de biomarcadores de exposición y daño Caracterización de HAP en el agua y en los tejidos La concentración de hidrocarburos policíclicos aromáticos (HAP) fue

determinada por espectroscopia de fluorescencia mediante un

Espectrofluorómetro LS-55 Perkin-Elmer de acuerdo a los criterios de

operación. Se determinó la concentración de 3 HAP: Naftaleno, Pireno y B[a]P

de acuerdo a la tabla 1 en el timo, bazo, cabeza del riñón, suero, bilis y en el

hígado de las carpas de la Laguna de Zumpango y en los peces control. La

concentración de HAP se determinó mediante curvas de concentraciones

conocidas.

Tabla 1. Longitudes de onda para la determinación de las concentraciones de

HAP en agua y tejido.

HAP λ Excitación

nm

λ Emisión

nm

Naftaleno 273 360

Pireno 341 380

B[a]P 380 430

Determinación de apoptosis por la Técnica de picos Sub-G0. La participación de la apoptosis en el sistema inmune es de vital importancia,

ya que intervienen en la selección del repertorio de linfocitos T y B. Esta

evaluación se realizó por citofluorométria mediante el análisis del ciclo celular

por la técnica denominada Pico sub-G0. Para la determinación se emplea un

fluorocromo que se intercala de manera estequimétrica en el DNA, por lo que

es posible determinar el contenido relativo en las células y por lo tanto

diferenciar la fase del ciclo celular en que se encuentran. En las células

apoptóticas se presenta degradación de la cromatina y el contenido de DNA es

menor a 2N por que pueden ser cuantificadas mediante la aparición de un pico

en la región SubG0. Previamente los eritrocitos de la muestras de sangre

heparinizada fueron eliminados mediante solución de lisis, los leucocitos se

lavaron, deshidrataron y se permeabilizaron. Las células se colocan con

regulador de suspensión y la apoptosis se evalúa en el clitómetro a 10,000

eventos.

Evaluación del estrés oxidativo en los órganos del sistema inmune de C.

carpio La lipoperoxidación (LPOX) se evaluó de acuerdo al método de Buege y Aust

(1978). Esta técnica se basa en la formación del complejo colorido entre el

malondialdehído que es el producto generado a consecuencia de la

destrucción de las membranas celulares con el ácido tiobarbiturico. La

concentración de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (SRATB) fue

calculada por medio del coeficiente de extinción molar (1.56 x 105 cm-1 M-1) y

reportada por g tejido.

Inducción de las defensas antioxidantes: superoxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GHS) La actividad de las defensas antioxidantes se evaluó en la fracción S9 de

acuerdo a diferentes métodos. La superoxido dismutasa (SOD) por medio del

método de Misra y Fridorich (1972) contra una curva de superoxido dismutasa

de eritrocitos bovinos. La actividad de la catalasa (CAT) de los peroxisomas se

cuantifico siguiendo el método de Radi et al. (1991). Los resultados se obtienen

a través del coeficiente de extinción molar (CEM) del H2O2 =0.093mM-1cm-1;

Los datos se expresaron en mM de H2O2 /min/g de tejido. La actividad de la

glutatión peroxidasa (GSH) se realizó de acuerdo al método de Gunzler y Flohe

(1985) y fue calculada mediante el coeficiente de extinción molar del NADPH

de 6.22 mM-1 cm-1.

Expresión del mRNA de genes pro-apoptóticos y antiapoptóticos por RT-PCR. Se analizó la expresión de genes pro-apoptóticos (BAX, CASP9) y

antiapoptóticos (BCL-2 y BCL-2 like 11) en los órganos del sistema inmune y

en hígado como órgano de referencia. La extracción de RNA total, la síntesis

del cDNA, la amplificación térmica por RT-PCR y a la visualización de los

productos de la RT-PCR de acuerdo con Vega-López et al. (2007). El control

interno del proceso fue la fracción 18s del rRNA. La expresión de los genes se

reportó de manera semicuantitativa en valores densitométricos utilizando el

programa ImageJ® con relación al control interno. El producto del RT-PRC se

purificó y se ligó con el vector de clonación pGEM-T (Marca Promega ). La

trasformación se desarrolló usando células competentes DH5α (Marca Gibco-

Invitrogen). Los clones positivos fueron caracterizados usando el secuenciador

LICOR IR2 de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Pruebas de aglutinación Se aislaron microorganismos del intestino grueso, delgado y del agua de la

Laguna de Zumpango utilizando medio de transporte, medios de cultivo

enriquecidos y pruebas bioquímicas (CAT, OXI, TSI Urea, LIA, Citrato, SIM, MI

O, Nitratos, MR, VP). Las cepas aisladas se cultivaron y se formalinizaron al

tubo 3 del nefelómetro para las pruebas de aglutinación. En el suero de las

carpas de la Laguna de Zumpango y en los peces control se realizaron

diluciones de 1:2 hasta 1: 4,096 y el titulo de anticuerpos se probó mediante la

aglutinación específica para cada una de las cepas formalinizadas a 590 nm en

lector de microplacas y con relación a la absorbancia de la cepa sin el suero.

Análisis estadístico

Los resultados de los diferentes biomarcadores se probaron por medio de

análisis de varianza de dos vias (ANOVA), comparando cada una de las clases

con respecto al testigo y posteriormente por medios análisis paramétricos y no

paramétricos. Se consideraron estadísticamente significativos aquellos

resultados con una p ≤0.05. Las relaciones de toxicidad de los biomarcadores

(variable dependiente) y la concentración de HAP (variable independiente) se

probaron mediante regresiones lineales.

III RESULTADOS Especimenes Los criterios de agrupación por tallas resultaron ser apropiados ya que el peso

presentó marcadas diferencias entre cada grupo (Tabla 3 ).

Tabla 3: Relación de especimenes de Cyprinus carpio colectados en la Laguna de Zumpango. Clases n Talla (cm) SD (cm) Peso (g) SD (g)

I Control 2 20 0.58 250 28.75 I Laguna de Zumpango 2 18.9 0.42 210 14.14 II Control 10 22.7 1.38 360.0 64.71 II Laguna de Zumpango 23 23.3 1.53 365.9 75.74 III Control 10 26.6 0.77 539.0 82.22 III Laguna de Zumpango 12 26.9 1.26 481.7 64.36 IV Control 4 36.5 0.65 576.7 212.43 IV Laguna de Zumpango 5 32.8 1.24 975.0 430.09

Concentraciones de HAP en el agua y en tejidos del sistema inmune

Las mayores concentraciones de HAP fueron de naftaleno y las menores de

Benzo [a] Pireno tanto en el agua de la laguna de Zumpango como en los

órganos del sistema inmune, bilis e hígado de acuerdo a las tablas 4, 5, 6 y 7.

Tabla 4: Concentración de HAP presentes en el agua de la laguna de

Zumpango, Edo. de México. LECTURA nm Promedio

HAP Emisión Excitación µg /mL agua Desv. Estandar

NAFTALENO 360 273 0,0628 0,004307

PIRENO 380 341 0,0117 0,182947

B[a]P 430 380 0,0033 0,002091

La concentración de naftaleno fue mayor en la bilis en todas las clases (tabla

5). En los tejidos del sistema inmune, el naftaleno esta presente todas las

clases de edad; sin embargo las mayores concentraciones se detectaron en los

peces más grandes. En este trabajo se ha documentado pro primera vez que el

naftaleno se puede bioconcentrar en los órganos del sistema inmune de la

carpa común y que en los fluidos como el suero y la bilis se presentan los

mayores factores de bioconcentración.

Tabla 5: Concentración de naftaleno [mg/g tejido] en los órganos del sistema inmune de la carpa común Cyprinus carpio habitante de la Laguna de Zumpango. Bazo Timo Suero Bilis Hígado

[ ] FB [ ] FB [ ] FB [ ] FB [ ] FB I C 0.97 15.4 0.27 4.29 5.58 88.84 16.98 204 1.26 20 I Z 0.45 7.2 0.22 3.52 11.19 178.22 12.81 213 1.53 24 II C 0.46 7.3 1.22 19.47 55.34 881.21 13.38 672 3.16 50 II Z 1.36 21.7 2.58 41 30.09 479.20 42.21 176 3.64 58 III C 0.30 4.7 0.86 13.65 69.47 1106.14 11.09 359 0.79 12.65 III Z 1.33 21.2 2.42 38.56 751.57 11967.61 22.55 188 2.16 34 IV C 0.35 5.6 1.08 17.12 49.90 794.61 11.79 278 0.93 14.74 IV Z 2.31 36.7 1.94 30.83 19.50 1107.86 17.44 204 0.21 3.29

[ ]= Concentración (mg naftaleno/g tejido); suero y bilis (μg pireno/ml). I C= Clase I, control. I Z= Clase I Laguna de Zumpango….. FB= Factor de bioconcentración.

La concentración más elevada de pireno se observó en el bazo, tanto en los

peces de la Laguna de Zumpango y además hubo diferencia significativa

respecto al nivel basal de los grupos control. En los peces de la Clase II de

Zumpango fue donde se detectaron las mayores concentraciones de este

tóxico (tabla 6). En el suero y en el bazo se detectaron los mayores factores de

bioconcentración.

Tabla 6: Concentración de pireno [μg/g tejido] en los órganos del sistema inmune de la carpa común Cyprinus carpio habitante de la Laguna de Zumpango. Bazo Timo Suero Bilis Hígado

[ ] FB [ ] FB [ ] FB [ ] FB [ ] FB I C 1.50 129 ND - ND - 2.48 212.9 ND - I Z 6.33 542 1.35 116.05 23.66 2027.50 0.24 20.9 28.9 2474.32 II C 6.87 589 ND - 18.34 1571.81 1.40 119.9 ND - II Z 57.45 4924 ND - 183.07 15689.57 3.15 269.7 102.1 8753.57 III C 4.06 348 ND - 11.42 978.54 0.76 65.4 ND - III Z 23.64 2026 ND - 26.08 2234.85 0.58 49.8 37.1 3177.57 IV C 10.81 927 ND - 5.31 455.14 0.21 17.7 ND - IV Z 37.72 3233 ND - ND - ND - 26.7 2287.99

[ ]= Concentración (μg pireno/g tejido); suero y bilis (μg pireno/ml). ND= No detectado. I C= Clase I, control. I Z= Clase I Laguna de Zumpango….. FB= Factor de bioconcentración.

Excepto en el bazo de la clase I no se detectó Benzo [a] pireno. Estos

resultados indican los procesos de biotransformación de este HAP y

probablemente una fotosensibilidad en las condiciones de la laguna. Solo en el

suero se observó que este hidrocarburo se bioconcentra (tabla 7).

Tabla 7: Concentración del Benzo [a] pireno [μg/g tejido] en los órganos del sistema inmune de la carpa común Cyprinus carpio habitante de la Laguna de Zumpango. Bazo Timo Suero Bilis Hígado

[ ] FB [ ] FB [ ] FB [ ] FB [ ] FB I C ND ND - ND - ND - ND - I Z 4.1 1232 ND - ND - ND - ND - II C ND ND - 0.09 27.19 ND - ND - II Z ND ND - ND - ND - ND - III C

ND ND - 0.09 28.43 ND - ND - III Z ND ND - 0.90 273.92 ND - ND - IV C ND ND - ND - ND - ND - IV Z ND ND - ND - ND - ND -

[ ]= Concentración (μg benzo[a] pireno /g tejido). ND= No detectado. I C= Clase I, control. I Z= Clase I Laguna de Zumpango….. FB= Factor de bioconcentración.

APOPTOSIS

Se observaron diferencias significativas entre los peces de las diferentes clases

respecto a los especimenes control. Los valores más elevados se detectaron

en las carpas de la clase II de la Laguna de Zumpango (Tabla 8). En la Clase I-

de los peces control se cuantificó un nivel basal de 3.5 % y en los organismos

expuestos la apoptosis alcanzó valores de hasta 34.8% de. En la Clase II

testigo y expuestos se determinaron valores de apoptosis de 8.02% y 55.68%

respectivamente, siendo este último uno de los valores más elevados de todas

las clases. En la clase III, se presentó un valor basal 4.9% y un máximo de

49.79% en los peces de la Laguna de Zumpango. Los valores cuantificados en

la clase IV fueron del 27.51 % en los organismos expuestos de la Laguna de

Zumpango. La apoptosis se incrementó conforme las concentraciones de

naftaleno y pireno, tanto en el suero como en la bilis.

Tabla 8: Porcentaje de apoptosis en leucocitos de la carpa común Cyprinus carpio habitante de la Laguna de Zumpango.

Lotes Promedio (%) SD Máximo Mínimo

I Control 8.2 0.0 14.71 3.24

I Laguna de Zumpango 28.2 7.8

33.7 22.7

II Control 10.0 3.1 22.9 5.4

II Laguna de Zumpango 35.5 13.1

53.5

12.0

III Control 12.9 4.9 15.59 2.9

III Laguna de Zumpango 27.7 8.9

40.9

7.5

IV Control 10.9 0.0 15.59 0.0

IV Laguna de Zumpango 22.6 7.4 33.0 6.11

SD= Desviación estándar

Respuesta pro-oxidante y antioxidante Estrés oxidativo, Lipoperoxidación La mayor lipoperoxidación fue detectada en la cabeza del riñón y en el timo. En

todos los casos la LPOX de los órganos del sistema inmune fue mayor que lo

observado en el hígado. Este daño fue mayor en los peces control que en los

expuestos (Tabla 9). Probablemente esta respuesta se deba a una mayor tasa

de respiración de los peces control dado que el metabolismo aerobio se puede

relacionar con un mayor estrés oxidativo. También se observaron diferencias

entre clases de edad, en peces de mayor tamaño los niveles de LPOX se

incrementaron. Tabla 9: Lipoperoxidación (M+2 SRATB/ g tejido) en los órganos del sistema inmune de la carpa común ambientalmente expuesta al agua de la la Laguna de Zumpango.

Clase Timo Bazo Riñón Hígado

[ ] SD [ ] SD [M+5/ g

tejido ]

SD [ ] SD

I C 372.5 74 154.4 16.2 957.2 1.1 35.4 6.2

I Z 23.9 13 236.3 3.1 377.0 383.0 17.7 3.8

II C 41.8 12 183.3 69.2 171.3 143.6 36.2 10.6

II Z 18.3 11 1060.6 11.0 124.4 64.1 15.6 6.6

III C 22.3 12 667.7 115.3 157.9 97.7 39.0 14.9

III Z 523.3 138.3 1628.2 115.3 118.5 42.3 32.3 13.1

IV C 10.0 1 302.5 8.0 55.7 0.2 43.2 4.2

IV Z 13.6 10 226.7 13.6 438.3 647.3 28.9 14.5

[ ] = Concentración (M+2SRATB /g tejido). I C= Clase I, control. I Z= Clase I Laguna de Zumpango…..

Defensas antioxidantes Actividad enzimática de la superoxido dismutasa (SOD) La mayor actividad de SOD se presentó en los organismos de la Clase III,

principalmente en el hígado y en el bazo. En el timo la actividad de esta enzima

no fue significativa con respecto a sus propios controles (Tabla 10). En los

especimenes capturados en la Laguna de Zumpango la actividad de la SOD

estuvo abatida significativamente en los peces de mayor talla y con relación a

sus testigos.

Tabla 10: Actividad enzimática de la superoxido dismutasa (mM/min/mg proteína/g tejido) en los órganos del sistema inmune de la carpa común ambientalmente expuesta al agua de la Laguna de Zumpango.

Clase Timo Bazo Hígado

[ ] SD [ ] SD [ ] SD

I C 0.20 0.0000 0.38 0.0007 0.39 0.0000 I Z 0.21 0.0006 0.49 0.0002 0.49 0.0000 II C 0.20 0.0002 0.49 0.0010 0.39 0.0000 II Z 0.20 0.0002 0.32 0.0011 0.39 0.0000 III C 0.09 0.0000 0.26 0.0008 0.26 0.0000 III Z 0.37 0.0029 6.05 0.0161 5.98 0.0100 IV C 0.06 0.0000 0.00 0.0000 0.00 0.0000 IV Z 0.10 0.0003 0.11 0.0018 0.11 0.0013 I C 0.20 0.0000 0.38 0.0007 0.39 0.0000

Actividad enzimática de la catalasa La mayor actividad de catalasa se detectó en la cabeza del riñón y en el

hígado. En el timo en promedio no hubo actividad catalasa y en el bazo se

cuantificó sólo en los peces expuestos al agua de la Laguna de Zumpango

(Tabla 11).

Actividad enzimática de la glutatión peroxidasa (GPx) en tejidos del sistema inmune e hígado La cabeza del riñón y el timo presentaron la mayor actividad de GPx tanto en

los peces expuestos al agua de la Laguna de Zumpango como en sus

respectivos controles. En el bazo la inducción de esta enzima presentó

incrementos en los especimenes de menor talla y abatimientos en los peces

más grandes con relación a sus controles. El hígado presentó la menor

actividad de GPx comparativamente con los órganos del sistema inmune

(Tabla 12).

Tabla 11: Actividad enzimática de la catalasa (mM/min/mg proteína/g tejido) en los órganos del sistema inmune de la carpa común ambientalmente expuesta al agua de la Laguna de Zumpango.

Clase Timo Bazo Riñón Hígado

[ ] SD [ ] SD [ ] SD [ ] SD

I C ND - ND - 61.90 3.23 0.042 0.028 I Z ND - 6.258 0.311 89.20 104.49 0.389 0.003 II C ND - ND - 89.20 286.42 0.113 0.018 II Z ND - 1.788 0.584 414.17 316.10 0.109 0.002 III C ND - ND - 49.23 68.08 0.084 0.001 III Z ND - ND - 491.51 73.51 0.125 0.011 IV C ND - ND - 49.62 12.15 0.243 0.011 IV Z ND - 1.948 0.375 314.83 147.51 0.081 0.006 [ ] = Concentración (mM/ min/mg proteína/ g tejido). I C= Clase I, control. I Z= Clase I Laguna de Zumpango….. Tabla 12: Actividad enzimática de la glutatión peroxidasa (mM/min/mg proteína/g tejido) en los órganos del sistema inmune de la carpa común ambientalmente expuesta al agua de la Laguna de Zumpango.

Clase Timo Bazo Riñón Hígado

[ ] SD [ ] SD [ ] SD [ ] SD

I C 0.052 2.820 0.060 0.142 0.73 0.73 0.009 0.737 I Z 0.081 0.025 0.068 0.051 1.41 1.31 0.034 0.016 II C 0.189 0.072 0.060 0.029 1.41 1.17 0.025 0.021 II Z 0.255 0.160 0.077 0.013 1.81 1.13 0.017 0.013 III C 0.051 0.045 0.058 0.009 0.92 0.44 0.019 0.016 III Z 0.126 0.036 0.019 0.020 1.43 0.65 0.018 0.008 IV C 0.043 0.006 0.043 0.006 0.33 0.33 0.011 0.000 IV Z 0.060 0.023 0.040 0.041 0.43 0.23 0.040 0.041 [ ] = Concentración (mM/ min/mg proteína/ g tejido). I C= Clase I, control. I Z= Clase I Laguna de Zumpango…..

Inmunidad humoral Caracterización de las Inmunoglobulinas de Cyprinus carpio En este trabajo se observaron tres isotipos de inmunoglobulinas en la carpa

común. Por medio de SDS-PAGe se cuantificó un peso de 761 kDa para la

cadena pesada de la IgM con pesos de 152 kDa para cada uno de los

pentámeros y la cadena ligera de tuvo una masa de 155 kDa con 32 kDa para

los pentámeros. El peso total de la IgM fue de 913 kDa. La Ig A fue dimérica y

presentó un peso de 142 kDa, el peso detectado para cada monómero fue de

71 kDa. La IgG presentó un peso total de 159 kDa. Se detectaron tanto una

cadena pesada como una ligera, formadas por dímeros; la cadena pesada fue

de 112 kDa y la ligera de 47 kDa.

Pruebas de aglutinación bacteriana Se observaron efectos de inmunomodulación de los HAP en la respuesta

humoral. Los efectos de los hidrocarburos en el suero fueron específicos con

respecto a cada cepa bacteriana aislada. El naftaleno y el pireno fueron

básicamente inmunoestimulantes mientras que hidrocarburos de mayor peso

molecular como el benzo [a] pireno fue inmunosupresor. Se observó una

respuesta estadísticamente significativa para Enterobacter cloacae y para

Shigella spp. En la mayoría de los casos los peces control tuvieron menores

títulos de inmunoglobulinas contra la microbiota que las carpas habitantes

crónicas de la Laguna de Zumpango así como diferencias entre las clases de

edad y entre organismos de la misma clase. La respuesta más alta se observó

contra Citrobacter spp cepas 1 y 2. En todos los casos se aislaron bacterias

patógenas que son indicadoras de la escasa calidad del aguay predominaron

coliformes pertenecientes a la Familia Enterobacteriaceae. De la misma forma

se ha reportado que estos géneros pueden infectar tanto al hombre como

especies acuáticas.

Títulos de anticuerpos contra Enterobacter spp Para la cepa 1 el titulo fue más alto en las carpas de la Laguna de Zumpango

que en los peces control. La respuesta por tallas fue mayor en los peces de las

clases I y IV tanto en los expuestos como en los testigos. En las tallas

intermedias no se observaron diferencias significativas (Tabla 13). Por medio

de las regresiones lineales múltiples se observó que la concentración de

naftaleno en el plasma tuvo efectos inmunoestimulantes mientras que la

concentración del pireno del pireno y benzo(a) pireno ejercieron

inmunosupresión en la respuesta humoral.

Títulos de anticuerpos contra Enterobacter cloacae La concentración de inmunoglobulinas disminuyó conforme la edad y fue mayor

en los peces habitantes crónicos de Laguna de Zumpango que en los peces

control excepto en la clase II donde no hubo diferencia. Los mayores títulos se

observaron en la clase I tanto en los peces testigo como en las carpas

expuestas (Tabla 14). Para esta especie de bacteria se notaron efectos

estadísticamente significativos entre la concentración de hidrocarburos y la

respuesta humoral (p<0.05). El naftaleno y el pireno tuvieron efectos

inmunoestimulantes y el benzo(a) pireno fue inmunosupresor.

Tabla 13: Títulos de anticuerpos contra Enterobacter spp en las carpas habitantes de la Laguna

de Zumpango y en los peces control, aglutinación bacteriana evaluada a 590 nm.

Clases de edad LZ Control

Promedio (1/V) SD Promedio (1/V) SD

I 128.205 15.234 8192 725

II 78.294 34.026 8.690 3.012

III 92.708 102.671 6.128 3.148

IV 115.056 77.396 256.921 19.413

L Z= Laguna de Zumpango SD= Desviación estándar. 1/V= Inverso del titulo (vol).

Títulos de anticuerpos contra Citrobacter spp cepa 1 La mayor reactividad específica se presentó contra la cepa 4 pero el patrón fue

irregular. Sólo contra esta cepa se observó un mayor titulo en los peces control

que en los peces de la Laguna de Zumpango. En la clase III se detectaron las

mayores concentraciones de anticuerpos (Tabla 15). Se observaron tendencias

estadísticas entre la concentración de hidrocarburos en la sangre y la

respuesta humoral. El naftaleno y del pireno tuvieron efectos de

inmunosupresión y el benzo(a) pireno fue inmunoestimulante.

Tabla 14: Títulos de anticuerpos contra Enterobacter cloacae en la carpa común Cyprinus

carpio habitante de la Laguna de Zumpango y en los peces control, aglutinación bacteriana

evaluada a 590 nm.

Clases de edad LZ Control

Promedio (1/V) SD Promedio (1/V) SD

I 66.667 4.590 32.025 5.270

II 19.520 12.776 22.686 22.686

III 46.022 24.388 5.533 2.717

IV 15.907 4.478 4 0.608

LZ= Laguna de Zumpango SD= Desviación estándar. 1/V= Inverso del titulo (vol).

Títulos de anticuerpos contra Citrobacter spp cepa 2 Para la cepa 5 se detectó una respuesta dependiente de la edad de los peces,

a mayor edad, fue mayor el titulo de inmunoglobulinas. Sólo se observaron

diferencias significativas entre los peces control y los expuestos en las clases

III y IV (Tabla 16). También se detectaron tendencias estadísticas entre la

concentración de hidrocarburos en l suero y la respuesta humoral contra

Citrobacter spp cepa 2. Se observó inmunoestimulación del pireno y el

naftaleno y el benzo(A) pireno fueron inmunosupresores.

Tabla 15: Títulos de anticuerpos contra Citrobacter spp cepa 1 en la carpa común Cyprinus

carpio habitante de la Laguna de Zumpango y en los peces control, aglutinación bacteriana

evaluada a 590 nm.

Clases de edad LZ Control

Promedio (1/V) SD Promedio (1/V) SD

II 19.562 13.274 101.764 67.865

III 63.459 42.488 712.348 0

IV 29.153 16.518 128 13.482

LZ= Laguna de Zumpango SD= Desviación estándar. 1/V= Inverso del titulo (vol).

Títulos de anticuerpos contra Shigella spp La concentración de anticuerpos contra la cepa 11 también fue en las carpas

de la Laguna de Zumpango que en los especimenes control. También se

detectaron diferencias entre clases de edad, en los peces de menor talla los

títulos fueron menores en los peces de menor talla. Sólo la respuesta de las

carpas control de la clase IV fue diferente mientras que en los peces expuestos

se observaron diferencias en todos las clases de edad (tabla 17). Las

relaciones estadísticas múltiples entre la concentración de hidrocarburos con la

respuesta humoral contra Shigella spp fueron estadísticamente significativas

(p<0.05). El naftaleno y el pireno fueron inmunoestimulantes pero el benzo(a)

pireno fue inmunosupresor.

Tabla 16: Títulos de anticuerpos contra Citrobacter spp cepa 2 en la carpa común Cyprinus

carpio habitante de la Laguna de Zumpango y en los peces control, aglutinación bacteriana

evaluada a 590 nm.

Clases de edad LZ Control

Promedio (1/V) SD Promedio (1/V) SD

II 41.235 15.730 32 6.531

III 87.459 41.863 16 2.146

IV 96.604 75.557 64.103 19.453

LZ= Laguna de Zumpango SD= Desviación estándar. 1/V= Inverso del titulo

(vol).

Tabla 17: Títulos de anticuerpos contra Shigella spp en la carpa común Cyprinus carpio

habitante de la Laguna de Zumpango y en los peces control, aglutinación bacteriana evaluada

a 590 nm.

Clases de edad LZ Control

Promedio (1/V) SD Promedio (1/V) SD

II 14.111 4.400 4.283 3.304

III 82.219 51.265 3.676 2.453

IV 36.571 38.593 64 23.789

LZ= Laguna de Zumpango SD= Desviación estándar. 1/V= Inverso del titulo (vol).

Títulos de anticuerpos contra Aeromonas spp probablemente A.

salmonicida

La menor concentración de anticuerpos se observó contra la cepa 12. En los

peces de la Laguna de Zumpango la respuesta fue mayor que en los controles.

No se observaron diferencias significativas en las carpas de la clase II y IV de

la Laguna de Zumpango ni en los peces testigos de la clase III y IV (Tabla 18).

Se advirtieron tendencias entre la concentración de hidrocarburos en el suero y

los títulos de anticuerpos contra Aeromonas spp. El naftaleno y el pireno fueron

inmunoestimulantes y el benzo(a) pireno inmunosupresor.

Tabla 18: Títulos de anticuerpos contra Aeromonas spp en la carpa común Cyprinus carpio

habitante de la Laguna de Zumpango y en los peces control, aglutinación bacteriana evaluada

a 590 nm.

Clases de edad LZ Control

Promedio (1/V) SD Promedio (1/V) SD

II 12.790 12.201 3.937 1.236

III 17.952 21.248 8 2.789

IV 12.488 17.708 7.843 3.789

LZ= Laguna de Zumpango SD= Desviación estándar. 1/V= Inverso del titulo (vol).

IV CONCLUSIONES

• La evaluación de las concentraciones de los tóxicos en los diferentes

compartimentos de un ecosistema por si mismos no reflejan el daño

potencial para la salud de los organismos.

• Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son fuerzas exógenas

pro-oxidantes en el sistema inmune de la carpa común ambientalmente

expuesta al agua de la Laguna de Zumpango.

• La determinación de biomarcadores inmunotoxicológicos en la carpa

común se constituyen como una herramienta fundamental en los

estudios del monitoreo del estado de salud de las poblaciones y

probablemente también en el hombre por consumo con pescado

contaminado con HAP.

• Ya que la toxicidad de los HAP tiene afinidades con el estallido

respiratorio de los macrófagos, entonces pueden existir sinergismos con

la función y/o integridad de este sistema.

• En todos los casos se observó una inducción de apoptosis en los

leucocitos de los peces de la Laguna de Zumpango respecto a sus

propios controles, por lo que puede considerarse un biomarcador

apropiado en estudios de inmunotoxicidad.

• La apoptosis estuvo relacionada con la concentración del naftaleno y el

pireno bioconcentrados tanto en el suero como en la bilis.

• Los HAP interfieren con los mecanismos celulares; probablemente en la

ruta extrínseca de la apoptosis, pero es necesario iniciar el estudio de

los mecanismos de acción toxica de los HAP sobre este proceso celular.

• El estrés oxidativo en los órganos del sistema inmune de la carpa común

evaluado como lipoperoxidación tuvo una respuesta estadísticamente

significativa respecto a los peces control por lo que se puede considerar

apropiado como indicador de daño temprano.

• Sin embargo, es necesario el uso de otros biomarcadores para

comprender más ampliamente los efectos de los radicales libres en las

diferentes biomoléculas y los procesos involucrados en la destrucción de

las membranas celulares de los órganos del sistema inmune.

• El estrés oxidativo fue mayor en los órganos del sistema inmune que en

el hígado, particularmente esto se observó en el timo de los peces de la

Laguna de Zumpango.

• Se observó también una respuesta dependiente del sexo. En las

hembras la LPOX tuvo relaciones con la concentración del naftaleno

pero esto no ocurrió en los machos, lo que indica que el metabolismo de

esteroides está involucrado en la toxicidad de HAP. Particularmente se

observaron relaciones en el timo y en el bazo.

• La respuesta antioxidante es mayor en los órganos del sistema inmune

que en el hígado.

• De las defensas antioxidantes la superoxido dismutasa, la catalasa y la

glutatión peroxidasa en los órganos del sistema inmune de la carpa

común fueron estadísticamente significativas respecto a sus controles y

además apropiadas para comprender los mecanismos de defensa contra

las especies reactivas del oxígeno.

• La mayor actividad de las defensas antioxidantes se detectó en la

cabeza del riñón y bazo pero en otros órganos se observaron patrones

de inducción particulares. El timo presentó una elevada actividad de

GPx, la menor actividad de SOD y carencia de CAT.

• Existen relaciones significativas en los mecanismos de toxicidad de los

HAP y la inducción de las defensas antioxidantes, además estos

incrementos estuvieron relacionados con el sexo de los especimenes

capturados y con el tipo de hidrocarburo. A menor peso molecular,

mayores relaciones de toxicidad.

• En machos la SOD y la GPx estuvieron relacionadas con naftaleno y

pireno mientras que en las hembras sucedió lo contrario.

• La CAT tuvo decrementos conforme se incrementó la concentración de

HAP en peces de ambos sexos.

• Probablemente este fenómeno se explica por daños en el sitio de unión

con el NADH en la superficie de la enzima, que la protege contra el

ataque de las especies reactivas del oxígeno.

• Se descartan deficiencias de las defensas antioxidantes en los órganos

del sistema inmune porque su actividad fue más elevada que en el

hígado.

• No se observó dependencia del benzo [a] pireno bioconcentrado con los

biomarcadores ensayados ni tampoco hubo relación de los HAP con la

respuesta hepática.

• En los órganos del sistema inmune debe existir un balance apropiado de

las defensas antioxidantes para contrarrestar los daños exógenos de

HAP y los endógenos producidos por el estallido respiratorio.

• Existen afinidades de la inmunidad humoral de la carpa común con

especies mamíferas ya que se detectaron tipos comunes de

inmunoglobulinas como la IgM, la IgG y la IgA.

• Se presentan efectos de inmunomodulación de los HAP sobre la

respuesta humoral y además tienen relación con peso molecular del

hidrocarburo, los de mayor tamaño como el benzo [a] pireno son

inmunosupresores y los de menor tamaño como el naftaleno y el pireno

inmunoestimulantes.

• La inmunidad humoral fue mayor en los peces expuestos al agua de la

Laguna de Zumpango que en los peces testigo.

• Se observaron diferentes relaciones de la respuesta humoral y el tipo de

hidrocarburo.

• La mayor respuesta humoral se observó contra Citrobacter sp cepa 1 y

Citrobacter sp cepa 2 pero los efectos de inmunomodulación de los HAP

fueron estadísticamente significativos en la respuesta humoral contra

Enterobacter cloacae y contra Shigella spp.

• CONSIDERACIONES FINALES: Dado que sólo se contó con recursos

económicos después del mes de agosto, actualmente se está

evaluando la expresión de los genes pro-apoptóticos y antiapoptóticos

en los órganos del sistema inmune de la carpa común expuesta al agua

de la Laguna de Zumpango y que forma parte del presente estudio. Los

resultados preliminares indican una sobre-expresión de los genes pro-

apoptóticos más que una inhibición de los genes antiapoptóticos.

IMPACTO Salud y Medio Ambiente, Ciencia Básica

Este proyecto sirve de base para el desarrollo de protocolos de investigación

destinados a evaluar los efectos inmunotóxicos de los hidrocarburos

aromáticos policíclicos en especies de interés comercial y también en

poblaciones silvestres. Gracias a los resultados obtenidos es posible proponer

tanto el uso de una batería de biomarcadores de inmunotoxicidad como

analizar el estado de salud de los organismos expuestos a matrices

ambientales complejas, los detrimentos del estado de salud de estas

poblaciones y el posible impacto en la salud del hombre.